Name: Zoptymalizowany protokół do oznaczania przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej przy użyciu oligonukleotydów znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym w podczerwieni (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Poznaj zoptymalizowany protokół fEMSA do badania interakcji białko-DNA z użyciem fluorescencyjnych sond podczerwieniowych. Ta bezpieczna metoda zastępuje radioaktywne znaczniki w badaniach biologii molekularnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez stypendium badawcze Alfreda P. Sloana (do C.-F.C.) oraz grant NIH R01 (5R01GM098026-05 do C.-F.C.). Dziękujemy Davidowi Crowe'owi za dostęp do zaawansowanego systemu obrazowania w podczerwieni.

UWAGA: EMSA wykorzystujące znakowane fluorescencyjnie sondy DNA lub inne formy znakowanego DNA mają te same protokoły przygotowania ekstraktu białkowego lub komórkowego, reakcji wiązania białko-DNA oraz przygotowania i uruchomienia żelu PAGE (Figura 1A). Kluczowymi różnicami są procedury znakowania DNA, etapy przetwarzania żelu po serii i metody wykrywania.
1. Przygotowanie żelu
<ol>
	<li>Przygotuj 5% natywnego żelu poliakrylamidowego zawierającego 0,5 x TBE (45 mM Tris-Boran, 1 mM EDTA) i 2,5% glicerolu, używając systemu mini żelu białkowego (8,3 cm szerokości x 7,3 cm długości x 0,75 mm grubości).
	<ol>
		<li>Aby przygotować 30 ml roztworu żelu na 4 żele, dokładnie wymieszaj 5 ml 30% akrylamidu/Bis (37,5:1), 3 ml 5x TBE (0,45 M tris-boranu, 10 mM EDTA), 1,5 ml 50% glicerolu, 300 μl 10% nadsiarczanu amonu, 15 μl TEMED i 20,2 ml ddH2O. 
		UWAGA: Akrylamid jest szkodliwy i toksyczny, należy obchodzić się z nim odpowiednimi środkami ochrony osobistej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Natychmiast odleć roztwór żelu. Po polimeryzacji owinąć żele w przezroczystą folię spożywczą wstępnie zwilżoną 0,5x TBE i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
2. Przygotowanie sond fluorescencyjnych znakowanych barwnikiem w podczerwieni
UWAGA: Oligonukleotydy znakowane barwnikiem fluorescencyjnym w podczerwieni należy trzymać jak najdalej od światła podczas przygotowywania, przechowywania i eksperymentów.
<ol>
	<li>Projektowanie i porządkowanie oligonukleotydów.
	<ol>
		<li>Zaprojektuj długi oligonukleotyd dla ~51-mers. 
		UWAGA: Długa sekwencja oligonukleotydowa sondy LIM-4/SOX-2 to TATCATATCTATTCTATGATTAAATACCTATTCATTTCAAAATCTTCCC. Długie oligonukleotydy nie wymagają oczyszczania metodą PAGE ani HPLC.</li>
		<li>Zaprojektuj komplementarne krótkie oligonukleotydy dla ~14-merów z modyfikacją barwnika fluorescencyjnego w podczerwieni na końcu 5' (5'Dye) i temperaturą topnienia powyżej 37 °C. 
		UWAGA: Krótka sekwencja oligonukleotydowa sondy LIM-4/SOX-2 to 5'Dye-GGGAGAAGATTTTG. Minimalna skala syntezy krótkich oligonukleotydów znakowanych barwnikiem 5' wynosi 100 nM. Dlatego oligonukleotydy wymagają oczyszczenia metodą HPLC.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zawiesić oligonukleotydy w 1x buforze Tris-EDTA (TE: 10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA) do końcowego stężenia 100 μM.</li>
	<li>Wyżarzane krótkie (5'Dye) i długie oligonukleotydy.
	<ol>
		<li>Wymieszać 0,6 μl 5'Dye-Short oligo (100 μM), 1,2 μL Long oligo (100 μM) i 28,2 μl buforu chlorku sodu-Tris-EDTA (STE: 100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA) w probówce o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Umieść probówkę we wrzącej wodzie na 5 minut. Wyłącz źródło ciepła i pozwól, aby woda z wyżarzonymi oligonukleotydami ostygła w ciemności.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wypełnij 5' zwisy wyżarzonych 5'Dye-Short/Long oligokleotydazy polimerazą DNA Klenowa, aby uzyskać dwuniciowe sondy DNA.
	<ol>
		<li>Przygotować reakcję, mieszając 30 μl wyżarzonych krótkich/długich oligonukleotydów ze znacznikiem 5'Dye, 8,5 μl 10x buforu Klenowa, 1,7 μl 10 mM dNTP, 1,7 μl Klenowa (3'->5' egzo-) (5 u/μL) i 43,1 μl ddH2O w probówce PCR o pojemności 0,2 ml.</li>
		<li>Inkubować przez 60 minut w temperaturze 37 °C w maszynie do PCR.</li>
		<li>Dodać 3,4 μl 0,5 M EDTA, aby zatrzymać reakcję i inaktywować ciepło w temperaturze 75 °C przez 20 minut w maszynie do PCR.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozcieńczyć wypełnione sondy (0,7 μM) w STE do końcowego stężenia 0,1 μM.</li>
	<li>Oligonukleotydy przechowywać w temperaturze -20 °C w ciemności do czasu użycia. Oligonukleotydy mogą być przechowywane w takim stanie przez okres do roku. 
	UWAGA: Aby wygenerować sondy DNA ze zmutowanymi miejscami wiązania, zmutowane wersje długich oligonukleotydów są wyżarzane krótkimi oligonukleotydami znakowanymi barwnikiem 5', a następnie wypełniane są zwisami 5' za pomocą Klenowa. Wykazano, że sonda z jedną nicią znakowaną barwnikiem fluorescencyjnym w podczerwieni ma tylko 30% intensywności sondy przy obu pasmach znakowanych barwnikiem. Jeśli intensywność sygnału musi zostać wzmocniona, długie oligonukleotydy obu pasm są znakowane barwnikami fluorescencyjnymi w podczerwieni na końcach 5' i wyżarzane w celu uzyskania sond znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym w podczerwieni.</li>
</ol>
3. Przygotowanie nieoznakowanych/zimnych sond (konkurenci)
Uwaga: Długie oligonukleotydy sekwencji komplementarnych (Long i LongR) wyżarzano w celu uzyskania nieznakowanych sond do analizy konkurencji za pomocą sond znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym w podczerwieni.
<ol>
	<li>Wymieszaj 20 μl oligonukleotydów o długości 100 μM, 20 μl oligonukleotydów 100 μM LongR i 60 μl STE w probówce o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Umieść probówkę we wrzącej wodzie na 5 minut, wyłącz źródło ciepła i pozwól wodzie z wyżarzonymi oligonukleotydami ostygnąć przez noc.</li>
</ol>
4. Reakcja wiązania i elektroforeza
<ol>
	<li>Przygotować 1 ml 5x buforu wiążącego, mieszając 50 μl 1 M Tris-HCl, pH 7,5; 10 μl 5 M NaCl; 200 μL z 1 M KCl, 5 μL z 1 M MgCl2, 10 μL z 0,5 M EDTA, pH 8,0; 5 μl 1 M naziemnej telewizji cyfrowej; 25 μl 10 mg/ml BSA i 695 μl ddH2O. 
	UWAGA: 5x bufor wiążący może być porcjowany i przechowywany w temperaturze -20 °C. Inną kwestią do rozważenia jest to, że różne czynniki transkrypcyjne będą miały różne modyfikacje bufora wiążącego.</li>
	<li>Tuż przed rozpoczęciem reakcji wiązania należy wstępnie uruchomić 5% natywny żel poliakryloamidowy w 0,5x TBE + 2,5% glicerolu, aby usunąć wszelkie ślady nadsiarczanu amonu przy napięciu 80 V przez 30 - 60 minut lub do momentu, gdy prąd przestanie się zmieniać w czasie.</li>
	<li>Ustawić reakcję wiązania w końcowej objętości 20 μl.
	<ol>
		<li>Wymieszaj 4 μl 5x buforu wiążącego, 80 - 200 ng oczyszczonego białka A (w 50% glicerolu, tj. SOX-2), 1 μL 0,1 μM sondy sprzężonej z barwnikiem (końcowe stężenie: 5 nM) i ddH2O.</li>
		<li>Opcjonalnie: Gdy wymagana jest zimna sonda, dodaj różne stężenia (2x, 10x, 25x, 50x, 100x itd.) zimnych sond.</li>
		<li>Opcjonalnie: Podczas badania interakcji między białkami A i B (tj. SOX-2 i LIM-4) dodać 80 - 200 ng oczyszczonego białka B (w 50% glicerolu, tj. LIM-4).</li>
		<li>Opcjonalnie: Gdy stosuje się preparat ekstraktu jądrowego i ma zostać zweryfikowane specyficzne wiązanie białka A, dodać przeciwciało specyficzne dla białka A (tj. anty-6xHis, anty-FLAG itp.).</li>
		<li>Inkubować w R/T w ciemności przez 15 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Załaduj całą reakcję wiązania na żel i uruchom żel pod napięciem 10 V/cm na żądaną odległość.</li>
</ol>
5. Obrazowanie
UWAGA: Żel został zeskanowany bezpośrednio w szklanych płytkach za pomocą zaawansowanego systemu obrazowania w podczerwieni. W związku z tym żel może być dalej rozpuszczany i wielokrotnie skanowany (ryc. 1C i 2). System obrazowania fluorescencyjnego w bliskiej podczerwieni, głównie dla Western blot, został również przetestowany w celu zeskanowania żelu, ale tylko zaawansowany system obrazowania w podczerwieni był w stanie zeskanować żel z dobrą rozdzielczością. Opisana metodologia jest specyficzna dla konkretnego oprogramowania do obrazowania w podczerwieni, chociaż mogą być używane inne pakiety oprogramowania.
<ol>
	<li>Wyczyść łóżko skanera za pomocą ddH2O i dobrze wysusz przed skanowaniem. Wytrzyj do sucha szklane płytki żelu i umieść płytki zawierające żel na łóżku skanera.</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie do obrazowania w podczerwieni i przejdź do zakładki "Pobierz". Po umieszczeniu cieńszej płytki (1 mm) na stole skanera użyj ustawień Kanał: 700, Intensywność: Auto, Rozdzielczość: 169 μm, Jakość: średnia i Przesunięcie ostrości: 1,5 mm. Po umieszczeniu grubszej płytki (3 mm) na stole skanera należy użyć ustawień Kanał: 700, Intensywność: Auto, Rozdzielczość: 84 μm, Jakość: średnia i Przesunięcie ostrości: 3,5 mm. Przesunięcie ostrości zależy od grubości płyty szklanej.</li>
	<li>Wybierz obszar, który żel zajmuje na skanerze. Kliknij "Start", aby rozpocząć skanowanie.</li>
	<li>Powtórz elektroforezę i w razie potrzeby skanuj dodatkowo.</li>
</ol>

<ol><li>Hellman, L. M., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+mobility+shift+assay+%28EMSA%29+for+detecting+protein-nucleic+acid+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions.</a> Nat Protoc. 2, 1849-1861 (2007).</li>
<li>Ludwig, L. B., Hughes, B. J., Schwartz, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotinylated+probes+in+the+electrophoretic+mobility+shift+assay+to+examine+specific+dsDNA%2C+ssDNA+or+RNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Biotinylated probes in the electrophoretic mobility shift assay to examine specific dsDNA, ssDNA or RNA-protein interactions.</a> Nucleic Acids Res. 23, 3792-3793 (1995).</li>
<li>Engler-Blum, G., Meier, M., Frank, J., Muller, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+background+problems+in+nonradioactive+northern+and+Southern+blot+analyses+enables+higher+sensitivity+than+32P-based+hybridizations%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Reduction of background problems in nonradioactive northern and Southern blot analyses enables higher sensitivity than 32P-based hybridizations.</a> Anal Biochem. 210, 235-244 (1993).</li>
<li>Jing, D., Agnew, J., Patton, W. F., Hendrickson, J., Beechem, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+two-color+electrophoretic+mobility+shift+assay+for+detecting+both+nucleic+acids+and+protein+in+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">A sensitive two-color electrophoretic mobility shift assay for detecting both nucleic acids and protein in gels.</a> Proteomics. 3, 1172-1180 (2003).</li>
<li>Alqadah, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postmitotic+diversification+of+olfactory+neuron+types+is+mediated+by+differential+activities+of+the+HMG-box+transcription+factor+SOX-2%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Postmitotic diversification of olfactory neuron types is mediated by differential activities of the HMG-box transcription factor SOX-2.</a> EMBO J. 34, 2574-2589 (2015).</li>
<li>Jullien, N., Herman, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LUEGO%3A+a+cost+and+time+saving+gel+shift+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">LUEGO: a cost and time saving gel shift procedure.</a> Biotechniques. 51, 267-269 (2011).</li>
<li>Poulin-Laprade, D., Burrus, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+Mobility+Shift+Assay+Using+Radiolabeled+DNA+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Radiolabeled DNA Probes.</a> Methods Mol Biol. 1334, 1-15 (2015).</li>
<li>Ruscher, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence+based+non-radioactive+electrophoretic+mobility+shift+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A fluorescence based non-radioactive electrophoretic mobility shift assay.</a> J Biotechnol. 78, 163-170 (2000).</li>
<li>Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+approaches+to+monitor+protein-nucleic+acid+interactions+using+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes.</a> RNA. 17, 14-20 (2011).</li>
<li>Alqadah, A., Hsieh, Y. W., Chuang, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2+goes+beyond+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle%22%5BJournal%5D)">Sox2 goes beyond stem cell biology.</a> Cell cycle. , (2016).</li>
<li>Larouche, K., Bergeron, M. J., Leclerc, S., Guerin, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+competitor+poly%28dI-dC%29.poly%28dI-dC%29+levels+is+advised+in+DNA-protein+interaction+studies+involving+enriched+nuclear+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Optimization of competitor poly(dI-dC).poly(dI-dC) levels is advised in DNA-protein interaction studies involving enriched nuclear proteins.</a> Biotechniques. 20, 439-444 (1996).</li>
<li>Sorenson, A. E., Schaeffer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-gel+detection+of+biotin-protein+conjugates+with+a+green+fluorescent+streptavidin+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Methods%22%5BJournal%5D)">In-gel detection of biotin-protein conjugates with a green fluorescent streptavidin probe.</a> Anal. Methods. 7, 2087-2092 (2015).</li>
<li>Onizuka, T., Endo, S., Hirano, M., Kanai, S., Akiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+a+fluorescent+electrophoretic+mobility+shift+assay+improved+for+the+quantitative+and+multiple+analysis+of+protein-DNA+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci+Biotechnol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Design of a fluorescent electrophoretic mobility shift assay improved for the quantitative and multiple analysis of protein-DNA complexes.</a> Biosci Biotechnol Biochem. 66, 2732-2734 (2002).</li>
<li>Steiner, S., Pfannschmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-based+electrophoretic+mobility+shift+assay+in+the+analysis+of+DNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-based electrophoretic mobility shift assay in the analysis of DNA-binding proteins.</a> Methods Mol Biol. 479, 273-289 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

fEMSA są skutecznym narzędziem do badania interakcji białko-DNA i stanowią alternatywę dla radioaktywnego znakowania DNA. Barwniki fluorescencyjne, takie jak barwniki podczerwone, są dostępne na rynku i stanowią bezpieczniejszą i bardziej przyjazną dla środowiska metodę w porównaniu z radioaktywnym znakowaniem DNA. EMSA wykorzystujące oligonukleotydy znakowane barwnikiem fluorescencyjnym w podczerwieni nie wymagają etapów przetwarzania żelu po uruchomieniu, a zatem oszczędzają czas i koszty w porównaniu z innymi technika...

EMSA są używane do analizy interakcji między DNA a białkami za pomocą natywnej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE) do rozwiązania mieszaniny interesującego białka i znakowanej sondy DNA zawierającej potencjalne miejsca docelowe białka1. Sonda DNA związana z białkiem będzie migrować wolniej w porównaniu z wolną sondą DNA, a zatem jej migracja przez matrycę poliakryloamidową jest opóźniona. Znakowanie radioaktywne DNA przez 32P jest dominującą metodą wykrywania w EMSA. Chociaż zastosowanie znakowania radioaktywnego w badaniach biochemicznych jest korzystne, stosuje się alternatywne metody znakowania DNA o porównywalnej czułości ze względu na zagrożenia dla zdrowia i bezpieczeństwa związane z obchodzeniem się z promieniotwórczością. Te alternatywne metody obejmują koniugację DNA z biotyną2 lub digoksygeniną (DIG)3 (z których oba są następnie wykrywane przez systemy chemiluminescencyjne), barwienie SYBR na zielono żeli PAGE4 lub bezpośrednie wykrywanie koniugatów barwnika DNA-fluorescencyjnego poprzez skanowanie żelu5,6.
Rozwiązane żele EMSA za pomocą radioaktywnie znakowanych sond DNA wymagają przetwarzania po uruchomieniu za pomocą filmów autoradiograficznych lub systemu fosforowego do wykrywania sygnałów radioaktywnych1,7. Żele EMSA wykorzystujące sondyDNA biotyny-2 lub 3 sprzężone z DIG muszą być również przetworzone i przeniesione na odpowiednią membranę, a następnie wykryte za pomocą chemiluminescencji6. Barwienie żelu na zielono metodą SYBR wymaga barwienia żelem po uruchomieniu i skanera fluorescencyjnego4. Ze względu na to, że w przypadku EMSA stosujących te techniki znakowania DNA wymagane są etapy przetwarzania żelu po przebiegu, rozwiązany żel można oznaczyć tylko raz. W przeciwieństwie do tego, sondy DNA znakowane fluoroforami mogą być bezpośrednio wykryte w żelu wewnątrz szklanych płytek za pomocą skanera. W związku z tym interakcje DNA-białko mogą być monitorowane i oznaczane kilkakrotnie w różnych punktach czasowych podczas przebiegu, co znacznie skraca czas i obniża koszty. Koniugaty barwników fluorescencyjnych DNA, które zostały użyte w EMSA, obejmują Cy36,8, Cy56,8, fluoresceinę9 i barwniki fluorescencyjne w podczerwieni4-6.
Regulacja transkrypcji wymaga interakcji białko-DNA czynników transkrypcyjnych i ich docelowych genów. Koordynacja tych interakcji generuje różne typy komórek ze wspólnego przodka podczas rozwoju zwierząt. Bezstronne badanie genetyczne zidentyfikowało mutację typu missense, G73E, w wysoce konserwatywnej domenie wiążącej DNA HMG czynnika transkrypcyjnego SOX-2 Caenorhabditis elegans. Mutacja powoduje transformację tożsamości komórkowej neuronów węchowych AWB w neurony węchowe AWC na poziomie molekularnym, morfologicznym i funkcjonalnym5,10. SOX-2 w różny sposób reguluje końcowe różnicowanie neuronów AWB i AWC poprzez interakcję z zależnymi od kontekstu czynnikami transkrypcyjnymi partnera i odpowiednimi miejscami docelowymi DNA5,10. SOX-2 współpracuje z LIM-4 (LHX) w końcowym różnicowaniu neuronów AWB, podczas gdy SOX-2 współpracuje z CEH-36 (OTX/OTD) w końcowym różnicowaniu neuronów AWC. Testy reporterowe lucyferazy pokazują, że SOX-2 i zmutowane białkaSOX-2 G73E mają interakcje kooperacyjne z kofaktorami transkrypcyjnymi LIM-4 i CEH-36 w celu aktywacji promotora ulegającego ekspresji w neuronach AWB i AWC. Jednak SOX-2 i zmutowany SOX-2G73E wykazywały zróżnicowane właściwości aktywacji promotora. Aby zbadać molekularne podstawy zróżnicowanej aktywności wiązania DNA SOX-2 i SOX-2G73E, przeprowadzono fEMSA z tymi białkami i ich potencjalnymi miejscami docelowymi.
Po pierwsze, zastosowano podejście bioinformatyczne w celu zidentyfikowania biologicznie istotnych sekwencji wiążących DNA w regionie promotora 1 kb użytym w teście lucyferazy. Ponieważ w całym promotorze obecnych było wiele potencjalnych miejsc wiązania SOX-2, skupiliśmy się na przewidywanych miejscach wiązania SOX-2 sąsiadujących z domniemanymi miejscami wiązania CEH-36 lub LIM-4 i ewolucyjnie konserwatywnych między różnymi gatunkami nicieni. Sekwencje te zostały usunięte lub zmutowane, a następnie przetestowane in vivo pod kątem ich aktywności w zakresie ekspresji transgenów reporterowych GFP w neuronach AWB lub AWC. Dzięki takiemu podejściu zidentyfikowaliśmy potencjalne sąsiednie miejsca docelowe LIM-4 / SOX-2 i CEH-36 / SOX-2, które są specyficznie wymagane do ekspresji GFP w neuronach AWB i AWC, odpowiednio5. Zbadaliśmy potencjalne różnice w wiązaniu DNA SOX-2 i SOX-2G73E za pomocą fEMSA ze zidentyfikowanymi sąsiednimi miejscami docelowymi LIM-4 / SOX-2 i CEH-36 / SOX-2. Nasza analiza EMSA wykazała, że SOX-2G73E nie wiązał sondy DNA zawierającej sąsiednie miejsca docelowe LIM-4 / SOX-2 (wymagane do ekspresji genów w AWB) tak skutecznie, jak zrobił to WT SOX-2. Jednak SOX-2 i SOX-2G73E nie miały różnicy w wiązaniu sondy DNA zawierającej sąsiednie miejsce docelowe CEH-36 / SOX-2 (wymagane do ekspresji genu w AWC)5,10. Nasze analizy fEMSA dostarczają mechanistycznego wglądu w naturę mutacji SOX-2G73E w wpływie na specyficzną aktywność wiązania DNA dla fenotypu transformacji tożsamości komórkowej AWB-do-AWC. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowany protokół fEMSA przy użyciu oczyszczonego 6xHis-SOX-2 lub 6xHis-SOX-2G73E wraz z sondami DNA znakowanymi barwnikiem fluorescencyjnym w podczerwieni zawierającymi sąsiednie miejsca docelowe LIM-4 / SOX-2 jako studium przypadku mające na celu rozwiązanie ważnego pytania biologicznego.

<table><tbody><tr><td>30% roztwór akryloamidu/bis, 37,5:1&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1610158</td><td>Akrylamid jest szkodliwy i toksyczny.</td></tr><tr><td>6x-Przeciwciało znacznika epitopu His (HIS. H8)</td> <td>Przeciwciało ThermoFisher</td><td>MA1-21315</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Flag M2&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3165-.2MG</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA) klasa biologii molekularnej</td><td>New England Biolabs</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>Oligonukleotydy DNA znakowane 5'IRDye700</td><td>Zintegrowane technologie DNA Niestandardowe</td><td>oligo DNA Są</td><td>one określane w manuskrypcie jako "Oligonukleotydy DNA znakowane barwnikiem 5' lub fluorescencyjnym barwnikiem znakowanym w podczerwieni". Firma będzie niestandardowo syntetyzować oligonukleotydy DNA znakowane 5' IRDye. Wymagane minimum 100&nbsp; &mu; Synteza w skali M i oczyszczanie HPLC.</td></tr><tr><td>Fragment Klenowa (egzo->-5'</td> <td>New England Biolabs</td><td>M0212S</td><td></td></tr><tr><td>LightShif Poly (dI-dC)</td><td>ThermoFisher</td><td>20148E</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN&nbsp; Pionowe ogniwo do elektroforezy&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1658000FC&nbsp;</td><td>W manuskrypcie nazywa się to "mini systemem żelu białkowego". Można zastosować dowolny system elektroforetyczny, o ile są to przezroczyste szklane płytki o wymiarach mniejszych niż 25 cm x 25 cm.</td></tr><tr><td>System obrazowania w podczerwieni Odyssey CLx</td><td>LI-COR Biotechnology</td><td>System obrazowania w podczerwieni Odyssey CLx</td><td>W manuskrypcie jest on określany jako "zaawansowany system obrazowania w podczerwieni".</td></tr><tr><td>System obrazowania Odyssey FC&nbsp;</td><td>LI-COR Biotechnology</td><td>Odyssey Fc Dual-Mode Imaging System</td><td>W manuskrypcie jest to określane jako "system obrazowania fluorescencyjnego w bliskiej podczerwieni głównie dla zachodnich plam".</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Image Studio (wersja 4.0)</td><td>Oprogramowanie LI-COR Biotechnology</td><td>Image Studio&nbsp;</td><td>W manuskrypcie jest to określane jako "szczególne oprogramowanie do obrazowania".&nbsp;</td></tr><tr><td>Pomarańczowy G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O3756-25G</td><td></td></tr><tr><td>6x Pomarańczowy barwnik ładujący</td><td></td><td></td><td>0,25% Pomarańczowy G; 30% Glicerol</td></tr><tr><td>0,5x TBE</td><td></td><td></td><td>45 mM Tris-Boran; 1 mM EDTA</td></tr><tr><td>1x TE</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA</td></tr><tr><td>1x STE</td><td></td><td></td><td>100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA</td></tr><tr><td>5x Bufor wiążący</td><td></td><td></td><td>50 mM Tris-HCl, pH 7,5; 50 mM NaCl; 200 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5 mM EDTA, pH 8,0; 5 mM naziemnej telewizji cyfrowej; 250 &#956; g/ml BSA</td></tr></tbody></table>

zoptymalizowany protokół do oznaczania przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej przy użyciu oligonukleotydów znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym w podczerwieni

An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides

Testy EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assays) są instrumentalnym narzędziem do charakteryzowania interakcji między białkami a ich docelowymi sekwencjami DNA. Radioaktywność jest dominującą metodą znakowania DNA w EMSA. Jednak ostatnie postępy w dziedzinie barwników fluorescencyjnych i metod skanowania skłoniły do zastosowania fluorescencyjnego znakowania DNA jako alternatywy dla radioaktywności ze względu na zalety łatwej obsługi, oszczędności czasu, obniżenia kosztów i poprawy bezpieczeństwa. Niedawno wykorzystaliśmy fluorescencyjną EMSA (fEMSA), aby skutecznie odpowiedzieć na ważne pytanie biologiczne. Nasza analiza fEMSA zapewnia mechanistyczny wgląd w wpływ mutacji typu missense, G73E, w wysoce konserwatywnym czynniku transkrypcyjnym HMG SOX-2 na dywersyfikację typów neuronów węchowych. Odkryliśmy, że zmutowane białko SOX-2G73E zmienia specyficzną aktywność wiązania DNA, powodując w ten sposób transformację tożsamości neuronów węchowych. Tutaj przedstawiamy zoptymalizowany i opłacalny protokół krok po kroku dla fEMSA wykorzystujący oligonukleotydy znakowane barwnikiem fluorescencyjnym w podczerwieni zawierające sąsiednie miejsca docelowe LIM-4 / SOX-2 i oczyszczone białka SOX-2 (WT i zmutowane białka SOX-2G73E) jako przykład biologiczny.

Barwnik do nakładania Orange G (6x: 0,12 g Orange G w 100 mL 30% glicerolu) można dodać do reakcji wiązania przed nakładaniem, aby monitorować postęp elektroforezy. Inne barwniki do nakładania, w tym błękit bromofenolowy, będą wykrywane podczas skanowania, a w konsekwencji zakłócą analizę obrazu (Rycina 1B).
W niektórych przypadkach podczas przeprowadzania EMSA, szczególnie przy użyciu preparatów ekstraktu jądro...

Opisujemy tutaj zoptymalizowany protokół fluorescencyjnych testów przesunięcia mobilności elektroforetycznej (fEMSA) przy użyciu oczyszczonych białek SOX-2 wraz z sondami DNA znakowanymi barwnikiem fluorescencyjnym w podczerwieni jako studium przypadku, aby rozwiązać ważne pytanie biologiczne.

Zoptymalizowany protokół do oznaczania przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej przy użyciu oligonukleotydów znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym w podczerwieni

Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) are an instrumental tool to characterize the interactions between proteins and their target DNA sequences. ...

Ogólnym celem tego testu jest wykrywanie oddziaływań białko-DNA przy użyciu sond nieradioaktywnych. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii molekularnej i biochemii, takie jak określenie sekwencji docelowej DNA dla danych białek. Główną zaletą tej techniki jest to, że stanowi ona łatwą, bezpieczną i oszczędzającą czas alternatywę dla stosowania sond radioaktywnych.Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować pięcioprocentowy natywny żel poliakrylamidowy zawierający 0,5x tris-boran EDTA lub TBE oraz 2,5% glicerolu, korzystając z systemu do miniżeli białkowych. Aby przygotować 30 mililitrów roztworu żelu dla czterech żeli, należy zmieszać wodę destylowaną, TBE, persiarczan amonu, TEMED, akrylamid-bis oraz glicerol. Roztwór żelu należy przelać niezwłocznie.Po polimeryzacji owiń żele przezroczystą folią spożywczą uprzednio zwilżoną 0,5x TBE i przechowuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie zaprojektuj długi oligonukleotyd o długości około 51 merów. Zaprojektuj komplementarne krótkie oligonukleotydy o długości około 14 merów z modyfikacją barwnikiem fluorescencyjnym w podczerwieni na końcu pięć prim.Po przygotowaniu oligonukleotydó

an-optimized-protocol-for-electrophoretic-mobility-shift-assay-using

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten film opisuje metodę analizy interakcji białko-ligand za pomocą elektroforezy kapilarnej z przesunięciem ruchliwości. Metoda ta może być stosowana do charakteryzowania zachowania wiązania białka z różnymi naładowanymi ligandami.

Elektroforeza kapilarna z przesunięciem ruchliwości i powinowactwa: metoda analizy interakcji próbka-ligand w zależności od zróżnicowanej migracji kompleksów białko-ligand

W tym filmie demonstrujemy test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej do wykrywania interakcji białko-DNA za pomocą sond DNA znakowanych fluorescencyjnie w podczerwieni. Kiedy białko wiąże się z sondą DNA, tworzy duży kompleks, który migruje powoli i pojawia się jako przesunięta prążek na żelu.

Test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej do wykrywania kompleksów czynnik transkrypcyjny-DNA

Badania biomolekuł in vivo są kluczowe dla zrozumienia funkcji molekularnej w kontekście biologicznym. W tym miejscu opisujemy nowatorską metodę pozwalającą na internalizację biomolekuł fluorescencyjnych, takich jak DNA czy białka, do żywych mikroorganizmów. Przedstawiono i omówiono również analizę danych in vivo zarejestrowanych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Internalizacja i obserwacja biomolekuł fluorescencyjnych w żywych mikroorganizmach za pomocą elektroporacji

Tutaj prezentujemy protokół do analizy interakcji RNA/białko. Test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) opiera się na zróżnicowanej migracji kompleksów RNA/białko i wolnego RNA podczas natywnej elektroforezy żelowej. Za pomocą znakowanej radioaktywnie sondy RNA, kompleksy RNA/białko można uwidocznić za pomocą autoradiografii.

Test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) do badania interakcji RNA-białko: przykład IRE/IRP

Przedstawiamy strategiczny plan i protokół identyfikacji niekodujących wariantów genetycznych wpływających na wiązanie DNA czynnika transkrypcyjnego (TF). Przedstawiono szczegółowy protokół eksperymentalny dla testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) i testu powinowactwa DNA (DAPA) analizy wiązania TF DNA zależnego od genotypu.

Badania przesiewowe w kierunku funkcjonalnych niekodujących wariantów genetycznych przy użyciu testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) i testu precypitacji powinowactwa DNA (DAPA)

Natywna elektroforeza w żelu poliakrylamidowym jest podstawowym narzędziem do analizy interakcji RNA-białko. Tradycyjnie w większości eksperymentów używano żeli pionowych. Jednak żele poziome mają kilka zalet, takich jak możliwość monitorowania kompleksów podczas elektroforezy. Udostępniamy szczegółowy protokół generowania i stosowania poziomej natywnej elektroforezy żelowej.

Pozioma elektroforeza żelowa w celu lepszego wykrywania kompleksów białko-RNA

Ten protokół opisuje charakterystykę syntezy modyfikowanego DNA przez polimerazę DNA poprzez obserwację zmian w DNA znakowanym fluorescencyjnie w bliskiej podczerwieni za pomocą elektroforezy żelowej i obrazowania żelowego. Żele akrylamidowe są używane do obrazowania w wysokiej rozdzielczości separacji krótkich kwasów nukleinowych, które migrują z różną szybkością w zależności od wielkości.

Test aktywności polimerazy DNA przy użyciu znakowanego fluorescencyjnie DNA w bliskiej podczerwieni wizualizowanego za pomocą elektroforezy w żelu akrylowym

Tutaj prezentujemy protokół użycia oranżu tiazolowego do wykrywania DNA w eksperymentach z elektroforezą żelową. Zastosowanie oranżu tiazolowego pozwala na eliminację bromku etydyny, a detekcję fluorescencji można osiągnąć za pomocą światła UV lub niebieskiego.

Elektroforeza DNA z użyciem oranżu tiazolowego zamiast bromku etydyny lub alternatywnych barwników

Tutaj przedstawiono protokół oznaczania enzymów metabolizujących kwasy nukleinowe, na przykładzie enzymów ligazy, nukleazy i polimerazy. Test wykorzystuje znakowane fluorescencyjnie i nieznakowane oligonukleotydy, które można łączyć w dupleksy naśladujące uszkodzenia RNA i / lub DNA lub pośrednie szlaki, co pozwala na scharakteryzowanie zachowania enzymu.

Wykorzystanie zmodyfikowanych syntetycznych oligonukleotydów do oznaczania enzymów metabolizujących kwasy nukleinowe

Protokół ten przedstawia projekt podzielonych sond hybrydyzacyjnych wykorzystujących fluorescencyjny aptamer, świecący aptamer DAP-10-42 jako reporter sygnału oraz ich zastosowanie do wykrywania kwasów nukleinowych i różnicowania celów z podstawieniami pojedynczych nukleotydów.

Dzielona sonda hybrydyzacyjna wykorzystująca fluorescencyjny aptamer rozświetlający DNA jako reporter sygnału do analizy kwasów nukleinowych specyficznych dla sekwencji

Poznaj zoptymalizowany protokół fEMSA do badania interakcji białko-DNA z użyciem fluorescencyjnych sond podczerwieniowych. Ta bezpieczna metoda zastępuje radioaktywne znaczniki w badaniach biologii molekularnej.

Zoptymalizowany protokół do oznaczania przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej przy użyciu oligonukleotydów znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym w podczerwieni (Wideo) | JoVE Journal

Zoptymalizowany protokół do oznaczania przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej przy użyciu oligonukleotydów znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym w podczerwieni

Przeglądaj więcej filmów