Name: Mysi model szczepu Clostridium difficile R20291 leczony cefoperazonem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Poznaj model myszy zakażonych Clostridioides difficile szczepu R20291 leczonych cefoperazonem. Protokół obejmuje monitorowanie objawów klinicznych, liczenie bakterii, cytotoksyczność toksyn i zmiany histopatologiczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Trevorowi Lawleyowi z Wellcome Trust Sanger Institute za zarodniki C. difficile R20291 oraz Jamesowi S. Guyowi z North Carolina State University College of Veterinary Medicine za komórki Vero, oba wykorzystane w tym manuskrypcie. Histopatologia zwierząt została przeprowadzona w LCCC Animal Histopathology Core Facility na Uniwersytecie Karoliny Północnej w Chapel Hill, przy specjalnej pomocy Traci Raley i Amandy Brown. LCCC Animal Histopathology Core jest częściowo wspierany przez NCI Center Core Support Grant (2P30CA016086-40) dla UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center. Chcielibyśmy również podziękować Vincentowi Youngowi, Annie Seekatz, Jhansi Leslie i Cassie Schumacher za pomocne dyskusje na temat protokołu testu cytotoksyczności komórek Vero. JAW jest finansowany przez Ruth L. Kirschstein National Research Service Award Research Training grant T32OD011130 przez NIH. CMT jest finansowany z grantu na rozwój kariery w dziedzinie metabolomiki K01GM109236 przez NIGMS NIH.

<ol><li>Antibiotic Resistance Threats in the United States. , U.S.D.o.H.a.H. Services. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.cdc.gov/drugresistance/pdf/ar-threats-2013-508.pdf">http://www.cdc.gov/drugresistance/pdf/ar-threats-2013-508.pdf</a> (2013).</li>
<li>Lessa, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+Clostridium+difficile+Infection+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Burden of Clostridium difficile Infection in the United States.</a> New England Journal of Medicine. 372, 825-834 (2015).</li>
<li>Gerding, D. N., Lessa, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epidemiology+of+Clostridium+difficile+infection+inside+and+outside+health+care+institutions%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Dis+Clin+North+Am%22%5BJournal%5D)">The epidemiology of Clostridium difficile infection inside and outside health care institutions.</a> Infect Dis Clin North Am. 29, 37-50 (2015).</li>
<li>Dubberke, E. R., Olsen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+Clostridium+difficile+on+the+healthcare+system%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Burden of Clostridium difficile on the healthcare system.</a> Clin Infect Dis. 55, Suppl 2 88-92 (2012).</li>
<li>Kociolek, L. K., Gerding, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breakthroughs+in+the+treatment+and+prevention+of+Clostridium+difficile+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Breakthroughs in the treatment and prevention of Clostridium difficile infection.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. , (2016).</li>
<li>Kelly, C. P., LaMont, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile--more+difficult+than+ever%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile--more difficult than ever.</a> N Engl J Med. 359, 1932-1940 (2008).</li>
<li>Louie, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fidaxomicin+versus+vancomycin+for+Clostridium+difficile+infection%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Fidaxomicin versus vancomycin for Clostridium difficile infection.</a> N Engl J Med. 364, 422-431 (2011).</li>
<li>Bartlett, J. G., Onderdonk, A. B., Cisneros, R. L., Kasper, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clindamycin-associated+colitis+due+to+a+toxin-producing+species+of+Clostridium+in+hamsters%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+infectious+diseases%22%5BJournal%5D)">Clindamycin-associated colitis due to a toxin-producing species of Clostridium in hamsters.</a> The Journal of infectious diseases. 136, 701-705 (1977).</li>
<li>Kelly, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+reproducibility+of+the+NAP1%2FB1%2F027+epidemic+strain+R20291+in+the+hamster+model+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Anaerobe%22%5BJournal%5D)">Improving the reproducibility of the NAP1/B1/027 epidemic strain R20291 in the hamster model of infection.</a> Anaerobe. , (2016).</li>
<li>Kuehne, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+toxin+A%2C+toxin+B%2C+and+CDT+in+virulence+of+an+epidemic+Clostridium+difficile+strain%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+infectious+diseases%22%5BJournal%5D)">Importance of toxin A, toxin B, and CDT in virulence of an epidemic Clostridium difficile strain.</a> The Journal of infectious diseases. 209, 83-86 (2014).</li>
<li>Bartlett, J. G., Onderdonk, A. B., Cisneros, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clindamycin-associated+colitis+in+hamsters%3A+protection+with+vancomycin%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Clindamycin-associated colitis in hamsters: protection with vancomycin.</a> Gastroenterology. 73, 772-776 (1977).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+of+Clostridium+difficile-associated+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">A mouse model of Clostridium difficile-associated disease.</a> Gastroenterology. 135, 1984-1992 (2008).</li>
<li>Lawley, T. D., Young, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+models+to+study+Clostridium+difficile+infection+and+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Anaerobe%22%5BJournal%5D)">Murine models to study Clostridium difficile infection and transmission.</a> Anaerobe. 24, 94-97 (2013).</li>
<li>Best, E. L., Freeman, J., Wilcox, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+for+the+study+of+Clostridium+difficile+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">Models for the study of Clostridium difficile infection.</a> Gut Microbes. 3, 145-167 (2012).</li>
<li>Reeves, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interplay+between+microbiome+dynamics+and+pathogen+dynamics+in+a+murine+model+of+Clostridium+difficile+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">The interplay between microbiome dynamics and pathogen dynamics in a murine model of Clostridium difficile Infection.</a> Gut Microbes. 2, 145-158 (2014).</li>
<li>Owens, R. C., Donskey, C. J., Gaynes, R. P., Loo, V. G., Muto, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial-associated+risk+factors+for+Clostridium+difficile+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial-associated risk factors for Clostridium difficile infection.</a> Clin Infect Dis. 46, Suppl 1 19-31 (2008).</li>
<li>Theriot, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cefoperazone-treated+mice+as+an+experimental+platform+to+assess+differential+virulence+of+Clostridium+difficile+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">Cefoperazone-treated mice as an experimental platform to assess differential virulence of Clostridium difficile strains.</a> Gut Microbes. 2, 326-334 (2011).</li>
<li>Martin, J. S., Monaghan, T. M., Wilcox, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile+infection%3A+epidemiology%2C+diagnosis+and+understanding+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile infection: epidemiology, diagnosis and understanding transmission.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. , (2016).</li>
<li>Connor, J. R., Johnson, S., Gerding, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile+infection+caused+by+the+epidemic+BI%2FNAP1%2F027+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile infection caused by the epidemic BI/NAP1/027 strain.</a> Gastroenterology. 136, 1913-1924 (2009).</li>
<li>He, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+and+global+spread+of+epidemic+healthcare-associated+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Emergence and global spread of epidemic healthcare-associated Clostridium difficile.</a> Nat Genet. 45, 109-113 (2013).</li>
<li>Perez, J., Springthorpe, V. S., Sattar, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clospore%3A+a+liquid+medium+for+producing+high+titers+of+semi-purified+spores+of+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+AOAC+International%22%5BJournal%5D)">Clospore: a liquid medium for producing high titers of semi-purified spores of Clostridium difficile.</a> Journal of AOAC International. 94, 618-626 (2011).</li>
<li>Sorg, J. A., Dineen, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+maintenance+of+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Laboratory maintenance of Clostridium difficile.</a> Curr Protoc Microbiol. , Chapter 9, Unit9A.1 (2009).</li>
<li>Edwards, A. N., Suarez, J. M., McBride, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+and+maintaining+Clostridium+difficile+in+an+anaerobic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Culturing and maintaining Clostridium difficile in an anaerobic environment.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e50787(2013).</li>
<li>George, W. L., Sutter, V. L., Citron, D., Finegold, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+and+differential+medium+for+isolation+of+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Selective and differential medium for isolation of Clostridium difficile.</a> J Clin Microbiol. 9, 214-219 (1979).</li>
<li>Knoblaugh, S., Randolph-Habecker, J., Rath, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKnoblaugh%2C+S+%22Comparative+Anatomy+and+Histology%22">Comparative Anatomy and Histology</a>. Dintzis, S. M. , Academic Press. 15-40 (2012).</li>
<li>Ammerman, N. C., Beier-Sexton, M., Azad, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+maintenance+of+Vero+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Growth and maintenance of Vero cell lines.</a> Curr Protoc Microbiol. , Appendix 4, Appendix 4E (2008).</li>
<li>Clostridium difficile Toxin/Antitoxin Kit Cat No.T5000. , TECHLAB. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.techlab.com/wp-content/uploads/2013/06/t5000isert_rev_0307.pdf">http://www.techlab.com/wp-content/uploads/2013/06/t5000isert_rev_0307.pdf</a> (2007).</li>
<li>Theriot, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic-induced+shifts+in+the+mouse+gut+microbiome+and+metabolome+increase+susceptibility+to+Clostridium+difficile+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Antibiotic-induced shifts in the mouse gut microbiome and metabolome increase susceptibility to Clostridium difficile infection.</a> Nat Commun. 5, 3114(2014).</li>
<li>Koenigsknecht, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+and+establishment+of+Clostridium+difficile+infection+in+the+murine+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Dynamics and establishment of Clostridium difficile infection in the murine gastrointestinal tract.</a> Infect Immun. 83, 934-941 (2015).</li>
<li>Theriot, C., Bowman, A., Young, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic-Induced+Alterations+of+the+Gut+Microbiota+Alter+Secondary+Bile+Acid+Production+and+Allow+for+Clostridium+difficile+Spore+Germination+and+Outgrowth+in+the+Large+Intestine%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Antibiotic-Induced Alterations of the Gut Microbiota Alter Secondary Bile Acid Production and Allow for Clostridium difficile Spore Germination and Outgrowth in the Large Intestine.</a> mSphere. 1, 00045(2016).</li>
<li>Xiao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+catalog+of+the+mouse+gut+metagenome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">A catalog of the mouse gut metagenome.</a> Nature biotechnology. 33, 1103-1108 (2015).</li>
<li>Leslie, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+and+toxin+production+by+Clostridium+difficile+within+human+intestinal+organoids+result+in+disruption+of+epithelial+paracellular+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Persistence and toxin production by Clostridium difficile within human intestinal organoids result in disruption of epithelial paracellular barrier function.</a> Infect Immun. 83, 138-145 (2015).</li>
<li>Stabler, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+genome+and+phenotypic+analysis+of+Clostridium+difficile+027+strains+provides+insight+into+the+evolution+of+a+hypervirulent+bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparative genome and phenotypic analysis of Clostridium difficile 027 strains provides insight into the evolution of a hypervirulent bacterium.</a> Genome Biol. 10, 102(2009).</li>
<li>Valiente, E., Dawson, L. F., Cairns, M. D., Stabler, R. A., Wren, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+new+PCR+ribotypes+from+the+hypervirulent+Clostridium+difficile+027+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Emergence of new PCR ribotypes from the hypervirulent Clostridium difficile 027 lineage.</a> J Med Microbiol. 61, 49-56 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają w tej chwili nic do ujawnienia.

Protokół ten charakteryzuje przebieg kliniczny, w tym utratę masy ciała, kolonizację bakteryjną, cytotoksyczność toksyn i zmiany histopatologiczne w przewodzie pokarmowym, myszy leczonych antybiotykiem poddanych działaniu zarodników C. difficile R20291. W protokole jest kilka krytycznych kroków, w których niezbędna jest dbałość o szczegóły. Dokładne obliczenie inokulum zarodników C. difficile ma kluczowe znaczenie. Obliczenia te opierają się na oryginalnym spisie zarodników C. difficile , które...

Clostridium difficile to beztlenowa, Gram-dodatnia, tworząca przetrwalniki pałeczka, która powoduje zagrażającą życiu biegunkę1. Zakażenie C. difficile (CDI) wiąże się ze zwiększoną zachorowalnością i śmiertelnością ludzi i powoduje ponad 4,8 miliarda dolarów kosztów opieki zdrowotnej rocznie1-4. W 2013 roku Centers for Disease Control and Prevention sklasyfikowało C. difficile jako pilne ryzyko oporności na antybiotyki, wskazując, że stanowi pilne zagrożenie dla zdrowia publicznego1. Obecnie antybiotykoterapia wankomycyną i metronidazolem jest uważana za standard leczenia CDI5. Niestety, nawroty CDI po skutecznym leczeniu antybiotykami są wysokie i występują u 20 - 30% pacjentów2,5-7. Dlatego konieczne jest odkrycie nowych metod leczenia przeciwko temu patogenowi jelitowemu. Aby ocenić skuteczność leczenia C. difficile, potrzebny jest model zwierzęcy zbliżony do choroby ludzkiej w klinicznie istotnym szczepie.
Początkowo, postulaty Kocha zostały ustalone dla C. difficile w 1977 roku przy użyciu modelu8 chomika syryjskiego leczonego klindamycyną. Model ten jest nadal wykorzystywany do badania wpływu toksyn C. difficile na patogenezę9,10. Jednak CDI w modelu chomika powoduje wysoką śmiertelność i nie przybliża przewlekłych podstępnych objawów choroby, które można zaobserwować u ludzi z CDI 10,11. Opierając się na dostępności i dostępności odczynników mysich platform w badaniach, istotny jest mysi model CDI.
W 2008 roku stworzono solidny mysi model CDI, lecząc myszy koktajlem antybiotyków w wodzie pitnej (kanamycyna, gentamycyna, kolistyna, metronidazol i wankomycyna) przez 3 dni, a następnie wstrzyknięto dootrzewnowo klindamycynę12. To sprawiło, że myszy były podatne na CDI i ciężkie zapalenie jelita grubego. W zależności od podanej dawki inokulum, przy użyciu tego modelu można zaobserwować szereg objawów klinicznych i śmiertelność. Od tego czasu badano różne schematy antybiotykowe, które zmieniają mikrobiotę jelitową myszy, zmniejszając oporność na kolonizację do punktu, w którym C. difficile może skolonizować przewód pokarmowy (przegląd w Best i wsp. oraz Lawley & Young)13,14.
Ostatnio cefalosporyna o szerokim spektrum działania, cefoperazon, podawana w wodzie pitnej przez 5 lub 10 dni, w sposób powtarzalny czyni myszy podatnymi na CDI15. Ponieważ podawanie cefalosporyn trzeciej generacji wiąże się ze zwiększonym ryzykiem CDI u ludzi, zastosowanie modelu cefoperazonu dokładniej odzwierciedla naturalnie występującą chorobę16. Myszy leczone cefoperazonem podatne na C. difficile zostały poddane prowokacji zarówno zarodnikami C. difficile, jak i komórkami wegetatywnymi różnych szczepów o różnym znaczeniu klinicznym i zjadliwości17. Pomimo niektórych oryginalnych badań wykorzystujących komórki wegetatywne C. difficile jako formę zakaźną, zarodniki C. difficile są uważane za główny sposób przenoszenia18.
W ostatniej dekadzie pojawił się C. difficile R20291, szczep NAP1/BI/027, powodując epidemie CDI19,20. Staraliśmy się określić kliniczny przebieg choroby, gdy myszy leczone cefoperazonem zostały poddane próbie klinicznie istotnego i genetycznie podatnego szczepu C. difficile, R20291. Protokół ten szczegółowo opisuje przebieg kliniczny, w tym utratę masy ciała, kolonizację bakteryjną, cytotoksyczność toksyn i zmiany histopatologiczne w przewodzie pokarmowym myszy poddanych zakażeniu zarodnikami C. difficile R20291. Ogólnie rzecz biorąc, ten mysi model okazuje się być cenną platformą eksperymentalną dla CDI przybliżającej chorobę człowieka. Ten scharakteryzowany model myszy może być zatem wykorzystany do oceny wpływu nowych terapii na złagodzenie choroby klinicznej i przywrócenie odporności kolonizacyjnej na C. difficile.

<table><tbody><tr><td>#62 Perisept Sporydicial Disinfectant Cleaner&nbsp;</td><td>SSS Navigator</td><td>48027</td><td>Ten produkt będzie wymagał rozcieńczenia zgodnie z zaleceniami producenta</td></tr><tr><td>0,22 &mu; m filtr</td><td>Fisherbrand</td><td>09-720-3</td><td>Alternatywa dla płyty filtracyjnej dla indywidualnych próbek testowanych w teście Vero Cell Assay</td></tr><tr><td>0,25% Trypsyna-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>Musi być podgrzewany w łaźni wodnej w temperaturze 37 &; C przed użyciem</td></tr><tr><td>0,4% Trypan Blue</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>1% Peniciilin/Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>10% inaktywowany termicznie FBS</td><td>Gibco</td><td>16140-071</td><td>Musi być podgrzewany w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni; C przed użyciem</td></tr><tr><td>1 ml plastikowa strzykawka&nbsp;</td><td>Zaopatrzenie medyczne BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>2 ml Zakrętka do mikrowirówek</td><td>Corning</td><td>430917</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płaska płytka dolna do hodowli komórkowych</td><td>Costar Corning</td><td>CL3595</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka filtracyjna</td><td>Millipore</td><td>MSGVS2210</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ThermoScientific</td><td>AB-0558</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Becton Dickinson</td><td>214010</td><td>Część płytek TCCFA (patrz poniżej)</td></tr><tr><td>Bacto Proteose Peptone</td><td>Becton Dickinson</td><td>211684</td><td>Część płytek TCCFA (patrz poniżej)</td></tr><tr><td>Cefoperazone</td><td>MP Bioworks</td><td>199695</td><td></td></tr><tr><td>Cefoxitine</td><td>Sigma</td><td>C47856</td><td>Część płytek TCCFA (patrz poniżej)</td></tr><tr><td>Clostridium difficile Zestaw antytoksyn</td><td>Tech Labs</td><td>T5000</td><td>Używany jako kontrola do testu komórek Vero</td></tr><tr><td>Clostridium difficile Lista toksyn A</td><td>Laboratoria biologiczne</td><td>152C</td><td>Kontrola pozytywna dla testu komórek Vero</td></tr><tr><td>D-cykloseryna</td><td>Sigma</td><td>C6880</td><td>Część płytek TCCFA (patrz poniżej)</td></tr> <tr><td>Woda destylowana</td><td>Gibco</td><td>15230</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 1x Media</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td>Musi być podgrzany w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni; C przed użyciem</td></tr><tr><td>Fruktoza</td><td>Fisher</td><td>L95500</td><td>Część płytek TCCFA (patrz poniżej)</td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>Bright-Line, Sigma</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher</td><td>P285-500</td><td>Część płytek TCCFA (patrz poniżej)</td></tr><tr><td>MgSO4 (bezwodny)</td><td>Sigma</td><td>M2643</td><td>Część płytek TCCFA (patrz poniżej)</td></tr><tr><td>Millex-GS 0,22 &mu; m filtr</td><td>Millex-GS</td><td>SLGS033SS</td><td>Filtr do płyt TCCFA&nbsp;</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S-0876</td><td>Część płytek TCCFA (patrz poniżej)</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S640-3</td><td>Część płytek TCCFA (patrz poniżej)Jednorazowe</td></tr> <tr><td>ostrze skalpela numer 10</td><td>Miltex, Inc</td><td>4-410</td><td></td></tr><tr><td>Talerze PCR</td><td>Fisherbrand</td><td>14230244</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowa szalka Petriego</td><td>Kord-Valmark Marka</td><td>2900</td><td></td></tr><tr><td>Sterylny plastikowy rozsiewacz komórek w kształcie litery L</td><td>Fisherbrand</td><td>14-665-230</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka stepperowa</td><td>Dymax Corporation</td><td>T15469</td><td></td></tr><tr><td>Taurocholate</td><td>Sigma</td><td>T4009</td><td>Część płytek TCCFA (patrz poniżej)</td></tr><tr><td>Ultraczysta woda destylowana</td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J Myszy</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>664</td><td>Myszy powinny mieć od 5 do 8 tygodni</td></tr><tr><td>Mikroskop świetlny Olympus BX43F</td><td>Aparat fotograficzny Olympus Life Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DP27</td><td>Olympus Life Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cellOprogramowanie Sens Dimension&nbsp;</td><td>Olympus Nauki przyrodnicze</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mysi model szczepu clostridium difficile r20291 leczony cefoperazonem

Cefoperazone-treated Mouse Model of Clinically-relevant Clostridium difficile Strain R20291

Clostridium difficile jest beztlenowym, Gram-dodatnim, przetrwalnikowym patogenem jelitowym, który jest związany ze wzrostem zachorowalności i śmiertelności, a w konsekwencji stanowi pilne zagrożenie dla zdrowia publicznego. Częstość nawrotów zakażenia C. difficile (CDI) po skutecznym leczeniu antybiotykami jest wysoka i występuje u 20-30% pacjentów, co wymaga odkrycia nowych metod leczenia tego patogenu. Obecne modele zwierzęce CDI skutkują wysoką śmiertelnością, a zatem nie przybliżają przewlekłych, podstępnych objawów choroby obserwowanych u ludzi z CDI. Aby ocenić skuteczność terapii przeciwko C. difficile, potrzebny jest mysi model zbliżony do choroby człowieka z wykorzystaniem klinicznie istotnego szczepu. Protokół ten przedstawia mysi model CDI cefoperazonu przy użyciu klinicznie istotnego i genetycznie podatnego szczepu R20291. Techniki klinicznego monitorowania choroby, liczenie bakterii C. difficile, cytotoksyczność toksyny i zmiany histopatologiczne w CDI w modelu mysim są szczegółowo opisane w protokole. W porównaniu z innymi mysimi modelami CDI, model ten nie jest jednolicie śmiertelny przy podawanej dawce, co pozwala na obserwację przedłużonego klinicznego przebiegu infekcji zgodnego z chorobą człowieka. W związku z tym mysi model CDI cefoperazonu stanowi cenną platformę eksperymentalną do oceny wpływu nowych terapii na łagodzenie objawów klinicznych choroby i przywrócenie odporności na kolonizację C. difficile.

W badaniu reprezentatywnym 5-tygodniowe myszy C57BL/6 WT poddano wstępnemu leczeniu cefoperazonem podawanym w wodzie do picia (0.5 mg/ml) przez 5 dni, po czym zastosowano 2-dniowy okres wypłukiwania z użyciem zwykłej wody pitnej. W dniu 0 myszy zainfekowano dawką 105 przetrwalników C. difficile R20291 poprzez zgłębnik doustny (Rycina 1A). Przez 14 dni monitorowano utratę masy ciała oraz objawy kliniczne CDI (letarg, brak apetytu, biegunkę i zgarbioną p...

Ten protokół przedstawia mysi model zakażenia Clostridium difficile (CDI) cefoperazonu przy użyciu klinicznie istotnego i genetycznie podatnego szczepu, R20291. Nacisk na kliniczne monitorowanie choroby, liczenie bakterii C. difficile, cytotoksyczność toksyn i zmiany histopatologiczne w całym CDI w modelu mysim są szczegółowo opisane w protokole.

Mysi model szczepu Clostridium difficile R20291 leczony cefoperazonem

Clostridium difficile is an anaerobic, gram-positive, spore-forming enteric pathogen that is associated with increasing morbidity and mortality and ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest przedstawienie instrukcji krok po kroku dotyczącej wdrażania mysiego modelu zakażenia Clostridium difficile indukowanego cefoperazonem, ze szczególnym uwzględnieniem monitorowania przebiegu klinicznego choroby, enumeracji bakterii, cytotoksyczności toksyn oraz zmian histopatologicznych po zakażeniu. Ten szczegółowy protokół pomoże badaczom w dokładnej realizacji mysiego modelu zakażenia Clostridium difficile, co jest niezbędne do badania patogenezy tej bakterii oraz oceny nowych metod terapeutycznych. Główną zaletą zastosowania tego modelu mysiego jest fakt, że pięciodniowa ekspozycja na jeden antybiotyk czyni myszy podatnymi na kolonizację przez C.difficile oraz prowadzi do przedłużonego klinicznego przebiegu zakażenia, analogicznego do przebiegu choroby u ludzi.Na początek należy wziąć odpowiedni szczep wyjściowy C.difficile i poddać go wirowaniu w wortexie. W komorze z laminarnym przepływem powietrza rozcieńczyć szczep w wodzie sterylnej w probówce z nakrętką do stężenia 10⁵ zarodników na 25 µL. Mieszaninę należy oznaczyć jako inokulum zarodników i umieścić probówkę w kąpieli wodnej o temperaturze 65 °C na 20 minut.Następnie, w komorze z laminarnym przepływem powietrza, pipetuj 50 µL podgrzanego inokulum zarodników do sterylnej probówki do mikrocentryfugi i przenieś ją do komory beztlenowej do dalszego użytku. Pozostałe inokulum zarodników nabierz do strzykawki o objętości 1 mL wyposażonej w sterylną igłę do zgłębnikowania żołądka z zaokrągloną końcówką. W komorze z laminarnym przepływem powietrza weź mysz badawczą i unieruchom głowę, delikatnie chwytając zwierzę za luźną skórę karku i grzbietu.Używając palca wskazującego i upewniając się, że zwierzę nie wydaje dźwięków ani nie wykazuje oznak stresu, należy dodatkowo unieruchomić głowę zwierzęcia i wydłużyć przełyk. Mysz należy utrzymać w pozycji pionowej, a następnie delikatnie wprowadzić igłę do zgłębnika przez bok pyska. Igłę należy prowadzić wzdłuż podniebienia i powoli wprowadzać do przełyku.Gdy igła znajdzie się mniej więcej w połowie drogi do przełyku, wstrzyknij 25 µl inokulum zarodników, a następnie ostrożnie wycofaj igłę. Umieść zwierzę z powrotem w klatce i obserwuj je pod kątem wystąpienia kaszlu lub duszności, które mogą wskazywać na przypadkowe podanie do tchawicy. Następnie pobierz alikwot inokulum zarodników przechowywany wcześniej w komorze beztlenowej oraz pozostałe inokulum do zgłębnika i wykonaj od jednego do dziesięciu rozcieńczeń seryjnych w 180 µl 1x PBS.Przygotuj od czterech do pięciu takich rozcieńczeń. Stosując technikę aseptyczną, przenieś 100 µL każdego rozcieńczenia seryjnego na oddzielną płytkę TCCFA. Używając za każdym razem nowej sterylnej rozprowadzalnika w kształcie litery L, równomiernie rozprowadź inokulum z rozcieńczenia na każdej płytce.Inkubuj płytki w warunkach beztlenowych przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Na koniec policz kolonie C.difficile na każdej płytce z rozcieńczenia i oblicz jednostki tworzące kolonie, aby uzyskać dawkę zakaźną podaną myszom. Aby pobrać próbki kału od myszy do oceny, najpierw lekko, ale pewnie unieruchom mysz, chwytając ją za luźną skórę na karku i grzbiecie, upewniając się, że zwierzę nie odczuwa stresu.Używając małego palca, delikatnie unieś ogon zwierzęcia, odsłaniając odbyt. Przyłóż sterylną probówkę do mikrocentryfugi o znanej masie bezpośrednio pod odbyt zwierzęcia, dbając o to, aby probówka nie dotykała bezpośrednio myszy. Gdy zwierzę odda stolec, zbierz pellet fekalny do probówki.Przechowywać probówkę w temperaturze pokojowej do momentu zebrania wszystkich niezbędnych próbek. Zważyć probówki zawierające kał na wadze analitycznej i zapisać masę z dokładnością do czterech miejsc po przecinku. Obliczyć masę pelletu kałowego, odejmując masę probówki.Następnie oblicz rozcieńczenie zawartości w stosunku od 1 do 10 i resuspenduj ją w 1x PBS. Za pomocą końcówki pipety delikatnie rozbij masę kałową w roztworze. Inkubuj próbki w temperaturze pokojowej przez 30 minut, pozwalając zawartości osiąść.Utrzymując roztwory w warunkach beztlenowych, należy przygotować rozcieńczenia seryjne dla każdej próbki w 1x PBS. Przenieś 100 µl każdego rozcieńczenia seryjnego na płytki TCCFA. Używając sterylnego rozprowadzacza w kształcie litery L, równomiernie rozprowadź kulturę na płytkach.Inkubować płytki w warunkach beztlenowych w temperaturze 37 °C przez 24 godziny. Na koniec policzyć kolonie C.difficile i obliczyć liczbę jednostek tworzących kolonie na gram zawartości fekaliów. Ten rysunek przedstawia masę myszy w dniach następujących po zakażeniu C.difficile R20291.W dniu zerowym wagę wyjściową ustalono na poziomie 100. Średnią masę ciała myszy mierzono każdego kolejnego dnia przez 14 dni. Wyraźny spadek masy ciała zaobserwowano u myszy poddanych działaniu czynnika od drugiego do siódmego dnia po ekspozycji.Wydawało się, że myszy zdrowieją i odzyskują masę ciała po tym punkcie. Tutaj przedstawiono ładunek C.difficile w kale w dniach po zakażeniu. W 24 godzinach po zakażeniu wszystkie myszy były skolonizowane w ilości 10^7 CFUs na gram kału.Obciążenie to zmniejszyło się od siódmego dnia, choć C.difficile nadal pozostawało obecne. Badanie histopatologiczne myszy w czasie trwania infekcji wykazało najistotniejsze zmiany patologiczne w kątnicy. Całkowite oceny histologiczne kątnicy różniły się znacząco między dniem zerowym a drugim i czwartym dniem po zakażeniu.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tym modelem mysim mogą napotykać trudności przy obliczaniu i przygotowywaniu inokulum zarodników wykorzystywanego do zakażania myszy oraz przy obliczaniu ładunku bakteryjnego C.difficile w kale. Podczas stosowania tego protokołu należy pamiętać, że modyfikacje dawki lub szczepu zarodników C.difficile podawanych myszom mogą zmienić wynik tego modelu.

cefoperazone-treated-mouse-model-clinically-relevant-clostridium

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Źródło: Winston, J. A. i in. Model myszy leczonem cefoperazonu klinicznie istotnego szczepu Clostridium difficile R20291.  J. Vis. Exp. (2016)Ten film pokazuje procedurę szczepienia myszy wcześniej leczonymi antybiotykiem zarodnikami Clostridium difficile , aby ustanowić model infekcji myszy do badania patogenezy i odpowiedzi gospodarza.

Ustanowienie mysiego modelu infekcji Clostridium difficile

Źródło: Winston, J. A. i in. Model myszy leczonem cefoperazonu klinicznie istotnego szczepu Clostridium difficile R20291. J. Vis. Exp. (2016)Ten film demonstruje ilościową identyfikację Clostridium difficile w próbkach kału z modelu zakażonej myszy za pomocą technik selektywnej hodowli. Określa procedury pobierania próbek, przetwarzania beztlenowego, rozcieńczania seryjnego oraz wyliczania kolonii w celu oceny kolonizacji bakterii oraz interakcji gospodarz-patogen.

Ilościowa identyfikacja Clostridium difficile w próbkach kału z modelu zakażonego myszy

Zakażenie gryzoniami Citrobacter stanowi cenny model do badania infekcji bakteryjnych jelit, jak również odpowiedzi immunologicznych gospodarza i zapalenia jelita grubego u myszy. Protokół ten określa pomiar integralności bariery, obciążenia patogenem i uszkodzeń histologicznych, co pozwala na dokładne scharakteryzowanie udziału patogenu i gospodarza w zakaźnym zapaleniu jelita grubego u myszy.

Mysi model Citrobacter rodentium: badanie udziału patogenów i gospodarza w zakaźnym zapaleniu jelita grubego

Obrazowanie multimodalne jest cennym podejściem do badania kolonizacji bakteryjnej w małych modelach zwierzęcych. Protokół ten przedstawia zakażenie myszy bioluminescencyjnym Citrobacter rodentium i podłużne monitorowanie kolonizacji bakteryjnej za pomocą kompozytowej tomografii obrazowania 3D w świetle rozproszonym z obrazowaniem μCT w celu stworzenia filmu 4D infekcji C. rodentium.

Multimodalne obrazowanie 4D zakażeń Citrobacter rodentium u myszy

Zdolność do modelowania infekcji dróg moczowych (ZUM) jest kluczowa, aby móc zrozumieć patogenezę bakterii i zapoczątkować rozwój nowych terapii. Celem tej pracy jest zademonstrowanie mysich modeli eksperymentalnego ZUM i ZUM związanego z cewnikiem, które podsumowują i przewidują wyniki obserwowane u ludzi.

Ustalenie i charakterystyka UTI i CAUTI w modelu mysim

Skuteczność antybiotyku jest najczęściej określana poprzez przeprowadzanie badań kinetycznych zabijania i pomiar jednostek tworzących kolonie (CFU). Integrując skaningową mikroskopię elektronową (SEM) z tymi standardowymi metodami, możemy rozróżnić efekty farmakologiczne leczenia między różnymi antybiotykami.

Protokół charakteryzujący zmiany morfologiczne Clostridium difficile w odpowiedzi na leczenie antybiotykami

Przedstawiona tutaj jest bezpieczna i skuteczna metoda infekowania larw danio pręgowanego fluorescencyjnie znakowanym beztlenowym C. difficile za pomocą mikroiniekcji i nieinwazyjnego mikrozgłębnika.

Opracowanie modelu zakażenia larw danio pręgowanego w kierunku Clostridioides difficile

Pokazano mysi model przezcewkowej inokulacji uropatogennej E. coli (UPEC) w celu stworzenia utajonych wewnątrzkomórkowych zbiorników pęcherza moczowego, a następnie ekspozycji pęcherza moczowego na G. vaginalis w celu wywołania nawrotu UPEC UTI. Zademonstrowano również liczenie bakterii, cytologię moczu oraz utrwalanie i przetwarzanie pęcherza moczowego in situ w skaningowej mikroskopii elektronowej.

Nawracające zakażenie dróg moczowych Escherichia coli wywołane ekspozycją pęcherza moczowego Gardnerella vaginalis u myszy

W tym miejscu przedstawiamy protokół mający na celu ustanowienie indukowanego antybiotykiem, pseudo-wolnego od zarazków modelu zapalenia jelita grubego wywołanego siarczanem dekstranu sodu w celu zbadania roli mikrobioty jelitowej w regulacji pozytywnego wpływu Bacillus cereus na zapalenie jelita grubego.

Badanie łagodzącego wpływu podawania Bacillus cereus na zapalenie jelita grubego poprzez modulację mikrobioty jelitowej

Wcześniaki (poród &lt; 37. tygodniu) to pilny globalny problem zdrowotny z nieoptymalnymi opcjami profilaktyki i leczenia. Przedstawiamy myszy model wcześnianego porodu wywołanego infekcją bakteryjną pochwy oraz opisujemy, jak analizować wynikającą z tego chorobność i śmiertelność noworodków.

Modelowanie wznoszącej się infekcji pochwy, przedwczesnych porodów i noworodkowej zachorowalności u myszy

Protokół ten opisuje niezbędne kroki kolonizacji myszy z pks+ Escherichia coli w warunkach niezapalnych, a także nieinwazyjne metody walidacji kolonizacji i oceny ekspansji pks+ E. coli w kału.

Kolonizacja przez myszą pks+ Escherichia coli w warunkach niezapalnych

Poznaj model myszy zakażonych Clostridioides difficile szczepu R20291 leczonych cefoperazonem. Protokół obejmuje monitorowanie objawów klinicznych, liczenie bakterii, cytotoksyczność toksyn i zmiany histopatologiczne.

Mysi model szczepu Clostridium difficile R20291 leczony cefoperazonem

Przeglądaj więcej filmów