Name: Metoda ekstrakcji pigmentów z kałamarnicy Doryteuthis pealeii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Naucz się ekstrakcji pigmentów z chromatoforów kałamarnicy Doryteuthis pealeii. Ta metoda pozwala badać nanostrukturalne mechanizmy zmiany koloru u głowonogów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za korzystanie z obiektów na Uniwersytecie New Hampshire, w tym z University Instrumentation Center. Prace te były wspierane przez Wydział Chemii Uniwersytetu New Hampshire.

Badania na zwierzętach bezkręgowych prowadzone w niniejszym dokumencie nie są regulowane w Stanach Zjednoczonych, dlatego Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystywania nie ma uprawnień do przeglądu takich protokołów. W związku z tym, że badania te nie podlegają jurysdykcji regulacyjnej w Stanach Zjednoczonych, autorzy niniejszym stwierdzają, że badania te zostały przeprowadzone ze szczerym wysiłkiem na rzecz etycznego wykorzystania, opieki i leczenia tych zwierząt, liczba osobników została zminimalizowana i wysiłki te są zgodne z Deklaracją Bazylejską i wytycznymi etycznymi Międzynarodowej Rady Nauk o Zwierzętach Laboratoryjnych (ICLAS).
1. Doryteuthis pealeii (D. pealeii) Sekcja
<ol>
	<li>Kup pozbawioną głowy kałamarnicę D. pealeii w Departamencie Zasobów Morskich w Morskim Laboratorium Biologicznym w Woods Hole, MA lub na dowolnym targu świeżych ryb. Nie należy używać próbek, które zostały filetowane lub wcześniej zmienione w celu zastosowania tej procedury. W szczególności warstwa chromatoforu musi być nadal nienaruszona na próbce.
	<ol>
		<li>Jeśli zwierzęta nie zostaną natychmiast wykorzystane, należy je przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia. Aby rozmrozić próbki, umieść je w wodzie o temperaturze pokojowej na 1 godzinę przed preparacją.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Za pomocą prostych nożyczek do preparowania ze stali nierdzewnej przeciąć wzdłuż tylnej strony zwierzęcia. Zacznij od podstawy płaszcza brzusznego i zakończ w okolicy płetwy.</li>
	<li>Usuń wszystkie narządy wewnętrzne (żołądek, skrzela, gruczoł atramentowy, narządy rozrodcze, serce układowe i serce ramienne), podnosząc je kleszczami preparacyjnymi i przecinając ich tkankę łączną za pomocą nożyczek preparacyjnych. Wyrzuć narządy do worka na próbki.</li>
	<li>Użyj szpilek do preparowania T, aby przypiąć płaszcz (płetwą do góry) w standardowej aluminiowej misce preparacyjnej 11-1/2" x 7-1/2" x 1-1/2" zawierającej elastyczną podkładkę do preparacji. Zanurz tkankę w 250 ml wody morskiej, która została przefiltrowana przez jednorazowy system filtracji próżniowej z polistyrenu o wielkości porów 0,2 μm.</li>
	<li>Ostrożnie usuń warstwę naskórka (nieprzezroczysty kolor) za pomocą kleszczy preparacyjnych, utrzymując nienaruszoną warstwę skóry zawierającą chromatofor. Po usunięciu warstwy naskórka wyrzuć ją do worka na próbki.</li>
	<li>Wyciąć małe (1 cm x 1 cm) odcinki warstwy chromatoforu za pomocą kleszczy i nożyczek preparacyjnych. Pobrać próbki do mikroprobówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml (wypełnić połowę każdej pustej probówki wypreparowaną tkanką).</li>
	<li>Dodać 500 μl przefiltrowanej wody morskiej do probówek zawierających tkankę. Próbki można przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
2. Izolowanie granulek pigmentu chromatoforowego
<ol>
	<li>Trawienie tkankowe
	<ol>
		<li>Przygotowanie papainy/kolagenazy
		<ol>
			<li>Odważ 30 mg kolagenazy i 5 mg papainy za pomocą papieru o wymiarach 4 x 4 cale o niskiej zawartości azotu. Przenieś je do probówki wirówkowej z polipropylenu o pojemności 50 ml z zakrętką.</li>
			<li>Odmierz 10 ml wody dejonizowanej za pomocą pipety miarowej. Dodać bezpośrednio do fiolki zawierającej papainę/kolagenazę. Wiruj na najwyższym ustawieniu, aż roztwór będzie klarowny.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Usuwanie tkanki zewnątrzkomórkowej
		<ol>
			<li>Odwirować zebraną tkankę chromatoforu z kroku 1.7 przez 5 minut przy 14 000 x g. Wyrzuć górną warstwę wody morskiej do plastikowego wiadra na odpady.</li>
			<li>Dodać 500 μl roztworu papainy/kolagenazy do tkanki za pomocą jednokanałowej mikropipety P1000 o zmiennej objętości. Wiruj każdą próbkę przez 1-2 minuty na najwyższym ustawieniu.</li>
			<li>Sonikować próbki przez 5 minut z częstotliwością 40 kHz w celu dysocjacji komórek od otaczającej tkanki.</li>
			<li>Wirować przez 5 minut przy 14 000 x g. Wyrzucić supernatant do plastikowego wiadra na odpady.</li>
			<li>Odwirować zebraną tkankę chromatoforu przez 5 minut przy 14 000 x g. Wyrzuć górną warstwę wody morskiej do plastikowego wiadra na odpady. Powtórz jeszcze raz.</li>
			<li>Ręcznie usuń wszelkie pozostałe duże odcinki tkanki, które nie zostały strawione w tym procesie, za pomocą kleszczy przed przejściem do następnego kroku.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolowanie granulek pigmentu
	<ol>
		<li>Przygotowanie buforu homogenizacyjnego
		<ol>
			<li>Odważyć 2,38 g kwasu (4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanasulfonowego) (HEPES, 100 mM), 0,095 g chlorku magnezu (10 mM), 0,856 g asparaginianu potasu (50 mM) i 0,015 g ditiotreitolu (1 mM). Przenieść do pojemnika z polistyrenu o pojemności 150 ml z zakrętką. Dodaj jedną komercyjną mini tabletkę inhibitora proteazy.</li>
			<li>Odmierz 100 ml wody dejonizowanej za pomocą cylindra z podziałką. Dodać bezpośrednio do pojemnika zawierającego sole homogenizacyjne. Wirować, aż roztwór będzie klarowny.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Homogenizacja granulek pigmentu
		<ol>
			<li>Odwirować każdą próbkę z etapu 2.1 przy 14 000 x g przez 5 minut. Wyrzucić sklarowany osad do plastikowego pojemnika na odpady. Ta próbka powinna być pozbawiona tkanki zewnątrzkomórkowej.</li>
			<li>Dodać 500 μl buforu homogenizacyjnego do każdej probówki i wirować przez 1-2 minuty każda, aby dokładnie wymieszać próbki. Sonikować próbki przez 30 minut (~40 kHz), a następnie przez 5 minut wirować przy 14 000 x g.</li>
			<li>Wyrzuć sklarowany osad do plastikowego pojemnika na odpady i powtórz poprzedni krok 2-3 razy, aby zapewnić całkowite roztrawienie woreczka chromatoforowego i pęt białkowych. Pozostały roztwór powinien zawierać jasnożółty supernatant i czerwoną osadkę zawierającą izolowane granulki pigmentu.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Ekstrakcja pigmentu
<ol>
	<li>Otrzymywanie metanolu kwaśnego (HCl-MeOH)
	<ol>
		<li>Ostrożnie dodać 25 μl stężonego (36,5–38 % (m/w)) kwasu solnego (HCl) do 5 ml metanolu (MeOH). Roztwór HCl-MeOH należy przechowywać w szklanej fiolce na próbkę z zakręcaną nakrętką. Delikatnie zamieszać, aby równomiernie wymieszać roztwór. 
		UWAGA: Im bardziej kwaśny roztwór, tym więcej pigmentu zostanie wyekstrahowane podczas pierwszej ekstrakcji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekstrakcja pigmentu
	<ol>
		<li>Odwirować zawiesinę granulek pigmentu (z ppkt 2.2.2) przez 5 minut przy 14 000 x g i wyrzucić supernatant do plastikowego pojemnika na odpady.</li>
		<li>Dodać 500 μl roztworu HCl-MeOH i wirować każdą próbkę przez ~3-4 min. Sonikować próbki przez 10 min (~40 kHz), a następnie wirować przez 5 min przy 14 000 x g.</li>
		<li>Za pomocą pipety transferowej zebrać supernatant do szklanej fiolki o pojemności 1 grama, z zakręcaną nakrętką. Supernatant powinien mieć kolor ciemnoczerwony.</li>
		<li>Powtórz etap ekstrakcji 3.2.2, aż nie zostanie usunięty dalszy kolor (~4-5 prań). 
		UWAGA: Każda ekstrakcja da ~1,5 ml pigmentu. Pozostała bezbarwna osadka to granulki wyekstrahowane z pigmentu. UWAGA: Zarówno bezbarwne granulki, jak i wyekstrahowane pigmenty można przechowywać w wodzie o temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Charakterystyka w całym procesie ekstrakcji
<ol>
	<li>Skaningowa mikroskopia elektronowa
	<ol>
		<li>Zobrazować granulki (nieprzereagowane z kroku 2.2.1 i ekstrahowane pigmentem z kroku 3.2.3) za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) w celu sprawdzenia czystości procesu ekstrakcji.</li>
		<li>Aby przygotować próbki granulek do obrazowania, najpierw odwiruj zarówno nieprzereagowane granulki, jak i granulki ekstrahowane pigmentem przez 5 minut przy 14 000 x g, a następnie wyrzuć supernatant do plastikowego wiadra na odpady. Ponownie zawiesić je w 1 ml etanolu i nanieść 2-3 krople zawiesiny granulatu na aluminiowe króćce SEM za pomocą pipety transferowej.</li>
		<li>Po wysuszeniu próbek przez noc, napylać powłokę złoto-platynową przez 3 minuty, aby uzyskać powłokę o długości 15 nm.</li>
		<li>Obraz za pomocą SEM z emiterem Schottky'ego i wtórnym detektorem elektronów. Do obrazowania tych materiałów należy użyć napięcia wiązki 5-7 kV i odległości roboczej od 8 do 9 mm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiary spektrofotometryczne w ultrafiolecie widzialnym (UV-vis)
	<ol>
		<li>Monitorować profile absorbancji dla wszystkich 3 warunków (nieprzereagowany granulat z 2.2.2, wyekstrahowany pigment z 3.2.3 i granulki ekstrahowane pigmentem z 3.2.4) za pomocą spektrofotometru dwuwiązkowego od 200-800 nm.</li>
		<li>Zebrać ślepą próbę pomiaru za pomocą wody dejonizowanej w kuwecie o pojemności 1 ml dla nieprzereagowanych granulek i granulek wyekstrahowanych pigmentem. Zebrać widma absorpcyjne UV-VIS dla obu próbek.</li>
		<li>Pobrać ślepą próbę przy użyciu kwaśnego roztworu metanolu w kuwecie o pojemności 1 ml dla wyekstrahowanego pigmentu. Pobrać widmo absorpcyjne UV-VIS dla próbki.</li>
		<li>Określić maksymalną długość fali każdej próbki, określając długość fali, przy której pik absorbancji osiąga maksymalną wysokość względną.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Bell, G. R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatophore+radial+muscle+fibers+anchor+in+flexible+squid+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Invertebr+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromatophore radial muscle fibers anchor in flexible squid skin.</a> Invertebr Biol. 132 (2), 120-132 (2013).</li>
<li>Crookes, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reflectins%3A+The+unusual+proteins+of+squid+reflective+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reflectins: The unusual proteins of squid reflective tissues.</a> Science. 303 (5655), 235-238 (2004).</li>
<li>Deravi, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure-function+relationships+of+a+natural+nanoscale+photonic+device+in+cuttlefish+chromatophores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">The structure-function relationships of a natural nanoscale photonic device in cuttlefish chromatophores.</a> J. R. Soc. Interface. 11 (93), 1-9 (2014).</li>
<li>Mäthger, L. M., Denton, E. J., Marshall, N. J., Hanlon, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+behavioural+functions+of+structural+coloration+in+cephalopods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and behavioural functions of structural coloration in cephalopods.</a> J. R. Soc. Interface. 6 (2), 149-163 (2009).</li>
<li>Mäthger, L. M., Hanlon, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+basis+for+camouflaged+polarized+light+communication+in+squid%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Anatomical basis for camouflaged polarized light communication in squid.</a> Biol. Lett. 2 (4), 494-496 (2006).</li>
<li>Mäthger, L. M., Hanlon, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malleable+skin+coloration+in+cephalopods%3A+selective+reflectance%2C+transmission+and+absorbance+of+light+by+chromatophores+and+iridophores%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Malleable skin coloration in cephalopods: selective reflectance, transmission and absorbance of light by chromatophores and iridophores.</a> Cell Tissue Res. 329 (1), 179-186 (2007).</li>
<li>Cloney, R. A., Brocco, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatophore+Organs%2C+Reflector+Cells%2C+Iridocytes+and+Leucophores+in+Cephalopods%5BTitle%5D)+AND+%22Amer.+Zool%22%5BJournal%5D)">Chromatophore Organs, Reflector Cells, Iridocytes and Leucophores in Cephalopods.</a> Amer. Zool. 23 (3), 581-592 (1983).</li>
<li>Hanlon, R. T., Messenger, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+coloration+in+young+cutttlefish+%28Sepia+officinalis+L%29-+The+morphology+and+development+of+body+patterns+and+their+relation+to+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Adaptive coloration in young cutttlefish (Sepia officinalis L)- The morphology and development of body patterns and their relation to behaviour.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 320 (1200), 437-487 (1988).</li>
<li>Sutherland, R. L., Mäthger, L. M., Hanlon, R. T., Urbas, A. M., Stone, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cephalopod+coloration+model.+II.+Multiple+layer+skin+effects%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Opt.+Soc.+Am%22%5BJournal%5D)">Cephalopod coloration model. II. Multiple layer skin effects.</a> J. Opt. Soc. Am. 25 (8), 2044-2054 (2008).</li>
<li>Florey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+and+function+of+cephalopod+chromatophores%5BTitle%5D)+AND+%22Amer.+Zool%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure and function of cephalopod chromatophores.</a> Amer. Zool. 9 (2), 429-442 (1969).</li>
<li>Florey, E., Kriebel, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+and+mechanical+responses+of+chromatophore+muscle+fibers+of+squid%2C+Loligo+opalescens%2C+to+nerve+stimulation+and+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Z.+Vergl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Electrical and mechanical responses of chromatophore muscle fibers of squid, Loligo opalescens, to nerve stimulation and drugs.</a> Z. Vergl. Physiol. 65 (1), 98-130 (1969).</li>
<li>Williams, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+Phenoxazone-Based+Pigments+to+the+Structure+and+Function+of+Nanostructured+Granules+in+Squid+Chromatophores%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Contributions of Phenoxazone-Based Pigments to the Structure and Function of Nanostructured Granules in Squid Chromatophores.</a> Langmuir. , (2016).</li>
<li>Nijhout, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ommochrome+pigmentation+of+the+linea+and+rosa+seasonal+forms+of+Precis+coenia+%28Lepidoptera%3A+Nymphalidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Insect.+Biochem.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ommochrome pigmentation of the linea and rosa seasonal forms of Precis coenia (Lepidoptera: Nymphalidae).</a> Arch. Insect. Biochem. Physiol. 36 (3), 215-222 (1997).</li>
<li>Van Den Branden, C., Decleir, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Study+of+the+Chromatophore+Pigments+in+the+Skin+of+the+Cephalopod+Sepia+Officinalis%5BTitle%5D)+AND+%22L.+Biol.+Jb.+Dodonaea%22%5BJournal%5D)">A Study of the Chromatophore Pigments in the Skin of the Cephalopod Sepia Officinalis.</a> L. Biol. Jb. Dodonaea. 44 (2), 345-352 (1976).</li>
<li>Aubourg, S., Torres-Arreola, W., Trigo, M., Ezquerra-Brauer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Jumbo+Squid+Skin+Pigment+Extract+and+its+Antioxidant+Potential+ina+Marine+Oil+System%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Lipid+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Characterization of Jumbo Squid Skin Pigment Extract and its Antioxidant Potential ina Marine Oil System.</a> Eur. J. Lipid Sci. Technol. 118 (0), (2016).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Pokazaliśmy metodę ekstrakcji pigmentów z granulek chromatoforu kałamarnicy. Poprzez ukierunkowanie na granulki, naszym celem jest określenie ich roli w pośredniczeniu w adaptacyjnym ubarwieniu. Metoda ta różni się od poprzednich doniesień mających na celu scharakteryzowanie pigmentów głowonogów przy użyciu próbek tkanek14 lub liofilizowanej skóry15.
Chociaż protokół ten jest skuteczny w ekstrakcji pigmentów chromatoforowych, jest ograniczony do małych skal reakcji. Rozbi...

Głowonogi, takie jak kałamarnice, mątwy i ośmiornice, mają zdolność dynamicznej zmiany swojego wyglądu w celu kamuflażu i sygnalizacji. 1-6 Zdolność ta jest częściowo wspierana przez selektywną ekspansję powierzchniową pigmentowanych narządów znanych jako chromatofory. 4,7-9 Chromatofory to miękkie siłowniki, które zawierają sieć nanostrukturalnych granulek pigmentu zamkniętych w cytoelastycznym woreczku, który jest zakotwiczony promieniowo przez włókna mięśniowe. 1,3 Po uruchomieniu chromatofory rozszerzają się o 500% na przedstawionej powierzchni, rozprowadzając granulki w całym narządzie. 3,7,10,11 Gdy to działanie jest skoordynowane przez kilka chromatoforów, ogólne ubarwienie zwierzęcia ulega zmianie. Chociaż wiadomo, że granulki pigmentu przyczyniają się do tej zmiany koloru, ich skład pozostaje nieznany. Opisujemy procedurę izolacji i oczyszczania pigmentów chromatoforowych, która może być dostosowana do przyszłych badań kompozycyjnych.
Izolacja granulek pigmentu obejmuje wieloetapową procedurę ekstrakcji, homogenizacji i oczyszczania. 3,12 Tkanka zawierająca chromatofor jest pobierana poprzez staranne wytępienie z głowonoga. Następnie stosuje się proces trawienia i homogenizacji w celu dysocjacji otaczającej tkanki i oddzielenia komórek chromatoforu. Nanostrukturalne granulki są następnie izolowane i oczyszczane z pozostałych chromatoforów za pomocą wielokrotnej sonikacji i wirowania. Po oczyszczeniu pigmenty są ekstrahowane z granulek w procesie, który jest dostosowany do ekstrakcji widocznego koloru ze skrzydeł motyla za pomocą kwaśnych roztworów metanolu. 13 Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) i spektrofotometria są stosowane w celu potwierdzenia, że pigmenty chromatoforowe zostały pomyślnie wyekstrahowane w tym procesie.
Ta metoda opisuje izolację granulek chromatoforu, która jest używana do badania molekularnego wkładu w ubarwienie u głowonogów. 12 Ekstrakcja małych cząsteczek z całych zwierząt często bywa długim i żmudnym procesem. Celem jest poinformowanie przyszłych badaczy o skutecznym i łatwym w obsłudze protokole pozyskiwania pigmentów z nanostrukturalnych granulek u głowonogów.

<table><tbody><tr><td>Kolagenaza</td><td>Alfa Aesar</td><td>9001-12-1</td><td>Brak zagrożenia</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3482-12-3</td><td>Działa drażniąco, ostra toksyczność</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7365-45-9</td><td>Łagodny środek drażniący</td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>EMD Chemicals</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>k-asparaginian</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1115-63-5</td><td>Reaguje gwałtownie z utleniaczami</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7786-30-3</td><td>Łagodny środek drażniący oczy</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>67-56-1</td><td>Wysoce łatwopalny</td></tr><tr><td>inhibitor środka w mini tabletkach</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>469315-90-01</td><td>Działa żrąco na metal i skórę</td></tr><tr><td>Papaina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9001-73-4</td><td>Działa drażniąco&nbsp;</td></tr></tbody></table>

metoda ekstrakcji pigmentów z kałamarnicy doryteuthis pealeii

A Method for Extracting Pigments from Squid Doryteuthis pealeii

Głowonogi mogą ulegać szybkim i adaptacyjnym zmianom w ubarwieniu skóry w celach wyczuwania, komunikacji, obrony i reprodukcji. Zdolności te są częściowo wspierane przez powierzchniowe rozszerzanie i cofanie pigmentowanych narządów znanych jako chromatofory. Chociaż wiadomo, że chromatofory zawierają na uwięzi sieć pigmentowanych granulek, ich właściwości strukturalno-funkcjonalne nie zostały w pełni szczegółowe. Opisujemy metodę izolowania nanostrukturalnych granulek w chromatoforach kałamarnicy Doryteuthis pealeii i pokazujemy, w jaki sposób związane z nimi pigmenty można ekstrahować w kwaśnych rozpuszczalnikach. Aby to osiągnąć, warstwa skórna zawierająca chromatofor jest najpierw ręcznie izolowana za pomocą powierzchownej sekcji, a granulki pigmentu są usuwane za pomocą cykli sonikacji, wirowania i mycia. Pigmenty zamknięte w oczyszczonych granulkach są następnie ekstrahowane za pomocą kwaśnych roztworów metanolu, pozostawiając nanostruktury o mniejszych średnicach, które są pozbawione widocznego koloru. Ta procedura ekstrakcji daje 58% wydajności rozpuszczalnych pigmentów wyizolowanych z granulek. Za pomocą tej metody można określić skład pigmentów chromatoforowych i wykorzystać je do uzyskania wglądu w mechanizm adaptacyjnego ubarwienia u głowonogów.

Chromatofory są wycinane z grzbietowej części płaszcza D. pealeii (Rysunek 1A, 1B). Po usunięciu chromatofory są lizowane i oczyszczane za pomocą cykli wirowania i przemywania w celu wyizolowania pigmentowych ziarnistości (Rysunki 2A, 2B). Do ekstrakcji pigmentu z ziarnistości stosuje się kwaśne roztwory metanolu (HCl-MeOH) (Rysunek 2C), co pozwala na uzyskanie rozpuszczalnego ekstraktu pigmentow...

Przedstawiono protokół ekstrakcji pigmentów z nanostrukturalnych granulek w chromatoforach kałamarnicy Doryteuthis pealeii.

Metoda ekstrakcji pigmentów z kałamarnicy Doryteuthis pealeii

Cephalopods can undergo rapid and adaptive changes in dermal coloration for sensing, communication, defense, and reproduction purposes. These capabilities ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest opisanie sposobu ekstrakcji pigmentów znajdujących się w nanostrukturalnych ziarnistościach chromatoforów świeżo wypreparowanych mątw squid, Doryteuthis pealeii. Głowonogi to złożone zwierzęta morskie, które podlegają szybkim i adaptacyjnym zmianom zabarwienia skóry.Nadal jednak wiele pozostaje nieznane w kwestii działania tych systemów. Główną zaletą tej techniki jest to, że specyficznie celuje ona w nanostrukturalne granulki w organie chromatoforowym. Pozwoli to badaczom wyjaśnić mechanizm zmiany barwy zapoczątkowanej w skali nano.Oprócz wglądu w biologię głowonogów, może to pomóc w projektowaniu syntetycznych systemów stworzonych do naśladowania dynamicznego zakresu adaptacyjnej zmiany barw obserwowanego u głowonogów, przy użyciu gotowych pigmentowanych nanocząsteczek. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ pobranie czystej tkanki chromatoforów jest utrudnione ze względu na jej bliskość względem tkanek otaczających. Nasza metoda została zoptymalizowana w celu ograniczenia tych zanieczyszczeń.Aby rozpocząć sekcję, najpierw wlej około 250 mililitrów filtrowanej wody morskiej do kuwety sekcyjnej. Umieść okaz w kuwecie i za pomocą stalowych prostych nożyczek z cienkim czubkiem wykonaj cięcie od podstawy płaszcza brzusznego wzdłuż tylnej strony zwierzęcia, kończąc w okolicy płetwy. Usuń wszystkie organy wewnętrzne, delikatnie podnosząc je pęsetą sekcyjną i przecinając tkankę łączną za pomocą nożyczek.Przenieś organy do worka na odpady biologiczne. Za pomocą szpilek T do sekcji przyprzypnij płaszcz stroną z płetwą do góry do podkładki sekcyjnej. Przy użyciu pęsety ostrożnie usuń nieprzezroczystą warstwę naskórka, pozostawiając nienaruszoną warstwę skóry zawierającą chromatofory.Warstwę naskórka należy wyrzucić do worka na próbki. Następnie usuń warstwę chromatoforów. Tkankę chromatoforową potnij na małe fragmenty o wymiarach 1 cm na 1 cm.Przenieś sekcje do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml, wypełniając każdą z nich w połowie wypreparowaną tkanką. Na koniec dodaj do probówek 500 µl przefiltrowanej wody morskiej. Aby wyizolować ziarna pigmentu, najpierw odwiruj sekcje tkanki chromatoforów przez pięć minut przy 14 000 ×g.Odlej wierzchnią warstwę wody morskiej. Dodaj 500 µL roztworu kolagenazy z papainą do próbek i mieszaj w wortexie przez jedną do dwóch minut na najwyższym ustawieniu. Następnie poddaj próbki sonikacji przez pięć minut przy 40 kHz, aby oddzielić komórki od otaczającej tkanki.Wiruj próbkę przez kolejne pięć minut przy 14 000 × g, a następnie odlej nadsącz. Powtórz wirowanie jeszcze dwa razy, za każdym razem usuwając nadsącz. Następnie dodaj zawiesinę w kolagenazie.Przed kontynuacją użyć pęsety, aby ręcznie usunąć wszelkie pozostałe duże fragmenty tkanki, które nie uległy strawieniu. Czystość początkowego roztworu granulek wpływa na ekstrakcję pigmentu, dlatego ważne jest zapewnienie pełnego strawienia materiałów chromatoforowych.Ustalono, że wycinki tkanek o rozmiarze około jednego centymetra są optymalne do pobrania najczystszej populacji granulek. Przygotować bufor do homogenizacji, biorąc probówkę z zakrętką o pojemności 150 mililitrów i dodając odpowiednią ilość HEPES, chlorku magnezu, aspartynianu potasu oraz ditiotreitolu. Dodać jedną komercyjną tabletkę inhibitora proteaz w wersji mini.Za pomocą cylindra miarowego odmierz 100ml wody dejonizowanej i dodaj ją do probówki zawierającej sole do homogenizacji. Mieszaj zawartość probówki na wirówce typu vortex aż do uzyskania klarownego roztworu. Odwiruj próbki tkanek, a następnie odlej supernatant.Do każdej probówki należy dodać 500 µL buforu do homogenizacji i mieszać w vorteksie przez 2 minuty do całkowitego wymieszania. Próbki należy poddać sonikacji przez 30 minut przy częstotliwości 40kHz, a następnie ponownie je odwirować.Po odlaniu supernatantu należy powtórzyć dodawanie homogenizatora, sonikację oraz wirowanie dwa do trzech razy, aby zapewnić całkowity rozkład tkanki pozakomórkowej. Ostatecznie w probówce powinien znajdować się jasnożółty supernatant oraz czerwony osad składający się z wyizolowanych granulek pigmentu. Odlać supernatant.W pierwszej kolejności należy przygotować kwaśny metanol do ekstrakcji w szklanej probówce z nakrętką, dodając 5ml metanolu i 25mcL stężonego kwasu solnego. Delikatnie zamieszać roztwór. Odstawić jedną probkę, która posłuży jako grupa kontrolna dla granulek po zakończeniu reakcji.Usuń bufor homogenizacyjny z drugiej probówki zawierającej granulaty. Dodaj 500mcL kwaśnego roztworu metanolu do pozostałych probówek i mieszaj w wstrząsarzu vortex przez trzy do czterech minut. Poddaj próbki sonikacji przez 10 minut przy 40kHz, a następnie odwiruj przez pięć minut przy 14000 x g.Za pomocą mikropipety należy zebrać nadsącz do szklanej fiolki z zakrętką o pojemności jednego drama. Jest to pigment, który powinien mieć ciemnoczerwony kolor. Powtórzyć etapy dodawania kwaśnego metanolu, sonikacji i wirowania od czterech do pięciu razy, zbierając nadsącz do momentu, aż nie będzie już ekstrahowany żaden dodatkowy barwnik.Pozostały bezbarwny osad stanowi granule z wyekstrahowanym pigmentem. Aby przygotować próbki granul do obrazowania, najpierw odwiruj zarówno alikwot granul nieprzereagowanych, jak i granule z wyekstrahowanym pigmentem przez pięć minut przy 14000 x g, odlej nadsącz, a następnie zawieś każdy osad w 1ml 95% etanolu. Za pomocą pipety transferowej nanieś 2-3 krople każdej zawiesiny granul na oddzielny aluminiowy uchwyt SEM.Umieścić próbki w eksykatorki w celu wysuszenia przez noc w próżni. Napylić na podstawki warstwę złota i platyny przez 3 minuty, aby uzyskać powłokę o grubości 15 nanometer. Wykonać obrazy próbek przy użyciu skaningowego mikroskopu elektronowego.Następnie należy użyć spektrofotometru do zebrania profili absorbancji dla nieprzereagowanych granulek, granulek po ekstrakcji oraz wyekstrahowanego pigmentu. Pomiar tła dla próbek granulek należy wykonać, dodając 1ml wody dejonizowanej do czystej kuwety. Próbkę tła należy przelać do pojemnika na odpady.Następnie do kuwety należy dodać zawiesinę zawierającą nieprzereagowane granulaty pigmentu. Należy zarejestrować widma absorpcji UV-vis dla próbki granulatu. Wykonać drugi pomiar tła dla ekstrahowanego pigmentu, używając 1mL kwaśnego metanolu i czystej kuwety.Na koniec wykonaj widmo absorpcyjne UV-vis dla pigmentu, a następnie wyznacz maksymalną długość fali dla każdej próbki. Skaningowa mikroskopia elektronowa wykazała, że proces ekstrakcji pigmentu zmniejsza średnicę granulek. Przed ekstrakcją granulki mają średnią średnicę 527.3nm.Po zastosowaniu procedury z kwasowym metanolem rozmiar ten znacznie maleje, osiągając około 202,6 nm. Redukcja ta jest prawdopodobnie wynikiem ekstrakcji pigmentu. Po dodaniu kwasowego metanolu kolor związany z niereagującymi ziarnami również wyraźnie zanika.Potwierdzenie tej hipotezy uzyskano za pomocą spektrofotometrii. Wykres ten przedstawia szeroki profil absorbancji dla granul przed ekstrakcją oraz podobnie szeroki, lecz o niższej intensywności profil dla granul po ekstrakcji. W przeciwieństwie do nich, rozpuszczalny wyekstrahowany pigment wykazuje lambda max w okolicy 500nm oraz wyraźne ramię w okolicy 380nm.Wszystkie te dane sugerują pomyślną ekstrakcję widocznego koloru z granulek. Po opanowaniu ta technika może zostać wykonana w około cztery godziny od początku do końca. Podczas próby przeprowadzenia tej procedury należy pamiętać o całkowitym usunięciu tkanki zawierającej odblaskowe płytki białkowe, które mogą zakłócać ekstrakcję i analizę.Tkanka naskórka może również zakłócać etapy homogenizacji oraz ekstrakcję pigmentów. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak chromatografia cienkowarstwowa i spektrometria mas, aby dalej oczyścić pigmenty i scharakteryzować ich skład. Kroki te mogą pomóc w wyjaśnieniu wkładu molekularnego w zabarwienie głowonogów.Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania stawiane przez biologów morskich, chemików i inżynierów, takie jak: Jaki jest skład pigmentów wykorzystywanych podczas zmiany barwy? W jaki sposób wpływają one na funkcję i strukturę nanostrukturalnych granulek w obrębie skórnych organów chromatoforowych? Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak wyizolować pigment z chromatoforów świeżo wypreparowanych kalmarów Doryteuthis pealeii.

a-method-for-extracting-pigments-from-squid-doryteuthis-pealeii

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszym filmie zaprezentowano sposób pozyskiwania hemocytów (komórek krwi) z hawajskiej mątwy, Euprymna scolopes, do wykorzystania w badaniach biologii komórki oraz testach adhezji bakteryjnej. Hemocyty zostaną zabarwione barwnikiem fluorescencyjnym i poddane działaniu bakterii znakowanych GFP.

Pozyskiwanie hemocytów z hawajskiej mątwy Euprymna scolopes i obserwacja ich przylegania do bakterii symbiotycznych i niesymbiotycznych

Ten protokół szczegółowo opisuje odtwarzanie kompleksów zbierających światło in vitro. Te integralne białka błonowe koordynują chlorofile i karotenoidy i są odpowiedzialne za zbieranie światła w roślinach wyższych i zielonych algach.

In vitro Rekonstytucja kompleksów roślin i zielonych alg zbierających światło

Ten artykuł opisuje protokół oczyszczania fragmentów zewnętrznych segmentów fotoreceptorów (POS) poprzez ultrawirowanie z siatkówki świni/bydła przy użyciu homogenizacji i wirowania w gradionym smaku sacharozy. Protokół ten pozwala na przygotowanie dużych zapasów porcji POS, oznakowanych lub nieoznakowanych, które mogą być następnie przechowywane w temperaturze -80 °C.

Oczyszczanie na dużą skalę zewnętrznych segmentów fotoreceptorów świń lub bydła do oznaczania fagocytozy na komórkach nabłonka barwnikowego siatkówki

Ten test biologiczny wykorzystuje model drapieżnej ryby do oceny obecności metabolitów odstraszających od karmienia z organicznych ekstraktów tkanek organizmów morskich w naturalnych stężeniach przy użyciu porównywalnej pod względem odżywczym matrycy pokarmowej.

Laboratoryjny test biologiczny żywiący się rybami w celu oceny aktywności przeciwdrapieżnej metabolitów wtórnych z tkanek organizmów morskich

Ten manuskrypt opisuje prostą i wysokoprzepustową metodę łączenia rozpuszczalnych w wodzie białek z hydrofobowymi pigmentami, która opiera się na emulsjach typu woda w oleju. Wykazano skuteczność metody w łączeniu natywnych chlorofili z czterema wariantami rekombinowanych rozpuszczalnych w wodzie białek wiążących chlorofil (WSCP) roślin kapustnych ulegających ekspresji w E. coli.

Emulsje typu woda w oleju: nowy system łączenia rozpuszczalnych w wodzie białek wiążących chlorofil z pigmentami hydrofobowymi

Ta praca przedstawia metodę szybkiego i precyzyjnego ilościowego określenia pigmentacji brzucha Drosophila melanogaster za pomocą cyfrowej analizy obrazu. Metoda ta usprawnia procedury między akwizycją fenotypu a analizą danych i obejmuje montowanie próbek, akwizycję obrazu, ekstrakcję wartości pikseli i pomiar cech.

Kwantyfikacja pigmentacji jamy brzusznej u Drosophila melanogaster

Tutaj prezentujemy protokół izolacji białek wiążących chlorofil a/c (FCP) z okrzemek i włączenia ich do liposomów o naturalnym składzie lipidowym w celu zbadania transferu energii wzbudzenia po zmianie składu jonów.

Izolowanie i włączanie anten zbierających światło z okrzemki Cyclotella Meneghiniana w liposomach z lipidami tylakoidowymi

Doliolidy, w tym gatunek Dolioletta gegenbauri, to mały, galaretowaty zooplankton morski o znaczeniu ekologicznym, występujący na produktywnych systemach szelfu subkontynentalnego na całym świecie. Trudność w hodowli tych delikatnych organizmów ogranicza ich badania. W tym badaniu opisujemy podejścia do uprawy w celu zbierania, hodowli i utrzymania doliolid Dolioletta gegenbauri.

Uprawa osłonicy morskiej pelagicznej Dolioletta gegenbauri (Uljanin 1884) do badań eksperymentalnych

Regulatory funkcji melanocytów regulują widoczne różnice w wyniku pigmentacji. Rozszyfrowanie funkcji molekularnej genu kandydującego na pigmentację stanowi wyzwanie. W niniejszym artykule demonstrujemy wykorzystanie systemu modelowego danio pręgowanego do identyfikacji kandydatów i klasyfikowania ich jako regulatorów zawartości melaniny i liczby melanocytów.

Odwrotne podejście genetyczne do identyfikacji regulatorów pigmentacji przy użyciu danio pręgowanego

Przedstawiamy protokół do elektrofizjologicznego charakterystyki bistabilnych fotopigmentów: (i) wykorzystanie przemieszczeń ładunku w cząsteczkach fotopigmentu po absorpcji fotonów i ich ogromnej ilości w fotoreceptorach, oraz (ii) wykorzystanie różnic w widmach absorpcyjnych rodopsyny i metarodopsyny. Protokoły te są przydatne do badań przesiewowych pod kątem mutacji wpływających na bistabilne systemy fotopigmentowe.

Elektrofizjologiczne metody pomiaru poziomu fotopigmentu w fotoreceptorach Drosophila

Tutaj opisujemy kilka protokołów mających na celu zintegrowaną waloryzację Gracilaria gracilis: zbiór dzikich gatunków, hodowla we własnym zakresie i ekstrakcja składników bioaktywnych. Oceniane jest działanie przeciwutleniające, przeciwbakteryjne i cytotoksyczne ekstraktów, a także ocena wartości odżywczej i stabilności żywności wzbogaconej o całą biomasę wodorostów i pigmenty.

Waloryzacja wodorostów czerwonych Gracilaria gracilis za pomocą podejścia biorafineryjnego

Naucz się ekstrakcji pigmentów z chromatoforów kałamarnicy Doryteuthis pealeii. Ta metoda pozwala badać nanostrukturalne mechanizmy zmiany koloru u głowonogów.

Metoda ekstrakcji pigmentów z kałamarnicy Doryteuthis pealeii

Przeglądaj więcej filmów