Mysi model szczepu Clostridium difficile R20291 leczony cefoperazonem

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest przedstawienie instrukcji krok po kroku dotyczącej wdrażania mysiego modelu zakażenia Clostridium difficile indukowanego cefoperazonem, ze szczególnym uwzględnieniem monitorowania przebiegu klinicznego choroby, enumeracji bakterii, cytotoksyczności toksyn oraz zmian histopatologicznych po zakażeniu. Ten szczegółowy protokół pomoże badaczom w dokładnej realizacji mysiego modelu zakażenia Clostridium difficile, co jest niezbędne do badania patogenezy tej bakterii oraz oceny nowych metod terapeutycznych. Główną zaletą zastosowania tego modelu mysiego jest fakt, że pięciodniowa ekspozycja na jeden antybiotyk czyni myszy podatnymi na kolonizację przez C.difficile oraz prowadzi do przedłużonego klinicznego przebiegu zakażenia, analogicznego do przebiegu choroby u ludzi.

Na początek należy wziąć odpowiedni szczep wyjściowy C.difficile i poddać go wirowaniu w wortexie. W komorze z laminarnym przepływem powietrza rozcieńczyć szczep w wodzie sterylnej w probówce z nakrętką do stężenia 10⁵ zarodników na 25 µL. Mieszaninę należy oznaczyć jako inokulum zarodników i umieścić probówkę w kąpieli wodnej o temperaturze 65 °C na 20 minut.

Następnie, w komorze z laminarnym przepływem powietrza, pipetuj 50 µL podgrzanego inokulum zarodników do sterylnej probówki do mikrocentryfugi i przenieś ją do komory beztlenowej do dalszego użytku. Pozostałe inokulum zarodników nabierz do strzykawki o objętości 1 mL wyposażonej w sterylną igłę do zgłębnikowania żołądka z zaokrągloną końcówką. W komorze z laminarnym przepływem powietrza weź mysz badawczą i unieruchom głowę, delikatnie chwytając zwierzę za luźną skórę karku i grzbietu.

Używając palca wskazującego i upewniając się, że zwierzę nie wydaje dźwięków ani nie wykazuje oznak stresu, należy dodatkowo unieruchomić głowę zwierzęcia i wydłużyć przełyk. Mysz należy utrzymać w pozycji pionowej, a następnie delikatnie wprowadzić igłę do zgłębnika przez bok pyska. Igłę należy prowadzić wzdłuż podniebienia i powoli wprowadzać do przełyku.

Gdy igła znajdzie się mniej więcej w połowie drogi do przełyku, wstrzyknij 25 µl inokulum zarodników, a następnie ostrożnie wycofaj igłę. Umieść zwierzę z powrotem w klatce i obserwuj je pod kątem wystąpienia kaszlu lub duszności, które mogą wskazywać na przypadkowe podanie do tchawicy. Następnie pobierz alikwot inokulum zarodników przechowywany wcześniej w komorze beztlenowej oraz pozostałe inokulum do zgłębnika i wykonaj od jednego do dziesięciu rozcieńczeń seryjnych w 180 µl 1x PBS.

Przygotuj od czterech do pięciu takich rozcieńczeń. Stosując technikę aseptyczną, przenieś 100 µL każdego rozcieńczenia seryjnego na oddzielną płytkę TCCFA. Używając za każdym razem nowej sterylnej rozprowadzalnika w kształcie litery L, równomiernie rozprowadź inokulum z rozcieńczenia na każdej płytce.

Inkubuj płytki w warunkach beztlenowych przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Na koniec policz kolonie C.difficile na każdej płytce z rozcieńczenia i oblicz jednostki tworzące kolonie, aby uzyskać dawkę zakaźną podaną myszom. Aby pobrać próbki kału od myszy do oceny, najpierw lekko, ale pewnie unieruchom mysz, chwytając ją za luźną skórę na karku i grzbiecie, upewniając się, że zwierzę nie odczuwa stresu.

Używając małego palca, delikatnie unieś ogon zwierzęcia, odsłaniając odbyt. Przyłóż sterylną probówkę do mikrocentryfugi o znanej masie bezpośrednio pod odbyt zwierzęcia, dbając o to, aby probówka nie dotykała bezpośrednio myszy. Gdy zwierzę odda stolec, zbierz pellet fekalny do probówki.

Przechowywać probówkę w temperaturze pokojowej do momentu zebrania wszystkich niezbędnych próbek. Zważyć probówki zawierające kał na wadze analitycznej i zapisać masę z dokładnością do czterech miejsc po przecinku. Obliczyć masę pelletu kałowego, odejmując masę probówki.

Następnie oblicz rozcieńczenie zawartości w stosunku od 1 do 10 i resuspenduj ją w 1x PBS. Za pomocą końcówki pipety delikatnie rozbij masę kałową w roztworze. Inkubuj próbki w temperaturze pokojowej przez 30 minut, pozwalając zawartości osiąść.

Utrzymując roztwory w warunkach beztlenowych, należy przygotować rozcieńczenia seryjne dla każdej próbki w 1x PBS. Przenieś 100 µl każdego rozcieńczenia seryjnego na płytki TCCFA. Używając sterylnego rozprowadzacza w kształcie litery L, równomiernie rozprowadź kulturę na płytkach.

Inkubować płytki w warunkach beztlenowych w temperaturze 37 °C przez 24 godziny. Na koniec policzyć kolonie C.difficile i obliczyć liczbę jednostek tworzących kolonie na gram zawartości fekaliów. Ten rysunek przedstawia masę myszy w dniach następujących po zakażeniu C.difficile R20291.

W dniu zerowym wagę wyjściową ustalono na poziomie 100. Średnią masę ciała myszy mierzono każdego kolejnego dnia przez 14 dni. Wyraźny spadek masy ciała zaobserwowano u myszy poddanych działaniu czynnika od drugiego do siódmego dnia po ekspozycji.

Wydawało się, że myszy zdrowieją i odzyskują masę ciała po tym punkcie. Tutaj przedstawiono ładunek C.difficile w kale w dniach po zakażeniu. W 24 godzinach po zakażeniu wszystkie myszy były skolonizowane w ilości 10^7 CFUs na gram kału.

Obciążenie to zmniejszyło się od siódmego dnia, choć C.difficile nadal pozostawało obecne. Badanie histopatologiczne myszy w czasie trwania infekcji wykazało najistotniejsze zmiany patologiczne w kątnicy. Całkowite oceny histologiczne kątnicy różniły się znacząco między dniem zerowym a drugim i czwartym dniem po zakażeniu.

Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tym modelem mysim mogą napotykać trudności przy obliczaniu i przygotowywaniu inokulum zarodników wykorzystywanego do zakażania myszy oraz przy obliczaniu ładunku bakteryjnego C.difficile w kale. Podczas stosowania tego protokołu należy pamiętać, że modyfikacje dawki lub szczepu zarodników C.difficile podawanych myszom mogą zmienić wynik tego modelu.