Zoptymalizowany protokół do oznaczania przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej przy użyciu oligonukleotydów znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym w podczerwieni
November 29th, 2016
Opisujemy tutaj zoptymalizowany protokół fluorescencyjnych testów przesunięcia mobilności elektroforetycznej (fEMSA) przy użyciu oczyszczonych białek SOX-2 wraz z sondami DNA znakowanymi barwnikiem fluorescencyjnym w podczerwieni jako studium przypadku, aby rozwiązać ważne pytanie biologiczne.
Ogólnym celem tego testu jest wykrycie interakcji białko-DNA za pomocą sond nieradioaktywnych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii molekularnej i biochemii, takie jak określenie docelowej sekwencji DNA białek. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to łatwa, bezpieczna i oszczędzająca czas alternatywa dla stosowania sond radioaktywnych.
Aby rozpocząć tę procedurę, przygotuj pięcioprocentowy natywny żel poliakrylamidowy zawierający 0,5x tris boran EDTA lub TBE i 2,5% glicerolu za pomocą systemu mini żelu białkowego. Aby przygotować 30 mililitrów roztworu żelu na cztery żele, wymieszaj wodę destylowaną, KZM, nadsiarczan amonu, TEMED, bis akryloamidu i glicerol. Natychmiast przepuścić roztwór żelu.
Po polimeryzacji zawiń żele w przezroczystą folię spożywczą wstępnie zwilżoną 0,5x TBE i przechowuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie zaprojektuj długi oligonukleotyd na około 51 merów. Zaprojektuj komplementarne krótkie oligonukleotydy dla około 14 merów z modyfikacją barwnika fluorescencyjnego w podczerwieni na pięciu głównych końcach.
Po przygotowaniu oligonukleotydów należy je ponownie zawiesić w buforze 1x Tris-EDTA do końcowego stężenia 100 mikromolowych. Do wyżarzania wymieszaj 0,6 mikrolitra krótkiego oligonukleotydu z pięcioma głównymi barwnikami, 1,2 mikrolitra długiego oligonukleotydu i 28,2 mikrolitra buforu Tris-EDTA chlorku sodu w probówce o pojemności 1,5 mililitra. Umieść probówkę we wrzącej wodzie na pięć minut, a następnie wyłącz źródło ciepła i pozwól wodzie z wyżarzonymi oligonukleotydami ostygnąć przez noc w ciemności.
Aby wykonać dwuniciowe sondy DNA, wymieszaj 30 mikrolitrów wyżarzonych oligonukleotydów z DNTP, buforem Klenowa, pięcioma głównymi znacznikami barwnika Klenowa i podwójnie destylowaną wodą w 0,2 mililitrowej probówce do PCR. Inkubować mieszaninę przez 60 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w maszynie do PCR. Następnie dodaj 3,4 mikrolitra 0,5 molowego EDTA, aby zatrzymać reakcję i podgrzej w temperaturze 75 stopni Celsjusza przez 20 minut w maszynie do PCR.
Następnie rozcieńczyć wypełnione sondy buforem Tris-EDTA chlorku sodu do końcowego stężenia 0,1 mikromola. Oligonukleotydy należy przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza w ciemności, aż będą gotowe do użycia. Aby przygotować nieznakowane sondy, wymieszaj 20 mikrolitrów długiego oligonukleotydu, 20 mikrolitrów oligonukleotydu Long R i 60 mikrolitrów buforu Tris-EDTA chlorku sodu w 1,5 mililitrowej probówce.
Umieść probówkę we wrzącej wodzie na pięć minut, a następnie wyłącz źródło ciepła i pozwól wodzie z wyżarzonymi oligonukleotydami ostygnąć przez noc. Przygotuj jeden mililitr 5x buforu wiążącego, mieszając Tris HCl, chlorek sodu, chlorek potasu, chlorek magnezu, EDTA, DTT, BSA i podwójnie destylowaną wodę. Przed rozpoczęciem reakcji wiązania należy wstępnie uruchomić 5% natywny żel poliakryloamidowy w 0,5x TBE i 2,5% glicerolu, aby usunąć wszelkie ślady nadsiarczanu amonu przy napięciu 80 woltów przez 30 minut do jednej godziny lub do momentu, gdy prąd przestanie się zmieniać w czasie.
Następnie wymieszaj cztery mikrolitry 5-krotnego buforu wiążącego, 80 do 200 nanogramów oczyszczonego białka A, jeden mikrolitr 0,1 mikromolowej sondy sprzężonej z barwnikiem i podwójnie destylowaną wodę. Inkubuj mieszaninę w temperaturze pokojowej w ciemności przez 15 minut. Po inkubacji załaduj całą reakcję wiązania na żel i uruchom żel pod napięciem 10 woltów na centymetr na żądaną odległość.
Przykryj aparat żelowy aluminium, aby żel był jak najbardziej w ciemności. Wyczyść łóżko skanera systemu obrazowania w podczerwieni wodą destylowaną. Wytrzyj do sucha szklane płytki zawierające żel i umieść je na łóżku skanera.
Otwórz oprogramowanie do obrazowania w podczerwieni i kliknij kartę Pobierz. W przypadku grubszych płyt użyj ustawień 700 dla kanału, auto dla intensywności, 84 mikrometrów dla rozdzielczości, średniej dla jakości i 3,5 milimetra dla przesunięcia ostrości. Wybierz obszar, który żel zajmuje na skanerze.
Na koniec kliknij Start, aby rozpocząć skanowanie. Postęp elektroforezy można wizualizować za pomocą barwnika Orange G, podczas gdy błękit bromofenolowy jest wykrywany podczas skanowania i dlatego zakłóca analizę obrazu. Dodanie dI-dC do reakcji wiązania zniosło wiązanie oczyszczonego 6xHis-SOX-2 z pięcioma sondami DNA z głównym barwnikiem.
Mutant LIM-4 i zimna sonda SOX-2 zmutowane w miejscu wiązania LIM-4 są tak samo skuteczne jak zimna sonda typu dzikiego w konkurowaniu z sondą znakowaną barwnikiem fluorescencyjnym w podczerwieni o wiązanie z 6xHis-SOX-2. Jednak skuteczność konkurencyjna zmutowanej zimnej sondy LIM-4 i SOX-2 zmutowanej w miejscu wiązania SOX-2 jest znacznie niższa niż zimnej sondy typu dzikiego w wiązaniu z 6xHis-SOX-2. Testy superprzesunięcia kompleksu DNA SOX-2 przy użyciu epitopów 6xHis i flagi dały w wyniku superprzesuniętego pasma DNA SOX-2.
Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch do czterech godzin, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby trzymać sondy podczerwieni w ciemności. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak edycja genomu CRISPR cas9, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak znaczenie określonej sekwencji wiążącej DNA.
Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biochemią do badania interakcji białko-DNA w różnych organizmach modelowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak określić interakcje białko-DNA za pomocą nieradioaktywnych etykiet DNA. Nie zapominaj, że praca z akrylamidem może być bardzo niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak środki ochrony osobistej.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia zoptymalizowany protokół do fluorescencyjnych Elektroforetycznych Assayów Przesuwnych Mobilności (fEMSA) wykorzystujących oczyszczone białka SOX-2 i infraczerwone fluorescencyjne sondy DNA z oznaczeniami barwnikowymi. Metoda ma na celu wykrywanie interakcji białko-DNA bez użycia materiałów radioaktywnych, zapewniając bezpieczniejszą i bardziej efektywną alternatywę.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Biologia molekularna
- Biochemia
- Interakcje białko-DNA
Tło
- Elektroforetyczne Assayy Przesuwne Mobilności (EMSA) są kluczowe dla badania interakcji białko-DNA.
- Tradycyjne metody EMSA często polegają na radioaktywnych sondach, co stanowi ryzyko dla bezpieczeństwa.
- Fluorescencyjne sondy oferują nieradioaktywną alternatywę do wykrywania tych interakcji.
- SOX-2 jest kluczowy białkiem w biologii komórek macierzystych, co sprawia, że jego interakcja z DNA jest znacząca.
Cel badania
- Opracowanie bezpieczniejszego, bardziej efektywnego protokołu do wykrywania interakcji białko-DNA.
- Wykorzystanie fluorescencyjnych sond dla lepszej wizualizacji i analizy.
- Dostarczenie szczegółowej metodologii dla badaczy z zakresu biologii molekularnej i biochemii.
Zastosowanie metod
- Przygotowanie pięcioprocentowego natywnego żelu poliakrylamidu.
- Użycie bufora 0,5x tris boranowo-EDTA (TBE).
- Włączenie glicerolu do żelu dla stabilności.
- Mieszanie konkretnych reagentów dla stworzenia roztworu żelu.
Główne wyniki
- Protokół fEMSA skutecznie wykrywa interakcje białko-DNA.
- Fluorescencyjne sondy zapewniają jasną wizualizację bez obaw o bezpieczeństwo.
- Metoda jest efektywna i czasopochłaniająca w porównaniu z tradycyjnymi technikami.
- Wyniki pokazują przydatność protokołu w różnych kontekstach biologicznych.
Konkluzje
- Zoptymalizowany protokół fEMSA jest cennym narzędziem dla badaczy.
- Nieradioaktywne metody zwiększają bezpieczeństwo i efektywność w badaniach molekularnych.
- To podejście może być zastosowane do różnych białek i sekwencji DNA.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This protocol enables safe, cost-effective detection of protein-DNA interactions using infrared fluorescent dye-labeled oligonucleotides, eliminating radioactivity-related hazards and reducing assay turnaround time. It supports target validation and mechanistic de-risking in early discovery by providing quantitative, reproducible binding data for transcription factors like SOX-2. The method enhances predictive confidence in lead identification workflows by delivering clear, analyzable electrophoretic shifts without radioisotope handling constraints.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcription factor-DNA binding specificity to validate therapeutic targets such as SOX-2 in neuronal differentiation pathways.
- Operational Value: Uses infrared fluorescent probes that allow direct visualization and quantification without autoradiography or phosphorimaging.
- Scientific Value: Detects altered binding affinity due to missense mutations (e.g., SOX-2G73E), supporting mechanistic insight into pathogenic variants.
- Operational Value: Eliminates radioactive waste disposal requirements, improving lab safety and reducing regulatory overhead.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates dose-dependent binding curves to assess protein-DNA interaction kinetics and affinity under controlled conditions.
- Operational Value: Utilizes stable, infrared dye-labeled probes storable at −20°C, enabling batch preparation and reuse across multiple experiments.
- Scientific Value: Permits competition assays with unlabeled probes to determine binding specificity and identify effective disruptors.
- Operational Value: Compatible with standard native PAGE systems and infrared imagers, requiring no specialized electrophoresis equipment.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links in vitro binding data to phenotypic outcomes, such as olfactory neuron identity transformation, supporting translational relevance.
- Operational Value: Requires only purified protein and oligonucleotide inputs, making it adaptable to various disease-relevant systems.
- Scientific Value: Supershift assays using epitope-tagged proteins (e.g., 6xHis, flag) confirm complex identity, increasing data interpretability.
- Operational Value: Total assay time of 2–4 hours allows integration into medium-throughput screening cascades.
Pipeline & Workflow Integration
The fEMSA method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing in target validation and informing lead selection through mechanistic de-risking of protein-DNA interactions.
- Discovery Biology: Tests transcriptional regulator binding to cis-regulatory elements to clarify pathway activity and target engagement.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible binding readouts that enable comparison of wild-type and mutant protein variants.
- Analytics: Generates electrophoretic shift patterns and competition data suitable for densitometric analysis and KD estimation.
- Translational Research: Connects binding defects to cellular phenotypes, aiding in biomarker-aligned target prioritization.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for probing transcription factor-DNA interactions across multiple targets and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by providing direct, visual evidence of sequence-specific binding.
- Operational Value: Reduces per-assay cost and time by avoiding radioactive probe synthesis, decay correction, and exposure delays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality by minimizing false positives from nonspecific binding through rigorous controls.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement of candidates with well-characterized mechanism of action at the DNA-binding level.
Implementation Considerations
- Requires expertise in oligonucleotide annealing, fill-in reactions, and native gel electrophoresis.
- Depends on access to an infrared imaging system capable of 700 nm channel detection.
- Necessitates standardized binding buffer composition and protein purification quality for reproducible results.
- Requires dark handling of IR-labeled probes to prevent photodegradation and signal loss.
- Limited to nucleic acid-binding proteins; not suitable for RNA or protein-protein interaction studies without adaptation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:32
Preparation of Gel, Infrared Fluorescent Dye-labeled Probes and Unlabeled Probes
4:49
Binding Reaction and Electrophoresis
6:37
Imaging
7:35
Results: Electrophoretic Mobility Shift Assays Using Purified Proteins and Dye-labeled DNA Probes
8:57
Conclusion
