Name: Przygotowanie pierwotnych mieszanych kultur glejowych z tkanki rdzenia kręgowego dorosłych myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Naucz się przygotowywać pierwotne mieszane kultury glejowe z rdzenia kręgowego dorosłych myszy. Ta metoda umożliwia badanie roli komórek glejowych w chorobach neurologicznych, zwłaszcza w neuropatycznym bólu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dorosłe kultury mieszane rdzenia kręgowego zostały po raz pierwszy opracowane przy użyciu szczurów przy wsparciu grantowym z nagrody NIH/NIDA R01 (PI De Leo) i grantu szkoleniowego NIH T32 (PI Green). Metody te zostały następnie zaadaptowane do mysich rdzeni kręgowych przy wsparciu z następujących grantów: NIH/NIDA 5K01DA023503 (PI Cao), NIH/NINDS 5R21NS066130 (PI Cao) i NIH/NIGMS P20GM103643 (PI Meng). Autorzy chcieliby również podziękować dr Alejandro M. S. Mayerowi z Wydziału Farmakologii Chicago College of Osteopathic Medicine za jego techniczną pomoc w uzyskaniu bogatych w mikroglej mieszanych komórek glejowych.

Poniższy protokół został zatwierdzony przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie w New England. Niniejszy protokół służy do przygotowania kultur glejowych z rdzenia kręgowego 4 dorosłych myszy.
1. Przygotowanie roztworów w komorze z laminarnym przepływem powietrza w warunkach aseptycznych
<ol>
	<li>Przygotuj pożywki hodowlane: kompletną pożywkę DMEM (cDMEM) zawierającą DMEM (z 4,5 g/L glukozy), 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 2 mM L-glutaminy, 100 IU/mL penicyliny, 100 mg/mL streptomycyny, 250 ng/mL amfoterycyny B oraz 50 µM 2-merkaptoetanolu (2-ME; patrz 1.1.1). Wymieszaj i wysterylizuj poprzez filtrację wszystkie pozostałe składniki, a następnie dodaj FBS. Przechowuj pożywki hodowlane w temperaturze 4 oC.
	<ol>
		<li>Przygotuj roztwór zapasowy 50 mM 2-ME w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS): dodaj 100 µL stężonego 2-ME (14,3 M) do 28,6 mL 1x PBS i wysterylizuj poprzez filtrację (roztwór można przechowywać w temperaturze 4 oC przez kilka miesięcy). Używaj 1 mL roztworu zapasowego 2-ME na każde 1000 mL pożywki hodowlanej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie pożywek do gradientu gęstości
	<ol>
		<li>Przygotuj izotoniczny roztwór zapasowy pożywki do gradientu gęstości (np. 100% Percoll) z 1 części 10x zwykłego sterylnego PBS i 9 części sterylnej zapasowej pożywki do gradientu gęstości (np. Percoll).</li>
		<li>Rozcieńcz 100% pożywkę do gradientu gęstości (przygotowaną w punkcie 1.2.1) zwykłym 1x sterylnym PBS, aby uzyskać 20% pożywkę do gradientu gęstości (np. 10 mL 100% pożywki do gradientu gęstości z 40 mL 1x PBS) i przechowuj ją w temperaturze 4 oC. Przed przygotowaniem hodowli komórkowej doprowadź 20% pożywkę do gradientu gęstości do temperatury pokojowej (RT).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie roztworów z zestawu do dysocjacji papainą 
	UWAGA: zestaw do dysocjacji papainą jest wyszczególniony w tabeli materiałów. Można również stosować inne podobne zestawy do dysocjacji (w tym przygotowane wewnętrznie). Wszystkie składniki muszą być sterylne.
	<ol>
		<li>Dodaj 32 mL zrównoważonego roztworu soli Earle'a (EBSS) do mieszaniny inhibitora owomukoidowego (proszek).</li>
		<li>Dodaj 5 mL EBSS do jednej fiolki z papainą (proszek). Umieść fiolkę z papainą w kąpieli wodnej o temperaturze 37 oC na 10 min lub do czasu rozpuszczenia papainy.</li>
		<li>Dodaj 500 µL EBSS do jednej fiolki z DNazą (proszek). Wymieszaj delikatnie.</li>
		<li>Dodaj 250 µL roztworu DNazy (powyższego) do fiolki z papainą.</li>
		<li>Oblicz całkowitą potrzebną ilość powyższej mieszaniny papainy/DNazy (około 800 µL mieszaniny papainy/DNazy na rdzeń kręgowy myszy) i przenieś wymaganą ilość mieszaniny do probówki 50 mL do trawienia tkanek (krok 3.2). Pozostałą część przechowuj w oryginalnej fiolce w temperaturze 4 °C przez co najmniej dwa tygodnie.</li>
		<li>Wszystkie składniki z zestawów przechowuj w lodzie do momentu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj probówki do pobierania rdzenia kręgowego: jedną sterylną probówkę 15 mL z 5 mL zrównoważonego roztworu soli Hanksa (HBSS; z zestawu do dysocjacji papainą, do zbierania rdzeni kręgowych) oraz jedną sterylną probówkę 15 mL z 1x PBS (do napełnienia strzykawki 5 mL, patrz krok 2.4). Dodatkowo przygotuj jedną sterylną szalkę Petriego (35 mm lub 60 mm) z 5 mL HBSS i pozostaw ją w komorze z laminarnym przepływem powietrza.</li>
</ol>
2. Pobieranie rdzenia kręgowego
UWAGA: Cały sprzęt musi być sterylny. Pobieranie należy przeprowadzić w wyznaczonym obszarze zatwierdzonym przez IACUC.
<ol>
	<li>Przygotuj następujące narzędzia do pobierania rdzeni kręgowych myszy: proste ostre/tępe nożyczki chirurgiczne o długości 18 cm, standardny skalpel o długości 12 cm (uchwyt stały nr 3), sterylne ostrza skalpela nr 10 ze stali węglowej, gilotynę do małych zwierząt, standardowe zakrzywione pęsety o długości 12 cm oraz sterylną igłę 20G przymocowaną do strzykawki 5 mL.</li>
	<li>Uśmierć zwierzę za pomocą CO2 i zdezynfekuj głowę oraz region grzbietowy myszy 70% etanolem (EtOH).</li>
	<li>Wykonaj dekapitację zwierzęcia za pomocą gilotyny. Wykonaj środkowe nacięcie podłużne w dolnej części grzbietu, aby odsłonić warstwę mięśniową. Za pomocą sterylnych prostych nożyczek chirurgicznych (18 cm) wykonaj czyste przecięcie kręgosłupa na poziomie bioder (przecinając również warstwę mięśniową pokrywającą kręgosłup).</li>
	<li>Umieść zwierzę na arkuszu świeżej jednorazowej chusteczki. Ostrożnie wprowadź igłę 20 G (przymocowaną do strzykawki 5 mL wypełnionej sterylnym 1x PBS (krok 1.4)) do kanału kręgowego w kierunku rostralnym. Mocno przytrzymaj zwierzę i szybko wypchnij zawartość strzykawki. Cały rdzeń kręgowy powinien zostać wypchnięty przez koniec szyjny. Zbierz rdzeń kręgowy do probówki 15 mL zawierającej HBSS.</li>
	<li>Powtórz krok 2.4 dla pozostałych myszy. Po każdym zwierzęciu zdezynfekuj wszystkie użyte instrumenty 70% EtOH. 
	UWAGA: Zazwyczaj jedna płytka 12-dołkowa może zostać przygotowana z każdych 4 rdzeni kręgowych myszy (patrz 4.3).</li>
</ol>
3. Przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek
Uwaga: Kroki 3 i 4 należy przeprowadzić w komorze z laminarnym przepływem powietrza, aby zachować sterylność.
<ol>
	<li>Przenieś wszystkie rdzenie kręgowe do szalki Petriego zawierającej HBSS (krok 1.4). Pokrój każdy z rdzeni kręgowych na wiele drobnych, małych kawałków za pomocą sterylnych nożyczek i pęsety. Przenieś tkankę rdzenia kręgowego do 50-mL stożkowej probówki zawierającej przygotowaną mieszaninę enzymów papainy/DNazy (krok 1.3.5), używając sterylnej pęsety lub pipety 10 mL (unikaj dodawania HBSS do mieszaniny enzymów, ponieważ spowoduje to dalsze rozcieńczenie przygotowanego roztworu enzymu i może doprowadzić do obniżenia jego aktywności).</li>
	<li>Delikatnie wymieszaj zawartość probówki na wirówce typu vortex. Inkubuj probówkę w temperaturze 37 oC przez 1 h w inkubatorze z wytrząsarką przy wytrząsaniu orbitalnym z prędkością 150 rpm.</li>
	<li>Ponownie wymieszaj probówkę na wirówce typu vortex i energicznie rozhomogenizuj roztwór enzymu z tkanką za pomocą pipety 5 mL, aby wspomóc dalszą dysocjację.</li>
	<li>Przenieś zawiesinę komórkową do probówki 15-mL i odwiruj przy 300 x g przez 5 min w RT.</li>
	<li>Podczas wirowania wymieszaj 2,7 mL EBSS z 300 µL zrekonstytuowanego roztworu inhibitora albuminowo-owomukoidowego (1.3.1) w sterylnej probówce. Dodaj 150 µL roztworu DNazy (krok 1.3.3).</li>
	<li>Po wirowaniu usuń supernatant i resuspenduj osad komórkowy w roztworze przygotowanym powyżej (krok 3.5). Wymieszaj dokładnie na wirówce typu vortex, aby rozbić osad komórkowy.</li>
	<li>Dodaj 3 mL zrekonstytuowanego roztworu inhibitora albuminowo-owomukoidowego (krok 1.4.1) do zawiesiny komórkowej. Odwiruj komórki przy 70 x g przez 6 min w RT. Usuń supernatant (który zawiera fragmenty błon).</li>
</ol>
4. Dalsze usuwanie mieliny z zawiesiny pojedynczych komórek
<ol>
	<li>Do probówki zawierającej osad komórkowy dodać 8 mL 20% medium do gradientu gęstości (przygotowanego w kroku 1.2.2), delikatnie wymieszać na wortexie w celu rozbicia osadu, a następnie odwirować komórki przy 800 x g przez 30 min w RT bez hamowania. Ostrożnie usunąć górną warstwę zanieczyszczeń (głównie mielinę) oraz nadsącz, zachowując osad.</li>
	<li>Aby usunąć pozostałości gradientu gęstości, przemyć komórki, resuspendując osad komórkowy w 8 mL rozcieńczonego cDMEM (1 część cDMEM i 2 części HBSS). Odwirować komórki przy 400 x g przez 10 min w 4 oC. Usunąć nadsącz i ponownie przemyć komórki rozcieńczonym cDMEM (opisanym powyżej) w ten sam sposób. Przechowywać komórki na lodzie do momentu wysiewania.</li>
	<li>Usunąć nadsącz i resuspendować osad komórkowy w medium hodowlanym (cDMEM z dodatkiem 2-ME (przygotowanym w kroku 1.1)). Dla jednej płytki 12-dołkowej użyć 3 mL x 4 (liczba użytych myszy) + 2 mL = 14 mL medium. Zapewni to wystarczającą ilość zawiesiny komórkowej dla całej płytki (12 dołków) oraz zapewni dodatkowe dołki, które można wykorzystać do określenia średniej liczby komórek na dołek i zawartości mikrogleju w hodowli. W przypadku zastosowania innych rodzajów naczyń hodowlanych, obliczyć całkowitą objętość potrzebnego medium hodowlanego proporcjonalnie.</li>
	<li>Do każdego dołka płytki 12-dołkowej dodać 1 mL zawiesiny komórkowej.</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 35,9 oC w atmosferze 5% CO2.</li>
	<li>Wymienić medium (usuwając stare medium poprzez aspirację) w D 1, a następnie co 3–4 dni (zazwyczaj wymienia się medium w dniach: 1, 4, 8 i 11, a następnie wykorzystuje komórki w dniu 12). 
	UWAGA: W dniu 1 hodowla może zawierać znaczną ilość zanieczyszczeń z powodu resztek mieliny z tkanki rdzenia kręgowego; dlatego zaleca się wymianę medium w dniu 1 (szczegółowe informacje znajdują się w sekcji Dyskusja). Hodowle są gotowe do traktowania między D 12 a 14. Komórki zazwyczaj osiągają 80% konfluencji w D 12 i mogą osiągnąć niemal 100% konfluencji do D 14. Typowo w D 12 w płytce 12-dołkowej znajduje się około 100 000 komórek na dołek.</li>
</ol>
<img alt="Wzrost hodowli komórkowej w ciągu 12 dni; obrazy mikroskopowe pokazują progresję od dnia 1 do dnia 12." src="/files/ftp_upload/54801/54801fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 2: Reprezentatywne obrazy mieszanych komórek glejowych w różnych odstępach czasu po ustanowieniu mieszanej hodowli gleju. Pierwotne mieszane komórki glejowe rdzenia kręgowego przygotowano z dorosłych myszy C57Bl/6. Reprezentatywne obrazy pokazują przebieg hodowli glejowej po wysianiu. W dniu 1 część komórek przylgnęła do płytki hodowlanej, ale wciąż mają one głównie okrągły kształt. Obecnych jest również wiele komórek pływających oraz znaczna ilość debris. W dniu 4 większość komórek przylgnęła do płytki hodowlanej. Komórki wydają się rozgałęzione z widocznymi wypustkami. Komórki są rozproszone, a stopień konfluencji hodowli wynosi w tym czasie około 20-30%. W dniu 8 konfluencja hodowli wynosi od 50-60%. W niektórych obszarach hodowli widoczne są duże skupiska komórek. W innych obszarach wzrost komórek jest rzadki. Niektóre komórki w obrębie skupisk przyjmują kształt „kwadratowy”. W dniu 12 konfluencja hodowli wynosi 80% lub więcej (na przedstawionym obrazie około 90%). W tym czasie komórki znajdują się w fazie logarytmicznej wzrostu, a okres między 12. a 14. dniem jest optymalnym czasem do wykorzystania komórek glejowych w eksperymentach. <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54801/54801fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<ol start="7">
	<li>Oceń zawartość mikrogleju w komórkach z dodatkowych studni (krok 4.3), stosując standardowy protokół barwienia do fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS)11 z użyciem kombinacji przeciwciał monoklonalnych przeciwko CD45 mysiem i CD11b mysiem. Komórki CD45+CD11b+ identyfikuje się jako mikroglej.</li>
</ol>

<ol><li>Gaskin, D. J., Richard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+economic+costs+of+pain+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pain%22%5BJournal%5D)">The economic costs of pain in the United States.</a> J Pain. 13 (8), 715-724 (2012).</li>
<li>Ji, R. R., Berta, T., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glia+and+pain%3A+Is+chronic+pain+a+gliopathy%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Glia and pain: Is chronic pain a gliopathy?</a> Pain. 154 (01), S10-S28 (2013).</li>
<li>Ni, M., Aschner, M., et al. Neonatal rat primary icroglia: isolation, culturing and selected applications. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNi%2C+M+%22Curr+Protoc+Toxicol%22">Curr Protoc Toxicol</a>. Maines, M. D., et al. , (2010).</li>
<li>Cao, L., Fei, L., Chang, T. T., DeLeo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+interleukin-1beta+by+interleukin-4+in+lipopolysaccharide-treated+mixed+glial+cultures%3A+microglial-dependent+effects%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Induction of interleukin-1beta by interleukin-4 in lipopolysaccharide-treated mixed glial cultures: microglial-dependent effects.</a> J Neurochem. 102 (2), 408-419 (2007).</li>
<li>Malon, J. T., Maddula, S., Bell, H., Cao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+calcitonin+gene-related+peptide+and+CCL2+production+in+CD40-mediated+behavioral+hypersensitivity+in+a+model+of+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron+Glia+Biol%22%5BJournal%5D)">Involvement of calcitonin gene-related peptide and CCL2 production in CD40-mediated behavioral hypersensitivity in a model of neuropathic pain.</a> Neuron Glia Biol. 7 (2-4), 117-128 (2011).</li>
<li>Blasi, E., Barluzzi, R., Bocchini, V., Mazzolla, R., Bistoni, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalization+of+murine+microglial+cells+by+a+v-raf+%2F+v-myc+carrying+retrovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Immortalization of murine microglial cells by a v-raf / v-myc carrying retrovirus.</a> J Neuroimmunol. 27 (2), 229-237 (1990).</li>
<li>Bocchini, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immortalized+cell+line+expresses+properties+of+activated+microglial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">An immortalized cell line expresses properties of activated microglial cells.</a> J Neurosci Res. 31 (4), 616-621 (1992).</li>
<li>Alliot, F. O., Marty, M. C., Cambier, D., Pessac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spontaneously+immortalized+mouse+microglial+cell+line+expressing+CD4%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">A spontaneously immortalized mouse microglial cell line expressing CD4.</a> Dev Brain Res. 95 (1), 140-143 (1996).</li>
<li>Alliot, F. O., Pessac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+cell+clones+derived+from+established+cultures+of+8-day+postnatal+mouse+cerebella%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Astrocytic cell clones derived from established cultures of 8-day postnatal mouse cerebella.</a> Brain Res. 306 (1-2), 283-291 (1984).</li>
<li>Malon, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+content-dependent+inhibitory+effects+of+calcitonin+gene-related+peptide+%28CGRP%29+on+murine+retroviral+infection+of+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Microglial content-dependent inhibitory effects of calcitonin gene-related peptide (CGRP) on murine retroviral infection of glial cells.</a> J Neuroimmunol. 279, 64-70 (2015).</li>
<li>Cao, L., DeLeo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNS+Infiltrating+CD4%28%2B%29+T+lymphocytes+Contribute+to+Murine+Spinal+Nerve+Transection-Induced+Neuropathic+Pain%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">CNS Infiltrating CD4(+) T lymphocytes Contribute to Murine Spinal Nerve Transection-Induced Neuropathic Pain.</a> Eur J Immunol. 38 (2), 448-458 (2008).</li>
<li>Mayer, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+a+short-term+in+vitro+exposure+to+the+marine+toxin+domoic+acid+on+viability%2C+tumor+necrosis+factor-alpha%2C+matrix+metalloproteinase-9+and+superoxide+anion+release+by+rat+neonatal+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Effect of a short-term in vitro exposure to the marine toxin domoic acid on viability, tumor necrosis factor-alpha, matrix metalloproteinase-9 and superoxide anion release by rat neonatal microglia.</a> BMC Pharmacol. 1, 7(2001).</li>
<li>Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+the+distribution+and+morphology+of+microglia+in+the+normal+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain.</a> Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).</li>
<li>Rock, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Microglia+in+Central+Nervous+System+Infections%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Role of Microglia in Central Nervous System Infections.</a> Clin Microbiol Rev. 17 (4), 942-964 (2004).</li>
<li>Yang, I., Han, S. J., Kaur, G., Crane, C., Parsa, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Microglia+in+Central+Nervous+System+Immunity+and+Glioma+Immunology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Role of Microglia in Central Nervous System Immunity and Glioma Immunology.</a> J Clin Neurosci. 17 (1), 6-10 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Bardzo ważne jest, aby wykonywać wszystkie kroki – w tym harmonogram zmiany pożywki – w spójny sposób, aby uzyskać powtarzalne wyniki między eksperymentami. Poniższe kroki są szczególnie ważne w uzyskaniu doskonałej jakości dorosłego mieszanego gleju.
Trawienie enzymatyczne jest ważnym aspektem tego protokołu. Bardzo ważne jest, aby fragmenty tkanek były dobrze trawione w celu uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki. Jednak nadmierne trawienie spowoduje znacznie mniej komórek. Każde laboratori...

Przewlekły ból to poważny problem zdrowotny, który dotyka około 100 milionów dorosłych w Stanach Zjednoczonych, a jego roczny koszt szacuje się na 635miliardów dolarów1. Coraz więcej dowodów wskazuje na znaczący udział komórek glejowych rdzenia kręgowego w rozwoju bólu neuropatycznego, jednego z najbardziej niszczycielskich rodzajów bólu przewlekłego2. Odpowiedni system hodowli in vitro znacznie pomógłby w dalszym badaniu roli komórek glejowych na poziomie komórkowym i molekularnym.
Obecnie, systemy hodowli glejowej in vitro wykorzystywane przez badaczy obejmują głównie komórki glejowe pochodzące z tkanek korowych mózgów nowonarodzonych myszy lub szczurów oraz nieśmiertelne linie komórek glejowych pochodzące z pierwotnych komórek glejowych noworodków myszy lub szczurów. Komórki noworodkowe zawierają znaczną liczbę niezróżnicowanych komórek, które mogą być dalej różnicowane w komórki glejowe (głównie astrocyty i mikroglej), zapewniając w ten sposób obfite komórki do użytku eksperymentalnego3. Jednak nasze poprzednie badanie wykazało, że komórki glejowe mózgu noworodków reagowały znacznie inaczej niż dorosłe komórki glejowe rdzenia kręgowego na stymulację lipopolisacharydem (LPS). Na przykład interleukina (IL)-4 wykazywała zwiększone działanie hamujące na indukowaną przez LPS produkcję tlenku azotu (NO) w gleju rdzenia kręgowego dorosłego szczura w porównaniu z glejem mózgunoworodka 4. Co więcej, profile produkcji chemokiny po stymulacji przez neuropeptyd, peptyd związany z genem kalcytoniny (CGRP), są bezsprzecznie różne między glejem mózgu noworodków myszy (metody opisane w odnośniku 5) a glejem rdzenia kręgowego dorosłych myszy (ryc. 1). Ugruntowane linie komórkowe są łatwe w użyciu i utrzymaniu oraz mogą zapewnić dużą liczbę komórek w krótkim czasie. Ogólnie rzecz biorąc, unieśmiertelnione linie komórkowe są generowane przy użyciu systemu nieśmiertelności za pośrednictwem wirusa (takiego jak szeroko stosowana linia komórek mikrogleju BV2)6, 7 lub po identyfikacji spontanicznej transformacji (takiej jak linia komórkowa astrocytów C8-D1A i linia komórek mikrogleju C8-B4)8, 9. Linie komórkowe doskonale nadają się do indywidualnego badania cech molekularnych astrocytów i mikrogleju; Jednak wyniki uzyskane z linii komórkowych zawsze wymagają dalszej walidacji w komórkach pierwotnych lub w warunkach in vivo. Należy również zauważyć, że nie było doniesień o linii komórek glejowych pochodzących z gleju rdzenia kręgowego gryzoni.
Aby pomóc w badaniu roli komórek glejowych rdzenia kręgowego w rozwoju bólu neuropatycznego, system hodowli wywodzący się z rdzenia kręgowego dorosłej myszy został opracowany poprzez adaptację wcześniej opisanej metody używanej do generowania mieszanych kultur glejowych dorosłych szczurów4, 5. Posiew glejowy rdzenia kręgowego myszy został niedawno jeszcze bardziej udoskonalony10 i został opisany bardziej szczegółowo w tym artykule. Mieszane hodowle gleju rdzenia kręgowego u dorosłych osób można ustalić za pomocą myszy z wybranych szczepów, które odpowiadają potrzebom konkretnego badania, a komórki można utrzymywać w hodowli do 21 dni po rozpoczęciu hodowli. Metoda ta może być stosowana w badaniach bólu neuropatycznego, a także w badaniach różnych chorób neurologicznych, które obejmują patologiczne zmiany w obrębie rdzenia kręgowego, takich jak stwardnienie zanikowe boczne (ALS), neuropatia czuciowa związana z ludzkim wirusem niedoboru odporności (HIV) i stwardnienie rozsiane (SM).

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s modyfikacja Eagle' s pożywka (DMEM) z 4,5 g/l glukozy</td><td>Lonza</td><td>12-709F</td><td>Pożywka cDMEM jest standardowym, szeroko stosowanym podłożem hodowlanym. Poszczególni badacze mogą zdecydować, gdzie kupić DMEM i wszystkie inne komponenty używane do produkcji nośników cDMEM.</td></tr><tr><td>L-Glutamina (100x)</td><td>Lonza</td><td>17-605E</td><td>L-glutamina jest standardowym, szeroko stosowanym składnikiem różnych pożywek hodowlanych. Indywidualni badacze mogą zdecydować, gdzie kupić L-glutaminę.</td></tr><tr><td>Antybiotyk-Roztwór przeciwgrzybiczy (100x)</td><td>Corning-Mediatech</td><td>30-004-CI</td><td>Jest to połączenie penicyliny, streptomycyny i amfoterycyny zawierające 10 000 jednostek/ml penicyliny G, 10 mg/ml siarczanu streptomycyny i 25 &mikro; g/ml amfoterycyny B. Indywidualni badacze mogą zdecydować, gdzie zakupić poszczególne składniki.</td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol (2-ME)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td>Odczynnik BioReagent, odpowiedni do hodowli komórkowych, biologii molekularnej i elektroforezy.</td></tr><tr><td>System dysocjacji papainy</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LK003150</td><td>Poszczególne elementy tego zestawu można zakupić osobno.&nbsp;</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Health Care</td><td>17-0891-01</td><td>Percoll jest sprzedawany w postaci sterylnego roztworu. Nierozcieńczony Percoll można w razie potrzeby ponownie sterylizować w autoklawie.</td></tr><tr><td>Inkubator/wytrząsarka laboratoryjna&nbsp;</td><td>Barstead/Lab-line</td><td>MaxQ4000&nbsp;</td><td>To jest inkubator/wytrząsarka, którą obecnie posiadamy. Zamiast tego można użyć innych rodzajów wytrząsarek.</td></tr><tr><td>Lipopolisacharydy, Salmonella Minnesota Re595</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-9764</td><td>Inne szczepy LPS mogą również wywoływać odpowiedzi glejowe. Skala odpowiedzi może się jednak różnić.</td></tr><tr><td>Mysz IL-6 DuoSet ELISA&nbsp;</td><td>R& D Systems</td><td>DY406</td><td>Każdy badacz może wybrać preferowany przez siebie zestaw ELISA.</td></tr><tr><td>Mysz TNF-alpha DuoSet ELISA</td><td>R& D Systems</td><td>DY410</td><td>Każdy badacz może wybrać preferowany przez siebie zestaw ELISA.</td></tr><tr><td>Mysz IP-10 (CXCL10) DuoSet ELISA</td><td>R& D Systems</td><td>DY466</td><td>Każdy badacz może wybrać preferowany przez siebie zestaw ELISA.</td></tr><tr><td>Mysz MCP-1 (CCL2) ELISA Opteia zestaw</td><td>BD Biosciences</td><td>555260</td><td>Każdy badacz może wybrać preferowany przez siebie zestaw ELISA.</td></tr><tr><td>Chemokina myszy Q-Plex</td><td>Quansys Biosciences</td><td>120251MS</td><td>Ten produkt nie był wówczas dostępny do testów wewnętrznych. Zamiast tego wysłaliśmy próbki do producenta w celu analizy.</td></tr><tr><td>APC-anti-mouse-CD45 (klon 30-F11)</td><td>eBioscience</td><td>17-0451</td><td>Można użyć przeciwciała tego samego klonu, ale od innych dostawców.</td></tr><tr><td>FITC-anti-mouse-CD11b (klon M1/70)</td><td>eBioscience</td><td>11-0112</td><td>Można użyć przeciwciała tego samego klonu, ale od innych dostawców.</td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy Accuri C6</td><td>BD Biosciences</td><td>BD Accuri C6&nbsp;</td><td>Każdy Badacz może korzystać z dowolnego cytometru przepływowego, który preferuje.</td></tr><tr><td>Oprogramowanie FlowJo</td><td>Tree Star, Inc.</td><td>FlowJo7.6.5</td><td>Każdy Badacz może korzystać z dowolnego oprogramowania analitycznego, które preferuje.</td></tr></tbody></table>

przygotowanie pierwotnych mieszanych kultur glejowych z tkanki rdzenia kręgowego dorosłych myszy

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

Powszechnie przyjęto, że reakcje glejowe rdzenia kręgowego znacząco przyczyniają się do rozwoju bólu neuropatycznego. Ogromne informacje na temat aktywności gleju na poziomie komórkowym i molekularnym uzyskano dzięki systemom hodowli komórkowych in vitro. Stosowane systemy in vitro obejmują głównie pierwotny glej pochodzący z tkanki korowej mózgu noworodka i unieśmiertelnione linie komórkowe. Jednak systemy te mogą nie odzwierciedlać cech komórek glejowych rdzenia kręgowego in vivo. W celu dalszego zbadania roli komórek glejowych rdzenia kręgowego w rozwoju bólu neuropatycznego wywołanego uszkodzeniem nerwów obwodowych przy użyciu systemu hodowli, który lepiej odzwierciedla stan in vivo, nasze laboratorium opracowało metodę ustalania pierwotnych mieszanych kultur glejowych rdzenia kręgowego od dorosłych myszy. Krótko mówiąc, rdzenie kręgowe są pobierane od dorosłych myszy i przetwarzane przez trawienie papainą, a następnie usuwane mielinę za pomocą pożywki o gradiencie gęstości. Zawiesiny pojedynczych komórek hoduje się w kompletnym zmodyfikowanym pożywce Eagle (cDMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 2-merkaptoetanolem (2-ME) w temperaturze 35,9 oC. Te warunki hodowli zostały zoptymalizowane specjalnie pod kątem wzrostu mieszanych komórek glejowych. W tych warunkach komórki są gotowe do wykorzystania do eksperymentów między 12 a 14 dni (w tym czasie komórki są zwykle w fazie logarytmicznej) po założeniu hodowli (D 0) i mogą być trzymane w warunkach hodowli do D 21. Ten system hodowli może być wykorzystany do zbadania reakcji komórek glejowych rdzenia kręgowego na stymulację różnymi substancjami i środkami. Oprócz bólu neuropatycznego, system ten może być wykorzystywany do badania odpowiedzi glejowych w innych chorobach, które obejmują patologiczne zmiany komórek glejowych rdzenia kręgowego.

Tę metodę można wykorzystać do przygotowania mieszanych komórek glejowych zarówno z myszy, jak i szczurów. Średnia całkowita liczba komórek na dołek w płytce 12-dołkowej w 12. dniu po zainicjowaniu hodowli powinna być stosunkowo stabilna i wynosić około 100 000 komórek na dołek w przypadku komórek pochodzących z rdzenia kręgowego myszy. Komórki glejowe uzyskane tą metodą mogą być wykorzystane w eksperymentach zaprojektowanych w celu zbadania odpowiedzi glejowej w dorosłym rdzeniu kręgowym...

Rozwój bólu neuropatycznego wiąże się z patologicznymi zmianami komórek glejowych rdzenia kręgowego. Brakuje niezawodnego systemu hodowli glejowej pochodzącego z dorosłej tkanki rdzenia kręgowego i przeznaczonego do badania tych komórek in vitro. Dlatego pokazujemy tutaj, jak ustalić pierwotne mieszane kultury glejowe z tkanki rdzenia kręgowego dorosłej myszy.

Przygotowanie pierwotnych mieszanych kultur glejowych z tkanki rdzenia kręgowego dorosłych myszy

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest utworzenie pierwotnych mieszanych kultur glejowych z rdzeni kręgowego dorosłych myszy do badań in vitro. Metoda ta dostarcza system in vitro do badania roli komórek glejowych w chorobach neurologicznych obejmujących patologiczne zmiany w obrębie rdzenia kręgowego, takich jak ból neuropatyczny i stwardnienie rozsiane. Główną zaletą tej techniki jest to, że kultury glejowe są przygotowywane z rdzenia kręgowego dorosłych myszy, co zapewnia system dokładniej odzwierciedlający warunki in vivo.Procedurę zaprezentuje Jennifer Malon, technik z mojego laboratorium. Pracując w komorze z laminarnym przepływem powietrza do hodowli tkankowych, przenieś cztery rdzenie kręgowe myszy do szalki Petriego z HBSS. Używając sterylnych nożyczek i pęsety, potnij każdy z rdzeni kręgowych na małe kawałki.Następnie przenieść fragmenty do 50 milimetrowej probówki stożkowej zawierającej mieszaninę enzymów papainy i DNAzy. Należy unikać przenoszenia HBSS do mieszaniny enzymatycznej, ponieważ może to doprowadzić do obniżenia aktywności enzymu. Kluczowe jest, aby fragmenty tkanki zostały dobrze strawione w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek.Należy jednak pamięt

preparation-primary-mixed-glial-cultures-from-adult-mouse-spinal-cord

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejszy protokół opisuje metodę otrzymywania prekursorów ograniczeń glejowych (Glial Restricted Precursors) z płodowych rdzeni kręgowych oraz ich utrzymywanie in vitro w celu transplantacji lub badania linii oligodendrocytów.

Wyizolowanie prekursorów ograniczonych do linii glejowej (GRP) od myszy w 13. dniu embrionalnym (E13)

Izolowanie pierwotnych mikroglejów z heterogenicznej populacji komórek mózgu jest niezbędne do zbadania ich roli w warunkach fizjologicznych i patologicznych. Niniejszy protokół opisuje technikę mechanicznej izolacji i mieszanej hodowli komórkowej, która zapewnia wysoką wydajność oraz wysoką czystość żywych, pierwotnych komórek mikrogleju do badań in vitro i dalszych zastosowań.

Izolacja pierwotnych mikroglejów z mieszanych kultur komórek glejowych tkanki mózgu noworodka szczura

Ten film demonstruje szczegółowy protokół izolowania ścian bocznych komór od mózgu dorosłej myszy i przeprowadzania enzymatycznej dysocjacji tkanek w celu uzyskania pojedynczych komórek. Komórki te są następnie poddawane specyficznym warunkom hodowli, które selektywnie zwiększają proliferację nerwowych komórek macierzystych i promują ich różnicowanie w kokultury oligodendrocytów i astrocytów.

Uzyskiwanie mieszanej kultury oligodendrocytów i astrocytów z dorosłych komórek macierzystych nerwowych myszy

Film demonstrował metodę izolowania i hodowli komórek z mózgu noworodka myszy. Polegało to na enzymatycznej i mechanicznej dysocjacji mózgu, a następnie hodowli w pożywkach wzrostowych pozbawionych neuronalnego czynnika wzrostu w celu uzyskania mieszanej populacji glejowej.

Uzyskiwanie mieszanej hodowli komórek glejowych z mózgu noworodka myszy

Ten film demonstruje technikę izolowania i hodowli pierwotnych mieszanych komórek glejowych z tkanki rdzenia kręgowego dorosłej myszy. Protokół obejmuje enzymatyczne trawienie tkanki, a następnie usunięcie uszkodzonych błon komórkowych i resztek mieliny w celu uzyskania populacji pojedynczej komórki. Komórki są następnie hodowane w pożywkach zoptymalizowanych pod kątem wzrostu mieszanych komórek glejowych.

Ustanawianie pierwotnych mieszanych kultur komórek glejowych z rdzenia kręgowego myszy

Przedstawiamy metody efektywnej i szybkiej izolacji/hodowli żywotnego mikrogleju z kory mózgowej noworodka i dorosłego rdzenia kręgowego.  Sekcja i posiew mikrogleju korowego może być przeprowadzona w ciągu 90 minut, a późniejsze zbieranie mikrogleju odbywa się ~ 10 dni po początkowym rozbiorze.

Hodowla mikrogleju z ośrodkowego układu nerwowego noworodków i dorosłych

Tutaj prezentujemy protokół izolacji in vitro wielu populacji komórek glejowych z ośrodkowego układu nerwowego myszy. Metoda ta pozwala na segregację regionalnego mikrogleju, komórek prekursorowych oligodendrocytów i astrocytów w celu zbadania fenotypów każdego z nich w różnych systemach hodowli.

Rozwarstwienie i izolacja mysiego gleju z wielu regionów ośrodkowego układu nerwowego

Mezenchymalne komórki zrębowe pochodzące z tkanki tłuszczowej (AdMSC) mają silne właściwości immunomodulacyjne, przydatne w leczeniu chorób związanych ze stanem zapalnym. Pokazujemy, jak izolować i hodować mysie AdMSC i pierwotny mieszany glej, stymulować AdMSC do zwiększania poziomu genów przeciwzapalnych i czynników wzrostu, oceniać migrację AdMSC i kohodować AdMSC z pierwotnym mieszanym glejem zakażonym prionami.

Mezenchymalne komórki zrębowe pochodzące z tkanki tłuszczowej współhodowane z pierwotnym mieszanym glejem w celu zmniejszenia stanu zapalnego wywołanego prionami

Ten protokół opisuje izolację oczyszczonych astrocytów i mikrogleju z rdzenia kręgowego dorosłej myszy, ułatwiając późniejsze zastosowania, takie jak analiza RNA i hodowla komórek. Zawiera szczegółowe metody i procedury dysocjacji komórek mające na celu poprawę zarówno jakości, jak i wydajności izolowanych komórek.

Izolacja czystych astrocytów i mikrogleju z rdzenia kręgowego dorosłej myszy do testów in vitro i badań transkryptomicznych

Ten protokół opisuje kokulturę mikrogleju i neuronów utworzoną z pierwotnych komórek nerwowych wyizolowanych z embrionalnych zarodków myszy w 15-16 dniach embrionalnych oraz pierwotnego mikrogleju generowanego z mózgów nowonarodzonych myszy w 1-2 dniach po urodzeniu.

Generowanie i kokultura mysich pierwotnych mikrogleju i neuronów korowych

Naucz się przygotowywać pierwotne mieszane kultury glejowe z rdzenia kręgowego dorosłych myszy. Ta metoda umożliwia badanie roli komórek glejowych w chorobach neurologicznych, zwłaszcza w neuropatycznym bólu.

Przygotowanie pierwotnych mieszanych kultur glejowych z tkanki rdzenia kręgowego dorosłych myszy

Przeglądaj więcej filmów