Zamrażanie wgłębne: narzędzie do badań ultrastrukturalnych i immunolokalizacyjnych komórek zawiesinowych w transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Celem poniższych eksperymentów jest zaproponowanie narzędzia do badań ultrastrukturalnych i immunolokalizacyjnych komórek zawiesinowych do wizualizacji w transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Ta technika jest łatwa w użyciu, tania i zapewnia doskonałe zachowanie struktury komórkowej. Jest to hodowla komórek zawiesinowych.

Najpierw komórki są zbierane przez różne wirowania w celu uzyskania osadu w probówce mikrowirówkowej. W drugim etapie próbka jest szybko zamrażana przez zamrażanie wgłębne, które unieruchamia komórki i ogranicza tworzenie się kryształków lodu. Następnie przeprowadza się substytucję przez zamrażanie w celu zastąpienia wody rozpuszczalnikiem zawierającym tetratlenek osmu jako utrwalacz stabilizujący struktury komórkowe.

Wyniki pokazują, że zamrażanie wgłębne i substytucja przez zamrażanie doskonale zachowują infrastrukturę komórek. Utrwalanie chemiczne było podstawową metodą utrwalania tkanek lub komórek w transmisyjnej mikroskopii elektronowej, ale dzięki tej metodzie zwykle obserwuje się artefakty i ekstrakcję zawartości komórkowej. Alternatywą dla utrwalania chemicznego jest kriofiksacja.

Metoda ta stanowi najlepszy wybór do uzyskania najwyższej jakości morfologii w cienkich sekcjach żywicy. Zamrażanie wgłębne to technika kriofiksacji, która natychmiast unieruchamia cząsteczki w komórce, aby uniknąć uszkodzeń spowodowanych konwencjonalnym utrwalaniem chemicznym. Przed zamrożeniem próbki wgłębnej należy przygotować siatkę przeciętą folią Formvar, która będzie używana jako podpora do zamrażania.

Wypoleruj szkiełko szkiełkiem niestrzępiącą się szmatką, aż będzie lśniące i wytrzyj do czysta. Zanurzyć szkiełko szkiełkowe w roztworze Formvaru 0,3% w chloroformie na kilka sekund i pozostawić do wyschnięcia w zlewce. Manipulacja musi odbywać się pod wyciągiem przy użyciu środków ochrony osobistej ze względu na obecność chloroformu.

Po napełnieniu krystalizatora wodą destylowaną przełóż nad powierzchnią wody szklaną listwę, aby usunąć kurz. Gdy folia wyschnie, naciąć krawędzie ostrą żyletką, aby folia mogła się oderwać. Zamroź szkiełko, mocno wydychając powietrze na szkiełko, aby uzyskać warstwę pary wodnej na folii.

Natychmiast spuść folię na powierzchnię wody, dotykając dna zjeżdżalni pod kątem około 30 stopni do powierzchni wody. Powoli opuść zjeżdżalnię do wanny, w razie potrzeby usuwając folię. Film Formvar powoli osiada na powierzchni wody.

Przymocuj folię do krawędzi krystalizatora za pomocą pęsety. Delikatnie połóż miedziane siatki o siatce 400 zadrukowaną stroną do dołu na folii w obszarach o odpowiedniej grubości i bez zmarszczek. Folię z kratkami podnosi się, przykrywając je papierem Joseph, gdy unoszą się na powierzchni wody.

Podnieś krawędź papieru Josepha, a folia z kratkami powinna być dołączona do niego. Nie pozwól, aby palce dotykały powierzchni wody, w przeciwnym razie ryzykujesz pozostawienie filmu w wodzie. Pozostaw kratki do wyschnięcia na kilka godzin przed ich użyciem.

W przypadku badań ultrastrukturalnych umieścić ampułkę z tetratoksydkiem osmu w szklanej kolbie. Dobrze wstrząsnąć kolbą, aby rozbić ampułkę. Dodać odpowiednią objętość acetonu 100%, aby uzyskać końcowe stężenie 4% Wymieszać kolbę zawierającą pożywkę do substytucji zamrażania i dozować 1,5 mililitra porcji do kriowiali za pomocą plastikowej pipety transferowej.

Zamknij wszystkie nakrętki i przechowuj w zamrażarce w temperaturze minus 84 stopni przed użyciem. Do badań immunoznakowania białek należy przygotować 0,1% octanu uranylu w acetonie. Gdy roztwór stanie się klarowny, przefiltrować za pomocą filtra 0,2 mikrometra i dozować 1,5 mililitra porcji do kriowialiów.

Przed użyciem przechowywać w zamrażarce w temperaturze minus 84 stopni. Aby mieć pewność, że masz odpowiednią konsystencję granulek z różnych typów komórek, surowe komórki drożdży w minimum kompletnym płynnym pożywce, aby uzyskać od 10 do dziewięciu komórek. Escherichia coli w pożywce DTY w celu uzyskania pięciu 10 do 10 komórek bakteryjnych.

Leishmania flagellum w pożywce AM i Trypanosoma brucei w pożywce SDM79 w celu uzyskania pięciu 10 do ośmiu komórek pasożyta. Przenieść pożywkę zawierającą zawiesinę do 50-mililitrowej probówki propylenowej i odwirować przez trzy minuty przy 1,500 g. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze odpowiedniej pożywki do hodowli komórkowych.

Wirować w probówce do mikrowirówek przez jedną minutę przy stężeniu 3 900 g. Całkowicie usunąć supernatant. W przypadku metody zamrażania wgłębnego należy użyć butli z propanem z rurką podłączoną do butli z propanem.

Ponieważ propan jest potencjalnie wybuchowy, uświadomij sobie skraplanie w dobrze wentylowanym pomieszczeniu lub w dygestorium. Nie wolno używać otwartego ognia. Podczas stosowania ciekłego azotu należy zawsze nosić środki ochrony osobistej, w tym rękawice kriogeniczne.

Umieść niewielką ilość ciekłego azotu w tacce styropianowej. Umieść mosiężny kubek w ciekłym azocie. Pojawiają się bąbelki.

Poczekaj, aż bąbelki opadną. Mosiężny kubek jest następnie zamrażany. Umieść rurkę podłączoną do butli z propanem w kontakcie ze ścianką mosiężnej nasadki.

Delikatnie otwórz zawór butli z propanem. Powstaje dużo dymu, ponieważ propan nie zaczyna się upłynniać. Kiedy propan zaczyna się upłynniać, dym znika.

Zatrzymaj skraplanie, zamykając zawór butli z propanem i szybko wyjmując rurkę podłączoną do butli z propanem. Napełnij tackę styropianową ciekłym azotem do pięciu milimetrów od górnej części mosiężnego kubka. Zamroź małe mosiężne kubki, w których wymienimy próbkę po zamrożeniu, umieszczając je w ciekłym azocie.

Umieść jedną filiżankę na jedną próbkę. Uważaj, aby nie mieszać próbek. Aby uzyskać odpowiednią konsystencję osadu, należy jedynie przestrzegać wskazanych wcześniej warunków hodowli i parametrów wirowania.

Zamroź pęsetę przed jej użyciem. Weź miedzianą siatkę mikroskopową o siatce 400 pociętą za pomocą Formvaru. Zanurz dwusieczną igłę preparacyjną w granulce.

Połóż za pomocą narzędzia kroplę pelletu na siatce. Bardzo szybko zanurz siatkę w ciekłym propanu i mieszaj przez kilka sekund. Szybko przenieś zamrożoną siatkę do małego mosiężnego kubka.

Dla każdej próbki należy wykonać co najmniej trzy siatki. Nie zapomnij zamrozić pęsety przed włożeniem siatki. Zamroź pęsetę przed jej użyciem.

Szybko wyjmij kubek i przenieś zamrożone kratki do kriowialu za pomocą pęsety. Załóż nakrętkę z powrotem na kriowial. Powtórzyć operację dla każdej siatki każdej próbki.

Zamknij nakrętki i wymieszaj kriowial, aby upewnić się, że próbki znajdują się w pożywce do substytucji przez zamrożenie. Pozostaw kriowiale na trzy dni w zamrażarce o temperaturze minus 84 stopni. Przenoś kriowiale w polistyrenowej tacy, aby uniknąć nagłego wzrostu temperatury do zamrażarki o temperaturze minus 30 stopni.

Odstawić godzinę w temperaturze minus 30 stopni. Przenoś kriowia w temperaturze minus 15 stopni przez dwie godziny, a następnie umieść próbki w temperaturze czterech stopni przez dwie godziny i 30 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć pożywkę do zamrażania za pomocą plastikowych pipet transferowych i umieścić ją w odpowiedniej, wyraźnie oznaczonej butelce na odpady.

Umieść około 500 mikrolitrów 100% acetonu. Otwórz szklaną fiolkę i wymieszaj kriowial, a następnie szybko umieść pożywkę do substytucji zamrażania w szklanej fiolce. Opłucz jeden kriowial 100% acetonem.

Spłucz trzy razy po 10 minut 100% acetonem. Przenoś kriowiale w polistyrenowej tacy, aby uniknąć nagłego wzrostu temperatury do zamrażarki o temperaturze minus 30 stopni. Odstawić dwie godziny w temperaturze minus 30 stopni.

Po umieszczeniu próbek w fiolce z polipropylenu, zastąpić pożywkę do substytucji zamrażania świeżą pożywką do zamrażania i odstawić na dwie godziny w temperaturze minus 30 stopni. Płukać przez godzinę 100% acetonem i trzy razy po godzinie 100% etanolem. Metoda zamrażania wgłębnego/substytucji przez zamrożenie pozwoliła na doskonałe zachowanie wewnątrzkomórkowych struktur komórek zawiesinowych.

U Saccharomyces cerevisiae struktury nie są skurczone, a cytoplazma wydaje się gęsta. Co więcej, membrany są gładkie, co świadczy o dobrym zachowaniu. Wszystkie organelle, takie jak jądro, mitochondria i wakuole, można doskonale zidentyfikować.

Doskonałe zachowanie obserwuje się również w przypadku wici Leishmania, Trypanosoma brucei i Escherichia coli. W jądrze wyraźnie widoczna jest podwójna błona tworząca otoczkę jądrową, pory jądrowe, korpus bieguna wrzeciona i rybosomy przyczepione do zewnętrznej błony otoczki jądrowej. W mitochondriach wyraźnie widoczne są wgłębienia błony wewnętrznej, zwane cristae.

Krytycznymi organellami są wakuole, ponieważ duże kryształki lodu mogą się łatwo rozwijać. Na zdjęciu wakuole są doskonale zachowane bez uszkodzeń kryształów lodu. Metoda zamrażania wgłębnego/substytucji przez zamrożenie może być również stosowana do przeprowadzania immunolokalizacji białek.

Zabieg doskonale zachowuje antygenowość białek, a jak wspomniano wcześniej, organelle są wyraźnie zidentyfikowane. Różne przeciwciała zostały już przetestowane pod kątem celowania w różne białka drożdży, takie jak syntaza anty-ATP i anty-porine. Taki eksperyment jest również możliwy dla różnych układów eksperymentalnych, jak np. w Leishmania, gdzie białko flabaryny było zlokalizowane.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować próbki za pomocą metody zamrażania wgłębnego/substytucji zamrażania w celu ich wizualizacji w transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Ta technika jest szybka, łatwa w użyciu, tania i zapewnia doskonałą ochronę infrastruktury komórkowej. Uważaj na ciekły azot, ale szczególnie na tetratlenek osmu i octan uranylu.

Należy obchodzić się z nimi pod wyciągiem, nosząc odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym fartuch laboratoryjny i rękawice.