Wizualizacja wpływu plwociny na rozwój biofilmu za pomocą komorowego modelu szkła nakrywkowego
14 grudnia 2016
Ten protokół opisuje wizualizację rozwoju biofilmu po ekspozycji na czynniki gospodarza za pomocą modelu komory szkiełkowej. Model ten pozwala na bezpośrednią wizualizację rozwoju biofilmu, a także analizę parametrów biofilmu za pomocą programów komputerowych.
Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja i ilościowe określenie zmian w biofilmach w odpowiedzi na plwocinę i antybiotyki. Metoda ta może być wykorzystana przez naukowców do zrozumienia kluczowych pytań, takich jak to, w jaki sposób obecność plwociny może wpływać na skuteczność różnych antybiotyków przeciwko biofilmom bakteryjnym. Główną zaletą tej metodologii jest to, że pozwala ona jednostkom zobaczyć zmiany zachodzące w biofilmach w odpowiedzi na różne czynniki.
Aby rozpocząć eksperyment, zapisz objętość wcześniej uzyskanej próbki plwociny. Dodać sól fizjologiczną buforowaną fosforanami lub PBS, dodać dwukrotność objętości próbki. Następnie za pomocą pipety transferowej dokładnie wymieszaj próbkę.
Wirować próbkę na najwyższym ustawieniu przez jedną minutę, aby całkowicie ją wymieszać. Podaniec jeden mililitr mieszaniny do 1,5 mililitrowych probówek wirówek. Następnie odkręć rurki.
Po odwirowaniu zachować supernatant i wyrzucić osad. Filtr: Wysterylizuj supernatant przez filtr 0,22 mikrona i zbierz go w czystej probówce do mikrowirówki. Przechowuj supernatant plwociny w temperaturze 80 stopni Celsjusza do wykorzystania w przyszłości.
Umieść 40 mikrolitrów wcześniej przygotowanej kultury w czterech mililitrach świeżego bulionu Luria lub pożywki LB i wyhoduj bakterie, aby uzyskać kulturę o gęstości optycznej 0,55 przy 600 nanometrach. Następnie rozcieńczyć 100 mikrolitrów kultury 0,5 OD w 400 mikrolitrach przygotowanych 10% filtratów plwociny w LB. Użyj 200 mikrolitrów rozcieńczenia do wysiewu dołków komór szkiełkowych. Pozwól bakteriom przyczepić się przez cztery godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza bez wstrząsania.
Po czterech godzinach usuń podłoże i delikatnie umyj biofilm 1X fresh LB. Zastąp pozostałą pożywkę 200 mikrolitrami świeżego LB. Pozwól biofilmom rosnąć w temperaturze 37 stopni Celsjusza bez wstrząsania. Wymieniaj pożywkę co 12 godzin bez mycia, aż biofilm będzie gotowy do mikroskopii. Bardzo ważne jest, aby delikatnie umyć szkiełka, aby nie zakłócić przyczepionych bakterii.
Po wzroście wyjmij pożywkę z dołków komory i delikatnie umyj każdą komorę dwa razy 300 mikrolitrami sterylnego PBS. Następnie, aby przygotować mieszaninę do barwienia biofilmu, dodaj jeden mikrolitr każdego barwnika dostarczonego w zestawie żywotności do każdego mililitra potrzebnego roztworu i wymieszaj roztwór. Optymalna ilość barwnika i czas barwienia są określane empirycznie dla każdego organizmu.
Dodaj 200 mikrolitrów mieszaniny barwiącej do każdej studzienki komorowego szkła nakrywkowego. Inkubować szkło nakrywkowe. Po inkubacji usunąć mieszaninę barwiącą z komór i umyć każdą studzienkę 300 mikrolitrami sterylnego PBS.
Wymień PBS na nowy nośnik. Na koniec przystąp do wizualizacji za pomocą mikroskopii konfokalnej. Reprezentatywne obrazy kompleksu Burkholderia cepacia lub izolatów klinicznych BCC, po 48 godzinach wzrostu w komorowym szkle nakrywkowym z samymi pożywkami lub w obecności 10% filtratów plwociny pokazują, że ich obecność może zmienić architekturę biofilmu.
Obrazy analizowano za pomocą oprogramowania Comstat w celu uzyskania kluczowych parametrów biofilmu, w tym średniej grubości biofilmu, która zwiększała się po potraktowaniu 10% plwociną. Aby ocenić wpływ różnych czynników na wzrost biofilmu, izolaty kliniczne hodowano tylko w pożywce lub z plwociną i leczono antybiotykiem lub bez niego. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak tworzyć i przetwarzać biofilmy na komorowym szkle nakrywkowym oraz przygotowywać je do barwienia i analizy konfokalnej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje wizualizację i kwantyfikację rozwoju biofilmu w odpowiedzi na plwocinę oraz antybiotyki z wykorzystaniem modelu komory na szkiełku. Model ten umożliwia bezpośrednią obserwację zmian w biofilmie i pozwala na szczegółową analizę przy użyciu oprogramowania komputerowego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Badania nad biofilmem
- Skuteczność antybiotyków
Wprowadzenie
- Biofilmy są złożonymi społecznościami mikroorganizmów.
- Zrozumienie odpowiedzi biofilmu na antybiotyki jest kluczowe dla strategii terapeutycznych.
- Plwocina może wpływać na skuteczność antybiotyków przeciwko biofilmom.
- Celem niniejszego badania jest efektywna wizualizacja tych oddziaływań.
Cel badania
- Wizualizacja zmian w biofilmach pod wpływem plwociny oraz ekspozycji na antybiotyki.
- Ilościowe określenie wpływu czynników gospodarza na rozwój biofilmu.
- Pogłębienie zrozumienia skuteczności antybiotyków przeciwko biofilmom.
Zastosowane metody
- Pobieranie próbek plwociny.
- Rozcieńczanie plwociny w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS).
- Mieszanie próbek w celu uzyskania jednorodności.
- Wizualizacja rozwoju biofilmu z wykorzystaniem modelu komory szkiełka.
Główne wyniki
- Bezpośrednia wizualizacja zmian w biofilmie w odpowiedzi na antybiotyki.
- Ilościowa analiza parametrów biofilmu.
- Wgląd w interakcję między plwociną a odpowiedzią biofilmu.
- Demonstracja skuteczności różnych antybiotyków.
Wnioski
- Model komory szkiełkowej jest skuteczny w badaniu dynamiki biofilmu.
- Czynniki gospodarza, takie jak plwocina, znacząco wpływają na zachowanie biofilmu.
- Metodyka ta może dostarczyć informacji dla przyszłych strategii leczenia antybiotykowego.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowa wizualizacja rozwoju biofilmu w obecności plwociny pochodzącej od gospodarza oraz antybiotyków rozwiązuje krytyczny problem w odkrywaniu leków przeciwzakaźnych i wierności modeli translacyjnych. Podejście to umożliwia mechanistyczne ograniczanie ryzyka poprzez ujawnienie sposobu, w jaki czynniki gospodarza modulują skuteczność antybiotyków i architekturę biofilmu, co dostarcza informacji dla wczesnych etapów walidacji celów i strategii przesiewowych. Metoda ta zwiększa pewność predykcyjną przy podejmowaniu decyzji dotyczących portfolio w badaniach i rozwoju w obszarze chorób zakaźnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych dotyczących wpływu czynników gospodarza na odporność biofilmu.
- Wspiera biologiczne ograniczanie ryzyka poprzez ilościowe określanie odpowiedzi biofilmu na antybiotyki w matrycach istotnych dla przebiegu choroby.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celu poprzez pomiar żywotności i architektury biofilmu w określonych warunkach.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane systemy biofilmu do dalszego przesiewania związków w obecności czynników o znaczeniu klinicznym.
- Standaryzuje warunki analizy w celu zapewnienia powtarzalności i możliwości ilościowego porównania pomiędzy grupami eksperymentalnymi.
- Generuje wiarygodne wyniki ilościowe, takie jak grubość i żywotność biofilmu, w celu rzetelnej oceny związków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Dostosowuje modele biofilmu in vitro do środowisk gospodarza istotnych dla przebiegu choroby, zwiększając ciągłość translacyjną.
- Wspiera postępy skorygowane o ryzyko poprzez ujawnienie wydajności antybiotyków w złożonych matrycach biologicznych.
- Zapewnia wgląd mechanistyczny w interakcje gospodarz-patogen-lek w celu predykcyjnej redukcji ryzyka.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten model szkiełka podstawowego z komorką wpisuje się w kontinuum od odkrycia do badań przedklinicznych, umożliwiając testowanie skuteczności antybiotyków w systemach biofilmu naśladujących gospodarza w oparciu o sformułowane hipotezy.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących wpływu czynników gospodarza i wyjaśnianie szlaków w rozwoju biofilmu.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalnych, ilościowych odczytów służących do priorytetyzacji związków w kontekście biofilmu.
- Analityka: Zapewnia pomiary oparte na obrazowaniu oraz wyniki statystyczne do porównań między różnymi warunkami.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki in vitro z modelami przedklinicznymi poprzez włączenie macierzy istotnych dla przebiegu choroby.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwach: Oferuje zestandaryzowaną, adaptowalną platformę do powtarzalnej oceny strategii przeciwbiofilmowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach i rozwoju (R&D) środków przeciwinfekcyjnych.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność testów biofilmu.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez ujawnienie zależnej od kontekstu skuteczności leków.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów z uwzględnieniem ryzyka na podstawie ich wydajności w systemach naśladujących gospodarza.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli biofilmu, mikroskopii konfokalnej oraz ilościowej analizie obrazu.
- Wymaga dostępu do systemów szkiełek podstawowych z komorami, zestawów do barwienia żywotności oraz oprogramowania analitycznego, takiego jak Comstat.
- Wymaga standaryzacji protokołów przygotowania próbek i obrazowania pomiędzy zespołami.
- Może wymagać adaptacji dla różnych gatunków bakterii lub macierzy pochodzenia gospodarza.
- Zależne od empirycznej optymalizacji parametrów barwienia i obrazowania dla każdego organizmu.
