Name: Wizualizacja wpływu plwociny na rozwój biofilmu za pomocą komorowego modelu szkła nakrywkowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji i kwantyfikacji zmian w biofilmach bakteryjnych pod wpływem plwociny i antybiotyków przy użyciu komorowego modelu szkła nakrywkowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

TB dziękuje za stypendium badawcze od Cystic Fibrosis Canada.

Zauważ, że Komisja Etyki Badań (REB) jest zobowiązana do pobierania i przechowywania próbek plwociny od ludzi. Badania te zostały zatwierdzone przez Szpital dla Chorych Dzieci REB#1000019444.
1. Przygotowanie próbek plwociny z mukowiscydozy
<ol>
	<li>Pobieraj próbki plwociny od pacjentów podczas rutynowych wizyt w klinice mukowiscydozy i trzymaj na lodzie.</li>
	<li>W ciągu pierwszej godziny od pobrania należy przetransportować próbkę plwociny na lodzie do laboratorium badawczego w celu poddania ją obróbce.</li>
</ol>
2. Przetwarzanie plwociny
<ol>
	<li>Zapisać objętość uzyskanej próbki plwociny. Dodać sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) do 2-krotności objętości próbki (tj. 2 części PBS, 1 część próbki).</li>
	<li>Dobrze wymieszać próbkę za pomocą pipety transferowej. Wirować próbkę na najwyższym ustawieniu przez 1 minutę, aby całkowicie wymieszać.</li>
	<li>Porcję 1 ml powyższej mieszaniny rozlać do odpowiedniej liczby 1,5 ml probówek do mikrowirówek i odwirowywać w dół przy 5 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Po odwirowaniu usunąć supernatant i wyrzucić osad.</li>
	<li>Filtr Wysterylizuj supernatant przez filtr 0,22 μm i zbierz w czystej probówce do mikrowirówki. 
	UWAGA: Sterylność filtratu jest testowana przez posiew na agarze LB i płynne podłoże do zaszczepiania.</li>
	<li>Przechowywać supernatant plwociny w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości. 
	UWAGA: Plwocina od wielu pacjentów może być również gromadzona po filtracji.</li>
	<li>Przed użyciem rozcieńczyć filtrat z plwociny 1/10 v/v (100 μl plwociny, 900 μl pożywki) w żądanym podłożu. 
	UWAGA: Tutaj użyto standardowych pożywek bulionowych lizogennych (LB).</li>
</ol>
3. Metoda komorowego szkła nakrywkowego do tworzenia biofilmu
<ol>
	<li>Hoduj interesujący izolat bakteryjny przez noc w żądanej pożywce w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem (200 obr./min). 
	Uwaga: Wykorzystano szereg różnych bakterii, w tym izolaty kliniczne Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, kompleks Burkholderia cepacia i Achromobacter xylosoxidans. Wybór pożywek zależy od szczepów i warunków zainteresowania, jednak podłoża LB mogą być używane do wstępnych eksperymentów.</li>
	<li>Z hodowli nocnej umieścić 40 μl kultury w 4 ml świeżej pożywki i rosnąć przez 3-4 godziny w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem (200 obr./min), aby uzyskać kulturę o gęstości optycznej przy 600 nm (OD600) wynoszącej około 0,5-0,6.</li>
	<li>Rozcieńczyć kulturę od kroku 3.2 do 1/5 w żądanym pożywce z 10% filtratem plwociny lub bez filtratu plwociny (jako kontrola). Można badać inne stężenie filtratu plwociny (tj. 50% lub 100%).</li>
	<li>Użyć 200 μl rozcieńczenia do zasiewu studzienek w komorach szkiełkowych.</li>
	<li>Pozwól bakteriom przyczepić się przez 4 godziny w temperaturze 37 °C bez wstrząsania.</li>
	<li>Po 4 godzinach usuń podłoże i delikatnie zmyj biofilm 1x świeżym podłożem. Zastąp 200 μl świeżej pożywki. 
	UWAGA: Aby zbadać wpływ plwociny na biofilm, świeże podłoże powinno zawierać supernatant plwociny.</li>
	<li>Pozostawić biofilmy do wzrostu przez żądany czas w temperaturze 37 °C bez wstrząsania, wymieniając pożywkę co 12 godzin, bez mycia do czasu mikroskopii. 
	UWAGA: Aby zbadać wpływ supernatantów plwociny na wrażliwość biofilmu na antybiotyki, antybiotyki dodaje się do pożywki po 24 godzinach wzrostu biofilmu i utrzymuje się w pożywce do momentu barwienia i obrazowania biofilmu.</li>
</ol>
4. Barwienie biofilmów i mikroskopia konfokalna
<ol>
	<li>Po pożądanym czasie wzrostu (najlepiej 24-48 godzin) wyjmij pożywkę z dołków komory i delikatnie umyj każdą komorę dwukrotnie 300 μl sterylnego PBS.</li>
	<li>Przygotować mieszaninę barwiącą do biofilmu, mieszając 1 μl każdego barwnika (dostarczonego w zestawie żywotności) na każdy ml potrzebnego roztworu. Zrób barwnik w roztworze wody lub pożywki. 
	UWAGA: Woda jest zalecana przez producenta.</li>
	<li>Dodać 200 μl mieszaniny barwników do każdego dołka ze szkła nakrywkowego w komorze i inkubować w temperaturze pokojowej, w ciemności przez 45 minut.</li>
	<li>Usunąć mieszaninę barwiącą z komór i umyć każdą studzienkę 300 μl sterylnego PBS. Usuń PBS i zastąp świeżą wodą lub nośnikiem.</li>
	<li>Kontynuuj wizualizację biofilmów za pomocą mikroskopii konfokalnej.</li>
</ol>
5. Wizualizacja biofilmów za pomocą mikroskopii konfokalnej
<ol>
	<li>Odczytaj wybarwione biofilmy w komorach natychmiast po barwieniu (w ciągu 1 godziny). Zminimalizuj opóźnienia w wizualizacji szkiełek, barwiąc od 1 do 2 komór 8-dołkowych na raz.</li>
	<li>Obrazowanie należy wykonywać za pomocą mikroskopu konfokalnego z laserami do wzbudzenia i zestawami filtrów do akwizycji. 
	UWAGA: W tym przypadku do wzbudzenia użyto układu konfokalnego z wirującym dyskiem z widmowymi laserami borealis (zielony: 491 nm, czerwony: 561 nm). Zestawy filtrów emisyjnych 515/40 i 624/40 użyto do wizualizacji plam z zestawu żywotności biofilmu.</li>
	<li>Rób zdjęcia za pomocą obiektywu wodnego 25X na mikroskopie konfokalnym z kamerą.</li>
	<li>Użyj Z-Stacks do modelowania biofilmu. Rób zdjęcia co 0,5-1 μm, zaczynając od pierwszej płaszczyzny ostrości do ostatniej ostrej klatki biofilmu (zwykle obejmującej 30-80 μm dla biofilmów trwających 48 godzin)</li>
	<li>Zrób 3-5 zdjęć z każdej studni. 
	UWAGA: Tak więc dla szkła nakrywkowego z 8 studniami zostanie wygenerowanych 24-40 obrazów.</li>
	<li>Zapisz obrazy do analizy. 
	UWAGA: Obrazy powinny być zapisane jako pliki OME-TIFF do analizy za pomocą COMSTAT18,19. Instrukcje dotyczące analizy obrazu biofilmu można znaleźć na stronie http://www.comstat.dk/. Po zaimportowaniu obrazów można przeanalizować takie parametry, jak średnia grubość, biomasa i pokrycie powierzchni dla każdego kanału (czerwony i zielony).</li>
</ol>

<ol><li>Beaudoin, T., Waters, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infections+with+biofilm+formation%3A+selection+of+antimicrobials+and+role+of+prolonged+antibiotic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr.Infect.Dis.J%22%5BJournal%5D)">Infections with biofilm formation: selection of antimicrobials and role of prolonged antibiotic therapy.</a> Pediatr.Infect.Dis.J. , (2016).</li>
<li>Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+microbial+life+on+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.Infect.Dis%22%5BJournal%5D)">Biofilms: microbial life on surfaces.</a> Emerg.Infect.Dis. 8 (9), 881-890 (2002).</li>
<li>Hobley, L., Harkins, C., MacPhee, C. E., Stanley-Wall, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giving+structure+to+the+biofilm+matrix%3A+an+overview+of+individual+strategies+and+emerging+common+themes%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.Rev%22%5BJournal%5D)">Giving structure to the biofilm matrix: an overview of individual strategies and emerging common themes.</a> FEMS Microbiol.Rev. 39 (5), 649-669 (2015).</li>
<li>Katharios-Lanwermeyer, S., Xi, C., Jakubovics, N. S., Rickard, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mini-review%3A+Microbial+coaggregation%3A+ubiquity+and+implications+for+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biofouling%22%5BJournal%5D)">Mini-review: Microbial coaggregation: ubiquity and implications for biofilm development.</a> Biofouling. 30 (10), 1235-1251 (2014).</li>
<li>Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation%3A+a+clinically+relevant+microbiological+process%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.Infect.Dis%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation: a clinically relevant microbiological process.</a> Clin.Infect.Dis. 33 (8), 1387-1392 (2001).</li>
<li>Bjarnsholt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vivo+biofilm%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The in vivo biofilm.</a> Trends Microbiol. 21 (9), 466-474 (2013).</li>
<li>Mah, T. F., Pitts, B., Pellock, B., Walker, G. C., Stewart, P. S., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+basis+for+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance.</a> Nature. 426 (6964), 306-310 (2003).</li>
<li>Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm-specific+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilm-specific antibiotic resistance.</a> Future Microbiol. 7 (9), 1061-1072 (2012).</li>
<li>Beaudoin, T., Zhang, L., Hinz, A. J., Parr, C. J., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biofilm-specific+antibiotic+resistance+gene+ndvB+is+important+for+expression+of+ethanol+oxidation+genes+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The biofilm-specific antibiotic resistance gene ndvB is important for expression of ethanol oxidation genes in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> J. Bacteriol. 194 (12), 3128-3136 (2012).</li>
<li>Beaudoin, T., Aaron, S. D., Giesbrecht-Lewis, T., Vandemheen, K., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+clonal+strains+of+Pseudomonas+aeruginosa+isolated+from+cystic+fibrosis+patients+in+Ontario%2C+Canada%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of clonal strains of Pseudomonas aeruginosa isolated from cystic fibrosis patients in Ontario, Canada.</a> Can. J. Microbiol. 56 (7), 548-557 (2010).</li>
<li>Vidya, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+infection+phenotypes+of+Pseudomonas+aeruginosa+are+associated+with+failure+of+eradication+in+children+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis%22%5BJournal%5D)">Chronic infection phenotypes of Pseudomonas aeruginosa are associated with failure of eradication in children with cystic fibrosis.</a> Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis. , (2015).</li>
<li>Beaudoin, T., Lafayette, S., Nguyen, D., Rousseau, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucoid+Pseudomonas+aeruginosa+caused+by+mucA+mutations+result+in+activation+of+TLR2+in+addition+to+TLR5+in+airway+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.Biophys.Res.Commun%22%5BJournal%5D)">Mucoid Pseudomonas aeruginosa caused by mucA mutations result in activation of TLR2 in addition to TLR5 in airway epithelial cells.</a> Biochem.Biophys.Res.Commun. 428 (1), 150-154 (2012).</li>
<li>Beaudoin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+level+of+p38alpha+mitogen-activated+protein+kinase+activation+in+airway+epithelial+cells+determines+the+onset+of+innate+immune+responses+to+planktonic+and+biofilm+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22J.Infect.Dis%22%5BJournal%5D)">The level of p38alpha mitogen-activated protein kinase activation in airway epithelial cells determines the onset of innate immune responses to planktonic and biofilm Pseudomonas aeruginosa.</a> J.Infect.Dis. 207 (10), 1544-1555 (2013).</li>
<li>LaFayette, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis-adapted+quorum+sensing+mutants+cause+hyperinflammatory+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.Adv%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis-adapted quorum sensing mutants cause hyperinflammatory responses.</a> Sci.Adv. 1 (6), e1500199(2015).</li>
<li>Staudinger, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditions+associated+with+the+cystic+fibrosis+defect+promote+chronic+Pseudomonas+aeruginosa+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Am.J.Respir.Crit.Care+Med%22%5BJournal%5D)">Conditions associated with the cystic fibrosis defect promote chronic Pseudomonas aeruginosa infection.</a> Am.J.Respir.Crit.Care Med. 189 (7), 812-824 (2014).</li>
<li>Kennedy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+Tobramycin+against+Cystic+Fibrosis+Isolates+of+Burkholderia+cepacia+Complex+Grown+as+Biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Activity of Tobramycin against Cystic Fibrosis Isolates of Burkholderia cepacia Complex Grown as Biofilms.</a> Antimicrob.Agents Chemother. 60 (1), 348-355 (2015).</li>
<li>Tom, S. K., Yau, Y. C., Beaudoin, T., LiPuma, J. J., Waters, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+High-Dose+Antimicrobials+on+Biofilm+Growth+of+Achromobacter+Species+Isolated+from+Cystic+Fibrosis+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Effect of High-Dose Antimicrobials on Biofilm Growth of Achromobacter Species Isolated from Cystic Fibrosis Patients.</a> Antimicrob.Agents Chemother. 60 (1), 650-652 (2015).</li>
<li>Heydorn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+biofilm+structures+by+the+novel+computer+program+COMSTAT%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT.</a> Microbiology. 146 (Pt 10), 2395-2407 (2000).</li>
<li>Vorregaard, M. Comstat2 - a modern 3D image analysis environment for biofilms
 . <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVorregaard%2C+M+%22Informatics+and+Mathematical+Modelling%22">Informatics and Mathematical Modelling</a>. , Technical University of Denmark. Kongens Lyngby, Denmark. (2008).</li>
<li>Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+Biofilm+Formation+in+an+8-well+Chamber+Slide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide.</a> J. Vis. Exp. (47), e2481(2011).</li>
</ol>

Opisane tu metody pozwalają na wizualizację biofilmów bakteryjnych wyhodowanych w obecności produktów egzogennych. Nic dziwnego, że produkcja egzoproduktów ma znaczenie przy stosowaniu tego typu systemu. Na przykład ditiotreitol (DTT) jest często stosowany w próbkach ludzkiej plwociny, aby pomóc w ich upłynnieniu. Jednak sam wpływ naziemnej telewizji cyfrowej może zmniejszyć rozwój i żywotność biofilmu (dane nie pokazane). W związku z tym konieczne są odpowiednie kontrole w każdych warunkach. Co więcej, dodanie produktów...

Biofilmy bakteryjne to grupy mikroorganizmów, które są połączone ze sobą i zamknięte w samowydzielającej się matrycy. 1,2 Klasycznie reprezentują one bakterie fizycznie przyczepione do powierzchni abiotycznej lub biotycznej utworzonej w warunkach przepływu. Wykazano również, że biofilmy rosną w warunkach statycznych (brak przepływu) i dystalnie od powierzchni, takich jak granica powietrza i cieczy w basenach termalnych lub błonkach utworzonych w probówkach. Te biofilmy są od dawna znane w środowisku i są główną szkodą dla procesów przemysłowych, ponieważ mogą tworzyć się w zbiornikach wodnych lub w rurach, powodując biofouling, korozję i zatory wodne. 3,4
Biofilmy są również kluczowe w placówkach służby zdrowia, ponieważ wykazano, że są zaangażowane w infekcje związane z cewnikiem, infekcje płuc u pacjentów z mukowiscydozą, a także w wielu innych infekcjach. 5,6 Jedną z cech charakterystycznych zakażeń biofilmem jest zmniejszona podatność bakterii na antybiotyki i upośledzony klirens przez wrodzony układ odpornościowy. 7-9 Najbardziej dobrze zbadane, klinicznie istotne scenariusze dotyczące zakażenia opartego na biofilmie występują u pacjentów z mukowiscydozą (CF), którzy są przewlekle zakażeni biofilmami Pseudomonas aeruginosa. P. aeruginosa może ulegać wielu zmianom podczas powstawania przewlekłej infekcji, które bardzo utrudniają jej leczenie. 10,11 Biofilmy mogą w różny sposób aktywować wrodzoną odporność i napędzać stan zapalny. 12-14 Ponieważ zakażenia te prowadzą do zwiększonej zachorowalności i śmiertelności u pacjentów z mukowiscydozą, kluczowe znaczenie ma zrozumienie czynników, które mogą wpływać na rozwój biofilmu w tym kontekście.
Ostatnie badanie sugeruje, że czynniki gospodarza są kluczowe w tworzeniu agregatów biofilmu P. aeruginosa. 15 Te biofilmy przyczyniają się do zmniejszenia podatności na antybiotyki i mechanizmy obronne gospodarza. Obecność czynników pochodzących od gospodarza, takich jak elastaza neutrofilowa, a także produkty wydzielane przez mikroorganizmy obecne w płucach mukowiscydozy, mogą w znacznym stopniu modulować tworzenie i rozwój biofilmu. 16 Ponadto biofilmy oddziałują z gospodarzem, modulując ekspresję wielu szlaków i inicjując stan zapalny. Podczas gdy metody o wysokiej przepustowości, takie jak standardowy test fioletu krystalicznego, mogą dostarczyć pewnych informacji na temat procesu biofilmu, wizualizacja biofilmu w odpowiedzi na te czynniki dostarcza bardziej szczegółowych informacji.
W tym manuskrypcie opisujemy metodę wykorzystania czynników z plwociny pacjentów z mukowiscydozą do badania rozwoju biofilmów in vitro. Metoda ta pozwala na szybką wizualizację biofilmów narażonych na działanie plwociny zawierającej czynniki gospodarza przy użyciu komercyjnego zestawu do sprawdzania żywotności biofilmu. Technika ta może być wykorzystana do wizualnej identyfikacji zmian, które zachodzą podczas wzrostu biofilmu w obecności produktów egzogennych i stanowi ulepszoną metodę analizy zmian w rozwoju biofilmu w różnych warunkach.

<table><tbody><tr><td>Lab-Tek II Komorowe szkło osłonowe, #1,5 borokrzemian, 8-dołkowe</td><td>Thermo Sicher Scientific</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>Filmtracer Zestaw do nawożenia żywych/martwych biofilmów</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L10316</td><td></td></tr><tr><td>Płytki z agarem do krwi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R10215</td><td>Potwierdzanie żywotności poprzez liczenie CFU lub wybór kolonii do inokulacji</td></tr><tr><td>COMSTAT</td><td>Oprogramowanie dostępne online</td><td></td><td>COMSTAT to oprogramowanie do analizy obrazów biofilmu. Dostępne www.comstat.dk&nbsp;</td></tr><tr><td>Millers LB Broth</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12780-052</td><td>Standardowe podłoża do nocnego wzrostu gowth/biofilmu</td></tr><tr><td>Millex-GV Filtry strzykawkowe</td><td>Millipore</td><td>SLGV013SL</td><td>Filtrowanie nadnantów plwociny</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (Dulbecco A)</td><td>Oxoid</td><td>BR0014G</td><td>Mycie komór biofilmu po usunięciu podłoża</td></tr><tr><td>Zeiss AxioVert 200M</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu C9100-13 EM-CCD</td><td>QS Technologies Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectral Borealis</td><td>Qs Technologies Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perkin Elmer Volocity</td><td>QS Technologies Inc.</td><td></td><td>Instrukcje dotyczące tego oprogramowania można znaleźć pod adresem: http://cellularimaging.perkinelmer.com/pdfs/manuals/VolocityuserGuide.pdf</td></tr></tbody></table>

wizualizacja wpływu plwociny na rozwój biofilmu za pomocą komorowego modelu szkła nakrywkowego

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Biofilmy składają się z grup bakterii zamkniętych w samowydzielającej się matrycy. Odgrywają one ważną rolę w skażeniu przemysłowym, a także w rozwoju i utrzymywaniu się wielu infekcji związanych ze zdrowiem. Jeden z najlepiej opisanych i przebadanych biofilmów w chorobach człowieka występuje w przewlekłym zakażeniu płuc pacjentów z mukowiscydozą. Badając biofilmy w kontekście gospodarza, wiele czynników może wpływać na powstawanie i rozwój biofilmu. Aby określić, w jaki sposób czynniki gospodarza mogą wpływać na tworzenie i rozwój biofilmu, zastosowaliśmy metodę szkła nakrywkowego ze statyczną komorą do hodowli biofilmów w obecności czynników pochodzących od gospodarza w postaci supernatantów plwociny. Bakterie są wysiewane do komór i wystawiane na działanie filtratów plwociny. Po 48 godzinach wzrostu biofilmy są barwione komercyjnym zestawem do sprawdzania żywotności biofilmu przed mikroskopią konfokalną i analizą. Po pozyskaniu obrazu właściwości biofilmu można ocenić za pomocą różnych platform oprogramowania. Metoda ta pozwala nam zobrazować kluczowe właściwości wzrostu biofilmu w obecności różnych substancji, w tym antybiotyków.

Ogólny schemat eksperymentu przedstawiono na Rysunku 1. Zastosowanie tego protokołu zapewnia wygodną metodę wizualizacji zmian w biofilmach hodowanych przez różne okresy czasu (np. 24, 48 lub 72 h). Co istotne, w celu wizualizacji zmian w rozwoju biofilmu można dodać sygnały egzogenne, takie jak filtrate z plwociny. Jak pokazano na Rysunku 2, obecność 10% filtrate z plwociny może zmienić architekturę biofilmu (Rysunek 2A, dolne p...

Ten protokół opisuje wizualizację rozwoju biofilmu po ekspozycji na czynniki gospodarza za pomocą modelu komory szkiełkowej. Model ten pozwala na bezpośrednią wizualizację rozwoju biofilmu, a także analizę parametrów biofilmu za pomocą programów komputerowych.

Wizualizacja wpływu plwociny na rozwój biofilmu za pomocą komorowego modelu szkła nakrywkowego

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wizualizacja i ilościowe określenie zmian w biofilmach w odpowiedzi na obecność plwociny i antybiotyków. Metoda ta może być wykorzystywana przez badaczy do udzielenia odpowiedzi na kluczowe pytania, takie jak wpływ obecności plwociny na skuteczność różnych antybiotyków przeciwko bakteryjnym biofilmom. Główną zaletą tej metodologii jest możliwość zaobserwowania zmian zachodzących w biofilmach w odpowiedzi na różne czynniki.Aby rozpocząć eksperyment, należy odnotować objętość wcześniej pobranej próbki plwociny. Dodać sól fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS) w ilości dwukrotnej objętości próbki. Następnie, używając pipety transferowej, dokładnie wymieszać próbkę.Mieszaj próbkę w wortexie na najwyższych obrotach przez jedną minutę do całkowitego wymieszania. Przenieś alikwoty po 1 mL mieszaniny do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL. Następnie odwiruj zawartość probówek.Po wirowaniu należy zebrać nadsącz, a osad odrzucić. Nadsącz należy wysterylizować poprzez filtrację przez filtr 0,22 mikrona i zebrać do czystej probówki do mikrocentryfugi. Nadsącz z plwociny należy przechowywać w temperaturze 80 stopni Celsjusza do późniejszego użycia.Przenieś 40 µL wcześniej przygotowanej hodowli do czterech mililitrów świeżej pożywki Luria broth (pożywka LB) i inkubuj bakterie do uzyskania gęstości optycznej 0,55 przy 600 nm. Następnie rozcieńcz 100 µL hodowli o OD 0,5 w 400 µL przygotowanych 10% filtratów plwociny w pożywce LB. Użyj 200 µL rozcieńczenia do zaszczepienia studzienek komór przesuwczych. Pozostaw bakterie na cztery godziny w temperaturze 37 °C bez wytrząsania, aby umożliwić ich przytwierdzenie.Po czterech godzinach usunąć pożywkę i delikatnie wypłukać biofilm świeżym 1X LB. Pozostałą pożywkę zastąpić 200 microliters świeżego LB. Pozostawić biofilmy do wzrostu w temperaturze 37 degrees Celsius bez wytrząsania. Wymieniać pożywkę co 12 hours bez płukania, aż biofilm będzie gotowy do badania mikroskopowego. Bardzo ważne jest, aby delikatnie płukać szkiełka, aby nie uszkodzić przytwierdzonych bakterii.Po zakończeniu wzrostu należy usunąć pożywkę z dołków komory i delikatnie przemyć każdą komorę dwukrotnie 300 µL sterylnego PBS. Następnie, aby przygotować mieszaninę do barwienia biofilmu, należy dodać jeden mikrolitr każdego z barwników zawartych w zestawie do badania żywotności na każdy mililitr wymaganego roztworu i wymieszać go. Optymalna ilość barwnika oraz czas barwienia są dobierane empirycznie dla każdego organizmu.Do każdej studni szkiełka podstawowego z komorami dodaj 200 µL mieszaniny barwiącej. Inkubuj szkiełko. Po inkubacji usuń mieszaninę barwiącą z komór i przemyj każdą studnię 300 µL sterylnego PBS.Zastąp PBS świeżą pożywką. Na koniec przeprowadź wizualizację za pomocą mikroskopii konfokalnej. Reprezentatywne obrazy izolatów klinicznych kompleksu Burkholderia cepacia (BCC) po 48 godzinach wzrostu w komorach szkiełek podstawowych z samą pożywką lub w obecności 10% filtratów plwociny wykazują, że ich obecność może zmieniać architekturę biofilmu.Obrazy przeanalizowano za pomocą oprogramowania Comstat w celu uzyskania kluczowych parametrów biofilmu, w tym średniej grubości biofilmu, która wzrosła po traktowaniu 10% plwociną. Aby ocenić wpływ różnych czynników na wzrost biofilmu, izolaty kliniczne hodowano w samych podłożach lub z dodatkiem plwociny, a następnie traktowano antybiotykiem lub nie. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak tworzyć i traktować biofilmy na szkiełkach podstawkowych z komorami oraz jak przygotowywać je do barwienia i analizy konfokalnej.

visualizing-effects-sputum-on-biofilm-development-using-chambered

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Niniejsza praca opisuje różne metody hodowli biofilmu Pseudomonas aeruginosa na hodowlach ludzkich komórkach nabłonkowych dróg oddechowych. Protokoły te można dostosować do badania różnych aspektów tworzenia biofilmu, w tym wizualizacji biofilmu, barwienia biofilmu, pomiaru jednostek tworzących kolonie (CFU) w biofilmie oraz badania cytotoksyczności biofilmu.

Modele kokultury biofilmów Pseudomonas aeruginosa hodowanych na żywych komórkach dróg oddechowych człowieka

Niniejszy artykuł opisuje procedurę tworzenia i wizualizacji biofilmu bakteryjnego hodowanego w szkiełku przedmiotowym z komorą...

In vitro tworzenie biofilmu w szkiełku przedmiotowym z 8-komorowym układem

Źródło: Beaudoin, T. i inni. Wizualizacja wpływu plwociny na rozwój biofilmu za pomocą komorowego modelu osłonowego. J. Vis. Exp. (2016)Ten film pokazuje użycie komorowego szkła osłonowego do badania wpływu czynników gospodarza plwociny pochodzących od pacjentów z mukowiscydozy na rozwój bakteryjnego biofilmu.

Metoda komorowego szkła pokrywowego do tworzenia biofilmu bakteryjnego in vitro

Źródło: Beaudoin, T. i inni. Wizualizacja wpływu plwociny na rozwój biofilmu za pomocą komorowego modelu osłonowego. J. Vis. Exp. (2016)Ten film prezentuje metodę in vitro do oceny, jak plwocina mukowiscydozy pochodząca od pacjentów wpływa na tworzenie biofilmu bakteryjnego. Za pomocą szkiełek komorowych, barwienia fluorescencyjnego oraz mikroskopii konfokalnej ujawnia się zwiększona grubość, zmieniona architektura oraz wyższa żywotna biomasa w biofilmach hodowanych ze plwociną, podkreślając...

Konfokalne obrazowanie biofilmów bakteryjnych indukowanych przez filtry plwociny u pacjentów z mukowiscydozą

Omawiane są protokoły badania tworzenia się biofilmu w urządzeniu mikroprzepływowym, które naśladuje porowate media. Urządzenie mikroprzepływowe składa się z szeregu mikrofilarów i badane jest tworzenie biofilmu przez Pseudomonas fluorescens w tym urządzeniu.

Protokół tworzenia strumienia biofilmu w urządzeniu mikroprzepływowym z mikrofilarami

To badanie przedstawia rozwój powtarzalnych metodologii badania inhibitorów biofilmu i ich wpływu na wielokomórkowość Bacillus subtilis.

Metodologie badania biofilmów B. subtilis jako modelu charakteryzującego małocząsteczkowe inhibitory biofilmu

Drogi oddechowe pacjentów z mukowiscydozą (CF) są idealnym środowiskiem dla rozwoju patogenów mikrobiologicznych. W manuskrypcie opisano nowatorską metodę badania mikrobiomu płuc mukowiscydozy w środowisku, które naśladuje miejsce, w którym powodują one chorobę i w jaki sposób zmiany warunków chemicznych mogą wpływać na dynamikę drobnoustrojów.

Model WinCF - niedrogi i łatwy w obsłudze mikrokosmos oskrzelika zatkanego śluzem do badania mikrobiologii infekcji płuc

Ten protokół opisuje użycie konfigurowalnego zautomatyzowanego urządzenia mikroprzepływowego do wizualizacji tworzenia biofilmu u Candida albicans w warunkach fizjologicznych gospodarza.

Wizualizacja tworzenia się biofilmu u Candida albicans za pomocą zautomatyzowanego urządzenia mikroprzepływowego

Opisujemy montaż, działanie i czyszczenie urządzenia przepływowego zaprojektowanego do obrazowania tworzenia się biofilmu grzybów w czasie rzeczywistym podczas przepływu. Dostarczamy również i omawiamy algorytmy ilościowe, które można zastosować na pozyskanych obrazach.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym i kwantyfikacja rozwoju biofilmu grzybów przy użyciu dwufazowego systemu przepływu recyrkulacyjnego

Wywołane przez środki przeciwbakteryjne zmiany w architekturze biofilmu Pseudomonas aeruginosa różnią się między klinicznymi izolatami hodowanymi od pacjentów z mukowiscydozą i przewlekłą infekcją płuc. Po mikroskopii konfokalnej oprogramowanie COMSTAT może być wykorzystane do ilościowego określenia zmian w architekturze biofilmu (np. powierzchni, grubości, biomasy) dla poszczególnych izolatów w celu oceny skuteczności środków przeciwinfekcyjnych.

Kwantyfikacja wpływu środków przeciwdrobnoustrojowych na architekturę biofilmu in vitro przy użyciu oprogramowania COMSTAT

Poznaj metodę wizualizacji i kwantyfikacji zmian w biofilmach bakteryjnych pod wpływem plwociny i antybiotyków przy użyciu komorowego modelu szkła nakrywkowego.

Wizualizacja wpływu plwociny na rozwój biofilmu za pomocą komorowego modelu szkła nakrywkowego

Przeglądaj więcej filmów