Zoptymalizowany protokół do oznaczania przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej przy użyciu oligonukleotydów znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym w podczerwieni

Ogólnym celem tego testu jest wykrywanie oddziaływań białko-DNA przy użyciu sond nieradioaktywnych. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii molekularnej i biochemii, takie jak określenie sekwencji docelowej DNA dla danych białek. Główną zaletą tej techniki jest to, że stanowi ona łatwą, bezpieczną i oszczędzającą czas alternatywę dla stosowania sond radioaktywnych.

Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować pięcioprocentowy natywny żel poliakrylamidowy zawierający 0,5x tris-boran EDTA lub TBE oraz 2,5% glicerolu, korzystając z systemu do miniżeli białkowych. Aby przygotować 30 mililitrów roztworu żelu dla czterech żeli, należy zmieszać wodę destylowaną, TBE, persiarczan amonu, TEMED, akrylamid-bis oraz glicerol. Roztwór żelu należy przelać niezwłocznie.

Po polimeryzacji owiń żele przezroczystą folią spożywczą uprzednio zwilżoną 0,5x TBE i przechowuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie zaprojektuj długi oligonukleotyd o długości około 51 merów. Zaprojektuj komplementarne krótkie oligonukleotydy o długości około 14 merów z modyfikacją barwnikiem fluorescencyjnym w podczerwieni na końcu pięć prim.

Po przygotowaniu oligonukleotydów należy zawiesić je ponownie w buforze 1x Tris-EDTA do stężenia końcowego 100 µM. W celu przeprowadzenia hybrydyzacji należy wymieszać w probówce o pojemności 1,5 ml 0,6 µl krótkiego oligonukleotydu z barwnikiem 5', 1,2 µl długiego oligonukleotydu oraz 28,2 µl buforu Tris-EDTA z NaCl. Probówkę należy umieścić we wrzącej wodzie na pięć minut, a następnie wyłączyć źródło ciepła i pozostawić wodę z zahybrydyzowanymi oligonukleotydami do schłodzenia przez noc w ciemności.

Aby przygotować dwuniciowe sondy DNA, wymieszaj 30 µL wyżarzowanych oligonukleotydów z dNTP, buforem Klenowa, znacznikiem barwnikowym Klenow 5' oraz wodą dwukrotnie destylowaną w probówce do PCR o pojemności 0,2 mL. Inkubuj mieszaninę przez 60 minut w temperaturze 37 °C w termocyklerze. Następnie dodaj 3,4 µL 0,5 M EDTA, aby zatrzymać reakcję, i przeprowadź inaktywację termiczną w temperaturze 75 °C przez 20 minut w termocyklerze.

Następnie rozcieńcz przygotowane sondy buforem Tris-EDTA z chlorkiem sodu do stężenia końcowego 0,1 µM. Przechowuj oligonukleotydy w temperaturze -20 °C w ciemności do momentu użycia. Aby przygotować sondy nieznakowane, wymieszaj 20 µL długiego oligonukleotydu, 20 µL długiego oligonukleotydu R oraz 60 µL buforu Tris-EDTA z chlorkiem sodu w probówce o pojemności 1,5 ml.

Umieść probówkę w wrzącej wodzie na pięć minut, następnie wyłącz źródło ciepła i pozostaw wodę z wyżarzonymi oligosami do ostygnięcia przez noc. Przygotuj jeden mililitr 5x buforu wiążącego, mieszając Tris HCl, NaCl, KCl, MgCl₂, EDTA, DTT, BSA oraz wodę dwukrotnie destylowaną. Przed przygotowaniem reakcji wiązania, przeprowadź wstępną elektroforezę natywnego żelu poliakryloamidowego 5% w 0,5x TBE i 2,5% glicerolu, aby usunąć wszelkie ślady persiarczanu amonu, przy napięciu 80 V przez 30 minut do jednej godziny lub do momentu, gdy natężenie prądu przestanie zmieniać się w czasie.

Następnie wymieszać 4 µL 5x buforu wiążącego, od 80 do 200 ng oczyszczonego białka A, 1 µL 0,1 µM sondy sprzężonej z barwnikiem oraz wodę dwukrotnie destylowaną. Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej w ciemności przez 15 minut. Po inkubacji nanieść całą mieszaninę z reakcji wiązania na żel i prowadzić elektroforezę przy napięciu 10 V/cm do pożądanej odległości.

Przykryć aparat do elektroforezy folią aluminiową, aby w miarę możliwości utrzymać żel w ciemności. Oczyścić blat skanera systemu obrazowania w podczerwieni wodą destylowaną. Wytrzeć do sucha szklane płytki z żelem i umieścić je na blacie skanera.

Otwórz oprogramowanie do obrazowania w podczerwieni i kliknij kartę Acquire. W przypadku grubszych płytek zastosuj następujące ustawienia: 700 dla kanału, auto dla intensywności, 84 micrometers dla rozdzielczości, medium dla jakości oraz 3.5 millimeters dla offsetu ostrości. Zaznacz obszar zajmowany przez żel w skanerze.

Na koniec kliknij Start, aby rozpocząć skanowanie. Postęp elektroforezy można wizualizować za pomocą barwnika do nakładania Orange G, podczas gdy błękit bromofenolowy jest wykrywany podczas skanowania i w związku z tym zakłóca analizę obrazu. Dodanie dI-dC do reakcji wiązania zniosło wiązanie oczyszczonego 6xHis-SOX-2 z sondami DNA znakowanymi barwnikiem na końcu 5'.

Mutant LIM-4 oraz zimna sonda SOX-2 z mutacją w miejscu wiązania LIM-4 wykazują taką samą wydajność w konkurowaniu o wiązanie z 6xHis-SOX-2, jak dzika sonda zimna znakowana podczerwienią fluorescencyjną. Jednak wydajność konkurowania zimnej sondy mutant LIM-4 i SOX-2 z mutacją w miejscu wiązania SOX-2 o wiązanie z 6xHis-SOX-2 jest znacznie niższa niż w przypadku zimnej sondy typu dzikiego. Analizy supershift kompleksu SOX-2-DNA z wykorzystaniem epitopów 6xHis i flag doprowadziły do powstania przesuniętego pasma (supershift) SOX-2-DNA.

Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura ta zajmuje od dwóch do czterech godzin. Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać o przechowywaniu sond podczerwonych w ciemności. Po zakończeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak edycja genomu CRISPR cas9, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące znaczenia konkretnej sekwencji wiążącej DNA.

Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom z zakresu biochemii do eksploracji oddziaływań białko-DNA w różnych organizmach modelowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak określać oddziaływania białko-DNA przy użyciu nieradioaktywnych znaczników DNA. Pamiętaj, że praca z akrylamidem może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak stosowanie środków ochrony osobistej.