Mysi model szczepu Clostridium difficile R20291 leczony cefoperazonem

Ogólnym celem tego protokołu jest dostarczenie przewodnika krok po kroku dotyczącego wdrażania mysiego modelu zakażenia Clostridium difficile cefoperazonem, ze szczególnym naciskiem na kliniczne monitorowanie choroby, liczenie bakterii, cytotoksyczność toksyn i zmiany histopatologiczne po prowokacji. Ten szczegółowy protokół pomoże naukowcom w dokładnym wykonaniu mysiego modelu zakażenia Clostridium difficile, który jest niezbędny do badania patogenezy tej bakterii i uzyskania dostępu do nowych metod terapeutycznych. Główną zaletą stosowania tego modelu mysiego jest to, że ekspozycja na jeden antybiotyk przez pięć dni sprawia, że myszy są podatne na kolonizację C. difficile i na przedłużony kliniczny przebieg infekcji współistniejący z chorobą u ludzi.

Na początek weźmy interesujący nas szczep zapasowy C.difficile i wir. W okapie z przepływem laminarnym rozcieńczyć wywar w sterylnej wodzie w zakrętce do stężenia od dziesięciu do piątych zarodników na 25 mikrolitrów. Oznacz mieszaninę jako inokulum zarodników i umieść probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 65 stopni Celsjusza na 20 minut.

Następnie, w kapturze z przepływem laminarnym, odpipetować 50 mikrolitrów podgrzanego inokulum zarodnikowego do sterylnej probówki mikrowirówkowej i przekazać do komory beztlenowej do dalszego użycia. Załaduj pozostały inokulum zarodników do jednomililitrowej strzykawki przymocowanej do sterylnej igły żołądkowej zakończonej gruszbką. W kapturze z przepływem laminarnym weź badaną mysz i unieruchamij głowę, delikatnie przytrzymując zwierzę luźną skórą szyi i grzbietu.

Używając palca wskazującego i upewniając się, że zwierzę nie wokalizuje ani nie wykazuje oznak niepokoju, dodatkowo unieruchamij głowę zwierzęcia i wydłuż przełyk. Utrzymuj mysz w pionowej, pionowej pozycji i delikatnie wsuń igłębkę w bok ust. Skieruj igłębkę wzdłuż podniebienia i powoli wsuń ją do przełyku.

Gdy igła znajdzie się mniej więcej w połowie drogi do przełyku, wstrzyknij 25 mikrolitrów inokulum zarodników, a następnie delikatnie wyjmij igłę. Umieść zwierzę z powrotem w klatce i obserwuj, czy nie ma żadnych oznak kaszlu lub niewydolności oddechowej, które mogą wskazywać na niezamierzone podanie tchawicy. Następnie weź podwielokrotność inokulum zarodnikowego przechowywaną wcześniej w komorze beztlenowej i wszelkie pozostałe inokulum zarodników zgłębnika i wykonaj od jednego do dziesięciu seryjnych rozcieńczeń w 180 mikrolitrach 1x PBS.

Wykonaj cztery do pięciu takich rozcieńczeń. Stosując technikę aseptyczną, przenieść 100 mikrolitrów każdego seryjnego rozcieńczenia na indywidualną płytkę TCCFA. Biorąc za każdym razem nowy sterylny rozsiewacz w kształcie litery L, równomiernie rozprowadź inokulant rozcieńczający na każdej płytce.

Inkubować płytki w warunkach beztlenowych przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Na koniec policz kolonie C.difficile na każdej płytce rozcieńczającej i oblicz jednostki tworzące kolonie, aby uzyskać dawkę infekcyjną podaną myszom. Aby pobrać próbki kału od myszy do oceny, najpierw delikatnie, ale stanowczo przytrzymaj badaną mysz za luźną skórę na szyi i plecach, upewniając się, że zwierzę nie jest w niebezpieczeństwie.

Małym palcem delikatnie unieś ogon zwierzęcia, odsłaniając odbyt. Trzymaj sterylną probówkę do mikrowirówki o znanej wadze bezpośrednio pod odbytem zwierzęcia, upewniając się, że probówka nie dotyka bezpośrednio myszy. Kiedy zwierzę się wypróżni, zbierz granulki kału do probówki.

Przechowywać probówkę w temperaturze pokojowej do czasu pobrania wszystkich niezbędnych próbek. Zważyć probówki zawierające kał na wadze analitycznej i zanotować masę z dokładnością do czterech miejsc po przecinku. Oblicz wagę osadu kału, odejmując wagę rurki.

Następnie obliczyć rozcieńczenie zawartości od 1 do 10 i ponownie zawiesić do 1x PBS. Użyj końcówki pipety, aby delikatnie rozbić kał na roztwór. Próbki należy inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut, pozwalając zawartości osiąść.

Utrzymując roztwory w stanie beztlenowym, należy wykonać seryjne rozcieńczenia dla każdej próbki w 1x PBS. Przenieść 100 mikrolitrów każdego seryjnego rozcieńczenia na płytki TCCFA. Użyj sterylnego rozsiewacza w kształcie litery L i równomiernie nałóż podłoże na płytki.

Inkubować płytki w warunkach beztlenowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Na koniec wylicz kolonie C.difficile i oblicz jednostkę tworzącą kolonię na gram zawartości kału. Ten rysunek pokazuje masę myszy w dniach następujących po prowokacji C.difficile R20291.

W dniu zerowym masa bazowa jest ustawiona na 100. Średnia masa ciała myszy była mierzona każdego następnego dnia przez 14 dni. Znaczny spadek masy ciała zaobserwowano u myszy prowokowanych w dniach od drugiego do siódmego po prowokacji.

Myszy wydawały się odzyskiwać i odzyskiwać wagę po tym momencie. Tutaj pokazane jest obciążenie C.difficile w kale w dniach po wyzwaniu. Po 24 godzinach od prowokacji wszystkie myszy zostały skolonizowane od 10 do siódmych CFU na gram kału.

Ładunek ten zmniejszył się od siódmego dnia, chociaż C.difficile jest nadal obecny. Badanie histopatologiczne myszy w czasie trwania infekcji wykazało najistotniejsze zmiany patologiczne w jelicie ślepym. Całkowite wyniki histologiczne jelita ślepego różniły się istotnie między dniem zero a drugim i czwartym dniem po prowokacji.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tym modelu myszy mogą mieć trudności z obliczeniami i przygotowaniem inokulum zarodników używanego do rzucania wyzwania myszom oraz obliczaniem obciążenia bakteriami C.difficile w kale. Próbując tego protokołu, należy pamiętać, że modyfikacje dawki lub szczepu zarodników C.difficile podawanych myszom mogą zmienić wynik tego modelu.