Metoda ekstrakcji pigmentów z kałamarnicy Doryteuthis pealeii

Ogólnym celem tej procedury jest opisanie sposobu ekstrakcji pigmentów znajdujących się w nanostrukturalnych granulkach świeżo wypreparowanych kałamarnic, chromatoforów Doryteuthis pealeii. Głowonogi to złożone zwierzęta morskie, które przechodzą szybkie i adaptacyjne zmiany koloru skóry. i adaptacyjne zmiany ich koloru skóry.

Jednak wciąż jest wiele niewiadomych na temat działania tych systemów. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest ona ukierunkowana na nanostrukturalne granulki w narządzie chromatoforowym. Umożliwi to naukowcom wyjaśnienie mechanizmu zmiany koloru wywodzącego się z nanoskali.

Oprócz wglądu w biologię głowonogów, może on pomóc w projektowaniu systemów syntetycznych zbudowanych w celu naśladowania dynamicznego zakresu adaptacyjnych kolorów wyświetlanych u głowonogów przy użyciu wstępnie zapakowanych pigmentowanych nanocząstek. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie zmagają się z tym, ponieważ zbieranie czystej tkanki chromatoforowej jest trudne ze względu na jej bliskość z otaczającą tkanką. Nasza metoda jest zoptymalizowana pod kątem redukcji tych zanieczyszczeń.

Aby rozpocząć sekcję, najpierw wlej około 250 mililitrów przefiltrowanej wody morskiej do szalki rozwarstwiającej. Umieść próbkę na patelni i za pomocą prostych nożyczek ze stali nierdzewnej, wyciętych od podstawy płaszcza brzusznego wzdłuż tylnej strony zwierzęcia, kończąc w okolicy płetwy. Usuń wszystkie narządy wewnętrzne, delikatnie podnosząc je kleszczami preparacyjnymi i przecinając tkankę łączną nożyczkami.

Wyrzuć narządy do worka na próbki. Za pomocą szpilek do preparowania T, przypnij płetwę płaszcza stroną do góry do podkładki preparcyjnej. Za pomocą kleszczy ostrożnie usuń nieprzezroczystą warstwę naskórka skóry, utrzymując nienaruszoną warstwę skóry zawierającą chromatofor

Wyrzuć warstwę naskórka do worka na próbki. Następnie usuń warstwę chromatoforu. Pokrój tkankę chromatoforu na małe odcinki o wymiarach jeden centymetr na jeden centymetr.

Umieść skrawki w mikroprobówce wirówkowej o pojemności 1,5 mililitra, wypełniając każdą probówkę do połowy wypreparowaną tkanką. Na koniec dodaj do probówek 500 mikrolitrów przefiltrowanej wody morskiej. Aby wyizolować granulki pigmentu, należy najpierw odwirować skrawki tkanki chromatoforu przez pięć minut w temperaturze 14 000 x g.

Wyrzuć wierzchnią warstwę wody morskiej. Dodaj 500 mikrolitrów roztworu kolagenazy papainy do próbek i wiruj przez jedną do dwóch minut na najwyższym ustawieniu. Następnie należy poddać próbki sonikacji przez pięć minut przy częstotliwości 40 kHz, aby oddzielić komórki od otaczającej tkanki.

Wirować przez kolejne pięć minut przy sile 14 000 x g, a następnie odrzucić supernatant. Powtórzyć wirowanie jeszcze dwa razy, za każdym razem odrzucając supernatant. Następnie dodać reparację do kolagenazy.

Użyj kleszczy, aby ręcznie usunąć wszelkie pozostałe duże fragmenty tkanki, które nie zostały strawione przed kontynuowaniem. Czystość wyjściowego roztworu granulek wpływa na ekstrakcję pigmentu. Dlatego ważne jest, aby upewnić się, że wyjściowe materiały chromatoforowe są w pełni strawione.

Stwierdzamy, że skrawki tkanek około jednego centymetra są optymalne do zbierania najczystszej populacji granulek. Przygotować bufor homogenizacyjny, biorąc 150-mililitrową rurkę z nakrętką i dodając odpowiednią ilość HEPES, chlorku magnezu, asparaginianu potasu i ditiotreitolu. Dodać jedną dostępną w handlu mini tabletkę inhibitora proteazy.

Za pomocą cylindra miarowego odmierz 100 ml wody dejonizowanej i dodaj ją do probówki zawierającej sole homogenizacyjne. Wiruj probówkę, aby wymieszać, aż roztwór stanie się klarowny. Odwirować próbki tkanek, a następnie odrzucić supernatant.

Dodaj 500 mikrolitrów buforu homogenizacyjnego do każdej probówki i wiruj przez 2 minuty, aby dokładnie wymieszać. Sonikować próbki przez 30 minut przy 40 kHz. A następnie ponownie je odwirować.

Po odrzuceniu supernatantu powtórzyć dodawanie homogenizacji, sonikację i wirowanie dwa do trzech razy, aby zapewnić całkowite trawienie tkanki zewnątrzkomórkowej. Na koniec probówka powinna zawierać jasnożółty supernatant i czerwoną osadkę składającą się z izolowanych granulek pigmentu. Odrzucić supernatant.

Najpierw przygotuj kwaśny metanol do ekstrakcji w szklanej próbce z zakrętką, dodając 5 ml metanolu i 25 mcL stężonego kwasu solnego. Delikatnie zamieszaj roztwór, aby wymieszać. Odłóż na bok jedną probówkę z próbką, będzie to obróbka granulkami przereagowanymi pod koniec.

Usunąć bufor homogenizacyjny z drugiej probówki zawierającej granulki. Dodaj 500 mcl kwaśnego roztworu metanolu do pozostałych probówek i wiruj przez trzy do czterech minut. Sonikować próbki przez 10 minut przy 40 kHz, a następnie wirować przez pięć minut przy 14000 x g.

Za pomocą mikropipety zebrać supernatant do szklanej fiolki o pojemności jednego grama, z zakręcaną nakrętką. To jest pigment, który powinien mieć ciemnoczerwony kolor. Powtórz etapy dodawania kwaśnego metanolu, sonikacji i wirowania cztery do pięciu razy, zbierając supernatant, aż do momentu, gdy nie zostanie wyekstrahowany dalszy kolor.

Pozostała bezbarwna osadka to granulki wyekstrahowane z pigmentu. Aby przygotować próbki granulek do obrazowania, najpierw odwiruj zarówno nieprzereagowaną porcję granulatu, jak i granulki wyekstrahowane pigmentem przez pięć minut przy 14000 x g, wyrzuć supernatant, a następnie ponownie zawieś każdą granulkę w 1 ml 95% etanolu. Za pomocą pipety transferowej umieść 2-3 krople każdej zawiesiny granulek na oddzielnym aluminiowym króćcu SEM.

Umieścić próbki w eksykatorze do wyschnięcia przez noc w próżni. Napyl kikuty złotą powłoką platynową przez 3 minuty, aby uzyskać powłokę o grubości 15 nanometrów. Zobrazuj próbki za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego.

Następnie za pomocą spektrofotometru należy zebrać profile absorbancji dla nieprzereagowanych granulek, wyekstrahowanych granulek i wyekstrahowanego pigmentu. Wykonaj ślepy pomiar próbek granulek, dodając 1 ml dejonizowanej wody do czystej kuwety. Wyrzuć półfabrykat do pojemnika na odpady.

Następnie dodać zawiesinę zawierającą nieprzereagowane granulki pigmentu do kuwety. Zebrać widma absorpcyjne UV/vis dla próbki granulek. Wykonaj drugi ślepy pomiar wyekstrahowanego pigmentu, używając 1 ml kwaśnego metanolu i czystej kuwety.

Na koniec weź widmo absorpcyjne UV/vis dla pigmentu, a następnie określ maksymalną długość fali każdej próbki. Skaningowa mikroskopia elektronowa wykazała, że proces ekstrakcji pigmentu zmniejsza średnią średnicę granulek. Przed ekstrakcją granulki mają średnią średnicę 527,3 nm.

Po procedurze kwaśnego metanolu wielkość ta znacznie się zmniejsza do około 202,6 nm. Uważa się, że redukcja jest spowodowana ekstrakcją pigmentu. Po dodaniu kwaśnego metanolu kolor związany z nieprzereagowanymi granulkami również widocznie się zmniejsza

Potwierdzenie tej hipotezy uzyskano za pomocą spektrofotometrii. Wykres ten przedstawia szeroki profil absorbancji dla wstępnie wyekstrahowanych granulek i podobnie szeroki, ale niższy profil intensywności dla wstępnie wyekstrahowanych granulek. W przeciwieństwie do tego, rozpuszczalny wyekstrahowany pigment wykazuje lambda max przy około 500 nm i wyraźne ramię przy około 380 nm.

Łącznie dane te sugerują udaną ekstrakcję widocznego koloru z granulek. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w około cztery godziny od początku do końca. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o całkowitym usunięciu tkanki zawierającej odblaskowe płytki krwi, które mogą zakłócać ekstrakcję i analizę.

Tkanka naskórka może również zakłócać etapy homogenizacji i ekstrakcji pigmentu. Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak chromatografia cienkowarstwowa i spektrometria mas, w celu dalszego oczyszczenia pigmentów i scharakteryzowania ich składu. Te kroki mogą pomóc w wyjaśnieniu molekularnego wkładu w ubarwienie u głowonogów.

Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania biologów morskich, chemików i inżynierów, w tym: Jaki jest skład pigmentów używanych podczas zmiany koloru? I w jaki sposób przyczyniają się one do funkcji i struktury nanostrukturalnych granulek w narządach chromatoforu skórnego? Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wydobyć pigment ze świeżo wypreparowanych kałamarnic, chromatoforów doryteuthis pealeii.