Platforma testów antybiofilmowych dostosowana do eksploracji bibliotek związków naturalnych

Ogólnie rzecz biorąc, celem tej platformy testowej jest zapewnienie znaczącego przepływu prac przesiewowych łączącego trzy, istotne, końcowe punkty: żywotność, biomasę i matrycę biofilmu, w celu identyfikacji i charakterystyki nowych związków antybiofilmu. Platforma ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie odkrywania środków przeciwbiofilmowych, umożliwiając wczesne rozróżnienie krótko- i długoterminowych efektów chemioterapii w szybki, zgodny z wyjaśnieniami sposób. Główną zaletą tej opracowanej platformy jest to, że łączy ona różne testy, aby zapewnić pełniejszy obraz efektów antybiofilmu bibliotek chemicznych, zwłaszcza związków naturalnych.

Aby rozpocząć eksperyment, należy przygotować niepoddane działaniu substancji próbki kontrolne zawierające 200 mikrolitrów od 10 do szóstego CFU na mililitr kultury bakteryjnej na studzienkę sterylnej płytki mikrodołkowej z 96 mikrodołkami. Uwzględnij kontrole pożywki bez hodowli bakteryjnej. Następnie, na tych samych 96-dołkowych płytkach, przygotuj próbki z czterema mikrolitrami 50-krotnego roztworu podstawowego antybiotyku i 196 mikrolitrami kultury bakterii na studzienkę, a następnie inkubuj kultury.

Kontynuuj barwienie rezazuryną za pomocą wielokanałowej pipety, aby przenieść cały roztwór planktonu, ostrożnie, bez dotykania biofilmów lub tworzenia pęcherzyków powietrza, na oddzielną, czystą, 96-dołkową płytkę. Ponownie, za pomocą pipety wielokanałowej, przemyć biofilmy raz sterylnym PBS, dodając 200 mikrolitrów na studzienkę i ostrożnie usunąć roztwór. Dodać 200 mikrolitrów 20 mikromolowego roztworu rezazuryny na dołek płytki biofilmu i inkubować biofilm w ciemności przy 200 obr./min przez 20 minut, aż niepoddane działaniu biofilmu kontrole staną się równomiernie różowe.

Następnie zmierz fluorescencję za pomocą czytnika płytek. Ostrożnie usuń plamę z resazuryny ze studzienek. Utrwal biofilmy za pomocą 200 mikrolitrów metanolu przez 15 minut.

Po utrwaleniu usuń metanol i pozostaw płytkę do wyschnięcia na powietrzu przez 10 minut. Następnie za pomocą pipety wielokanałowej ostrożnie dodaj 190 mikrolitrów 0,02% roztworu fioletu krystalicznego do biofilmu. Unikaj dotykania boków studzienek plamą podczas pipetowania i zapobiegaj tworzeniu się pęcherzyków powietrza oraz nie naciskaj pipety w celu całkowitego wydmuchania.

Następnie inkubuj płytkę przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Za pomocą pipety wielokanałowej ostrożnie usuń plamę. Umyj biofilm 200 mikrolitrami wody dejonizowanej.

Pozostaw studzienki do wyschnięcia na pięć minut w temperaturze pokojowej i rozpuść pozostałą plamę w 33% kwasie octowym. Inkubować płytkę przez godzinę w temperaturze pokojowej. Po inkubacji odczytać absorbancję przy 595 nanometrach.

Zmierz zmętnienie w odległości 595 nanometrów od przygotowanej płytki z roztworem planktonu. Można to zrobić podczas inkubacji płytki barwionej na fiolet krystaliczny. Następnie zabarwić bakterie planktonowe resazuryną, dodając 10 mikrolitrów zapasu resazuryny na studzienkę.

Odpipetować roztwór, aby dobrze go wymieszać. Inkubować płytkę w ciemności, w temperaturze pokojowej, 200 obr./min, przez około pięć minut, aż niepoddane działaniu substancji kontrolki staną się równomiernie różowe. Następnie zmierz fluorescencję.

Uzyskać jedną z równoległych płytek do pobierania próbek do tego barwienia i użyć pipety wielokanałowej, aby usunąć roztwór planktonu ze studzienek. Umyj studzienki, raz, ostrożnie sterylnym PBS, nie dotykając biofilmów. Dodaj 200 mikrolitrów aglutyniny z kiełków pszenicy lub roztworu WGA na dołek, który ma być zabarwiony.

Następnie inkubuj płytkę. Po inkubacji przemyj komórki trzykrotnie PBS, aby usunąć niezwiązaną plamę. Pozostaw talerz do wyschnięcia na 15 minut w temperaturze pokojowej.

Wizualizacja próbek za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i filtra FITC. Rozpuść związaną plamę w 200 mikrolitrach 33% kwasu octowego na studzienkę. Uszczelnij studzienki nasadkami paskowymi i poddaj je sonikacji za pomocą sonikatora łaźni wodnej.

Po sonikacji inkubować płytkę przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po godzinie powtórz sonikację, utrzymując studzienki szczelnie zamknięte między etapami sonikacji. Zmierz fluorescencję za pomocą czytnika płytek.

Ponownie weź jedną z równoległych płytek do pobierania próbek do tego barwienia i za pomocą pipety wielokanałowej usuń roztwór planktonu ze studzienek. Następnie umyj studzienki raz sterylnym PBS. Dodaj sześć mikrolitrów roztworu barwiącego do dołka i inkubuj płytkę w ciemności przez 15 minut.

Przed mikroskopią należy ręcznie usunąć nadmiar płynu za pomocą pipety wielokanałowej. Uchwyć obrazy za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z filtrem FITC, dla zielonej fluorescencji, aby uwidocznić żywe komórki i filtra TRITC, dla czerwonej fluorescencji, aby uwidocznić martwe komórki. Do tego barwienia należy użyć jednej z równoległych płytek do pobierania próbek, usunąć roztwór planktonu ze studzienek i raz umyć studzienki sterylnym PBS za pomocą pipety wielokanałowej.

Następnie dodaj 200 mikrolitrów roztworu barwiącego na studzienkę i inkubuj je przez 15 minut w ciemności. Na koniec zmierz fluorescencję za pomocą czytnika płytek. Przeprowadzono dwa badania przesiewowe, aby zademonstrować wydajność platformy jako procentu kontroli niepoddanego działaniu biofilmu.

Badania przesiewowe biblioteki pochodnych alkaloidów chinowych zidentyfikowały jeden, aktywny związek. Badania przesiewowe biblioteki diterpenoidów i pochodnych typu abietanowego pozwoliły zidentyfikować pięć związków aktywnych. Zarówno penicylina G, jak i cyprofloksacyna znacznie zmniejszają żywotność, biomasę i zawartość PNAG w matrycy biofilmu przed powstaniem biofilmu.

Nie miało to jednak miejsca w przypadku stosowania postekspozycji. Najbardziej widocznym rezultatem był wzrost matrycy biofilmu do ponad 200%, gdy wstępnie uformowane biofilmy potraktowano wysokimi stężeniami penicyliny G. Ten obraz fluorescencyjny potwierdza, że penicylina G zabija około 50% wstępnie uformowanej populacji bakterii gronkowca złocistego. Średnia proporcji fluorescencji od zielonej do czerwonej dla studzienek biofilmu niepoddanych działaniu środka wskazuje na przewagę żywych komórek.

Podczas gdy studzienki poddane działaniu penicyliny mają około 56% żywych komórek. Komórki, które pozostały przy życiu, po leczeniu penicyliną, wytwarzały znacznie większą ilość zewnątrzkomórkowej substancji polimerowej (EPS) w porównaniu z nieleczonymi biofilmami. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o zwróceniu uwagi na ręczne obchodzenie się z pipetą, aby uniknąć zanieczyszczenia bakteriami i plam między studzienkami.

Na podstawie tej platformy można szybko zidentyfikować i scharakteryzować związki przeciwdziałające biofilmowi skuteczne przeciwko Staphylococcus aureus. Jeśli stosowane są inne gatunki bakterii, konieczna będzie inna optymalizacja protokołów barwienia, ale racjonalność platformy pozostanie taka sama.