Name: Wizualizacja steroidogennej tkanki międzynerkowej i jej mikrośrodowiska naczyniowego u danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Poznaj metodę wykrywania zróżnicowanych komórek steroidogennych w gruczolu międzynerkowym danio pręgowanego. Technika ta umożliwia analizę mikrośrodowiska naczyniowego i badanie rozwoju układu endokrynnego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Prof. Christophowi Englertowi i Prof. Didierowi Stainierowi za podarowanie odpowiednio szczepów Tg(wt1b:GFP) li1 i Tg(kdrl:EGFP)s843, a także Taiwan Zebrafish Core Facility za dostarczenie Tg(kdrl:mCherry)ci5. Badanie to było wspierane przez granty z tajwańskiego Ministerstwa Nauki i Technologii (96-2628-B-029-002-MY3, 101-2313-B-029-001, 102-2628-B-029-002-MY3, 102-2321-B-400-018).

Oświadczenie etyczne: Wszystkie procedury eksperymentalne na danio pręgowanym zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Tunghai (Zatwierdzenie IRB nr 101-12) i przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi.
1. Roztwory podstawowe do barwienia aktywności enzymatycznej 3β-HSD
<ol>
	<li>Przygotować trans-dehydroandrosteron [10 mg/ml w dimetylosulfotlenku (DMSO)].</li>
	<li>Przygotować hydrat dinukleotydu β-nikotynamidoadeninowego (1,2 mg/ml w 0,1 M buforze fosforanowym, pH 7,2).</li>
	<li>Przygotuj amid kwasu nikotynowego (witamina B3, 50 mg/ml wH2O).</li>
	<li>Przygotować 4-nitro niebieski tetrazolium (50 mg/ml w 70% dimetyloformamidzie).</li>
	<li>Wszystkie te składniki przelać do probówek do mikrofuge i przechowywać w temperaturze -20 °C. 
	UWAGA: Z naszego doświadczenia wynika, że wielokrotne zamrażanie i rozmrażanie podwielokrotności wszystkich wyżej wymienionych roztworów nie wpływa na intensywność barwienia aktywnością 3β-Hsd.</li>
</ol>
2. Barwienie aktywności 3β-Hsd w całości
UWAGA: Aktywność enzymatyczna 3β-Hsd jest wykrywalna w zarodkach danio pręgowanego już po 28 godzinach od zapłodnienia (hpf) podczas hodowli w temperaturze 28,5 °C, co jest zgodne z początkiem ekspresji mRNA hsd3b12,7. Protokół barwienia aktywności 3β-Hsd w tym badaniu oparty jest na wcześniej opisanej metodzie8 i został uznany za skuteczny u rozwijającego się danio pręgowanego do 7 dni po zapłodnieniu9. Do analizy mikrośrodowiska naczyniowego międzynerkowej tkanki steroidogennej należy zastosować barwienie aktywności 3β-Hsd w całości do linii transgenicznych wyrażających fluorescencję specyficzną dla śródbłonka, takich jak Tg(kdrl:EGFP)s843 14 i Tg(kdrl:mCherry)ci5 15. Aby przeanalizować międzynerkową tkankę steroidogenną z uwzględnieniem rozwoju nerek danio pręgowanego, barwienie aktywnością 3β-Hsd można zastosować do ryby Tg(wt1b:GFP)li1 16, gdzie nakreślone jest tworzenie kłębuszków nerkowych i kanalików pronerkowych.
<ol>
	<li>Traktuj rozwijającego się danio pręgowanego, inkubując je w 0,03% fenylotiomocznika w wodzie z jaj (0,06 mg/l soli rafowej w wodzie dejonizowanej), zaczynając od etapu od 12 do 24 hpf, aby zahamować tworzenie pigmentu.</li>
	<li>Utrwalić zdekorionowane zarodki lub larwy w (A) 4% paraformaldehydzie (PFA) w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) uzupełnionej 0,1% Tween 20 (PFAT) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT) lub (B) 2% PFAT przez noc w temperaturze 4 °C lub przez 2 godziny w temperaturze 4 °C, a następnie 4 godziny w temperaturze RT. 
	Uwaga: PFA jest toksyczny przez drogi oddechowe i kontakt ze skórą. Działa destrukcyjnie na skórę, błony śluzowe, oczy i górne drogi oddechowe.</li>
	<li>Myj zarodki 4x przez 10 minut PBS uzupełnionym 0,1% Tween 20 (PBST) w RT. 
	UWAGA: Bardzo ważne jest, aby nie suszyć próbek podczas wymiany roztworów myjących.</li>
	<li>Świeżo przygotować roztwór barwiący przed reakcjami (Tabela 1). Przygotuj, odwiruj i odwiruj części A i B w oddzielnych probówkach. 
	UWAGA: Dodanie wszystkich składników bezpośrednio do jednej probówki spowodowałoby silne opady.</li>
	<li>Dodać cały roztwór z części A do całego roztworu z części B, dobrze wymieszać, aby przygotować roztwór barwiący i natychmiast rozprowadzić 1 ml do każdej probówki do mikrofuge zawierającej utrwalone i umyte zarodki.</li>
	<li>Owiń rurki do mikrofug folią aluminiową, aby chronić je przed światłem i umieść na rotatorze lub platformie kołyszącej, aby delikatnie potrząsnąć przy RT.</li>
	<li>Empirycznie określ czas reakcji, monitorując sygnały chromogenne za pomocą mikroskopii. Z czasem pojawią się niewielkie opady; Nie będą one jednak zakłócać procesu reakcji. 
	UWAGA: W przypadku zarodków utrwalonych w temperaturze 28 hpf, barwienie w temperaturze 25 °C przez 4 godziny generuje wyraźny sygnał w tkance międzynerkowej.</li>
	<li>Zatrzymaj reakcję myjąc 4x przez 10 min w PBST. Jeśli nie jest wymagana dalsza analiza immunohistochemiczna (IHC), należy utrwalić barwione zarodki 4% PFAT przez 60 minut w temperaturze pokojowej. W przeciwnym razie umyte zarodki należy przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.</li>
	<li>W przypadku mikroskopii z pełnym mocowaniem oczyść wybarwione, utrwalone i umyte zarodki za pomocą 50% glicerolu w PBS, ustaw je stroną grzbietową skierowaną do góry na szkiełku i obserwuj za pomocą mikroskopu pionowego w jasnym oświetleniu polowym. 
	UWAGA: Aby uzyskać obraz morfologii tkanki międzynerkowej w wysokiej rozdzielczości, zaleca się analizę płaskiego zarodka barwionego aktywnością 3β-Hsd i odżółkowanego. Ponieważ steroidogenna tkanka międzynerkowa znajduje się tuż nad woreczkiem żółtkowym, brzuszna analiza płasko zamontowana tkanki międzynerkowej umożliwia bezpośrednią i wyraźną obserwację morfologii międzynerkowej17.</li>
</ol>
3. Analiza IHC zarodków barwionych aktywnością 3β-HSD
UWAGA: W celu analizy mikrośrodowiska naczyniowego tkanki steroidogennej, zarodki barwione aktywnością 3β-Hsd z transgenicznym reporterem fluorescencyjnym specyficznym dla śródbłonka są poddawane przekrojowi wibratomu poprzecznego i późniejszej analizie IHC12,18.
<ol>
	<li>Po utrwaleniu
	<ol>
		<li>Po utrwaleniu 3β-Hsd barwione aktywnością i umyte zarodki z 2% PFA uzupełnione 1% Triton X-100 przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C i myć 4x przez 10 minut w PBS zawierającym 1% Triton X-100 (PBSTx) w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Osadzanie
	<ol>
		<li>Przygotować 4% niskotopliwej agarozy, rozpuszczając ją w PBS w temperaturze 95 °C, przelać do probówek do mikrofuge i przechowywać w temperaturze 4-8 °C.</li>
		<li>Rozpuść podwielokrotność 4% niskotopliwej agarozy w temperaturze 70 °C przez 10 minut, a następnie utrzymuj podwielokrotność w temperaturze 47 °C. Zanurz każdy zarodek w stopionej 4% niskotopliwej agarozie w odłączonej nasadce z probówki do mikrofuzy o pojemności 1,5 ml, która służy jako forma, i pozostaw do ostygnięcia do stwardnienia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sekcja wibratomu
	<ol>
		<li>Przyklej kawałek papierowej taśmy do suchej platformy wibratomu.</li>
		<li>Usuń stwardniały blok agarozy z formy za pomocą żyletki. Nałóż superglue na taśmę papierową na platformie i przymocuj blok agarozy do taśmy papierowej, przednią stroną próbki skierowaną do góry. Przyciąć blok agarozy do kształtu trapezoidalnego graniastosłupa, z około 4 mm i 8 mm z każdej strony odpowiednio górnej i dolnej fasety.</li>
		<li>Przepłukać blok agarozy zawierający próbkę zimnym PBS uzupełnionym 0,5% Triton X-100 (0,5% PBSTx) za pomocą zakraplacza.</li>
		<li>Pokrój blok agarozy na odcinki 100 μm zgodnie z instrukcją obsługi wibratomu. Stale płucz blok agarozy, aby zapobiec wysuszeniu. Po przecięciu każdego plastra należy wyjąć go z wibratomu za pomocą igły strzykawkowej 26 G i przenieść na płytkę punktową zawierającą zimne 0,5% PBSTx (500 μl / studziennik).</li>
		<li>Zebrać skrawki tkanek o dodatniej aktywności 3β-Hsd, sprawdzając je pod mikroskopem preparacyjnym, i przenieść skrawki za pomocą końcówki pipety z odciętym końcem (około 1 mm średnicy wewnętrznej przy otworze) do 96-dołkowej płytki zawierającej zimne 0,5% PBSTx (150 μl/dołek). Po tym etapie próbki tkanek zwykle odłączają się od bloku agarozowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przepuszczalność i mycie
	<ol>
		<li>Plastry myć 6x przez 15 min w 0,5% PBSTx w RT, 10 min w PBS i 4x przez 10 min w PBS z dodatkiem 1% albuminy surowicy bydlęcej/1% DMSO/0,1% Triton X-100 (PBDTx).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Blokowanie
	<ol>
		<li>Inkubować plastry przez 1 godzinę w 2% płodowej surowicy cielęcej (FCS) w PBDTx w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pierwotna reakcja przeciwciał
	<ol>
		<li>Inkubować plastry przez 1,5 dnia w PBDTx zawierającym pierwszorzędowe przeciwciało (np. króliczą poliklonalną anty-ludzką fibronektynę i mysią antyludzką ogniskową kinazę adhezyjną) w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>mycie
	<ol>
		<li>Plastry myć 6x przez 10 min w PBDTx w temperaturze RT.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Blokowanie
	<ol>
		<li>Inkubować plastry przez 1 godzinę w 2% FCS w PBDTx w RT.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wtórna reakcja przeciwciał
	<ol>
		<li>Inkubować plastry przez 1,5 dnia w PBDTx zawierającym drugorzędowe przeciwciało (anty-królicze lub anty-mysie IgG sprzężone z fluoroforem, kozie) w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>mycie
	<ol>
		<li>Plastry myć 6x przez 10 min w PBDTx w RT i 4x przez 10 min w PBST w RT. 
		UWAGA: W przypadku konfokalnej analizy mikroskopowej należy oczyścić próbki z 50% glicerolem w PBS.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza konfokalna
<ol>
	<li>Obserwuj cały zarodek i przekrój za pomocą mikroskopu konfokalnego wyposażonego w soczewkę obiektywową 10X/0,5 i 20X/0,75.</li>
	<li>W celu jednoczesnego wykrywania fluorescencji i barwienia 3β-Hsd, ustaw tryb wielościeżkowy w następujący sposób: laser argonowy 488 nm i filtr pasmowoprzepustowy 505-530 nm do wykrywania GFP; laser helowo-neonowy 543 nm i filtr pasmowo-przepustowy 560-615 nm do wykrywania mCherry; oraz kanał światła przechodzącego do wykrywania barwienia 3β-Hsd. Rozmiar otworka to 1 jednostka Aireya, a rozdzielczość to 1,024 x 1,024 pikseli.</li>
	<li>Zmontuj stosy z (w odstępie 6 μm) jako projekcję 3D i połącz projekcję i jasne pole za pomocą wbudowanego oprogramowania konfokalnego.</li>
</ol>

<ol><li>Hsu, H. J., Lin, G., Chung, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+early+development+of+zebrafish+interrenal+glands+and+pronephros%3A+differential+control+by+wt1+and+ff1b%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Parallel early development of zebrafish interrenal glands and pronephros: differential control by wt1 and ff1b.</a> Development. 130, 2107-2116 (2003).</li>
<li>To, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pituitary-interrenal+interaction+in+zebrafish+interrenal+organ+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Pituitary-interrenal interaction in zebrafish interrenal organ development.</a> Mol Endocrinol. 21, 472-485 (2007).</li>
<li>Liu, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrenal+organogenesis+in+the+zebrafish+model%5BTitle%5D)+AND+%22Organogenesis%22%5BJournal%5D)">Interrenal organogenesis in the zebrafish model.</a> Organogenesis. 3, 44-48 (2007).</li>
<li>Cravioto, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+inherited+variant+of+the+3+beta-hydroxysteroid+dehydrogenase-isomerase+deficiency+syndrome%3A+evidence+for+the+existence+of+two+isoenzymes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">A new inherited variant of the 3 beta-hydroxysteroid dehydrogenase-isomerase deficiency syndrome: evidence for the existence of two isoenzymes.</a> J Clin Endocrinol Metab. 63, 360-367 (1986).</li>
<li>Lachance, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+3+beta-hydroxysteroid+dehydrogenase%2Fdelta+5-delta+4-isomerase+gene+and+its+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of human 3 beta-hydroxysteroid dehydrogenase/delta 5-delta 4-isomerase gene and its expression in mammalian cells.</a> J Biol Chem. 267, 3551(1992).</li>
<li>Simard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biology+of+the+3beta-hydroxysteroid+dehydrogenase%2Fdelta5-delta4+isomerase+gene+family%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Rev%22%5BJournal%5D)">Molecular biology of the 3beta-hydroxysteroid dehydrogenase/delta5-delta4 isomerase gene family.</a> Endocr Rev. 26, 525-582 (2005).</li>
<li>Lin, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+zebrafish+hsd3b+genes+are+distinct+in+function%2C+expression%2C+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Two zebrafish hsd3b genes are distinct in function, expression, and evolution.</a> Endocrinology. 156, 2854-2862 (2015).</li>
<li>Grassi Milano, E., Basari, F., Chimenti, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adrenocortical+and+adrenomedullary+homologs+in+eight+species+of+adult+and+developing+teleosts%3A+morphology%2C+histology%2C+and+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Gen+Comp+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Adrenocortical and adrenomedullary homologs in eight species of adult and developing teleosts: morphology, histology, and immunohistochemistry.</a> Gen Comp Endocrinol. 108, 483-496 (1997).</li>
<li>Chai, C., Liu, Y. W., Chan, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ff1b+is+required+for+the+development+of+steroidogenic+component+of+the+zebrafish+interrenal+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Ff1b is required for the development of steroidogenic component of the zebrafish interrenal organ.</a> Dev Biol. 260, 226-244 (2003).</li>
<li>Liu, Y. W., Gao, W., Teh, H. L., Tan, J. H., Chan, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prox1+is+a+novel+coregulator+of+Ff1b+and+is+involved+in+the+embryonic+development+of+the+zebra+fish+interrenal+primordium%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Prox1 is a novel coregulator of Ff1b and is involved in the embryonic development of the zebra fish interrenal primordium.</a> Mol Cell Biol. 23, 7243-7255 (2003).</li>
<li>Chai, C., Liu, Y. W., Chan, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ff1b+is+required+for+the+development+of+steroidogenic+component+of+the+zebrafish+interrenal+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ff1b is required for the development of steroidogenic component of the zebrafish interrenal organ.</a> Dev. Biol. 260, 226-244 (2003).</li>
<li>Chou, C. W., Zhuo, Y. L., Jiang, Z. Y., Liu, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hemodynamically-regulated+vascular+microenvironment+promotes+migration+of+the+steroidogenic+tissue+during+its+interaction+with+chromaffin+cells+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The hemodynamically-regulated vascular microenvironment promotes migration of the steroidogenic tissue during its interaction with chromaffin cells in the zebrafish embryo.</a> PLoS One. 9, e107997(2014).</li>
<li>Liu, Y. W., Guo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelium+is+required+for+the+promotion+of+interrenal+morphogenetic+movement+during+early+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Endothelium is required for the promotion of interrenal morphogenetic movement during early zebrafish development.</a> Dev Biol. 297, 44-58 (2006).</li>
<li>Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+analyses+of+vascular+tube+and+lumen+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish.</a> Development. 132, 5199-5209 (2005).</li>
<li>Proulx, K., Lu, A., Sumanas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cranial+vasculature+in+zebrafish+forms+by+angioblast+cluster-derived+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cranial vasculature in zebrafish forms by angioblast cluster-derived angiogenesis.</a> Dev Biol. 348, 34-46 (2010).</li>
<li>Perner, B., Englert, C., Bollig, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Wilms+tumor+genes+wt1a+and+wt1b+control+different+steps+during+formation+of+the+zebrafish+pronephros%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The Wilms tumor genes wt1a and wt1b control different steps during formation of the zebrafish pronephros.</a> Dev Biol. 309, 87-96 (2007).</li>
<li>Chou, C. W., Chiu, C. H., Liu, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin+mediates+correct+positioning+of+the+interrenal+organ+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Fibronectin mediates correct positioning of the interrenal organ in zebrafish.</a> Dev Dyn. 242, 432-443 (2013).</li>
<li>Chiu, C. H., Chou, C. W., Takada, S., Liu, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+fibronectin+signaling+requirements+of+the+zebrafish+interrenal+vessel%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development and fibronectin signaling requirements of the zebrafish interrenal vessel.</a> PLoS One. 7, e43040(2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych, które mogliby zadeklarować.

Siła sygnału aktywności 3β-Hsd wzrastała w trakcie reakcji. Wyraźne sygnały aktywności 3β-Hsd wykryto po 4 godzinach reakcji dla etapów od 28 hpf wzwyż. Jednak czas trwania reakcji wymaga empirycznego określenia, w zależności od celu testu. W przypadkach, gdy barwienie wymaga przetworzenia przez noc, na próbkach ma tendencję do tworzenia się lekko niebieskawego tła. Problem ten można przezwyciężyć poprzez wydłużenie czasu wiązania (np. 4 godziny w 4% PFAT w RT) przed barwieniem aktywnością 3β-Hsd. Z kolei nadmie...

Nadnercza, kluczowy składnik osi podwzgórze-przysadka-nadnercza, wydzielają sterydy i koordynują homeostazę steroidów oraz reakcję organizmu na stres. Nadnercza składają się z kory zewnętrznej, która wydziela sterydy w sposób specyficzny dla strefy, oraz rdzenia wewnętrznego, który syntetyzuje katecholaminy. Gruczoł międzynerkowy w teleostach jest odpowiednikiem nadnercza u ssaków i składa się ze steroidogennych komórek międzynerkowych i chromochłonnych, które są funkcjonalnymi odpowiednikami kory nadnerczy i rdzenia, odpowiednio1-3. Badania przeprowadzone z wykorzystaniem modelu danio pręgowanego wykazały, że zarówno steroidogenne, jak i chromochłonne linie komórkowe są tworzone przez mechanizmy molekularne i komórkowe bardzo przypominające te u ssaków1,2. Dlatego danio pręgowany jest potencjalnie potężnym modelem do badania zaburzeń genetycznych, kontroli neuroendokrynnej i biologii systemowej osi podwzgórze-przysadka-nadnercza (międzynerczowe).
W nadnerczach 3β-Hsd katalizuje konwersję progesteronu z pregnenolonu, 17α-hydroksyprogesteronu z 17α-hydroksypregnelolonu i androstendionu z dehydroepiandrosteronu4,5. 3β-Hsd jest niezbędny do biosyntezy wszystkich klas steroidów hormonalnych, a mianowicie progesteronu, glikokortykosteroidów, mineralokortykosteroidów, androgenów i estrogenów. Dwa ludzkie izoenzymy 3β-Hsd HSD3B1 i HSD3B2 mają różną ekspresję6. HSD3B1 ulega ekspresji w łożysku i tkankach obwodowych, podczas gdy HSD3B2 ulega ekspresji w korze nadnerczy i gonadach. Ludzkie HSD3B1 i HSD3B2 są współortologami zebry HSD3B1, który ulega ekspresji w tkance międzynerkowej i gonadach dorosłych; Danio pręgowany HSD3B2 jest genem ulegającym ekspresji matczynej, którego transkrypty znikają przed organogenezą7. Protokół testu aktywności enzymatycznej 3β-Hsd dla całego wierzchowca dla zebrytania został opracowany poprzez modyfikację metody Levy'ego, opisanej przez Milano i wsp., na zamrożonych odcinkach ośmiu gatunków teleostów8. Ze względu na przepuszczalność tkanek i przezroczystość optyczną rozwijającego się danio pręgowanego, histochemia 3β-Hsd w całości może być z powodzeniem stosowana do utrwalonych zarodków i larw danio pręgowanego oraz specyficznie wyznaczać zróżnicowane tkanki międzynerkowe.
Ten czuły i szybki test został zastosowany do różnych mutantów i morfantów wykazujących różne typy dysmorfogenezy międzynerkowej. Międzynerkowa aktywność 3β-HSD jest nieobecna w zarodku, w którym specyfikacja tkanki międzynerkowej jest zaburzona przez specyficzny knockdown czynnika transkrypcyjnego Ff1b i jest zmniejszona, ponieważ różnicowanie międzynerkowe jest zaburzone przez knockdown koregulatora Ff1b Prox19,10. Warto zauważyć, że aktywność 3β-Hsd można wykryć u mutantów z poważnymi wadami we wczesnym stadium, takimi jak jednooka główka od szpilki i zez, gdzie histochemia 3β-Hsd określa, w jaki sposób wpływa na migrację komórek międzynerkowych11. Różnicowanie tkanki międzynerkowej nie jest zaburzone nawet przy całkowitym braku krwi i naczyń krwionośnych. W związku z tym, w jaki sposób sygnały pochodzące ze śródbłonka kształtują rozwijający się narząd międzynerkowymożna określić 12,13. Ogólnie rzecz biorąc, ten test histochemiczny został z powodzeniem wykorzystany do badania specyfikacji, różnicowania i migracji komórek steroidogennych w modelu danio pręgowanego. Dlatego powinien być skutecznym i niezawodnym narzędziem do wszelkich genetycznych lub chemicznych badań przesiewowych ukierunkowanych na zaburzenia nadnerczy i narządów międzynerkowych.

<table><tbody><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Carl Zeiss&nbsp;</td><td>LSM510&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>USB</td><td>US16374</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone Surowica dla cieląt płodowych&nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30073</td><td></td></tr><tr><td>Nikotynamid</td><td>Sigma</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Hydrat dinukleotydu nikotynamidoadeninowego</td><td>Sigma</td><td>N1636</td><td></td></tr><tr><td>4-Nitro niebieski tetrazolium</td><td>Promega</td><td>S380C</td><td></td></tr><tr><td>Nusieve GTG</td><td>Lonza</td><td>50081</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Fenylotiomocznik</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Solanka buforowana fosforanami</td><td>Sigma</td><td>P4417-100Tab</td><td></td></tr><tr><td>PYREX Spot Plate</td><td>Corning</td><td>7220-85</td><td></td></tr><tr><td>Sól rafowa</td><td>AZOO</td><td>AZ28001</td><td></td></tr><tr><td>trans-Dehydroandrosteron</td><td>Sigma</td><td>D4000</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000M</td><td></td></tr></tbody></table>

wizualizacja steroidogennej tkanki międzynerkowej i jej mikrośrodowiska naczyniowego u danio pręgowanego

Visualizing the Interrenal Steroidogenic Tissue and Its Vascular Microenvironment in Zebrafish

Ten protokół wprowadza sposób wykrywania zróżnicowanych międzynerkowych komórek steroidogennych za pomocą prostego testu aktywności enzymatycznej na całej górze. Identyfikacja zróżnicowanych tkanek steroidogennych poprzez chromogenne barwienie histochemiczne komórek dodatnich pod względem aktywności dehydrogenazy 3-β-hydroksysteroidowej / izomerazyΔ 5-4 (3β-Hsd) ma kluczowe znaczenie dla monitorowania morfologii i różnicowania tkanek kory nadnerczy i międzynerkowych odpowiednio u ssaków i teleostów. W modelu danio pręgowanego przezroczystość optyczna i przepuszczalność tkanek rozwijających się zarodków i larw pozwalają na barwienie całego wierzchowca o aktywności 3β-Hsd. Ten protokół barwienia, wykonywany na transgenicznych fluorescencyjnych liniach reporterowych oznaczających rozwijające się komórki przednercza i śródbłonka, umożliwia wykrycie steroidogennej tkanki międzynerkowej oprócz nerki i sąsiednich naczyń krwionośnych. W połączeniu z przekrojem wibratomowym, immunohistochemią i mikroskopią konfokalną możemy uwidocznić i oznaczyć mikrośrodowisko naczyniowe międzynerkowych tkanek steroidogennych. Test aktywności 3β-Hsd jest niezbędny do badania biologii komórki gruczołu międzynerkowego danio pręgowanego, ponieważ do tej pory nie ma odpowiedniego przeciwciała do znakowania komórek steroidogennych danio pręgowanego. Co więcej, test ten jest szybki i prosty, dzięki czemu stanowi potężne narzędzie do badań przesiewowych mutantów ukierunkowanych na zaburzenia genetyczne nadnerczy (międzynerkowych), a także do określania wpływu substancji chemicznych na steroidogenezę w badaniach farmaceutycznych lub toksykologicznych.

Aby określić, w jaki sposób steroidogenna tkanka interrenalna współrozwija się z kłębuszkami nerek przednerkowych i ich rodzącym się układem naczyniowym, przeprowadzono analizę aktywności enzymatycznej 3β-Hsd u podwójnego transgenicznego embrionu Tg(wt1b:GFP)li1;Tg(kdrl:mCherry)ci5 w 34 hpf (Rysunek 1). Na tym etapie tkanka steroidogenna wykazująca aktywność 3β-Hsd znajduje się po prawej stronie linii środkowej, bezpośrednio za kłębuszkami ...

Gruczoł międzynerkowy u danio pręgowanego jest teleosteańskim odpowiednikiem nadnerczy ssaków. Protokół ten przedstawia, jak przeprowadzić test aktywności enzymatycznej dehydrogenazy 3-β-hydroksysteroidowej (izomerazy Δ5-4; 3β-Hsd), który wykrywa zróżnicowane komórki steroidogenne u rozwijającego się danio pręgowanego.

Wizualizacja steroidogennej tkanki międzynerkowej i jej mikrośrodowiska naczyniowego u danio pręgowanego

This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykrycie zróżnicowanych steroidogennych komórek międzynerkowych w rozwijających się danio pręgowanych za pomocą prostego testu aktywności enzymatycznej w preparacie całego organizmu. Ta procedura barwienia może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące molekularnych i komórkowych mechanizmów powstawania oraz wad rozwojowych gruczołu międzynerkowego. Główną zaletą tego testu barwienia jest jego szybkość, prostota i niezawodność, co czyni go potężnym narzędziem do przesiewów genetycznych lub chemicznych u danio pręgowanych.Niniejszą procedurę można przeprowadzić na transgenicznych liniach reporterowych z białkami fluorescencyjnymi, znakujących nerki oraz naczynia krwionośne, co pozwala na analizę wielu tkanek w tym samym embrionie. W połączeniu z sekcjonowaniem za pomocą wibratomu, immunohistochemią i mikroskopią konfokalną można również zwizualizować mikrośrodowisko naczyniowe tkanki nadnerczowej. Po przygotowaniu roztworów zapasowych do barwienia aktywności beta-Hsd zgodnie z protokołem tekstowym, należy umieścić rozwijające się embriony danio pręgowanego w 0,03% PTU w wodzie do jaj, aby zahamować tworzenie się pigmentu.Utrwal embriony po usunięciu błony chorionowej lub larwy w 2% lub 4% PFA w PBS z 0,1% Tween 20 lub w PFAT. Wypłucz embriony w PBST cztery razy po 10 minut, dbając o to, aby próbki nie wyschły pomiędzy kolejnymi etapami płukania. Przed reakcjami barwienia przygotuj świeżo części A i B w osobnych probówkach, a następnie wymieszaj roztwory w wirówce typu vortex i odwirowuj je.Niezbędne jest przygotowanie części A i B w osobnych probówkach. Dodanie wszystkich składników bezpośrednio do jednej probówki spowoduje natychmiastowe i silne wytrącanie osadu. Przenieś całą zawartość probówki z częścią A do całej zawartości probówki z częścią B. Dobrze wymieszaj i natychmiast rozdziel 1 mL do każdej probówki do mikrocentryfugi zawierającej utrwalone i przemyte embriony.Użyj folii aluminiowej do owinięcia probówek, a następnie umieść je w temperaturze pokojowej na rotatorze lub platformie kołyszącej przy łagodnym wstrząsaniu. Czas reakcji określ empirycznie, monitorując sygnały chromogenne pod mikroskopem. Z czasem powstaną niewielkie osady, które nie będą zakłócać przebiegu reakcji.Reakcję zatrzymuje się poprzez czterokrotne przemycie zarodków w PBST (po 10 minut każde przemycie), a następnie przeprowadza się post-fiksację zbarwionych zarodków w 4%PFAT w temperaturze pokojowej przez 60 minut. W przypadku mikroskopii całych preparatów (whole-mount), do klarowania zarodków należy użyć 50% glicerolu w PBS. Następnie, po ułożeniu ich stroną grzbietową do góry, próbki obserwuje się za pomocą mikroskopu odwróconego w świetle białym.Usuń żółtko z zarodka i przygotuj z niego preparat typu flat mount. Następnie wykonaj obraz o wysokiej rozdzielczości przedstawiający morfologię tkanki interrenalnej. Aby przeanalizować mikrośrodowisko naczyniowe tkanki steroidotwórczej, przeprowadź postfiksację barwionych zarodków w 2% PFA.Uzupełnić o 1% Triton X-100 w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną godzinę, a następnie użyć PBST-X do czterokrotnego przemycia embrionów w temperaturze pokojowej przez 10 minut każde. Aby zatopić embriony, przygotować 4% niskotopiwą agarozę, rozpuszczając agarozę w PBS w temperaturze 95 stopni Celsjusza. Następnie rozdzielić do probówek mikrocentryfugicznych i przechowywać w temperaturze od czterech do ośmiu stopni Celsjusza.Rozpuść alikwot 4% agarozy niskotopliwej w temperaturze 70°C przez 10 minut, a następnie utrzymuj alikwot w temperaturze 47°C. Używając oddzielonej zakrętki z probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml jako formy, zatop zarodek w płynnej agarozie i pozostaw do ostygnięcia aż do stwardnienia. Aby przeprowadzić sekcjonowanie w wibratomie, przyklej kawałek papierowej taśmy do suchej platformy wibratomu.Następnie za pomocą żyletki należy usunąć utwardzony blok agarozy z formy. Na taśmę papierową na platformie nanieść superglue i przytwierdzić blok agarozy do taśmy papierowej tak, aby przednia strona próbki była skierowana do góry. Następnie przyciąć blok agarozy do kształtu grani trapezowej, tak aby górna i dolna ściana miały odpowiednio od około czterech do ośmiu milimetrów z każdej strony.Użyj zakraplacza wypełnionego zimnym PBS z 0,5% Trident X-100, aby wypłukać blok agarozowy. Następnie, zgodnie z instrukcją producenta, użyj wibratomu do przygotowania przekrojów o grubości 100 mikrometrów. Za pomocą igły 26G wyjmij wycięte sekcje z wibratomu i przenieś je na płytkę do testów kropelkowych zawierającą 500 mikrolitrów zimnego 0,5% PBST-X w każdej studzience.Pobierz trzy przekroje tkankowe wykazujące dodatnią aktywność beta-Hsd, sprawdzając je pod mikroskopem stereoskopowym, a następnie za pomocą końcówki pipety przenieś przekroje do płytki 96-dołkowej zawierającej zimny 0,5%PBST-X. Następnie przeprowadź barwienie i obrazowanie przekrojów zgodnie z protokołem tekstowym. Aby ustalić, w jaki sposób steroidogenna tkanka interrenalna rozwija się równolegle z kłębuszkami nerek przednerkowych i ich powstającym układem naczyniowym, test aktywności enzymatycznej beta-Hsd przeprowadzono na podwójnie transgenicznych embrionach zebrafish, wykazujących fluorescencję specyficzną zarówno dla nerek, jak i dla śródbłonka.Jak pokazano tutaj, trzy beta-Hsd dodatkowe tkanki steroidogenne znajdują się po prawej stronie linii środkowej i bezpośrednio przylegają do kłębuszków nerkowych pronerki. Niektóre komórki steroidogenne zaczynają również migrować przez linię środkową. Te przekroje wykonane w wibratomie z embrionów transgenicznych wykazujących ekspresję GFP w śródbłonku, poddane analizie beta-Hsd, zostały zbadane metodą immunohistochemii w celu wykrycia fibronektyny oraz jej efektora downstream, fosforylowanej kinazy adhezji ogniskowej.Osadzanie fibronektyny wokół aorty grzbietowej jest niezbędne dla wspierania wzrostu naczyń nadnerczowych. W przypadku zarodka lub larwy ryby, histochemiczne barwienie całego preparatu można przeprowadzić w ciągu jednego dnia, jeśli zostanie ono wykonane prawidłowo. Chociaż ta metoda barwienia jest prosta i szybka, należy pamiętać, że wykrywa ona tylko jeden pojedynczy enzym szlaku steroidogennego.W przypadku dążenia do przeprowadzenia analizy rozwojowej tkanki śródnerkowej, poza tym testem, konieczne będzie wykonanie hybrydyzacji in situ w celu wykrycia ekspresji innych krytycznych genów zaangażowanych w steroidogenezę.

visualizing-interrenal-steroidogenic-tissue-its-vascular

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W niniejszym materiale przedstawiamy sposób wykonywania iniekcji do zatoki nadoczodołowej u dorosłych rybek zebrafish.

Iniekcja zaoczna u dorosłych danio pręgowanych

Nerka danio pręgowanego jest siedliskiem zarówno nerkowych, jak i krwiotwórczych dorosłych komórek macierzystych i progenitorowych, co stanowi wyjątkową okazję do badania tych typów komórek oraz ich potomstwa w kręgowym organizmie modelowym. W niniejszej pracy prezentujemy szczegółową procedurę sekcji, która umożliwia badaczowi identyfikację i chirurgiczne usunięcie nerki dorosłego danio pręgowanego, co może być wykorzystane w takich zastosowaniach jak izolacja komórek, transplantacja oraz...

Sekcja nerek dorosłego danio pręgowanego

Opisano obrazowanie rozwoju naczyń mózgowych u larw danio pręgowanego. Dostępne są również techniki ułatwiające obrazowanie 3D i modyfikujące rozwój naczyń mózgowych za pomocą zabiegów chemicznych.

Obrazowanie i rekonstrukcja 3D struktur naczyniowo-mózgowych u embrionalnego danio pręgowanego

Opisana tutaj metoda pozwala na analizę poklatkową rozwoju narządów w zarodkach danio pręgowanego za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu preparacyjnego, zdolnego do wykonywania sekcji optycznych i prostych strategii dostosowania w celu skorygowania dryfu ogniskowego i płaskiego.

Analiza rozwoju nerek danio pręgowanego z obrazowaniem poklatkowym przy użyciu mikroskopu preparacyjnego wyposażonego w sekcję optyczną

Tutaj prezentujemy protokół izolacji tkanki gonad larw danio pręgowanego, który ułatwi badania różnicowania i utrzymania płci danio pręgowanego.

Rozwarstwienie larw tkanki gonad danio pręgowanego

Ten protokół demonstruje metodę opartą na fluorescencji do wizualizacji układu naczyniowego i ilościowego określenia jego złożoności u Xenopus tropicalis. Naczynia krwionośne można obrazować kilka minut po wstrzyknięciu barwnika fluorescencyjnego do bijącego serca zarodka po manipulacjach genetycznych i/lub farmakologicznych w celu zbadania rozwoju układu sercowo-naczyniowego in vivo.

Wizualizacja i analiza ilościowa angiogenezy embrionalnej u Xenopus tropicalis

Rozwój rzęsek jest niezbędny do prawidłowego organogenezy. Protokół ten opisuje zoptymalizowaną metodę oznaczania i wizualizacji komórek rzęskowych danio pręgowanego.

Wizualizacja wielorzęskowych komórek u danio pręgowanego za pomocą połączonego protokołu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ i immunofluorescencji całej góry

Tutaj omawiamy protokół metody, który pozwoli na łatwą analizę unaczynienia siatkówki dorosłego dg(fli:EGFP) danio pręgowanego jako szybki odczyt w warunkach długotrwałych patologii naczyniowych związanych z neoangiogenezą i zmianami strukturalnymi.

Badanie cukrzycy oczami ryby: mikrodysekcja, wizualizacja i analiza naczyń naczyniowych siatkówki dorosłego tg(fli:EGFP) danio pręgowanego

Tutaj opisujemy 3 modele uszkodzeń dorosłego danio pręgowanego i ich łączne stosowanie z leczeniem lekami immunosupresyjnymi. Udzielamy wskazówek w zakresie obrazowania regenerujących się tkanek oraz wykrywania w nich mineralizacji kości.

Modele urazów dorosłych danio pręgowanego w celu zbadania wpływu prednizolonu na regenerację tkanki kostnej

Tutaj demonstrujemy metodę ilościowego określania wielkości wątroby u larw danio pręgowanego, umożliwiając ocenę wpływu manipulacji genetycznych i farmakologicznych na wzrost i rozwój wątroby.

Kwantyfikacja wielkości wątroby u larw danio pręgowanego za pomocą mikroskopii jasnego pola

Poznaj metodę wykrywania zróżnicowanych komórek steroidogennych w gruczolu międzynerkowym danio pręgowanego. Technika ta umożliwia analizę mikrośrodowiska naczyniowego i badanie rozwoju układu endokrynnego.

Wizualizacja steroidogennej tkanki międzynerkowej i jej mikrośrodowiska naczyniowego u danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów