Wizualizacja steroidogennej tkanki międzynerkowej i jej mikrośrodowiska naczyniowego u danio pręgowanego

Ogólnym celem tej procedury jest wykrycie zróżnicowanych międzynerkowych komórek steroidogennych u rozwijającego się danio pręgowanego za pomocą prostego testu aktywności enzymatycznej typu whole-mount. Ta procedura barwienia może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące molekularnych i komórkowych mechanizmów powstawania i wad rozwojowych gruczołów międzynerkowych. Główną zaletą tego testu barwienia jest to, że jest szybki, prosty i niezawodny, co czyni go potężnym narzędziem do genetycznych lub chemicznych badań przesiewowych u danio pręgowanego.

Procedura ta może być wykonywana na transgenicznych fluorescencyjnych liniach reporterowych, oznaczających nerkę i naczynia krwionośne, dzięki czemu można analizować wiele tkanek w tym samym zarodku. W połączeniu z sekcją wibratomową, immunohistochemią i mikroskopią konfokalną można również uwidocznić mikrośrodowisko naczyniowe tkanki międzynerkowej. Po przygotowaniu roztworów podstawowych do trzech barwień aktywności beta-Hsd zgodnie z protokołem tekstowym, należy umieścić rozwijające się zarodki danio pręgowanego w 0,03% PTU w wodzie jajowej, aby zahamować tworzenie się pigmentu.

Utrwal zdekorionowane zarodki lub larwy w 2% lub 4% PFA w PBS za pomocą 0,1% Tween 20 lub PFAT. W przypadku PBST należy umyć zarodki cztery razy po 10 minut każde, upewniając się, że próbki nie wysychają między myciami. Przed reakcjami barwienia należy świeżo przygotować części A i B w oddzielnych probówkach, a następnie zwirować i odwirować roztwory.

Konieczne jest przygotowanie części A i B w osobnych probówkach. Dodanie wszystkich składników bezpośrednio do jednej probówki spowoduje od razu silne opady. Dodaj całą probówkę części A do całej probówki części B. Dobrze wymieszaj i natychmiast rozprowadź jeden mililitr do każdej probówki do mikrofuge zawierającej utrwalone i umyte zarodki.

Użyj folii aluminiowej do owinięcia rurek i umieść je w temperaturze pokojowej na rotatorze lub platformie bujanej, delikatnie potrząsając. Empirycznie określ czas reakcji za pomocą mikroskopu do monitorowania sygnałów chromogenicznych. Z czasem pojawią się niewielkie opady, które nie będą zakłócać procesu reakcji.

Zatrzymaj reakcję, używając PBST do mycia zarodków cztery razy przez 10 minut każdy, a następnie po utrwaleniu zarodków 4% PFAT w temperaturze pokojowej przez 60 minut. Do mikroskopii całomocowej użyj 50% glicerolu w PBS, aby usunąć zarodki. Następnie, po ustawieniu ich stroną grzbietową skierowaną do góry, obserwuj próbki za pomocą mikroskopu pionowego w jasnym oświetleniu polowym.

Usuń żółtko zarodka i użyj go do przygotowania płaskiego wierzchowca. Następnie uchwyć obraz morfologii tkanki międzynerkowej w wysokiej rozdzielczości. Aby przeanalizować mikrośrodowisko naczyniowe tkanki steroidogennej, należy po utrwaleniu barwionych zarodków za pomocą 2% PFA.

Uzupełnij go 1%Triton X-100 w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez godzinę i użyj PBST-X do umycia zarodków w temperaturze pokojowej cztery razy po 10 minut każdy. Aby osadzić zarodki, przygotuj 4% niskotopliwą agarozę, rozpuszczając ją w PBS w temperaturze 95 stopni Celsjusza. Następnie porcjować w probówkach do mikrowirówek i przechowywać w temperaturze od czterech do ośmiu stopni Celsjusza.

Rozpuść podwielokrotność 4% niskotopliwej agarozy w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez 10 minut, a następnie utrzymuj podwielokrotność w temperaturze 47 stopni Celsjusza. Używając odczepionej nakrętki z 1,5% mililitrowej probówki do mikrowirówki jako formy, zanurz zarodek w stopionej agarozie i pozwól mu ostygnąć do stwardnienia. Aby przeprowadzić sekcję wibratomu, przyklej kawałek taśmy papierowej do suchej platformy wibratomu.

Następnie za pomocą żyletki usuń stwardniały blok agarozy z formy. Nałóż superglue na taśmę papierową na platformie i przymocuj blok agarozy do taśmy papierowej przednią stroną próbki skierowaną do góry. Następnie przytnij blok agarozy do kształtu trapezoidalnego graniastosłupa z około czterema do ośmiu milimetrami z każdej strony odpowiednio górnej i dolnej fasety.

Użyj zakraplacza wypełnionego zimnym PBS z 0,5% Trident X-100, aby spłukać blok agarozy. Następnie za pomocą wibratomu zgodnie z instrukcją producenta przygotuj skrawki o długości 100 mikrometrów. Za pomocą igły o rozmiarze 26 usuń wycięte fragmenty z wibratomu i przenieś je na płytkę punktową zawierającą 500 mikrolitrów zimnego 0,5% PBST-X na studzienkę.

Zebrać trzy skrawki tkanek z dodatnim wynikiem aktywności beta-Hsd, sprawdzając je pod mikroskopem preparacyjnym i za pomocą końcówki pipety przenieść skrawki do 96-dołkowej płytki zawierającej zimne 0,5% PBST-X. Następnie bejcuj i zobrazuj sekcje zgodnie z protokołem tekstowym. Aby określić, w jaki sposób steroidogenna tkanka międzynerkowa współrozwija się z kłębuszkiem nerkowym pronefric i jego powstającym naczyniem, przeprowadzono test aktywności enzymatycznej trzech beta-Hsd na podwójnym transgenicznym zarodku danio pręgowanego, wykazującym ekspresję fluorescencji specyficznej zarówno dla nerek, jak i dla śródbłonka.

Jak pokazano tutaj, trzy tkanki steroidogenne beta-Hsd znajdują się na prawo od linii środkowej i natychmiast rozpieszczają kłębuszek nerkowych nerki. Niektóre komórki steroidogenne zaczynają również migrować przez linię środkową. Te wibratomy z transgenicznych zarodków eksprymujących śródbłonek GFP poddanych trzem testom beta-Hsd analizowano za pomocą immunohistochemii w celu wykrycia fibronektyny i jej efektora, fosforylowanej ogniskowej kinazy adhezyjnej.

Odkładanie fibronektyny w aorcie okołogrzbietowej jest niezbędne do wspierania wzrostu naczyń międzynerkowych. W przypadku zarodka lub larwy ryby, barwienie histochemiczne całej góry można wykonać w ciągu jednego dnia, jeśli zostanie wykonane prawidłowo. Chociaż ta metoda barwienia jest prosta i szybka, ważne jest, aby pamiętać, że wykrywa tylko jeden enzym szlaku steroidogennego.

Jeśli dąży się do analizy rozwojowej tkanki międzynerkowej, oprócz tego testu, konieczne będzie przeprowadzenie habitacji in situ w celu wykrycia ekspresji innych krytycznych genów zaangażowanych w steroidogenezę.