Przygotowanie pierwotnych mieszanych kultur glejowych z tkanki rdzenia kręgowego dorosłych myszy

Ogólnym celem tego protokołu jest ustanowienie pierwotnych mieszanych kultur glejowych z rdzenia kręgowego dorosłych myszy do badań in vitro. Metoda ta zapewnia nam system in vitro do badania roli komórek glejowych w chorobach neurologicznych, które obejmują patologiczne zmiany w rdzeniu kręgowym, takie jak ból neuropatyczny i stwardnienie rozsiane. Główną zaletą tej techniki jest to, że kultury glejowe są przygotowywane z rdzenia kręgowego dorosłej myszy, zapewniając system, który dokładniej odzwierciedla warunki in vivo.

Procedurę zademonstruje Jennifer Malon, technik z mojego laboratorium. Pracując w kapturze do hodowli tkankowej, przenieś cztery rdzenie kręgowe myszy na szalkę Petriego HBSS. Użyj sterylnych nożyczek i kleszczy, aby przeciąć każdy z rdzeni kręgowych na małe kawałki.

Następnie przenieś kawałki do 50-milimetrowej stożkowej rurki zawierającej mieszaninę enzymów DNAzy Papainy. Należy unikać przenoszenia HBSS do mieszaniny enzymów, ponieważ może to spowodować zmniejszenie wydajności enzymu. Bardzo ważne jest, aby fragmenty tkanek były dobrze trawione, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki.

Jednak nadmierne trawienie spowoduje zmniejszenie liczby żywotnych komórek. Każde laboratorium musi przeprowadzić testy pilotażowe, aby określić dokładny czas trawienia w oparciu o to, co działa najlepiej dla ich komórek. Następnie delikatnie zawiruj rurkę, a następnie inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę z wytrząsaniem orbitalnym z prędkością 150 obrotów na minutę.

Po inkubacji należy zawirować probówkę, a następnie energicznie rozetrzeć tkankę za pomocą pięciomililitrowej pipety, aby przyspieszyć dalszą dysocjację. Następnie przenieś zawiesinę komórek do 15-mililitrowej probówki i odwiruj przez 300 x g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Podczas wirowania, w 300 mikrolitrach odtworzonego roztworu inhibitora albuminy owukooidalnej do 2,7 mililitra ABSS w sterylnej probówce i dobrze wymieszać.

Następnie dodaj 150 mikrolitrów roztworu DNA. Po centyfikacji usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w świeżo przygotowanym roztworze inhibitora albuminy owomkoidów i DNA. Dobrze wywiruj, aby rozbić osad komórkowy.

Następnie dodać trzy mililitry odtworzonego roztworu inhibitora albuminy jajomkoidów, bez DNAzy, do zawiesiny komórki. Odwirować komórki przy 70 x g przez sześć minut w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu usunąć supernatant, który zawiera fragmenty membrany, i zachować osad.

Aby usunąć mielinę ze zdysocjowanych komórek rdzenia kręgowego, najpierw dodaj osiem mililitrów pożywki o gęstości gradientowej 20% o temperaturze pokojowej do probówki zawierającej osad komórkowy i delikatnie przemieszaj. Następnie odwiruj komórki o sile 800 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej bez pękania. Po odwirowaniu ostrożnie odessać wierzchnią warstwę gruzu, która zawiera głównie mielinę i supernatant, pozostawiając osad.

Aby usunąć pozostały gradient gęstości, umyj komórki, ponownie zawieszając osad z ośmioma mililitrami cDMEM rozcieńczonym HBSS. Odwiruj komórki z natężeniem 400 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usunąć supernatant i przemyć komórki rozcieńczonym cDMEM, jak poprzednio.

Po usunięciu supernatantu osad można przechowywać na lodzie do czasu wysiewu komórek. Gdy będą gotowe do posiewu, ponownie zawieś ogniwa w 14 mililitrach cDMEM, uzupełnionym 2-merkaptoetanolem. I dodaj jeden mililitr zawiesiny komórek do każdej studzienki w 12-dołkowej płytce.

Płytki dodatkowe studzienki, które można wykorzystać do określenia średniej liczby komórek w basenie i zawartości mikrogleju w kulturze. Po pokryciu komórek inkubuj je w temperaturze 35,9 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Zmień podłoże w dniu 1, czyli dzień po poszyciu.

Niektóre komórki są przyczepione do płytki hodowlanej, ale nadal są w większości okrągłe. Jest też wiele pływających komórek i znaczne śmieci. Powtórz zmianę pożywki trzy do czterech dni później, aż komórki będą gotowe do leczenia między 12 a 14 dniem.

Mieszane komórki glejowe od dorosłych czarnych sześciu myszy C57 hodowano w temperaturze 37 stopni Celsjusza lub 35,9 stopni Celsjusza i analizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Jak widać, nie ma oczywistej różnicy w całkowitych populacjach komórek w tych temperaturach. Te reprezentatywne wykresy pokazują populacje mikrogleju CD45 z dodatnim CD11b wyizolowane z całkowitych populacji komórek pokazanych wcześniej.

Liczba ta pokazuje, że wyższą zawartość mikrogleju można uzyskać, gdy mieszany glej jest hodowany w temperaturze 35,9 stopni Celsjusza, a nie 37 stopni Celsjusza. Dorosłe rdzenia kręgowego, mieszane kultury glejowe przygotowano z czarnych sześciu myszy C67. Pokazano reprezentatywne obrazy hodowanych komórek w pierwszym, czwartym, ósmym i dwunastym dniu.

Obrazy ukazujące typowy postęp kultury, a także pokazujące znaczenie mediów, zmieniają się w pierwszym dniu postkulturowego establishmentu. Po opanowaniu, wstępna konfiguracja mieszanej hodowli komórek glejowych może zostać zakończona w ciągu około czterech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po ustanowieniu mieszanej kultury gleju, z tej początkowej populacji mieszanej można uzyskać kultury zubożone mikrogleju i wzbogacone mikroglejem.

Jednak wydajność komórek wzbogaconych mikroglejem będzie ograniczona, chyba że do założenia kultur zostanie wykorzystana duża liczba rdzeni kręgowych. Technika ta została początkowo zaprojektowana w celu zbadania roli komórek glejowych podczas rozwoju bólu neuropatycznego. Można go jednak wykorzystać do badania innych chorób neurologicznych, które obejmują patologiczne zmiany w obrębie dorosłego rdzenia kręgowego.