Name: Metoda ekstrakcji pigmentów z kałamarnicy Doryteuthis pealeii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Naucz się ekstrakcji pigmentów z chromatoforów kałamarnicy Doryteuthis pealeii. Ta metoda pozwala badać nanostrukturalne mechanizmy zmiany koloru u głowonogów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy dziękują za korzystanie z obiektów na Uniwersytecie New Hampshire, w tym z University Instrumentation Center. Prace te były wspierane przez Wydział Chemii Uniwersytetu New Hampshire.

Badania na zwierzętach bezkręgowych prowadzone w niniejszym dokumencie nie są regulowane w Stanach Zjednoczonych, dlatego Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystywania nie ma uprawnień do przeglądu takich protokołów. W związku z tym, że badania te nie podlegają jurysdykcji regulacyjnej w Stanach Zjednoczonych, autorzy niniejszym stwierdzają, że badania te zostały przeprowadzone ze szczerym wysiłkiem na rzecz etycznego wykorzystania, opieki i leczenia tych zwierząt, liczba osobników została zminimalizowana i wysiłki te są zgodne z Deklaracją Bazylejską i wytycznymi etycznymi Międzynarodowej Rady Nauk o Zwierzętach Laboratoryjnych (ICLAS).
1. Doryteuthis pealeii (D. pealeii) Sekcja
<ol>
	<li>Kup pozbawioną głowy kałamarnicę D. pealeii w Departamencie Zasobów Morskich w Morskim Laboratorium Biologicznym w Woods Hole, MA lub na dowolnym targu świeżych ryb. Nie należy używać próbek, które zostały filetowane lub wcześniej zmienione w celu zastosowania tej procedury. W szczególności warstwa chromatoforu musi być nadal nienaruszona na próbce.
	<ol>
		<li>Jeśli zwierzęta nie zostaną natychmiast wykorzystane, należy je przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia. Aby rozmrozić próbki, umieść je w wodzie o temperaturze pokojowej na 1 godzinę przed preparacją.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Za pomocą prostych nożyczek do preparowania ze stali nierdzewnej przeciąć wzdłuż tylnej strony zwierzęcia. Zacznij od podstawy płaszcza brzusznego i zakończ w okolicy płetwy.</li>
	<li>Usuń wszystkie narządy wewnętrzne (żołądek, skrzela, gruczoł atramentowy, narządy rozrodcze, serce układowe i serce ramienne), podnosząc je kleszczami preparacyjnymi i przecinając ich tkankę łączną za pomocą nożyczek preparacyjnych. Wyrzuć narządy do worka na próbki.</li>
	<li>Użyj szpilek do preparowania T, aby przypiąć płaszcz (płetwą do góry) w standardowej aluminiowej misce preparacyjnej 11-1/2" x 7-1/2" x 1-1/2" zawierającej elastyczną podkładkę do preparacji. Zanurz tkankę w 250 ml wody morskiej, która została przefiltrowana przez jednorazowy system filtracji próżniowej z polistyrenu o wielkości porów 0,2 μm.</li>
	<li>Ostrożnie usuń warstwę naskórka (nieprzezroczysty kolor) za pomocą kleszczy preparacyjnych, utrzymując nienaruszoną warstwę skóry zawierającą chromatofor. Po usunięciu warstwy naskórka wyrzuć ją do worka na próbki.</li>
	<li>Wyciąć małe (1 cm x 1 cm) odcinki warstwy chromatoforu za pomocą kleszczy i nożyczek preparacyjnych. Pobrać próbki do mikroprobówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml (wypełnić połowę każdej pustej probówki wypreparowaną tkanką).</li>
	<li>Dodać 500 μl przefiltrowanej wody morskiej do probówek zawierających tkankę. Próbki można przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
2. Izolowanie granulek pigmentu chromatoforowego
<ol>
	<li>Trawienie tkankowe
	<ol>
		<li>Przygotowanie papainy/kolagenazy
		<ol>
			<li>Odważ 30 mg kolagenazy i 5 mg papainy za pomocą papieru o wymiarach 4 x 4 cale o niskiej zawartości azotu. Przenieś je do probówki wirówkowej z polipropylenu o pojemności 50 ml z zakrętką.</li>
			<li>Odmierz 10 ml wody dejonizowanej za pomocą pipety miarowej. Dodać bezpośrednio do fiolki zawierającej papainę/kolagenazę. Wiruj na najwyższym ustawieniu, aż roztwór będzie klarowny.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Usuwanie tkanki zewnątrzkomórkowej
		<ol>
			<li>Odwirować zebraną tkankę chromatoforu z kroku 1.7 przez 5 minut przy 14 000 x g. Wyrzuć górną warstwę wody morskiej do plastikowego wiadra na odpady.</li>
			<li>Dodać 500 μl roztworu papainy/kolagenazy do tkanki za pomocą jednokanałowej mikropipety P1000 o zmiennej objętości. Wiruj każdą próbkę przez 1-2 minuty na najwyższym ustawieniu.</li>
			<li>Sonikować próbki przez 5 minut z częstotliwością 40 kHz w celu dysocjacji komórek od otaczającej tkanki.</li>
			<li>Wirować przez 5 minut przy 14 000 x g. Wyrzucić supernatant do plastikowego wiadra na odpady.</li>
			<li>Odwirować zebraną tkankę chromatoforu przez 5 minut przy 14 000 x g. Wyrzuć górną warstwę wody morskiej do plastikowego wiadra na odpady. Powtórz jeszcze raz.</li>
			<li>Ręcznie usuń wszelkie pozostałe duże odcinki tkanki, które nie zostały strawione w tym procesie, za pomocą kleszczy przed przejściem do następnego kroku.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolowanie granulek pigmentu
	<ol>
		<li>Przygotowanie buforu homogenizacyjnego
		<ol>
			<li>Odważyć 2,38 g kwasu (4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanasulfonowego) (HEPES, 100 mM), 0,095 g chlorku magnezu (10 mM), 0,856 g asparaginianu potasu (50 mM) i 0,015 g ditiotreitolu (1 mM). Przenieść do pojemnika z polistyrenu o pojemności 150 ml z zakrętką. Dodaj jedną komercyjną mini tabletkę inhibitora proteazy.</li>
			<li>Odmierz 100 ml wody dejonizowanej za pomocą cylindra z podziałką. Dodać bezpośrednio do pojemnika zawierającego sole homogenizacyjne. Wirować, aż roztwór będzie klarowny.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Homogenizacja granulek pigmentu
		<ol>
			<li>Odwirować każdą próbkę z etapu 2.1 przy 14 000 x g przez 5 minut. Wyrzucić sklarowany osad do plastikowego pojemnika na odpady. Ta próbka powinna być pozbawiona tkanki zewnątrzkomórkowej.</li>
			<li>Dodać 500 μl buforu homogenizacyjnego do każdej probówki i wirować przez 1-2 minuty każda, aby dokładnie wymieszać próbki. Sonikować próbki przez 30 minut (~40 kHz), a następnie przez 5 minut wirować przy 14 000 x g.</li>
			<li>Wyrzuć sklarowany osad do plastikowego pojemnika na odpady i powtórz poprzedni krok 2-3 razy, aby zapewnić całkowite roztrawienie woreczka chromatoforowego i pęt białkowych. Pozostały roztwór powinien zawierać jasnożółty supernatant i czerwoną osadkę zawierającą izolowane granulki pigmentu.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Ekstrakcja pigmentu
<ol>
	<li>Otrzymywanie metanolu kwaśnego (HCl-MeOH)
	<ol>
		<li>Ostrożnie dodać 25 μl stężonego (36,5–38 % (m/w)) kwasu solnego (HCl) do 5 ml metanolu (MeOH). Roztwór HCl-MeOH należy przechowywać w szklanej fiolce na próbkę z zakręcaną nakrętką. Delikatnie zamieszać, aby równomiernie wymieszać roztwór. 
		UWAGA: Im bardziej kwaśny roztwór, tym więcej pigmentu zostanie wyekstrahowane podczas pierwszej ekstrakcji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekstrakcja pigmentu
	<ol>
		<li>Odwirować zawiesinę granulek pigmentu (z ppkt 2.2.2) przez 5 minut przy 14 000 x g i wyrzucić supernatant do plastikowego pojemnika na odpady.</li>
		<li>Dodać 500 μl roztworu HCl-MeOH i wirować każdą próbkę przez ~3-4 min. Sonikować próbki przez 10 min (~40 kHz), a następnie wirować przez 5 min przy 14 000 x g.</li>
		<li>Za pomocą pipety transferowej zebrać supernatant do szklanej fiolki o pojemności 1 grama, z zakręcaną nakrętką. Supernatant powinien mieć kolor ciemnoczerwony.</li>
		<li>Powtórz etap ekstrakcji 3.2.2, aż nie zostanie usunięty dalszy kolor (~4-5 prań). 
		UWAGA: Każda ekstrakcja da ~1,5 ml pigmentu. Pozostała bezbarwna osadka to granulki wyekstrahowane z pigmentu. UWAGA: Zarówno bezbarwne granulki, jak i wyekstrahowane pigmenty można przechowywać w wodzie o temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Charakterystyka w całym procesie ekstrakcji
<ol>
	<li>Skaningowa mikroskopia elektronowa
	<ol>
		<li>Zobrazować granulki (nieprzereagowane z kroku 2.2.1 i ekstrahowane pigmentem z kroku 3.2.3) za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) w celu sprawdzenia czystości procesu ekstrakcji.</li>
		<li>Aby przygotować próbki granulek do obrazowania, najpierw odwiruj zarówno nieprzereagowane granulki, jak i granulki ekstrahowane pigmentem przez 5 minut przy 14 000 x g, a następnie wyrzuć supernatant do plastikowego wiadra na odpady. Ponownie zawiesić je w 1 ml etanolu i nanieść 2-3 krople zawiesiny granulatu na aluminiowe króćce SEM za pomocą pipety transferowej.</li>
		<li>Po wysuszeniu próbek przez noc, napylać powłokę złoto-platynową przez 3 minuty, aby uzyskać powłokę o długości 15 nm.</li>
		<li>Obraz za pomocą SEM z emiterem Schottky'ego i wtórnym detektorem elektronów. Do obrazowania tych materiałów należy użyć napięcia wiązki 5-7 kV i odległości roboczej od 8 do 9 mm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiary spektrofotometryczne w ultrafiolecie widzialnym (UV-vis)
	<ol>
		<li>Monitorować profile absorbancji dla wszystkich 3 warunków (nieprzereagowany granulat z 2.2.2, wyekstrahowany pigment z 3.2.3 i granulki ekstrahowane pigmentem z 3.2.4) za pomocą spektrofotometru dwuwiązkowego od 200-800 nm.</li>
		<li>Zebrać ślepą próbę pomiaru za pomocą wody dejonizowanej w kuwecie o pojemności 1 ml dla nieprzereagowanych granulek i granulek wyekstrahowanych pigmentem. Zebrać widma absorpcyjne UV-VIS dla obu próbek.</li>
		<li>Pobrać ślepą próbę przy użyciu kwaśnego roztworu metanolu w kuwecie o pojemności 1 ml dla wyekstrahowanego pigmentu. Pobrać widmo absorpcyjne UV-VIS dla próbki.</li>
		<li>Określić maksymalną długość fali każdej próbki, określając długość fali, przy której pik absorbancji osiąga maksymalną wysokość względną.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Bell, G. R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatophore+radial+muscle+fibers+anchor+in+flexible+squid+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Invertebr+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromatophore radial muscle fibers anchor in flexible squid skin.</a> Invertebr Biol. 132 (2), 120-132 (2013).</li>
<li>Crookes, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reflectins%3A+The+unusual+proteins+of+squid+reflective+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reflectins: The unusual proteins of squid reflective tissues.</a> Science. 303 (5655), 235-238 (2004).</li>
<li>Deravi, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure-function+relationships+of+a+natural+nanoscale+photonic+device+in+cuttlefish+chromatophores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">The structure-function relationships of a natural nanoscale photonic device in cuttlefish chromatophores.</a> J. R. Soc. Interface. 11 (93), 1-9 (2014).</li>
<li>Mäthger, L. M., Denton, E. J., Marshall, N. J., Hanlon, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+behavioural+functions+of+structural+coloration+in+cephalopods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and behavioural functions of structural coloration in cephalopods.</a> J. R. Soc. Interface. 6 (2), 149-163 (2009).</li>
<li>Mäthger, L. M., Hanlon, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+basis+for+camouflaged+polarized+light+communication+in+squid%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Anatomical basis for camouflaged polarized light communication in squid.</a> Biol. Lett. 2 (4), 494-496 (2006).</li>
<li>Mäthger, L. M., Hanlon, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malleable+skin+coloration+in+cephalopods%3A+selective+reflectance%2C+transmission+and+absorbance+of+light+by+chromatophores+and+iridophores%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Malleable skin coloration in cephalopods: selective reflectance, transmission and absorbance of light by chromatophores and iridophores.</a> Cell Tissue Res. 329 (1), 179-186 (2007).</li>
<li>Cloney, R. A., Brocco, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatophore+Organs%2C+Reflector+Cells%2C+Iridocytes+and+Leucophores+in+Cephalopods%5BTitle%5D)+AND+%22Amer.+Zool%22%5BJournal%5D)">Chromatophore Organs, Reflector Cells, Iridocytes and Leucophores in Cephalopods.</a> Amer. Zool. 23 (3), 581-592 (1983).</li>
<li>Hanlon, R. T., Messenger, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+coloration+in+young+cutttlefish+%28Sepia+officinalis+L%29-+The+morphology+and+development+of+body+patterns+and+their+relation+to+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Adaptive coloration in young cutttlefish (Sepia officinalis L)- The morphology and development of body patterns and their relation to behaviour.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 320 (1200), 437-487 (1988).</li>
<li>Sutherland, R. L., Mäthger, L. M., Hanlon, R. T., Urbas, A. M., Stone, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cephalopod+coloration+model.+II.+Multiple+layer+skin+effects%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Opt.+Soc.+Am%22%5BJournal%5D)">Cephalopod coloration model. II. Multiple layer skin effects.</a> J. Opt. Soc. Am. 25 (8), 2044-2054 (2008).</li>
<li>Florey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+and+function+of+cephalopod+chromatophores%5BTitle%5D)+AND+%22Amer.+Zool%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure and function of cephalopod chromatophores.</a> Amer. Zool. 9 (2), 429-442 (1969).</li>
<li>Florey, E., Kriebel, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+and+mechanical+responses+of+chromatophore+muscle+fibers+of+squid%2C+Loligo+opalescens%2C+to+nerve+stimulation+and+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Z.+Vergl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Electrical and mechanical responses of chromatophore muscle fibers of squid, Loligo opalescens, to nerve stimulation and drugs.</a> Z. Vergl. Physiol. 65 (1), 98-130 (1969).</li>
<li>Williams, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+Phenoxazone-Based+Pigments+to+the+Structure+and+Function+of+Nanostructured+Granules+in+Squid+Chromatophores%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Contributions of Phenoxazone-Based Pigments to the Structure and Function of Nanostructured Granules in Squid Chromatophores.</a> Langmuir. , (2016).</li>
<li>Nijhout, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ommochrome+pigmentation+of+the+linea+and+rosa+seasonal+forms+of+Precis+coenia+%28Lepidoptera%3A+Nymphalidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Insect.+Biochem.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ommochrome pigmentation of the linea and rosa seasonal forms of Precis coenia (Lepidoptera: Nymphalidae).</a> Arch. Insect. Biochem. Physiol. 36 (3), 215-222 (1997).</li>
<li>Van Den Branden, C., Decleir, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Study+of+the+Chromatophore+Pigments+in+the+Skin+of+the+Cephalopod+Sepia+Officinalis%5BTitle%5D)+AND+%22L.+Biol.+Jb.+Dodonaea%22%5BJournal%5D)">A Study of the Chromatophore Pigments in the Skin of the Cephalopod Sepia Officinalis.</a> L. Biol. Jb. Dodonaea. 44 (2), 345-352 (1976).</li>
<li>Aubourg, S., Torres-Arreola, W., Trigo, M., Ezquerra-Brauer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Jumbo+Squid+Skin+Pigment+Extract+and+its+Antioxidant+Potential+ina+Marine+Oil+System%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Lipid+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Characterization of Jumbo Squid Skin Pigment Extract and its Antioxidant Potential ina Marine Oil System.</a> Eur. J. Lipid Sci. Technol. 118 (0), (2016).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Pokazaliśmy metodę ekstrakcji pigmentów z granulek chromatoforu kałamarnicy. Poprzez ukierunkowanie na granulki, naszym celem jest określenie ich roli w pośredniczeniu w adaptacyjnym ubarwieniu. Metoda ta różni się od poprzednich doniesień mających na celu scharakteryzowanie pigmentów głowonogów przy użyciu próbek tkanek14 lub liofilizowanej skóry15.
Chociaż protokół ten jest skuteczny w ekstrakcji pigmentów chromatoforowych, jest ograniczony do małych skal reakcji. Rozbi...

Głowonogi, takie jak kałamarnice, mątwy i ośmiornice, mają zdolność dynamicznej zmiany swojego wyglądu w celu kamuflażu i sygnalizacji. 1-6 Zdolność ta jest częściowo wspierana przez selektywną ekspansję powierzchniową pigmentowanych narządów znanych jako chromatofory. 4,7-9 Chromatofory to miękkie siłowniki, które zawierają sieć nanostrukturalnych granulek pigmentu zamkniętych w cytoelastycznym woreczku, który jest zakotwiczony promieniowo przez włókna mięśniowe. 1,3 Po uruchomieniu chromatofory rozszerzają się o 500% na przedstawionej powierzchni, rozprowadzając granulki w całym narządzie. 3,7,10,11 Gdy to działanie jest skoordynowane przez kilka chromatoforów, ogólne ubarwienie zwierzęcia ulega zmianie. Chociaż wiadomo, że granulki pigmentu przyczyniają się do tej zmiany koloru, ich skład pozostaje nieznany. Opisujemy procedurę izolacji i oczyszczania pigmentów chromatoforowych, która może być dostosowana do przyszłych badań kompozycyjnych.
Izolacja granulek pigmentu obejmuje wieloetapową procedurę ekstrakcji, homogenizacji i oczyszczania. 3,12 Tkanka zawierająca chromatofor jest pobierana poprzez staranne wytępienie z głowonoga. Następnie stosuje się proces trawienia i homogenizacji w celu dysocjacji otaczającej tkanki i oddzielenia komórek chromatoforu. Nanostrukturalne granulki są następnie izolowane i oczyszczane z pozostałych chromatoforów za pomocą wielokrotnej sonikacji i wirowania. Po oczyszczeniu pigmenty są ekstrahowane z granulek w procesie, który jest dostosowany do ekstrakcji widocznego koloru ze skrzydeł motyla za pomocą kwaśnych roztworów metanolu. 13 Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) i spektrofotometria są stosowane w celu potwierdzenia, że pigmenty chromatoforowe zostały pomyślnie wyekstrahowane w tym procesie.
Ta metoda opisuje izolację granulek chromatoforu, która jest używana do badania molekularnego wkładu w ubarwienie u głowonogów. 12 Ekstrakcja małych cząsteczek z całych zwierząt często bywa długim i żmudnym procesem. Celem jest poinformowanie przyszłych badaczy o skutecznym i łatwym w obsłudze protokole pozyskiwania pigmentów z nanostrukturalnych granulek u głowonogów.

<table><tbody><tr><td>Kolagenaza</td><td>Alfa Aesar</td><td>9001-12-1</td><td>Brak zagrożenia</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3482-12-3</td><td>Działa drażniąco, ostra toksyczność</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7365-45-9</td><td>Łagodny środek drażniący</td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>EMD Chemicals</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>k-asparaginian</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1115-63-5</td><td>Reaguje gwałtownie z utleniaczami</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7786-30-3</td><td>Łagodny środek drażniący oczy</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>67-56-1</td><td>Wysoce łatwopalny</td></tr><tr><td>inhibitor środka w mini tabletkach</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>469315-90-01</td><td>Działa żrąco na metal i skórę</td></tr><tr><td>Papaina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9001-73-4</td><td>Działa drażniąco&nbsp;</td></tr></tbody></table>

metoda ekstrakcji pigmentów z kałamarnicy doryteuthis pealeii

A Method for Extracting Pigments from Squid Doryteuthis pealeii

Głowonogi mogą ulegać szybkim i adaptacyjnym zmianom w ubarwieniu skóry w celach wyczuwania, komunikacji, obrony i reprodukcji. Zdolności te są częściowo wspierane przez powierzchniowe rozszerzanie i cofanie pigmentowanych narządów znanych jako chromatofory. Chociaż wiadomo, że chromatofory zawierają na uwięzi sieć pigmentowanych granulek, ich właściwości strukturalno-funkcjonalne nie zostały w pełni szczegółowe. Opisujemy metodę izolowania nanostrukturalnych granulek w chromatoforach kałamarnicy Doryteuthis pealeii i pokazujemy, w jaki sposób związane z nimi pigmenty można ekstrahować w kwaśnych rozpuszczalnikach. Aby to osiągnąć, warstwa skórna zawierająca chromatofor jest najpierw ręcznie izolowana za pomocą powierzchownej sekcji, a granulki pigmentu są usuwane za pomocą cykli sonikacji, wirowania i mycia. Pigmenty zamknięte w oczyszczonych granulkach są następnie ekstrahowane za pomocą kwaśnych roztworów metanolu, pozostawiając nanostruktury o mniejszych średnicach, które są pozbawione widocznego koloru. Ta procedura ekstrakcji daje 58% wydajności rozpuszczalnych pigmentów wyizolowanych z granulek. Za pomocą tej metody można określić skład pigmentów chromatoforowych i wykorzystać je do uzyskania wglądu w mechanizm adaptacyjnego ubarwienia u głowonogów.

Chromatofory są wycinane z grzbietowej części płaszcza D. pealeii (Rysunek 1A, 1B). Po ich usunięciu chromatofory są lizowane i oczyszczane przy użyciu cykli wirowania i przemywania w celu wyizolowania pigmentowych granulek (Rysunki 2A, 2B). Zakwaszone roztwory metanolu (HCl-MeOH) są wykorzystywane do ekstrakcji pigmentu z granulek (Rysunek 2C), co pozwala na uzyskanie rozpuszczalnego ekstraktu p...

Przedstawiono protokół ekstrakcji pigmentów z nanostrukturalnych granulek w chromatoforach kałamarnicy Doryteuthis pealeii.

Metoda ekstrakcji pigmentów z kałamarnicy Doryteuthis pealeii

Cephalopods can undergo rapid and adaptive changes in dermal coloration for sensing, communication, defense, and reproduction purposes. These capabilities ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest opisanie sposobu ekstrakcji pigmentów znajdujących się w nanostrukturalnych ziarnistościach chromatoforów świeżo wypreparowanych mątw squid, Doryteuthis pealeii. Głowonogi to złożone zwierzęta morskie, które podlegają szybkim i adaptacyjnym zmianom zabarwienia skóry.Nadal jednak wiele pozostaje nieznane w kwestii działania tych systemów. Główną zaletą tej techniki jest to, że specyficznie celuje ona w nanostrukturalne granulki w organie chromatoforowym. Pozwoli to badaczom wyjaśnić mechanizm zmiany barwy zapoczątkowanej w skali nano.Oprócz wglądu w biologię głowonogów, może to pomóc w projektowaniu syntetycznych systemów stworzonych do naśladowania dynamicznego zakresu adaptacyjnej zmiany barw obserwowanego u głowonogów, przy użyciu gotowych pigmentowanych nanocząsteczek. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ pobranie czystej tkanki chromatoforów jest utrudnione ze względu na jej bliskość względem tkanek otaczających. Nasza metoda została zoptymalizowana w celu ograniczenia tych zanieczyszczeń.Aby rozpocząć sekcję, najpierw wlej około 250 mililitrów filtrowanej wody morskiej do kuwety sekcyjnej. Umieś

a-method-for-extracting-pigments-from-squid-doryteuthis-pealeii

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszym filmie zaprezentowano sposób pozyskiwania hemocytów (komórek krwi) z hawajskiej mątwy, Euprymna scolopes, do wykorzystania w badaniach biologii komórki oraz testach adhezji bakteryjnej. Hemocyty zostaną zabarwione barwnikiem fluorescencyjnym i poddane działaniu bakterii znakowanych GFP.

Pozyskiwanie hemocytów z hawajskiej mątwy Euprymna scolopes i obserwacja ich przylegania do bakterii symbiotycznych i niesymbiotycznych

W tym filmie opisujemy technikę izolowania komórek nabłonka tęczówki i barwnika siatkówki z oczu świń w celu uzyskania ich pierwotnych kultur do badań in vivo i ex vivo. Te komórki pigmentowe mogą być genetycznie modyfikowane w celu zbadania metod regeneracyjnych w leczeniu chorób oczu.

Izolacja komórek IPE i RPE: technika uzyskiwania pigmentowanych komórek nabłonkowych z izolowanego oka świni

Ten protokół szczegółowo opisuje odtwarzanie kompleksów zbierających światło in vitro. Te integralne białka błonowe koordynują chlorofile i karotenoidy i są odpowiedzialne za zbieranie światła w roślinach wyższych i zielonych algach.

In vitro Rekonstytucja kompleksów roślin i zielonych alg zbierających światło

Ten test biologiczny wykorzystuje model drapieżnej ryby do oceny obecności metabolitów odstraszających od karmienia z organicznych ekstraktów tkanek organizmów morskich w naturalnych stężeniach przy użyciu porównywalnej pod względem odżywczym matrycy pokarmowej.

Laboratoryjny test biologiczny żywiący się rybami w celu oceny aktywności przeciwdrapieżnej metabolitów wtórnych z tkanek organizmów morskich

Ten manuskrypt opisuje prostą i wysokoprzepustową metodę łączenia rozpuszczalnych w wodzie białek z hydrofobowymi pigmentami, która opiera się na emulsjach typu woda w oleju. Wykazano skuteczność metody w łączeniu natywnych chlorofili z czterema wariantami rekombinowanych rozpuszczalnych w wodzie białek wiążących chlorofil (WSCP) roślin kapustnych ulegających ekspresji w E. coli.

Emulsje typu woda w oleju: nowy system łączenia rozpuszczalnych w wodzie białek wiążących chlorofil z pigmentami hydrofobowymi

Ta praca przedstawia metodę szybkiego i precyzyjnego ilościowego określenia pigmentacji brzucha Drosophila melanogaster za pomocą cyfrowej analizy obrazu. Metoda ta usprawnia procedury między akwizycją fenotypu a analizą danych i obejmuje montowanie próbek, akwizycję obrazu, ekstrakcję wartości pikseli i pomiar cech.

Kwantyfikacja pigmentacji jamy brzusznej u Drosophila melanogaster

Tutaj prezentujemy protokół izolacji białek wiążących chlorofil a/c (FCP) z okrzemek i włączenia ich do liposomów o naturalnym składzie lipidowym w celu zbadania transferu energii wzbudzenia po zmianie składu jonów.

Izolowanie i włączanie anten zbierających światło z okrzemki Cyclotella Meneghiniana w liposomach z lipidami tylakoidowymi

Doliolidy, w tym gatunek Dolioletta gegenbauri, to mały, galaretowaty zooplankton morski o znaczeniu ekologicznym, występujący na produktywnych systemach szelfu subkontynentalnego na całym świecie. Trudność w hodowli tych delikatnych organizmów ogranicza ich badania. W tym badaniu opisujemy podejścia do uprawy w celu zbierania, hodowli i utrzymania doliolid Dolioletta gegenbauri.

Uprawa osłonicy morskiej pelagicznej Dolioletta gegenbauri (Uljanin 1884) do badań eksperymentalnych

Regulatory funkcji melanocytów regulują widoczne różnice w wyniku pigmentacji. Rozszyfrowanie funkcji molekularnej genu kandydującego na pigmentację stanowi wyzwanie. W niniejszym artykule demonstrujemy wykorzystanie systemu modelowego danio pręgowanego do identyfikacji kandydatów i klasyfikowania ich jako regulatorów zawartości melaniny i liczby melanocytów.

Odwrotne podejście genetyczne do identyfikacji regulatorów pigmentacji przy użyciu danio pręgowanego

Przedstawiamy protokół do elektrofizjologicznego charakterystyki bistabilnych fotopigmentów: (i) wykorzystanie przemieszczeń ładunku w cząsteczkach fotopigmentu po absorpcji fotonów i ich ogromnej ilości w fotoreceptorach, oraz (ii) wykorzystanie różnic w widmach absorpcyjnych rodopsyny i metarodopsyny. Protokoły te są przydatne do badań przesiewowych pod kątem mutacji wpływających na bistabilne systemy fotopigmentowe.

Elektrofizjologiczne metody pomiaru poziomu fotopigmentu w fotoreceptorach Drosophila

Tutaj opisujemy kilka protokołów mających na celu zintegrowaną waloryzację Gracilaria gracilis: zbiór dzikich gatunków, hodowla we własnym zakresie i ekstrakcja składników bioaktywnych. Oceniane jest działanie przeciwutleniające, przeciwbakteryjne i cytotoksyczne ekstraktów, a także ocena wartości odżywczej i stabilności żywności wzbogaconej o całą biomasę wodorostów i pigmenty.

Waloryzacja wodorostów czerwonych Gracilaria gracilis za pomocą podejścia biorafineryjnego

Naucz się ekstrakcji pigmentów z chromatoforów kałamarnicy Doryteuthis pealeii. Ta metoda pozwala badać nanostrukturalne mechanizmy zmiany koloru u głowonogów.

Metoda ekstrakcji pigmentów z kałamarnicy Doryteuthis pealeii

Przeglądaj więcej filmów