Wizualizacja wpływu plwociny na rozwój biofilmu za pomocą komorowego modelu szkła nakrywkowego
December 14th, 2016
Ten protokół opisuje wizualizację rozwoju biofilmu po ekspozycji na czynniki gospodarza za pomocą modelu komory szkiełkowej. Model ten pozwala na bezpośrednią wizualizację rozwoju biofilmu, a także analizę parametrów biofilmu za pomocą programów komputerowych.
Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja i ilościowe określenie zmian w biofilmach w odpowiedzi na plwocinę i antybiotyki. Metoda ta może być wykorzystana przez naukowców do zrozumienia kluczowych pytań, takich jak to, w jaki sposób obecność plwociny może wpływać na skuteczność różnych antybiotyków przeciwko biofilmom bakteryjnym. Główną zaletą tej metodologii jest to, że pozwala ona jednostkom zobaczyć zmiany zachodzące w biofilmach w odpowiedzi na różne czynniki.
Aby rozpocząć eksperyment, zapisz objętość wcześniej uzyskanej próbki plwociny. Dodać sól fizjologiczną buforowaną fosforanami lub PBS, dodać dwukrotność objętości próbki. Następnie za pomocą pipety transferowej dokładnie wymieszaj próbkę.
Wirować próbkę na najwyższym ustawieniu przez jedną minutę, aby całkowicie ją wymieszać. Podaniec jeden mililitr mieszaniny do 1,5 mililitrowych probówek wirówek. Następnie odkręć rurki.
Po odwirowaniu zachować supernatant i wyrzucić osad. Filtr: Wysterylizuj supernatant przez filtr 0,22 mikrona i zbierz go w czystej probówce do mikrowirówki. Przechowuj supernatant plwociny w temperaturze 80 stopni Celsjusza do wykorzystania w przyszłości.
Umieść 40 mikrolitrów wcześniej przygotowanej kultury w czterech mililitrach świeżego bulionu Luria lub pożywki LB i wyhoduj bakterie, aby uzyskać kulturę o gęstości optycznej 0,55 przy 600 nanometrach. Następnie rozcieńczyć 100 mikrolitrów kultury 0,5 OD w 400 mikrolitrach przygotowanych 10% filtratów plwociny w LB. Użyj 200 mikrolitrów rozcieńczenia do wysiewu dołków komór szkiełkowych. Pozwól bakteriom przyczepić się przez cztery godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza bez wstrząsania.
Po czterech godzinach usuń podłoże i delikatnie umyj biofilm 1X fresh LB. Zastąp pozostałą pożywkę 200 mikrolitrami świeżego LB. Pozwól biofilmom rosnąć w temperaturze 37 stopni Celsjusza bez wstrząsania. Wymieniaj pożywkę co 12 godzin bez mycia, aż biofilm będzie gotowy do mikroskopii. Bardzo ważne jest, aby delikatnie umyć szkiełka, aby nie zakłócić przyczepionych bakterii.
Po wzroście wyjmij pożywkę z dołków komory i delikatnie umyj każdą komorę dwa razy 300 mikrolitrami sterylnego PBS. Następnie, aby przygotować mieszaninę do barwienia biofilmu, dodaj jeden mikrolitr każdego barwnika dostarczonego w zestawie żywotności do każdego mililitra potrzebnego roztworu i wymieszaj roztwór. Optymalna ilość barwnika i czas barwienia są określane empirycznie dla każdego organizmu.
Dodaj 200 mikrolitrów mieszaniny barwiącej do każdej studzienki komorowego szkła nakrywkowego. Inkubować szkło nakrywkowe. Po inkubacji usunąć mieszaninę barwiącą z komór i umyć każdą studzienkę 300 mikrolitrami sterylnego PBS.
Wymień PBS na nowy nośnik. Na koniec przystąp do wizualizacji za pomocą mikroskopii konfokalnej. Reprezentatywne obrazy kompleksu Burkholderia cepacia lub izolatów klinicznych BCC, po 48 godzinach wzrostu w komorowym szkle nakrywkowym z samymi pożywkami lub w obecności 10% filtratów plwociny pokazują, że ich obecność może zmienić architekturę biofilmu.
Obrazy analizowano za pomocą oprogramowania Comstat w celu uzyskania kluczowych parametrów biofilmu, w tym średniej grubości biofilmu, która zwiększała się po potraktowaniu 10% plwociną. Aby ocenić wpływ różnych czynników na wzrost biofilmu, izolaty kliniczne hodowano tylko w pożywce lub z plwociną i leczono antybiotykiem lub bez niego. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak tworzyć i przetwarzać biofilmy na komorowym szkle nakrywkowym oraz przygotowywać je do barwienia i analizy konfokalnej.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół opisuje wizualizację i ilościową analizę rozwoju biofilmu w reakcji na plwocinę i antybiotyki za pomocą modelu komory na szkle. Model ten umożliwia bezpośrednie obserwowanie zmian w biofilmie i pozwala na szczegółową analizę przy użyciu oprogramowania komputerowego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Badania nad biofilmem
- Skuteczność antybiotyków
Tło
- Biofilmy to złożone społeczności mikroorganizmów.
- Rozumienie reakcji biofilmu na antybiotyki jest kluczowe dla strategii leczenia.
- Plwocina może wpływać na skuteczność antybiotyków wobec biofilmów.
- Celem tego badania jest skuteczne wizualizowanie tych interakcji.
Cel badania
- Wizualizacja zmian w biofilmach z powodu ekspozycji na plwocinę i antybiotyki.
- Ilościowa analiza wpływu czynników gospodarza na rozwój biofilmu.
- Zwiększenie zrozumienia skuteczności antybiotyków wobec biofilmów.
Stosowane metody
- Zbieranie próbek plwociny.
- Rozcieńczanie plwociny buforem fosforanowym (PBS).
- Mieszanie próbek dla jednorodności.
- Wizualizacja rozwoju biofilmu za pomocą modelu komory na szkle.
Główne wyniki
- Bezpośrednia wizualizacja zmian w biofilmie w odpowiedzi na antybiotyki.
- Ilościowa analiza parametrów biofilmu.
- Wgląd w interakcję między plwociną a reakcją biofilmu.
- Demonstracja skuteczności różnych antybiotyków.
Wnioski
- Model komory na szkle jest skuteczny w badaniu dynamiki biofilmu.
- Czynniki gospodarza, takie jak plwocina, znacząco wpływają na zachowanie biofilmu.
- Ta metodologia może wpłynąć na przyszłe strategie leczenia antybiotykami.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative visualization of biofilm development in the presence of host-derived sputum and antibiotics addresses a critical challenge in anti-infective discovery and translational model fidelity. This approach enables mechanistic de-risking by revealing how host factors modulate antibiotic efficacy and biofilm architecture, informing early-stage target validation and screening strategies. The method supports predictive confidence for portfolio decisions in infectious disease R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of therapeutic hypotheses regarding host factor influence on biofilm resilience.
- Supports biological de-risking by quantifying biofilm response to antibiotics in disease-relevant matrices.
- Facilitates functional target validation by measuring biofilm viability and architecture under defined conditions.
Screening & Assay Development
- Prepares validated biofilm systems for downstream compound screening in the presence of clinically relevant factors.
- Standardizes assay conditions for reproducibility and quantitative comparison across experimental arms.
- Generates robust, quantitative outputs such as biofilm thickness and viability for reliable compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro biofilm models with disease-relevant host environments, enhancing translational continuity.
- Supports risk-adjusted advancement by revealing antibiotic performance in complex biological matrices.
- Provides mechanistic insight into host-pathogen-drug interactions for predictive de-risking.
Pipeline & Workflow Integration
This chambered coverglass model integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven testing of antibiotic efficacy in host-mimetic biofilm systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on host factor impact and pathway clarification in biofilm development.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts for compound prioritization in biofilm contexts.
- Analytics: Provides image-based measurements and statistical outputs for cross-condition comparison.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models by incorporating disease-relevant matrices.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, adaptable platform for repeated evaluation of anti-biofilm strategies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in anti-infective R&D.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of biofilm assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by revealing context-dependent drug efficacy.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on performance in host-mimetic systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in biofilm culture, confocal microscopy, and quantitative image analysis.
- Needs access to chambered coverglass systems, viability staining kits, and analytical software such as Comstat.
- Demands cross-team standardization of sample preparation and imaging protocols.
- May require adaptation for different bacterial species or host-derived matrices.
- Dependent on empirical optimization of staining and imaging parameters for each organism.
