Ocena funkcji bioenergetycznych w komórkach śródbłonka naczyń mózgowych

Ogólnym celem tej procedury jest ocena, w jaki sposób zmiany funkcji mitochondriów wpływają na rozwój zaburzeń neurologicznych oraz zaprojektowanie terapii, które mają bezpośredni wpływ na otwarcie bariery krew-mózg. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie zaburzeń neurologicznych, takie jak to, w jaki sposób można zminimalizować śmierć komórek neuronalnych po udarze? Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona ocenę funkcji mitochondriów w czasie rzeczywistym w całych nienaruszonych komórkach.

Po wyhodowaniu komórek śródbłonka naczyń mózgowych w kompletnym podłożu, w kolbie do hodowli tkankowej o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych, w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla do 80% konfluencji, wyrzuć pożywkę do hodowli komórkowej i przepłucz komórki trypsyną EDTA. Następnie dodaj jeden do dwóch mililitrów świeżej trypsyny EDTA do kolby i odłącz komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza na trzy do pięciu minut. Po potwierdzeniu, że komórki uniosły się pod odwróconym mikroskopem, zatrzymaj reakcję delikatnym dodaniem 10 mililitrów świeżej, kompletnej pożywki komórkowej i przenieś komórki do 15-mililitrowej stożkowej probówki w celu odwirowania.

Odrzucić supernatant i umyć osad w 10 mililitrach świeżej, kompletnej pożywki wzrostowej do kolejnego odwirowania. Następnie ponownie zawiesić osad w kompletnym podłożu wzrostowym w stężeniu dwa razy od 10 do piątych komórek na mililitr dla subkultury. Po odpowiedniej liczbie subkultur wysiewa się 1,6 razy 10 do czwartych komórek w 80 mikrolitrach kompletnej pożywki na studzienkę, na 96-dołkowej płytce do hodowli komórek strumienia zewnątrzkomórkowego i umieszcza płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.

Gdy komórki przyczepią się do płytki, dodaj odpowiednią obróbkę do odpowiednich studzienek i włóż komórki z powrotem do inkubatora. Dzień przed testem oceny funkcjonalnej mitochondriów należy nawodnić wkład cenzora strumienia zewnątrzkomórkowego 150 mikrolitrami roztworu kalibru strumienia zewnątrzkomórkowego i inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza bez dwutlenku węgla. Następnego ranka użyj myjki płytki, aby zmienić pożywkę do hodowli komórkowych na pożywkę do oznaczania strumienia zewnątrzkomórkowego pH 7,0.

Następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza, bez dwutlenku węgla, przez 30 do 60 minut. Gdy komórki zrównoważą się, załaduj uwodniony wkład do bioanalizatora i kliknij przycisk Start, aby rozpocząć kalibrację. Pod koniec kalibracji kliknij monit Odblokuj kasetę, aby wyjąć dolną płytkę wkładu i załadować płytkę ogniwa.

Następnie otwórz plik danych, aby uzyskać wartości szybkości z Bioanalyzera w celu wyeksportowania do pliku arkusza kalkulacyjnego. Biorąc pod uwagę, że kinetyka i względna intensywność odpowiedzi są zróżnicowane wśród różnych typów komórek śródbłonka naczyń krwionośnych mózgu, w tych eksperymentach seria stężeń bEnd. Wykorzystano 3 komórki do zidentyfikowania optymalnej liczby komórek do pomiaru poziomu zużycia tlenu w teście profilowania metabolicznego.

Jak zaobserwowano, oddychanie podstawowe i maksymalne oraz wolna wydolność oddechowa wykazują proporcjonalną reakcję na gęstość komórek. Produkcja ATP zmniejsza się jednak, gdy stosuje się najwyższe stężenie komórek na studzienkę, co sugeruje, że nadmiernie zlewająca się hodowla komórkowa nie jest odpowiednia dla eksperymentu. Przy optymalnym zagęszczeniu komórek wydaje się, że występuje w średnim zakresie liczby komórek na studzienkę.

W związku z tym oczekiwane poziomy zużycia tlenu oceniono w tym reprezentatywnym eksperymencie przy użyciu średniego zakresu stężenia komórek, wykazując, że niekodujące prekursorowe cząsteczki mRNA zmniejszają funkcję mitochondriów w komórkach śródbłonka naczyń mózgowych. Eksperymenty te pokazują również, że maksymalne oddychanie i zapasowa pojemność są znacznie zmniejszone przez nadekspresję tych cząsteczek w komórkach śródbłonka naczyń mózgowych w ciągu 24 godzin po transfekcji, mimo że oddychanie podstawowe, produkcja ATP i wyciek protonów nie wykazują znaczących zmian. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch dni.

Od posiewu komórek po dostęp do funkcji mitochondriów, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że określenie optymalnej gęstości komórek jest niezwykle ważne przed rozpoczęciem jakichkolwiek innych procedur. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak żywotność komórek lub testy glikolityczne, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące zmian zachodzących w funkcji mitochondriów z powodu zmniejszonej żywotności komórek lub zmian w innych szlakach metabolicznych.

Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się funkcją mitochondriów do wykorzystania nienaruszonych komórek wewnątrz izolowanych mitochondriów i różnych chorób, w tym chorób neurologicznych, nowotworów lub zaburzeń metabolicznych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak uzyskać dostęp do funkcji mitochondriów w komórkach śródbłonka naczyń mózgowych.