Name: Ocena funkcji bioenergetycznych w komórkach śródbłonka naczyń mózgowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: Poznaj metodę oceny funkcji mitochondrialnych w komórkach śródbłonka naczyń mózgowych. Technika umożliwia badanie bioenergetyki w czasie rzeczywistym, co jest kluczowe dla zrozumienia chorób neurologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta przez następujące granty: AHA 16SDG31170008 dla X.R. i NIH P20 GM109098, P01 AG027956, oraz U54 GM104942 dla J.W.S.

UWAGA: Schemat protokołu jest pokazany na rysunku 1, w tym oś czasu procedur.
1. Hodowla i przejście komórek CVE
<ol>
	<li>Hodowla komórek CVE (komórki bEnd.3) w kompletnym pożywce wzrostowej (zmodyfikowana pożywka Dulbecco o wysokiej zawartości glukozy, DMEM) uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną/streptomycyną w kolbie do hodowli tkankowej T75 cm2. Rosnąć w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5%CO2</li>.
	<li>Wyjąć i wyrzucić pożywkę do hodowli komórkowych. Przepłukać warstwę komórkową 0,25% roztworem trypsyny-0,03% EDTA, a następnie dodać 1 - 2 ml roztworu trypsyny-EDTA do kolby i utrzymywać kolbę w temperaturze 37 °C przez 3 - 5 minut. Obserwuj komórki pod odwróconym mikroskopem, aż warstwa komórkowa zostanie oderwana. Dodać 10 ml kompletnej pożywki wzrostowej i delikatnie odessać komórki, pipetując.</li>
	<li>Zdekantować płyn i komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i wirować z prędkością 700 x g przez 5 minut, aby usunąć resztki komórkowe.</li>
	<li>Wyrzucić sklarowany osad z probówki wirówkowej. Dodać 10 ml kompletnej pożywki wzrostowej i ponownie zawiesić osad komórkowy. Wiruj komórki w temperaturze 700 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Wyrzucić sklarowany osad z probówki wirówkowej. Ponownie zawiesić osad komórkowy w kompletnej pożywce wzrostowej o stężeniu 2,0 × 105 komórek/ml (oznaczone przez liczenie za pomocą hemocytometru; wykluczyć martwe komórki za pomocą barwienia błękitem trypanowym). 
	UWAGA: Świeżo rozmrożone komórki są hodowane przez co najmniej 3 pasaże do eksperymentów.</li>
</ol>
2. Wysiewaj i traktuj komórki na płytkach do hodowli komórkowych
<ol>
	<li>Komórki nasienne na 96-dołkowej płytce do hodowli komórek strumienia zewnątrzkomórkowego: 80 μl/basenik. Umieścić płytkę do hodowli komórkowej w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 . Uwaga: 16 × 103 komórki na studzienkę osiągną 60 - 80% konfluencji w ciągu 24 godzin.</li>
	<li>Jeśli komórki są wystawione na działanie substancji chemicznej, dodaj zabiegi, gdy komórki zostaną przymocowane do dna płytki (8 - 24 godziny po wysianiu). 
	UWAGA: W przypadku eksperymentów z transfekcją nie należy dodawać antybiotyków do kompletnej pożywki wzrostowej.</li>
</ol>
3. Ocena funkcji mitochondriów za pomocą bioanalizatora
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem badania należy uwodnić wkład czujnika strumienia zewnątrzkomórkowego z kalibrantem, dodając do płytki 150 μl roztworu kalibru strumienia zewnątrzkomórkowego i inkubując O/N w temperaturze 37 °C bez CO2 .</li>
	<li>Za pomocą stacji myjki płytkowej zmień pożywkę do hodowli komórkowych na pożywkę do oznaczania strumienia zewnątrzkomórkowego o pH 7,0. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C bez CO2 przez 30–60 minut.</li>
	<li>Przygotować roztwory robocze 8 μM oligomycyny, 4,5 μM FCCP, 10 μM rotenonu i 10 μM antymycyny A w DMEM. Załadować 25 μl roztworów podstawowych do portów iniekcji wkładu: port A, oligomycyna; Port B, FCCP; Port C, rotenon i antymycyna A z pożywką do oznaczania strumienia zewnątrzkomórkowego. Wdrożyć protokół oznaczania zgodnie z opisem w tabeli 1.</li>
	<li>Załaduj uwodniony wkład do bioanalizatora i przeprowadź kalibrację, klikając przycisk "Start". Po zakończeniu kalibracji zdejmij dolną płytę wkładu i załaduj płytkę ogniwa, klikając monit "Rozładuj wkład". Kontynuować test do końca wszystkich pomiarów.</li>
	<li>Otwórz plik danych i uzyskaj wartości szybkości z bioanalizatora. Wyeksportuj dane do pliku arkusza kalkulacyjnego.</li>
</ol>
4. Analizy danych
UWAGA: Obliczenia do analiz danych są sformułowane poniżej. Wartości są uzyskiwane z bioanalizatora jako OCR przedstawiony na rysunku 2.
<ol>
	<li>Aby obliczyć oddychanie podstawowe, odejmij oddychanie niemitochondrialne (pomiary 10 - 12) od wartości podstawowej (pomiar 3). 
	UWAGA: Oddychanie podstawowe = Podstawowe - oddychanie niemitochondrialne = Szybkość (3) - Szybkość (10)~(12).</li>
	<li>Aby obliczyć produkcję ATP, odejmij oddychanie sprzężone z ATP (pomiary 4 - 6) od wartości podstawowej (pomiar 3). 
	UWAGA: Produkcja ATP = Podstawowa - oddychanie związane z ATP = Szybkość (3) - Szybkość (4) ~ (6).</li>
	<li>Aby obliczyć maksymalne oddychanie, odejmij oddychanie niemitochondrialne (pomiary 10 - 12) od maksymalnego oddychania (pomiary 7 - 9). 
	UWAGA: Maksymalne oddychanie = Maksymalne oddychanie - oddychanie niemitochondrialne = Szybkość (7) ~ (9) - Szybkość (10) ~ (12).</li>
	<li>Aby obliczyć wolną pojemność, odejmij wartość podstawową (pomiar 3) od maksymalnego oddechu (pomiary 7 - 9). 
	UWAGA: Wolna pojemność = Maksymalne oddychanie - Podstawowe = Szybkość (7) ~ (9) - Szybkość (3).</li>
	<li>Aby obliczyć wyciek protonów, odejmij oddychanie niemitochondrialne (pomiar 10 - 12) od oddychania sprzężonego z ATP (pomiar 4). 
	UWAGA: Wyciek protonów = oddychanie związane z ATP - oddychanie niemitochondrialne = Szybkość (4) - Szybkość (10)~(12).</li>
</ol>

<ol><li>Quintero, M., Colombo, S. L., Godfrey, A., Moncada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+as+signaling+organelles+in+the+vascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mitochondria as signaling organelles in the vascular endothelium.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 5379-5384 (2006).</li>
<li>Liu, Y., Li, H., Bubolz, A. H., Zhang, D. X., Gutterman, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cytoskeletal+elements+are+critical+for+flow-mediated+dilation+in+human+coronary+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Biol+Eng+Comput%22%5BJournal%5D)">Endothelial cytoskeletal elements are critical for flow-mediated dilation in human coronary arterioles.</a> Med Biol Eng Comput. 46, 469-478 (2008).</li>
<li>Al-Mehdi, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perinuclear+mitochondrial+clustering+creates+an+oxidant-rich+nuclear+domain+required+for+hypoxia-induced+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Perinuclear mitochondrial clustering creates an oxidant-rich nuclear domain required for hypoxia-induced transcription.</a> Sci Signal. 5, ra47(2012).</li>
<li>Mironov, S. L., Ivannikov, M. V., Johansson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5BCa2%2B%5Di+signaling+between+mitochondria+and+endoplasmic+reticulum+in+neurons+is+regulated+by+microtubules.+From+mitochondrial+permeability+transition+pore+to+Ca2%2B-induced+Ca2%2B+release%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">[Ca2+]i signaling between mitochondria and endoplasmic reticulum in neurons is regulated by microtubules. From mitochondrial permeability transition pore to Ca2+-induced Ca2+ release.</a> J Biol Chem. 280, 715-721 (2005).</li>
<li>Sutendra, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Nogo+and+the+mitochondria-endoplasmic+reticulum+unit+in+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">The role of Nogo and the mitochondria-endoplasmic reticulum unit in pulmonary hypertension.</a> Sci Transl Med. 3, 88ra55(2011).</li>
<li>Mitra, K., Wunder, C., Roysam, B., Lin, G., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hyperfused+mitochondrial+state+achieved+at+G1-S+regulates+cyclin+E+buildup+and+entry+into+S+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A hyperfused mitochondrial state achieved at G1-S regulates cyclin E buildup and entry into S phase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11960-11965 (2009).</li>
<li>Doll, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+crisis+in+cerebrovascular+endothelial+cells+opens+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial crisis in cerebrovascular endothelial cells opens the blood-brain barrier.</a> Stroke. 46, 1681-1689 (2015).</li>
<li>Ren, X., Simpkins, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+Blood-Brain+Barrier+Damage+in+Stroke%3A+Mitochondrial+Mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinfect+Dis%22%5BJournal%5D)">Deciphering the Blood-Brain Barrier Damage in Stroke: Mitochondrial Mechanism.</a> J Neuroinfect Dis. S2, e002(2015).</li>
<li>Pun, P. B., Lu, J., Moochhala, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+ROS+in+BBB+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Res%22%5BJournal%5D)">Involvement of ROS in BBB dysfunction.</a> Free Radic Res. 43, 348-364 (2009).</li>
<li>Sun, J., Hu, H., Ren, X., Simpkins, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tert-butylhydroquinone+compromises+survival+in+murine+experimental+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicol+Teratol%22%5BJournal%5D)">Tert-butylhydroquinone compromises survival in murine experimental stroke.</a> Neurotoxicol Teratol. 54, 15-21 (2016).</li>
<li>Modis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+bioenergetics+is+regulated+by+PARP1+under+resting+conditions+and+during+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Cellular bioenergetics is regulated by PARP1 under resting conditions and during oxidative stress.</a> Biochem Pharmacol. 83, 633-643 (2012).</li>
<li>Brown, R. C., Morris, A. P., O'Neil, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+junction+protein+expression+and+barrier+properties+of+immortalized+mouse+brain+microvessel+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Tight junction protein expression and barrier properties of immortalized mouse brain microvessel endothelial cells.</a> Brain Res. 1130, 17-30 (2007).</li>
<li>Bukeirat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-34a+regulates+blood-brain+barrier+permeability+and+mitochondrial+function+by+targeting+cytochrome+c%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">MiR-34a regulates blood-brain barrier permeability and mitochondrial function by targeting cytochrome c.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 36, 387-392 (2016).</li>
<li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Impairment+in+Cerebrovascular+Endothelial+Cells+is+Involved+in+the+Correlation+between+Body+Temperature+and+Stroke+Severity%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Dis%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Impairment in Cerebrovascular Endothelial Cells is Involved in the Correlation between Body Temperature and Stroke Severity.</a> Aging Dis. 7, 14-27 (2016).</li>
<li>Oldendorf, W. H., Cornford, M. E., Brown, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+large+apparent+work+capability+of+the+blood-brain+barrier%3A+a+study+of+the+mitochondrial+content+of+capillary+endothelial+cells+in+brain+and+other+tissues+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">The large apparent work capability of the blood-brain barrier: a study of the mitochondrial content of capillary endothelial cells in brain and other tissues of the rat.</a> Ann Neurol. 1, 409-417 (1977).</li>
<li>Oldendorf, W. H., Brown, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Greater+number+of+capillary+endothelial+cell+mitochondria+in+brain+than+in+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Soc+Exp+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Greater number of capillary endothelial cell mitochondria in brain than in muscle.</a> Proc Soc Exp Biol Med. 149, 736-738 (1975).</li>
<li>Kaczara, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+monoxide+released+by+CORM-401+uncouples+mitochondrial+respiration+and+inhibits+glycolysis+in+endothelial+cells%3A+A+role+for+mitoBKCa+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Carbon monoxide released by CORM-401 uncouples mitochondrial respiration and inhibits glycolysis in endothelial cells: A role for mitoBKCa channels.</a> Biochim Biophys Acta. 1847, 1297-1309 (2015).</li>
<li>Bharadwaj, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+respirometric+assessment+of+mitochondria+isolated+from+skeletal+muscle+tissue+obtained+by+percutaneous+needle+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy.</a> J Vis Exp. (96), e52350(2015).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak potencjalnych konfliktów interesów w odniesieniu do badań, autorstwa i/lub publikacji tego artykułu. Opłaty za otwarty dostęp do tego artykułu zostały zapewnione przez Agilent Technologies.

Protokół ten stanowi metodę oceny fenotypu bioenergetycznego w komórkach śródbłonka naczyń mózgowych. Służy jako podstawowy test do oceny mitochondriów komórek śródbłonka i jest optymalny do eksperymentów mających na celu zbadanie mechanizmów bodźców, które mogą wpływać na mitochondrialny szlak sygnałowy w komórkach CVE. Stanowi również metodę testowania potencjalnych metod leczenia chorób związanych z zaburzeniem bariery krew-mózg.
Kluczowe kroki w ramach protokołu
Bioanalizatory strumienia zewnątrzkomórkowego mają możliwość pomiaru OCR w czasie rzeczywistym. W tym teście określenie odpowiedniej gęstości komórek ma kluczowe znaczenie. Jeśli gęstość komórek jest mniejsza niż 8 × 103 komórek na studzienkę, podstawowy OCR jest zbyt niski, aby można go było analizować (ryc. 2 i ryc. 3); jeśli gęstość komórek przekracza 32 × 103 komórek na studzienkę, komórki nie reagują na leczenie oligomycyną lub FCCP (ryc. 2 i ryc. 3). Optymalna gęstość komórek dla tej linii komórkowej w naszym modelu eksperymentalnym wynosi 16 × 103 komórek na studzienkę, co świadczy o powtarzalnych wynikach i wrażliwości na bodźce7 i zabiegi10,14. Jeśli używany jest bioanalizator 24-dołkowy, do testu wymagane byłoby nowe miareczkowanie gęstości komórek.
Udokumentowano, że CVE mają dużą objętość mitochondriów w porównaniu z innymi komórkami śródbłonka lub typami tkanek15,16, co sugeruje potrzebę większej produkcji energii i mniejszej liczby komórek do pomiaru metabolizmu bioenergetycznego. Przetestowaliśmy kilka typów komórek śródbłonka mózgu, takich jak pierwotne i unieśmiertelnione mysie komórki śródbłonka naczyń mózgowych7 oraz unieśmiertelnione ludzkie komórki śródbłonka naczyń mózgowych (dane niepublikowane). Komórki te wymagały podobnej gęstości komórek, aby osiągnąć akceptowalny OCR (OCR oddychania podstawowego w zakresie 40 - 160 pmol/min dla płytek 96-dołkowych i 50 - 400 pmol/min dla płytek 24-dołkowych) podczas wykonywania testu bioenergetycznego. Kaczara i wsp. poinformowali o pomiarze metabolizmu bioenergetycznego w ludzkich komórkach śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC), w których wykorzystano większą gęstość komórek17.
Nasza grupa nie oceniała komórek naczyń krwionośnych z innych tkanek lub narządów. Teoretycznie bioanalizator może być potencjalnie stosowany na każdym typie komórek, ale wymaga optymalizacji testu pod kątem gęstości komórek, pożywki do hodowli komórkowej i warunków hodowli (niektóre określone komórki mogą wymagać powlekanych płytek, aby dobrze rosnąć). Wymagane jest, aby eksperymenty zostały zakończone, aby upewnić się, że szybkość OCR mieści się w dopuszczalnym zakresie. Jeśli OCR w komórkach śródbłonka z innych narządów jest niższy niż CVE z mózgu, zwiększenie gęstości komórek może pomóc w osiągnięciu akceptowalnego zakresu OCR. Alternatywnie, jeśli komórki nie wykorzystują fosforylacji oksydacyjnej jako głównego źródła energii, bioanalizator nie byłby optymalnym testem.
Bioanalizator pozwala na sekwencyjne przerwanie łańcucha transportu elektronów, w oparciu o kolejność, w jakiej odczynniki są stosowane. Najpierw stosuje się oligomycynę, która hamuje mitochondrialny kompleks V (syntazę ATP). Po drugie, stosuje się FCCP, czyli rozprzęgacz elektronów, który prowadzi do zakłócenia gradientu protonów. Wreszcie, rotenon i antymycyna A, które hamują odpowiednio kompleksy mitochondrialne I i III, są stosowane w celu doprowadzenia do całkowitego zahamowania przepływu elektronów. Kolejność ekspozycji na leki jest istotna, ponieważ leki blokują specyficzną reakcję łańcuchową transportu elektronów, a sekwencyjne zmiany można zmierzyć, aby odzwierciedlić funkcję mitochondriów.
Modyfikacje i rozwiązywanie problemów
Aby ocenić odpowiedź mitochondriów na bodźce w komórkach CVE, zaleca się, aby bodźce były podawane do komórek po przyklejeniu komórek do dna płytki hodowli komórkowej (patrz oś czasu pokazana na rysunku 1; zwykle trwa to co najmniej 6 godzin). Aby uzyskać powtarzalne wyniki za pomocą zabiegów, niezwykle ważne jest utrzymanie stałej gęstości komórek. Jeżeli obróbka wstępna jest projektowana przed wysiewem komórek, gęstość komórek dla każdego zabiegu wstępnego powinna być dokładnie zmierzona, z wyłączeniem martwych komórek przeznaczonych do wysiewu. Jeżeli transfekcja jest uwzględniona w projekcie doświadczalnym, należy zapoznać się z protokołem transfekcji producenta. Jak wykazano w danych przedstawionych na rycinie 4, miR-34a transfekowano do komórek CVE przy użyciu zestawu do transfekcji lipofektaminy, który wymaga pożywki do hodowli komórkowej wolnej od antybiotyków i testu mito-stresu w celu oceny zmian w funkcji metabolicznej z nadekspresją miR-34a. Dawki plazmidu mogą być również zoptymalizowane, jak wcześniej opublikowano13. Kolejną zmianą, którą można wprowadzić do protokołu, jest zmiana stężeń odczynników. Można ukończyć krzywą miareczkowania oligomycyny, FCCP i/lub rotenonu i antymycyny A.
Ponadto, jeśli test ten jest używany do wysokoprzepustowych analiz różnych leków, sugeruje się, aby uwzględnić równoległy test do pomiaru żywotności komórek i proliferacji komórek, co zostało opisane w naszych poprzednich publikacjach7,13. Na wartości OCR znaczący wpływ ma liczba komórek (ryc. 2 i 3), a testy proliferacji komórek i żywotności korzystnie wpływają na normalizację danych. Jednak wykonanie tych testów leży w gestii każdego laboratorium z osobna.
Ograniczenia techniki
Głównym ograniczeniem tego protokołu jest to, że w badaniu użyliśmy tylko modelu hodowli komórkowej in vitro . Obecnie nie ma dostępnych modeli ex vivo ani modeli zwierzęcych, które mogłyby zajmować się funkcją mitochondriów komórek śródbłonka. Oczekuje się, że w przyszłych badaniach zostaną opracowane nowe modele do oceny funkcji bioenergetycznych in vivo i ex vivo .
Kolejnym ograniczeniem jest rozszerzenie ocen barier w ślad za działaniami bioenergetycznymi. Doświadczenia nie mogą być przeprowadzone, ponieważ, po pierwsze, po zakończeniu pomiarów bioenergetycznych, żywotność komórki jest zmniejszona w wyniku całkowitego przerwania łańcucha transportu elektronów; Po drugie, do wykrywania wartości bioenergetycznych wymagane są specjalne płytki i wkładki do hodowli komórkowych, które nie pasują do wkładek do oceny bariery. W związku z tym nie ma wielu testów funkcjonalnych, które można wykonać po teście bioenergetycznym. Oczekuje się jednak, że uda się opracować specjalne urządzenia do wykonywania testów funkcjonalnych przed testem bioenergetycznym.
Znaczenie techniki w odniesieniu do istniejących/alternatywnych metod
Poprzednie techniki oceny funkcji mitochondriów wymagały izolacji mitochondriów od komórek18. Ta nowa technika wykorzystująca bioanalizator pozwala na pomiar aktywności mitochondriów w nienaruszonych komórkach, co pozwala zachować więcej środowiska komórkowego niż ocena izolowanych mitochondriów.
Przyszłe zastosowania lub wskazówki po opanowaniu tej techniki
Protokół ten został zaprojektowany i opracowany dla linii komórkowej bEnd.3, ale jest również kompatybilny z pierwotnymi komórkami śródbłonka naczyń mózgowych (pCVE)7 lub innymi komórkami śródbłonka, co wykazaliśmy w naszej poprzedniej publikacji przy użyciu komórek pCVE7. W przypadku stosowania innych rodzajów śródbłonka może być wymagane pokrycie płytki hodowlanej i zastosowanie czynników wzrostu. Jednak test miareczkowania jest zalecany również dla innych typów komórek. Protokół ten oferuje ogólną metodę, którą należy przyjąć w ocenie bioenergetyki komórek CVE i może być dalej stosowany do badań mechanizmów lub odpowiedzi terapeutycznych w ten sposób.

Powszechnie uznaje się, że bariera krew-mózg (BBB) tworzona przez komórki śródbłonka naczyń mózgowych (CVE) ma bardzo wyraźne i unikalne funkcje kluczowe dla biologii naczyniowej. Te komórki śródbłonka wykorzystują mitochondria do generowania większości komórkowego zaopatrzenia w adenozynotrójfosforan (ATP) jako źródło energii chemicznej. Oprócz dostarczania ATP dla komórek CVE, mitochondria regulują różne procesy komórkowe w komórkach śródbłonka naczyń krwionośnych, takie jak sygnalizacja komórkowa1-4, apoptoza5 oraz kontrola cyklu komórkowego i wzrostu komórek6. Rozregulowanie bioenergetycznej funkcji mitochondriów w komórkach CVE może wpływać na biogenezę mitochondriów, prowadząc do upośledzenia aktywności śródbłonka naczyń krwionośnych oraz zaostrzać choroby naczyń mózgowych i zaburzenia neurodegeneracyjne, np. udarmózgu 7,8 i chorobę Alzheimera (AD)9. Wykazaliśmy, że uszkodzenia komórek CVE po ekspozycji na lipopolisacharyd (LPS) upośledzają funkcję mitochondriów w komórkach CVE i pogarszają wyniki udaru7. Tert-butylohydrochinon (tBHQ) zwiększa śmiertelność z powodu udaru mózgu poprzez zakłócanie fosforylacji oksydacyjnej w komórkach CVE10. W związku z tym ilościowy model funkcji bioenergetycznej w komórkach CVE nie tylko pilotuje serię badań związanych z mechanizmami chorób ośrodkowego układu nerwowego (OUN), ale także stanowi przełom w badaniach przesiewowych leków ukierunkowanych na funkcję mitochondriów w biologii naczyniowej.
Izolowane mitochondria zostały użyte do pomiaru funkcji bioenergetycznej. My7 i inni11 opisaliśmy oceny bioenergetyki komórkowej w nienaruszonych komórkach CVE przy użyciu bioanalizatora strumienia zewnątrzkomórkowego. Analizator zapewnia przewagę endogennej komórkowej oceny bioenergetycznej. Ten czuły i spójny test mierzy mitochondrialny metabolizm komórek CVE i może być wykorzystany do oceny upośledzenia bioenergetycznego przez bodźce, badania mechanizmów mitochondrialnych szlaków sygnałowych oraz badań przesiewowych leków lub terapii, które wpływają na funkcję mitochondriów w komórkach CVE. Wskaźnik zużycia tlenu (OCR) jest rejestrowany przez bioanalizator przy użyciu podejścia do profilowania farmakologicznego poprzez połączenie czterech mitochondrialnych substancji zaburzających: oligomycyny, cyjanku karbonylu-4 (trifluorometoksy), fenylohydrazonu (FCCP), rotenonu i antymycyny A. W tym protokole szczegółowo opisujemy zoptymalizowane podejście, które pozwala na pomiar i obliczenie parametrów funkcjonalnych mitochondriów w komórkach CVE, w tym podstawowego oddychania mitochondrialnego, produkcji ATP, wycieku protonów, maksymalnego oddychania i wolnej pojemności oddechowej, w jednym teście.

<table><tbody><tr><td>bEnd.3 linia komórkowa</td><td>ATCC</td><td>CRL-2299</td><td>25 - 30 przejść</td></tr><tr><td>Zmodyfikowane podłoże orła Dulbecco (DMEM)</td> <td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12450</td><td>10% stężenie końcowe</td></tr><tr><td>Penicylina / Steptomycyna</td><td>Hyklon</td><td>SV30010</td><td>1 razy; 100 pończochy</td></tr><tr><td>0,25% trypsyna, 0,03% roztwór EDTA</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Corning</td><td>25-000-CI</td><td>1,0 i mikro; M stężenie końcowe</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma</td><td>CAS 50-99-7</td><td>25 mM stężenie końcowe</td></tr><tr><td>Oligomycyna</td><td>Sigma</td><td>O4876</td><td>1,0 &mikro; M stężenie końcowe</td></tr><tr><td>4-(trifluorometoksy)fenylohydrazon karbonilocyjanku (FCCP)</td><td>Sigma</td><td>C2920</td><td>0,5 &mikro; M stężenie końcowe</td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Sigma</td><td>R8875</td><td>1.0 &mikro; M końcowe stężenie</td></tr><tr><td>Antymycyna A</td><td>Sigma</td><td>CAS 1397-94-0</td><td>1,0 &mikro; M stężenie końcowe</td></tr><tr><td>Stacja mycia płytek</td><td>Seahorse Bioscience Bioanalizator</td><td></td><td></td></tr><tr><td>strumienia zewnątrzkomórkowego&nbsp; &nbsp;</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>XFe96</td><td></td></tr><tr><td>Płytka do hodowli komórek strumienia zewnątrzkomórkowego</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>102416-100</td><td></td></tr><tr><td>Wkład czujnika strumienia zewnątrzkomórkowego</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>102416-100</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór kalibru strumienia zewnątrzkomórkowego</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>100840-000</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do oznaczania strumienia zewnątrzkomórkowego</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>102365-100</td><td>PH buforowane przed badaniem</td></tr></tbody></table>

ocena funkcji bioenergetycznych w komórkach śródbłonka naczyń mózgowych

Evaluation of Bioenergetic Function in Cerebral Vascular Endothelial Cells

Integralność bariery krew-mózg (BBB) jest kluczowa dla zapobiegania urazom mózgu. Komórki śródbłonka naczyń mózgowych (CVE) są jednym z typów komórek wchodzących w skład bariery krew-mózg; Komórki te mają bardzo duże zapotrzebowanie na energię, co wymaga optymalnego funkcjonowania mitochondriów. W przypadku choroby lub urazu funkcja mitochondriów w tych komórkach może zostać zmieniona, co prowadzi do choroby lub otwarcia bariery krew-mózg. W tym manuskrypcie przedstawiamy metodę pomiaru funkcji mitochondriów w komórkach CVE przy użyciu całych, nienaruszonych komórek i bioanalizatora. Test mitostresu służy do rzucenia wyzwania komórkom, które zostały zaburzone, fizycznie lub chemicznie, i oceny ich funkcji bioenergetycznej. Ponadto metoda ta stanowi również użyteczny sposób badania przesiewowego nowych terapii, które mają bezpośredni wpływ na funkcję mitochondriów. Zoptymalizowaliśmy gęstość komórek niezbędną do uzyskania wskaźników zużycia tlenu, które pozwalają na obliczenie różnych parametrów mitochondriów, w tym produkcji ATP, maksymalnego oddychania i wolnej pojemności. Pokazujemy również czułość testu, wykazując, że wprowadzenie mikroRNA, miR-34a, prowadzi do wyraźnego i wykrywalnego spadku aktywności mitochondriów. Chociaż dane przedstawione w tym artykule są zoptymalizowane pod kątem linii komórkowej bEnd.3, zoptymalizowaliśmy również protokół dla pierwotnych komórek CVE, co dodatkowo sugeruje użyteczność w modelach przedklinicznych i klinicznych.

Aby ocenić funkcję bioenergetyczną komórek CVE w odpowiedzi na stres oksydacyjny, wybrano linię komórkową śródbłonka mikrokrążenia mózgu myszy bEnd.3, która wykazuje podobne porównawcze właściwości barierowe jak pierwotne komórki śródbłonka mikrokrążenia mózgu12. Biorąc pod uwagę, że kinetyka i względna intensywność odpowiedzi różnią się w zależności od typu komórek, pierwsza seria eksperymentów została zaprojektowana w celu uzyskania mierzalnych poziomów OCR poprzez określenie optymalnej liczby komórek bEnd.3 do zastosowania w teście profilowania metabolicznego, co przedstawiono na Rysunku 2. Po dokonaniu oceny dane zostały skwantyfikowane i zaprezentowane na Rysunku 3. Oddychanie podstawowe, oddychanie maksymalne oraz rezerwy wydolności oddechowej wykazały odpowiedź proporcjonalną do gęstości komórek. Jednakże produkcja ATP spadła przy wyborze 64 × 103 komórek na dołek, co sugeruje, że nadmiernie konfluencyjna hodowla komórek nie nadaje się do tego eksperymentu. Optymalna gęstość komórek mieści się w przedziale od 8 do 32 × 103 komórek na dołek, w oparciu o odpowiedź na disruptory mitochondrialne.
W kolejnych eksperymentach zastosowano gęstość wysiewu 16 × 103 komórek na dołek, aby umożliwić optymalną detekcję zmian w OCR. Przy użyciu 16 × 103 komórek na dołek zaobserwowano oczekiwane odpowiedzi w OCR i wykazano, że mikroRNA miR-34a redukuje funkcję mitochondrialną w komórkach CVE (Rycina 4). Wcześniej zgłaszaliśmy, że miR-34a redukuje fosforylację oksydacyjną w tych komórkach13. Powtórzone eksperymenty wykazały również, że respiracja maksymalna oraz pojemność zapasowa zostały istotnie zmniejszone przez nadekspresję miR-34a w CVE w 24 h po transfekcji, mimo że respiracja podstawowa, produkcja ATP i wyciek protonów nie uległy istotnym zmianom (Rycina 4). Dane te demonstrują czułość bioanalizatora w wykrywaniu zmian funkcji mitochondrialnej w CVE.
<img alt="Schemat przebiegu hodowli komórkowych: pasażowanie komórek, traktowanie, analiza strumienia, etapy analizy danych." src="/files/ftp_upload/54847/54847fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Planowanie strategiczne eksperymentu. Przedstawiono harmonogram przygotowania komórek, płytek oraz kartridży. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54847/54847fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Metabolizm komórkowy; wykres; tempo zużycia tlenu (OCR) w czasie; analizowano wiele wariantów traktowania." src="/files/ftp_upload/54847/54847fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Reprezentatywne surowe dane dotyczące funkcji bioenergetycznej w komórkach CVE o różnej gęstości komórkowej. Tempo zużycia tlenu mierzono w komórkach CVE o różnych gęstościach komórkowych. Dane przedstawiają średnią ± SD (n = 5); OCR: tempo zużycia tlenu; FCCP: karbonylocyjanid-4-(trifluorometoksy)fenylohydrazon; Rot/Anti-A: rotenon i antymycyna A. ①, ② i ③ oznaczają respirację podstawową; ④, ⑤ i ⑥ oznaczają respirację związaną z syntezą ATP; ⑦, ⑧ i ⑨ oznaczają respirację maksymalną; ⑩, ⑪ i ⑫ oznaczają respirację pozimitochondrialną. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54847/54847fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza oddychania komórkowego; wykresy słupkowe OCR w zależności od liczby komórek; podstawowe, ATP, maksymalne, rezerwowe, przeciek." src="/files/ftp_upload/54847/54847fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Reprezentatywne wyniki funkcji bioenergetycznej w komórkach CVE przy różnych gęstościach komórek. Oddychanie podstawowe, produkcja ATP, oddychanie maksymalne oraz pojemność rezerwowa zostały obliczone z surowych danych uzyskanych w teście funkcji bioenergetycznej przedstawionym na Rysunku 2, z wykorzystaniem wzorów wskazanych w sekcji 4. Dane przedstawiają średnią ± SD (n = 5); OCR: szybkość zużycia tlenu. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54847/54847fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres analizy oddychania mitochondrialnego, wykresy słupkowe; OCR w czasie, produkcja ATP, oddychanie maksymalne." src="/files/ftp_upload/54847/54847fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Reprezentatywne wyniki obniżenia funkcji bioenergetycznej przez miR-34a. (A) Surowe dane dotyczące funkcji mitochondrialnej po nadekspresji miR-34a w 24 h po transfekcji. (B) Oddychanie podstawowe, produkcja ATP, oddychanie maksymalne oraz rezerwa wydolnościowa obliczone na podstawie surowych danych uzyskanych w teście funkcjonalnym bioenergetyki przedstawionym na Rycini 4A; parametry obliczono zgodnie ze wzorami wskazanymi w sekcji 4. Nadekspresja miR-34a obniża funkcję mitochondrialną w komórkach CVE w 24 h po transfekcji. Dane przedstawiają średnią ± SD (n = 5); OCR: tempo zużycia tlenu. ****, P &lt; 0.0001. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54847/54847fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat procesu metabolizmu komórkowego z etapami kalibracji i wtryskiwania w cyklach czasowych do analizy." src="/files/ftp_upload/54847/54847table1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Tabela 1"> 
Tabela 1. Protokół pracy urządzenia.

Mitochondria komórek śródbłonka są niezbędne do utrzymania integralności bariery krew-mózg. Wprowadzamy protokół pomiaru funkcji bioenergetycznych w komórkach śródbłonka naczyń mózgowych.

Ocena funkcji bioenergetycznych w komórkach śródbłonka naczyń mózgowych

The integrity of the blood-brain-barrier (BBB) is critical to prevent brain injury. Cerebral vascular endothelial (CVE) cells are one of the cell types ...

Ogólnymi celami tej procedury są ocena wpływu zmian w funkcji mitochondriów na rozwój zaburzeń neurologicznych oraz opracowanie środków terapeutycznych bezpośrednio oddziałujących na otwarcie bariery krew-mózg. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie zaburzeń neurologicznych, takie jak: w jaki sposób można zminimalizować śmierć komórek neuronalnych po udarze? Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona ocenę funkcji mitochondriów w czasie rzeczywistym w całych, nienaruszonych komórkach.Po wyhodowaniu komórek śródbłonka naczyń mózgowych w pożywce kompletnej, w kolbie do hodowli tkankowej o powierzchni 75 cm², w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2 do osiągnięcia 80% konfluencji, należy usunąć pożywkę hodowlaną i opłukać komórki roztworem trypsyny z EDTA. Następnie do kolby należy dodać od 1 do 2 ml świeżej trypsyny z EDTA i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 3 do 5 minut w celu ich odklejenia. Po potwierdzeniu pod mikroskopem odwróconym, że komórki oddzieliły się od podłoża, należy przerwać reakcję poprzez ostrożne dodanie 10 ml świeżej kompletnej pożywki i przenieść komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml w celu odwirowania.Odlej supernatant i przemyj osad w 10 mililitrach świeżej kompletnej pożywki wzrostowej przed kolejnym wirowaniem. Następnie ponownie zawieś osad w kompletnej pożywce wzrostowej w stężeniu 2 × 10⁵ komórek na mililitr w celu subkultury. Po odpowiedniej liczbie pasaży wysiej 1,6 × 10⁴ komórek w 80 mikrolitrach kompletnej pożywki na studzienkę, na 96-studzienkową płytkę do hodowli komórkowych do pomiaru strumienia zewnątrzkomórkowego, a następnie umieść płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% dwutlenku węgla.Po przytwierdzeniu się komórek do płytki, dodaj odpowiednią substancję do wybranych studzienek i przenieś komórki z powrotem do inkubatora. Dzień przed testem oceny funkcji mitochondriów nawilż kasetę czujnika przepływu zewnątrzkomórkowego (extracellular flux censor cartridge), dodając 150 µL roztworu kalibracyjnego do analizy przepływu zewnątrzkomórkowego, i inkubuj płytkę przez noc w temperaturze 37 °C bez dostępu dwutlenku węgla. Następnego ranka, używając stacji mycia płytek, wymień pożywkę hodowlaną na pożywkę do analizy przepływu zewnątrzkomórkowego o pH 7,0.Następnie inkubuj komórki w temperaturze 37°C, bez dwutlenku węgla, przez 30 do 60 minut. Po wyrównaniu stanu komórek włóż nawodniony kartridż do Bioanalizatora i kliknij przycisk Start, aby rozpocząć kalibrację. Po zakończeniu kalibracji kliknij komunikat Unlock Cartridge, aby zdjąć dolną płytkę kartridża i włożyć płytkę z komórkami.Następnie otwórz plik z danymi, aby uzyskać wartości szybkości z Bioanalyzera w celu eksportu do pliku arkusza kalkulacyjnego. Biorąc pod uwagę, że kinetyka i względna intensywność odpowiedzi różnią się w zależności od typów komórek śródbłonka naczyń mózgowych, w eksperymentach tych zastosowano serię stężeń komórek bEnd. 3, aby zidentyfikować optymalną liczbę komórek do pomiaru poziomów szybkości zużycia tlenu w badaniu profilowania metabolicznego.Jak zaobserwowano, oddychanie podstawowe i maksymalne oraz rezerwową wydolność oddechową wykazują odpowiedź proporcjonalną do gęstości komórek. Produkcja ATP spada jednak w przypadku zastosowania najwyższego stężenia komórek na studzinkę, co sugeruje, że zbyt gęsta kultura komórek nie nadaje się do tego eksperymentu. Optymalna gęstość komórek wydaje się występować w średnim zakresie liczby komórek na studzinkę.W związku z tym, w tym reprezentatywnym eksperymencie z zastosowaniem średniego stężenia komórek, oceniono oczekiwane poziomy szybkości zużycia tlenu, co wykazało, że niekodujące cząsteczki prekursorowego mRNA ograniczają funkcję mitochondriów w komórkach śródbłonka naczyń mózgowych. Eksperymenty te wykazują również, że maksymalna respiracja oraz pojemność rezerwowa są znacząco obniżone w wyniku nadekspresji tych cząsteczek w komórkach śródbłonka naczyń mózgowych 24 godziny po transfekcji, mimo że respiracja podstawowa, produkcja ATP oraz wyciek protonów nie wykazują istotnych zmian. Po opanowaniu techniki, procedurę tę można przeprowadzić w ciągu dwóch dni.Od wysiewania komórek po ocenę funkcji mitochondriów, jeśli procedura zostanie przeprowadzona prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że określenie optymalnej gęstości komórek jest niezwykle ważne przed rozpoczęciem jakichkolwiek innych czynności. Po zastosowaniu tej procedury można wykonać inne metody, takie jak testy żywotności komórek lub testy glikolityczne, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące zmian w funkcji mitochondriów wynikających ze zmniejszonej żywotności komórek lub zmian w innych szlakach metabolicznych.Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom zajmującym się funkcją mitochondriów do wykorzystania nienaruszonych komórek zamiast izolowanych mitochondriów w badaniach nad szeregiem schorzeń, w tym chorobami neurologicznymi, nowotworami oraz zaburzeniami metabolicznymi. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat oceny funkcji mitochondriów w komórkach śródbłonka naczyniowego mózgu.

evaluation-bioenergetic-function-cerebral-vascular-endothelial

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejsza metoda opisuje sposób izolacji i unieśmiertelniania mikro naczyniowych komórek śródbłonka z mózgu myszy. Przedstawiamy szczegółowy protokół, obejmujący kolejno homogenizację tkanki mózgowej, etapy trawienia, wysiew oraz unieśmiertelnianie komórek. Uzyskanie homogennej, unieśmiertelnionej linii mikro naczyniowych komórek śródbłonka zajmuje zazwyczaj około pięciu tygodni.

Generowanie unieśmiertelnionej linii komórek śródbłonka mikrokrążenia mózgu myszy jako modelu bariery krew-mózg in vitro

Ten film demonstruje ocenę funkcjonowania mitochondriów komórek śródbłonka naczyń mózgowych (CVE) za pomocą testu strumienia zewnątrzkomórkowego. Komórki CVE są siane na płytce do hodowli komórek strumienia zewnątrzkomórkowego. Czujniki strumienia zewnątrzkomórkowego są nawilżane przed załadowaniem i kalibracją do bioanalizatora. Płytka zawierająca komórki jest następnie ładowana do analizy.

Ocena funkcji mitochondriów w komórkach śródbłonka naczyń mózgowych

Dysfunkcja śródbłonka jest związana z licznymi stanami chorobowymi i jest predyktorem niekorzystnych zdarzeń sercowo-naczyniowych u ludzi. Rozszerzenie naczyń krwionośnych za pośrednictwem przepływu (FMD) jest nieinwazyjną metodą ultrasonograficzną służącą do oceny funkcji śródbłonka. Wybory metodologiczne i doświadczenie operatora mogą mieć wpływ na wyniki. Omówiono tu systematyczne podejście do pryszczycy w badaniach na ludziach.

Ocena ultrasonograficzna zależnego od śródbłonka rozszerzenia naczyń krwionośnych tętnicy ramiennej za pośrednictwem przepływu w badaniach klinicznych

Komórki śródbłonka mikronaczyniowego mózgu (BMEC) są połączone specyficznymi białkami połączeniowymi, tworząc wysoce regulowaną barierę oddzielającą krew od ośrodkowego układu nerwowego (OUN), tak zwaną barierę krew-mózg (BBB). Izolacja pierwotnych mysich komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu, jak omówiono w tym protokole, umożliwia szczegółowe badania in vitro bariery krew-mózg.

Izolacja pierwotnych mysich komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu

Niniejszy artykuł opisuje metodologiczne rozważania dotyczące kilku nieinwazyjnych ocen funkcji i morfologii naczyń krwionośnych, które są powszechnie stosowane w badaniach medycznych do oceny różnych etapów miażdżycy.

Metodologiczne podejście do nieinwazyjnej oceny funkcji i morfologii naczyń krwionośnych

Opisujemy prosty test biologiczny oparty na komórkach do wykrywania, ilościowego określania i monitorowania aktywności członków rodziny ligandów czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego. Test wykorzystuje receptory chimeryczne ulegające ekspresji w linii komórkowej zależnej od czynnika, aby zapewnić półilościową lub ilościową ocenę wiązania receptora i sieciowania przez ligand.

Prosty test biologiczny do oceny czynników wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych

Pokazane są tutaj protokoły (1) świeżo izolowania nienaruszonych "rurek" śródbłonka mózgu oraz (2) jednoczesnych pomiarów śródbłonka wapnia i potencjału błonowego podczas hiperpolaryzacji pochodzącej ze śródbłonka. Co więcej, metody te pozwalają na farmakologiczne dostrojenie wapnia w komórkach śródbłonka i sygnalizacji elektrycznej jako indywidualnych lub interaktywnych zmiennych eksperymentalnych.

Jednoczesne pomiary wewnątrzkomórkowego potencjału wapnia i błony w świeżo wyizolowanym i nienaruszonym śródbłonku mózgowym myszy

Prezentujemy trzy proste testy in vitro - test migracji na duże odległości, test migracji kokulturowej i test przyciągania chemo-chemicznego - które wspólnie oceniają funkcje komórek śródbłonka okołokomorowego pochodzących z ludzkich komórek macierzystych i ich interakcję z interneuronami GABA-ergicznymi.

Testy migracji, chemoprzyciągania i kohodowli komórek śródbłonka pochodzących z ludzkich komórek macierzystych i neuronów GABA-ergicznych

Intensywne przygotowanie nienaruszonych "rurek" śródbłonka mózgu myszy z tętniczek miąższowych mózgu jest zilustrowane do badania regulacji przepływu krwi w mózgu. Ponadto pokazujemy eksperymentalne mocne strony tego modelu badania śródbłonka do obrazowania fluorescencyjnego i pomiaru elektrofizjologii kluczowych szlaków sygnalizacji komórkowej, w tym zmian wewnątrzkomórkowych [Ca2+] i potencjału błonowego.

Izolacja i analiza funkcjonalna śródbłonka tętniczego miąższu mózgu myszy

Ten protokół opisuje niezawodny i skuteczny model in vitro bariery mózgowo-krwiennej. Metoda wykorzystuje mysie komórki śródbłonka naczyniowego mózgu bEnd.3 i mierzy transbłonowy opór elektryczny.

Zapis integralności funkcjonalnej bariery na komórkach śródbłonka naczyniowego bEnd.3 poprzez transśródbłonkową detekcję oporu elektrycznego

Tutaj demonstrujemy technikę korzystania z biosensorów opartych na impedancji: ECIS i cellZscope, do pomiaru siły bariery śródbłonka mózgu. Szczegółowo opisujemy przygotowanie i technikę dodawania różnych bodźców do modelu śródbłonka mózgu in vitro. Mierzymy, rejestrujemy i przedstawiamy reprezentatywną analizę wyników.

Pomiar zmian w integralności bariery śródbłonka mózgu za pomocą dwóch bioczujników opartych na impedancji w odpowiedzi na komórki nowotworowe i cytokiny

Poznaj metodę oceny funkcji mitochondrialnych w komórkach śródbłonka naczyń mózgowych. Technika umożliwia badanie bioenergetyki w czasie rzeczywistym, co jest kluczowe dla zrozumienia chorób neurologicznych.

Ocena funkcji bioenergetycznych w komórkach śródbłonka naczyń mózgowych

Przeglądaj więcej filmów