Opracowanie i identyfikacja nowej subpopulacji ludzkich fagocytów olbrzymich pochodzących z neutrofili in vitro

Ogólnym celem tej metody jest wygenerowanie i identyfikacja hodowanych in vitro gigantycznych fagocytów pochodzących z krążących ludzkich neutrofili w celu zbadania ich roli w zapalnych i przeciwzapalnych odpowiedziach immunologicznych. Metoda ta może być wykorzystana do uzyskania i zidentyfikowania nowej subpopulacji gigantycznych fagocytów, które rozwijają się z ludzkich neutrofili w celu utrzymania długotrwałych warunków hodowli. Technika ta może być wykorzystana do dalszego badania znaczenia i funkcji gigantycznych fagocytów, a także do udzielenia odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące ich aktywacji i plastyczności.

Procedurę zademonstrują Eva Leder, nasza asystentka naukowa, i Oksana Rogovoy, postdoc, obie z mojego laboratorium. Użyj sterylnego zestawu żył skóry głowy, aby uzyskać co najmniej 40 mililitrów krwi żylnej od zdrowego, młodego ochotnika. Następnie delikatnie wymieszaj krew w kapturze z przepływem laminowym bezpieczeństwa biologicznego.

Rozcieńczyć od 10 do 12 mililitrów podwielokrotności próbki krwi pełnej do końcowej objętości 24 mililitrów wstępnie podgrzanym bezjonowym PBS zawierającym 2% inaktywowany cieplnie FCS. Następnie dodaj 12% mililitrów polisacharozy 1119 na dno jednej 50-mililitrowej sterylnej stożkowej probówki wirówkowej z polipropylenu na podwielokrotność próbki krwi, a następnie ostrożnie ułóż warstwy 12 mililitrów polisacharozy 1077 na wierzchu roztworu gradientowego polisacharozy 1119. Ostrożnie odpipetować 24 mililitry rozcieńczonej krwi na poszczególne probówki roztworów gradientu gęstości i oddzielić komórki przez odwirowanie.

Należy obserwować dwie powstałe nieprzezroczyste warstwy. Wyrzuć płyn do 0,5 centymetra powyżej warstwy komórek jednojądrzastych w każdej probówce. Następnie przenieś komórki jednojądrzaste z każdej próbki do jednej nowej probówki.

Następnie wyrzuć pozostały płyn do 0,5 centymetra powyżej komórki wielojądrowej lub warstwy PMN i przenieś PMN z każdej próbki do innej nowej probówki. Przemyć PMN w końcowej objętości 30 mililitrów PBS zawierającej 2% inaktywowanego cieplnie FCS, a następnie zliczyć czerwone krwinki trzema mililitrami sterylnego, lodowatego, hipotonicznego 0,2% chlorku sodu. Po 30 sekundach na lodzie przywróć izotoniczność za pomocą trzech mililitrów sterylnego lodowatego 1,6% chlorku sodu.

Następnie dodaj sześć mililitrów pożywki RPMI 1640 o temperaturze 37 stopni Celsjusza uzupełnionej inaktywowanym termicznie FCS i zbierz komórki przez odwirowanie. Ponownie zawiesić pelety w czterech mililitrach RPMI 1640 uzupełnionych 10% inaktywowanym ciepłem FCS. Po zliczeniu dostosuj stężenie do 1,25 do 1,5 razy 10 do szóstego PMN na mililitr pożywki hodowlanej i umieść jeden mililitr komórek na studzienkę w poszczególnych dołkach 24-dołkowej płytki.

Następnie umieść płytkę w nawilżonym inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza, karmiąc kultury poprzez delikatną wymianę połowy pożywki na świeżą pożywkę RPMI 1640 uzupełnioną 10% inaktywowanym ciepłem FCS co trzy dni. Neutrofile różnicują się w gigantyczne fagocyty w ciągu siedmiu dni od hodowli. W siódmym dniu hodowli ostrożnie usuń połowę pożywki z każdej studzienki.

Następnie delikatnie odpipetować pozostałą pożywkę, aby usunąć lekko przylegające gigantyczne fagocyty. Przenieś odłączone komórki z dwóch do czterech studzienek z każdej grupy poddawanej działaniu substancji do pojedynczych stożkowych probówek o średnicy 15 milimetrów i zbierz komórki przez odwirowanie, ponownie zawieszając granulki w 100 do 120 mikrolitrach pożywki na probówkę. Następnie wyposaż dwie do trzech posiadaczy na każdą grupę zabiegową w szkiełka mikroskopowe, karty filtracyjne i lejki.

Następnie dodaj całą objętość komórek z każdej probówki do odpowiedniego lejka Cytospin. Następnie załaduj uchwyty na Cytospin i obróć komórki na szkiełkach. Suszyć wirowane szkiełka przez 10 minut.

Następnie użyj stabilnego dla wody markera, aby narysować hydrofobową barierę wokół komórek i utrwalić próbki za pomocą 4% paraformaldehydu pod kapturem chemicznym w temperaturze pokojowej. Po 10 minutach krótko spłukać szkiełka trzy razy około 100 mikrolitrami PBS na pranie. Następnie przepuszczaj komórki 0,5% Triton X-100 w PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie wykonaj pięć płukań PBS, jak właśnie pokazano.

Zablokuj niespecyficzne wiązanie za pomocą 10% normalnej koziej surowicy w RPMI 1640 Medium przez odpowiedni okres czasu, a następnie wykonaj pojedyncze płukanie PBS. Teraz dodaj niewielką ilość wody do pudełka, aby utrzymać wilgotność, a następnie oznacz komórki około 100 mikrolitrami odpowiedniego pierwotnego przeciwciała przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza w wilgotnej ciemnej komorze. Następnie wykonaj pojedyncze płukanie PBS, a następnie dodaj odpowiednie przeciwciało drugorzędowe sprzężone z fluorescencją.

Po 40 minutach w temperaturze pokojowej chronionej przed światłem, umyć próbki w celu usunięcia nadmiaru przeciwciał i zamocować szkiełka z jedną kroplą podłoża montażowego na próbkę i szkiełkiem nakrywkowym. Analizuj szkiełka za pomocą konfokalnej laserowej skaningowej mikroskopii fluorescencyjnej w ciągu 30 do 120 minut pod obiektywem z olejem emersyjnym 40X. Następnie oblicz powierzchnię komórki, intensywność fluorescencji i kolokalizację za pomocą odpowiedniego oprogramowania.

Na tych obrazach można zaobserwować rozwój neutrofili w gigantyczne fagocyty w ciągu siedmiu dni od hodowli. Autofagocytoza jest widoczna już po 90 minutach od hodowli neutrofili z fluorescencyjnymi barwnikami błonowymi o znacznie powiększonej średnicy komórek, widocznymi po czterech do siedmiu dniach. Jeśli jednak kultury neutrofili zostaną uzupełnione GM-CSF i IL-4, komórki wykazują ogólnie mniejszą średnicę i projekcje cytoplazmatyczne przypominające komórki dendrytyczne.

Mikroskopia poklatkowa gigantycznych fagocytów w dniach hodowli od trzeciego do czwartego i od czwartego do piątego ujawnia brak lub słabo przylegające komórki o ograniczonej zdolności ruchowej, które aktywnie połykają otaczające resztki neutrofili i szczątki. W tej mieszanej hodowli neutrofili monocytów migrację aktywnie pełzającego makrofaga można porównać do prawie stacjonarnego ruchu znakowanego fluorescencyjnie gigantycznego fagocytu w tej samej studni. Neutrofilowe pochodzenie gigantycznych fagocytów można zweryfikować na podstawie ich pozytywnej ekspresji markerów braku neutrofili i braku ekspresji markerów komórek monocytowych i dendrytycznych.

Gigantyczne fagocyty wytwarzają również podstawowe reaktywne formy tlenu i reagują na stymulację zymozanem i PMA przez wybuch oksydacyjny. Jednak w przeciwieństwie do monocytów lub neutrofili, reagują one również wybuchami oksydacyjnymi na utlenioną stymulację lipoprotein o niskiej gęstości. Po opanowaniu tej techniki można ją ukończyć w ciągu sześciu do siedmiu dni.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o delikatnej wymianie połowy pożywki podczas karmienia kultur neutrofili. Po tej procedurze można wykonać inne techniki barwienia, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące dodatkowych funkcji tych intrygujących komórek zarówno in vitro, jak i in vivo. Technika ta może utorować drogę naukowcom zajmującym się biologią neutrofili do zbadania aktywacji i plastyczności neutrofili oraz do identyfikacji tych komórek in vivo w warunkach fizjologicznych i patofizjologicznych u ludzi.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak uzyskać i zidentyfikować gigantyczne fagocyty w hodowli. Nie zapominaj, że praca z ludzką krwią może być potencjalnie zakaźna i że podczas wykonywania tej procedury konieczne jest zachowanie środków ostrożności, takich jak noszenie rękawiczek i wyrzucanie wszystkich płynów oraz używanie jednorazowego sprzętu do odpowiednich pojemników na zagrożenia biologiczne.