Optogenetyczna mutageneza losowa z wykorzystaniem histonów-miniSOG u C. elegans
14 listopada 2016
Ogólnym celem tego protokołu mutagenezy jest wykorzystanie prostej konfiguracji LED do mutagenizacji genomowego DNA C. elegans, które wyraża zależne od niebieskiego, reaktywne białka generatora tlenu. Dwie główne zalety tej techniki to jedna, protokół mutagenezy jest bardzo prosty i nie wymaga toksycznych chemikaliów. A po drugie, generator mutagenezy okazuje się po długiej mutacji.
Po raz pierwszy wpadł mi do głowy pomysł na tę metodę i zdałem sobie sprawę, że białka generujące RFT nigdy nie były używane do wywoływania mutacji dziedzicznych. W tym eksperymencie podłącz sterownik oświetlacza LED do cyfrowego generatora funkcyjnego za pomocą BNC. Za pomocą niestandardowego uchwytu zabezpiecz światła LED 10 centymetrów nad sceną.
Teraz częściowo zakryj ustawienie, aby ograniczyć ekspozycję niebieskiego światła na otoczenie, ale nie na tyle, aby ciepło gromadziło się na scenie. Zastosowano tu wykonaną na zamówienie, twardą plastikową osłonę z otwartą górą i dołem. Podczas pracy diody LED należy zawsze nosić okulary chroniące przed laserem lub okulary przeciwsłoneczne, ponieważ światło jest bardzo jasne.
Teraz przełącz dźwignię kontrolera LED na wewnętrzną i ustaw ją na 65% jego maksymalnej mocy. Za pomocą fotometru w razie potrzeby wyreguluj moc światła, tak aby na scenie wynosiła 2,0 miliwata na milimetr kwadratowy podczas ciągłego oświetlenia. W przypadku tego protokołu utrzymuj wrażliwy na światło szczep w ciemności w standardowych warunkach.
Należy unikać niepotrzebnej ekspozycji na światło, ale rutynowe używanie lamp halogenowych do przejścia nie powoduje mutacji. Ponieważ przypadkowa mutacja jest problemem, należy zamrozić podwielokrotności szczepu, gdy zostaną one uzyskane po raz pierwszy. Do mutagenezy przygotuj bibułę filtracyjną pasującą do 60-milimetrowej płytki z około 25-milimetrowym kwadratowym otworem pośrodku i umieść ją na nieziarnistej płytce.
Następnie rozprowadź 100 mikrolitrów 100-milimolowego chlorku miedzi równomiernie na bibule filtracyjnej, aby robaki nie opuściły kwadratowego otworu. Teraz, z talerza robaków, które są około 12 godzin po ich stadium L4, wybierz ciężarne, młode dorosłe hermafrodyty i umieść je w środkowym kwadracie na talerzu. Następnie włącz diodę LED i generator funkcji.
Następnie przełącz sterownik LED na zewnętrzny, aby sterować nim za pomocą generatora funkcyjnego i odpowiednio ustaw moc. Z generatora funkcyjnego wytwórz falę sinusoidalną o częstotliwości 4 herców. Teraz przenieś płytkę na scenę i oświetl robaki niebieskim światłem przez 30 minut.
Bezpośrednio po zabiegu przenieś wszystkie zdrowo wyglądające robaki na talerz z nasionami. Robaki te będą wydawać się nieskoordynowane po leczeniu światłem, ale wyzdrowieją. Trzymaj robaki potraktowane światłem w ciemności.
Później sprawdź, czy nie ma nieprawidłowych morfologii lub zachowań u dorosłego potomstwa F2. Przeprowadzono przesiewowe badanie genetyczne przy użyciu opisanej techniki dla 60 płytek F1, odpowiadających 120 mutagenizowanym genomom haploidalnym. Osiem z 60 płytek F1 z robakami F2 wykazywało widoczne fenotypy, takie jak przysadzisty kształt ciała, nieskoordynowane ruchy lub śmiertelność dorosłych.
Potomstwo tych robaków F2 zachowało te obserwowalne fenotypy. Liczba widocznych mutantów na tym ekranie sugeruje, że szczep i konfiguracja działają prawidłowo dla mutagenezy optogenetycznej. Procedurę mutagenezy można przeprowadzić w ciągu godziny.
Ciesz się szybką i bezpieczną metodą mutagenezy.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół mutagenezy wykorzystujący genetycznie kodowaną histone-miniSOG w celu indukowania dziedzicznych mutacji w całym genomie w sposób zależny od światła niebieskiego. Metoda ta jest prosta, szybka i wolna od toksycznych substancji chemicznych, co czyni ją idealną do forward genetic screening oraz integracji transgenów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Genetyka
- Neuronauka
- Mutogeneza
Wprowadzenie
- Białka kodowane genetycznie mogą generować reaktywne formy tlenu (ROS).
- Poprzednie metody indukcji mutacji często wiązały się z użyciem toksycznych substancji chemicznych.
- Niniejsze badanie analizuje nowatorskie podejście do mutogenezy dziedzicznej.
- C. elegans służy jako organizm modelowy w tym protokole.
Cel badania
- Opracowanie prostego protokołu mutagenezy z wykorzystaniem światła niebieskiego.
- Wykazanie skuteczności białek generujących ROS w indukowaniu mutacji.
- Ułatwienie forward genetic screening oraz integracji transgenów.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie prostego układu LED do mutagenezy.
- Podłączenie iluminatora LED do cyfrowego generatora funkcji.
- Zamocowanie lamp LED nad platformą za pomocą specjalnego uchwytu.
- Obserwacja efektów mutagenezy u C. elegans.
Główne wyniki
- Skuteczna indukcja dziedzicznych mutacji w całym genomie.
- Wykazanie nietoksycznej metody mutagenezy.
- Walidacja techniki do forward genetic screening.
- Potencjał integracji transgenów z wykorzystaniem tej metody.
Wnioski
- Protokół ten oferuje prostą i skuteczną metodę mutagenezy.
- Mutageneza zależna od światła niebieskiego jest obiecującą techniką w badaniach genetycznych.
- Metoda ta może przyczynić się do postępów w badaniach z zakresu genetyki i biologii molekularnej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Optogenetyczna randomowa mutageneza z wykorzystaniem histone-miniSOG u C. elegans umożliwia szybką, dziedziczną modyfikację genomu bez użycia niebezpiecznych chemikaliów, co usprawnia wczesne etapy procesów badawczych. Podejście to wspiera wysokoprzepustowe przesiewanie genetyczne oraz integrację transgenów, zmniejszając bariery operacyjne i zwiększając elastyczność portfolio. Bezpieczeństwo i prostota tej metody czynią ją skalowalnym narzędziem do genomiki funkcjonalnej oraz walidacji celów w badaniach przedklinicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia systematyczną analizę funkcji genów poprzez forward genetic screening.
- Ułatwia identyfikację nowych szlaków i modyfikatorów genetycznych istotnych dla modeli chorób.
- Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez generowanie zróżnicowanych wariantów allelicznych do badań mechanistycznych.
- Zwiększa pewność prognostyczną w wyborze celu poprzez umożliwienie bezstronnej mutogenezy.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowany, powtarzalny system generowania bibliotek mutantów u C. elegans.
- Eliminuje zagrożenia chemiczne, upraszczając standaryzację testów i zapewniając zgodność z wymogami laboratoryjnymi.
- Umożliwia szybkie przygotowanie genetycznie zróżnicowanych populacji do dalszych przesiewów fenotypowych.
- Wspiera skalowalne, gotowe do wdrożenia przepływy pracy w celu oceny związków oraz badań nad interakcjami genetycznymi.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wspiera rozwój modeli istotnych dla przebiegu choroby, umożliwiając ukierunkowaną mutogenezę oraz integrację transgenów.
- Ułatwia przejście od odkryć genetycznych do walidacji przedklinicznej w organizmach modelowych.
- Wspiera optymalizację ryzyka w procesie rozwoju poprzez dostarczanie niezawodnych narzędzi genetycznych do weryfikacji mechanistycznej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda mutagenezy optogenetycznej integruje się z wczesnymi etapami odkrywania i walidacji celu, wspierając identyfikację związków wiodących oraz rozwój modeli przedklinicznych.
- Biologia odkrywcza: Przyspiesza testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez bezstronną mutogenezę.
- Screening: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki niezbędne do selekcji mutantów i analizy fenotypowej.
- Analityka: Umożliwia statystyczne porównanie fenotypów mutantów oraz wydajności integracji transgenów.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia genetyczne z optymalizacją modeli przedklinicznych u C. elegans.
- Zastosowania instytucjonalne: Oferuje wielokrotnego użytku, nietoksyczną platformę do ciągłego screeningu genetycznego i opracowywania nowych narzędzi.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i walidację celu poprzez umożliwienie szerokiej mutogenezy bez zakłóceń chemicznych.
- Wartość operacyjna: Poprawia bezpieczeństwo laboratoryjne, standaryzację i przepustowość poprzez wyeliminowanie niebezpiecznych odczynników.
- Wartość strategiczna: Wspiera efektywne podejmowanie decyzji go/no-go i redukuje biologiczne ryzyko na późnych etapach dzięki zastosowaniu solidnych narzędzi genetycznych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz elastyczne rozwijanie programów odkrywania genetycznego.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w genetyce C. elegans oraz w konfiguracji systemów optogenetycznych.
- Wymaga infrastruktury oświetleniowej LED oraz przestrzegania podstawowych protokołów bezpieczeństwa laboratoryjnego dotyczących ekspozycji na światło.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w celu zapewnienia powtarzalności i porównywalności danych.
- Możliwość adaptacji do innych systemów modelowych z kompatybilnymi konstruktami optogenetycznymi.
- Wymaga ostrożnego obchodzenia się z próbkami, aby uniknąć niezamierzonych mutacji indukowanych światłem.
