Name: Zamrażanie wgłębne: narzędzie do badań ultrastrukturalnych i immunolokalizacyjnych komórek zawiesinowych w transmisyjnej mikroskopii elektronowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 35 s
Description: Poznaj metodę zamrażania wgłębnego do badań ultrastrukturalnych i immunolokalizacyjnych komórek zawiesinowych w transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Technika zapewnia doskonałą preservację struktur komórkowych przy niskich kosztach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wyrażamy naszą wdzięczność M. Bouchecareilhowi, E. Tétaud, S. Duvezin-Caubet, oraz A. Devinowi za ich pomoc i komentarze do manuskryptu. Jesteśmy wdzięczni operatorowi elektronicznego systemu obrazowania w Centrum Obrazowania w Bordeaux, w którym wykonano zdjęcia. Prace te były wspierane przez Centre National de la Recherche Scientifique.

1. Przygotowanie filmu Formvar Grid
UWAGA: Wykonaj manipulację chloroformem pod wyciągiem za pomocą środków ochrony osobistej (rękawice, fartuch laboratoryjny, okulary). Użyj miedzianych siatek mikroskopii elektronowej o siatce 400. W przypadku innych typów siatek (inne rozmiary oczek, siatki złote i niklowe) jakość zamrażania jest gorsza.
<ol>
	<li>Przygotować 100 ml roztworu 0,3% formwaru w chloroformie. Pozostaw do rozpuszczenia przez noc bez mieszania.</li>
	<li>Umieść 400 siatek (liczba otworów na cal kwadratowy)mikroskopia elektronowasiatki miedziane (średnica 3,05 mm) w szklanej fiolce (wysokość 3 cm i średnica 2 cm) zawierającej aceton. Wymieszać szklaną fiolkę okrężnymi ruchami ręki. Usuń aceton za pomocą plastikowej pipety transferowej. Pozostawić rozpuszczalnik do odparowania na 5 minut. Przenieś kratki, wylewając je na bibułę filtracyjną i pozostaw do wyschnięcia na 5 minut.</li>
	<li>Wypoleruj szkiełko o wymiarach 76 x 26 mm2, przecierając je niestrzępiącą się szmatką, aż będzie błyszczące/śliskie.</li>
	<li>Weź krystalizator (średnica 15 cm, wysokość: 7 cm i pojemność 1200 ml) i napełnij go po brzegi wodą destylowaną. Oczyść powierzchnię wody, dwukrotnie przesuwając szklaną listwę po powierzchni, aby usunąć kurz.</li>
	<li>Trzymaj szkiełko między dwoma palcami i zanurz je w roztworze formvar na kilka sekund. Trzymaj go pionowo do wyschnięcia pod odwróconą zlewką przez 5 minut.</li>
	<li>Gdy folia wyschnie, naciąć krawędzie szklanego szkiełka ostrą żyletką, aby określić granice folii, która ma zostać usunięta ze szkiełka.</li>
	<li>Weź głęboki wdech i mocno wydychaj powietrze na szkiełko, aby warstwa pary wodnej znalazła się na folii i pod nią, aby folia była lekko nieprzezroczysta i poprawiła jej widoczność.
	<ol>
		<li>Natychmiast wypuść folię na powierzchnię wody krystalizatora, dotykając dna szkiełka pod kątem około 30°. Pozwól, aby folia uwolniła się od szkiełka i oderwij ją od powierzchni wody krystalizatora. W razie potrzeby delikatnie ściągnij folię pęsetą.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Delikatnie połóż kratki stroną do dołu na folii unoszącej się na powierzchni wody w obszarach o odpowiedniej grubości (około 10 nm) i bez zmarszczek.</li>
	<li>Podnieś folię, przykrywając siatki papierem Joseph, gdy unoszą się na powierzchni wody krystalizatora.
	<ol>
		<li>Trzymając jedną ręką papier Józefa, przyłóż jeden koniec papieru Józefa do jednego końca folii. Poczekaj, aż papier Josepha będzie całkowicie mokry. Wyjmij papier Joseph z przyklejonymi kratkami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść kratki na 24 godziny na przykrytej szalce Petriego w celu ostatecznego wysuszenia i przechowywania przed użyciem w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
2. Przygotowanie podłoża do zamrażania
UWAGA: Tetroksynek osmu (OsO4) i octan uranylu są niebezpiecznymi substancjami chemicznymi. Należy obchodzić się z nimi pod wyciągiem, nosząc odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE), w tym fartuch laboratoryjny i rękawice. Postępuj zgodnie z ostrzeżeniami dotyczącymi obchodzenia się z (OsO4) i octanem uranylu. Użyj kriowialiów O-ring, aby uniknąć wycieku OsO4.
<ol>
	<li>Badania ultrastrukturalne
	<ol>
		<li>Umieścić szklaną ampułkę OsO4 w szklanej kolbie.</li>
		<li>Rozbić ampułkę, potrząsając kolbą.</li>
		<li>Dodać odpowiednią objętość acetonu 100%, aby uzyskać 4% stężenie końcowe.</li>
		<li>Wymieszaj i dozuj 1,5 ml porcji do 1,8 ml kriowialiów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Znakowanie immunologiczne białek
	<ol>
		<li>Umieścić 0,05 g octanu uranylu w szklanej kolbie.</li>
		<li>Dodaj 50 ml 100% acetonu.</li>
		<li>Wymieszać roztwór za pomocą mieszadła magnetycznego. Gdy roztwór stanie się klarowny, przefiltruj go za pomocą filtra 0,2 μm.</li>
		<li>Dozować 1,5 ml porcji do 1,8 ml kriowialików. 
		UWAGA: Przed procesem zamrażania wgłębnego należy przygotować kriowiale zawierające pożywkę do zamrażania przez zamrożenie i przechowywać je w zamrażarce o temperaturze -84 °C. Odwrócić szklaną kolbę, aby wyrzucić ampułkę OsO4 wraz z odpadami niebezpiecznymi.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie komórek
UWAGA: Ten krok jest kluczowy dla powodzenia metody. Dla wszystkich typów komórek hoduj komórki, aby uzyskać wskazaną liczbę komórek. Odwirować we wskazanej probówce o określonej porze i prędkości.
<ol>
	<li>Aby uzyskać odpowiednią konsystencję granulek z różnych typów komórek, hoduj komórki w następujący sposób:
	<ol>
		<li>W przypadku Saccharomyces cerevisiae i Schizosaccharomyces pombe należy zaszczepić drożdże w 5 ml minimalnej lub pełnej płynnej pożywki. Inkubować przez noc w temperaturze 28 °C, obracając się (180 obr./min). Zmierzyć gęstość optyczną przy 600 nm (OD600) kultury przez noc. Rozcieńczyć komórki drożdży do OD600 0,2 w 50 ml świeżej pożywki selektywnej. Kontynuuj inkubację komórek w temperaturze 28 °C, obracając się, aby uzyskać 1 x 109 komórek drożdży7.</li>
		<li>W przypadku wici Leishmania należy zaszczepić pasożyty w 5 ml pożywki AM z 7,5% FCS (płodowa surowica cielęca). Inkubować przez noc w temperaturze 24 °C, obracając się (180 obr./min). Zmierz OD600 w nocnej hodowli. Rozcieńczyć komórki pasożyta do OD600 0,2 w 50 ml świeżej pożywki selektywnej. Kontynuuj inkubację komórek w temperaturze 24 °C, obracając się, aby uzyskać 5 x 108 komórek pasożyta12.</li>
		<li>W przypadku Trypanosoma brucei należy zaszczepić pasożyty w 5 ml pożywki SDM-79 z 10% FCS i 30 μg/ml higromycyny. Inkubować przez noc w temperaturze 27 °C, obracając się (180 obr./min). Zmierz OD600 w nocnej hodowli. Rozcieńczyć komórki pasożyta do OD600 0,2 w 50 ml świeżej pożywki selektywnej. Kontynuuj inkubację komórek w temperaturze 27 °C, obracając się, aby uzyskać 5 x 108 komórek pasożyta13.</li>
		<li>W przypadku Escherichia coli należy zaszczepić bakterie w 5 ml pożywki DYT za pomocą 100 μg/ml ampicyliny. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C, obracając się (180 obr./min). Zmierz OD600 w nocnej hodowli. Rozcieńczyć komórki bakteryjne do OD600 0,2 w 50 ml świeżej pożywki selektywnej. Kontynuuj inkubację komórek w temperaturze 37 °C, obracając się, aby uzyskać 5 x 1010 komórek bakteryjnych14. 
		UWAGA: Po całonocnej inkubacji komórki w hodowli mogą znajdować się w logarytmicznej lub stacjonarnej fazie wzrostu. Bardzo wolno rosnące szczepy komórkowe mogą wymagać inkubacji dłuższej niż jedna noc lub inokulacji większej liczby komórek, jak określono empirycznie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dla wszystkich typów komórek przenieść pożywkę hodowlaną zawierającą komórki do probówki polipropylenowej o pojemności 50 ml i odwirować przez 3 minuty przy 1 500 x g.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad wszystkich typów komórek w 1 ml odpowiedniej pożywki do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Odwirować wszystkie typy komórek w probówce do mikrowirówek przez 1 minutę przy 3 900 x g. Całkowicie usunąć supernatant.</li>
	<li>Utrzymuj komórki na lodzie.</li>
</ol>
4. Skraplanie propanu
Uwaga: Z ciekłym azotem należy obchodzić się ostrożnie. Używaj środków ochrony osobistej, w tym rękawic kriogenicznych i gogli. Propan jest potencjalnie wybuchowy, dlatego skraplanie należy przeprowadzić w dobrze wentylowanym pomieszczeniu lub pod wyciągiem. Nie wolno używać otwartego ognia.
<ol>
	<li>Umieść około 150 ml ciekłego azotu w tacce styropianowej. Umieść mosiężny kubek (wysokość 3,6 cm, średnica 2 cm i grubość 1,5 mm) w ciekłym azocie, aby go zamrozić. Nie pozwól, aby ciekły azot wniknął do mosiężnego kubka.</li>
	<li>Poczekaj, aż bąbelki opadną, aby upewnić się, że mosiężny kubek jest zamrożony.</li>
	<li>Umieść wąż podłączony do butli z propanem w kontakcie z mosiężną ścianką kubka.</li>
	<li>Delikatnie otwórz zawór butli z propanem. 
	UWAGA: Na tym etapie propan skrapla się w mosiężnym kubku.</li>
	<li>Zatrzymaj skraplanie, zamykając zawór butli z propanem i szybko wyjmując wąż gazowy.</li>
	<li>Napełnij tackę styropianową ciekłym azotem do 5 mm od górnej części mosiężnego kubka. Nie pozwól, aby ciekły azot wniknął do mosiężnego kubka.</li>
</ol>
5. Zamrażanie próbki metodą wgłębną
<ol>
	<li>Umieść około 200 ml ciekłego azotu w tacce styropianowej. Zamroź małe mosiężne kubki (wysokość 1,5 cm, średnica 2,5 cm i grubość 1 mm), wkładając je do ciekłego azotu. Umieść jedną filiżankę na jedną próbkę komórki zawiesiny. Uważaj, aby nie mieszać próbek. W tym celu umieść próbkę 1 w filiżance 1, próbkę 2 w filiżance 2 itd.</li>
	<li>Zamroź pęsetę, zanurzając jej końcówkę w ciekłym azocie.</li>
	<li>Zanurz igłę preparacyjną o podwójnej krawędzi w granulce otrzymanej w 3,5.</li>
	<li>Za pomocą pęsety weź miedzianą siatkę mikroskopową o oczkach 400 pokrytą formvarem przygotowanym w sekcji 1.</li>
	<li>Za pomocą igły preparacyjnej umieść kroplę granulki uzyskanej w 3,5 na siatce. Wypróbuj różne wielkości kropli (np. 2, 5 i 10 μl).</li>
	<li>Bardzo szybko zanurz siatkę trzymaną przez pęsetę w ciekłym propanu wytworzonym w sekcji 4 i mieszaj siatkę okrężnymi ruchami przez kilka sekund.</li>
	<li>Szybko przenieś zamrożoną siatkę za pomocą pęsety do małego mosiężnego kubka zamrożonego w sekcji 5.1. 
	UWAGA: Dla każdej próbki wykonaj co najmniej 3 siatki. Zawsze zamrażaj pęsetę przed wzięciem miedzianej siatki.</li>
</ol>
6. Zamiana zamrożenia
UWAGA: Tetroxide osmu jest potencjalnie lotny, więc użyj respiratora oczyszczającego powietrze z wkładami oparowymi. Rozwiązaniem jest również zamrożenie utrwalacza w ciekłym azocie przed zamrożeniem wgłębnym.
<ol>
	<li>W celu przeprowadzenia badań ultrastrukturalnych otworzyć probówki kriowialne o pojemności 1,8 ml zawierające pożywkę do substytucji przez wymrażanie, przygotowane w sekcji 2.1. W celu przeprowadzenia badań immunolokalizacyjnych należy otworzyć probówki kriowialne o pojemności 1,8 ml zawierające pożywkę do substytucji przez zamrażanie, przygotowane w sekcji 2.2. Umieść nakrętkę na kriowialach.</li>
	<li>Zamroź pęsetę, zanurzając jej końcówkę w ciekłym azocie.</li>
	<li>Szybko zdejmij nakrętkę i przenieś zamrożone siatki do kriowiali za pomocą pęsety.</li>
	<li>Załóż nakrętkę z powrotem na kriowialisty.</li>
	<li>Powtórzyć operację dla każdej siatki każdej próbki.</li>
	<li>Zamknij wszystkie nakrętki i wymieszaj kriowiale okrężnymi ruchami ręki, aby upewnić się, że próbki znajdują się w pożywce do zamrażania.</li>
	<li>Umieść kriowiale w hermetycznym pudełku na 3 dni w zamrażarce o temperaturze -84 °C podczas procesu substytucji przez zamrożenie.</li>
</ol>
7. Ocieplenie próbki
<ol>
	<li>Badania ultrastruktury
	<ol>
		<li>Kriowiale należy przenieść w polistyrenowej tacce (aby uniknąć nagłego wzrostu temperatury) do zamrażarki o temperaturze -30 °C. Umieść je w zamrażarce w temperaturze -30 °C na 1 godzinę.</li>
		<li>Umieścić kriowiale w zamrażarce o temperaturze -15 °C na 2 godziny. Umieścić próbki w temperaturze 4 °C na 2 godziny, a następnie na 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Usunąć pożywkę podstawiania przez zamrażanie za pomocą plastikowej pipety transferowej. Dodać około 500 μl 100% acetonu.</li>
		<li>Wymieszać 1,8 ml kriowialu okrężnymi ruchami ręki i szybko wlać aceton (1,5 ml) zawierający kratki do szklanej fiolki (wysokość 3 cm i średnica 2 cm).</li>
		<li>Opłucz ten sam kriowial 1 ml 100% acetonu, aby upewnić się, że wszystkie siatki zostały przeniesione. Wymieszaj kriowial okrężnymi ruchami ręki i wlej zawartość kriowialu do szklanej fiolki.</li>
		<li>Przepłukać każdą szklaną fiolkę 3 ml 100% acetonu 3 razy przez 10 minut.</li>
		<li>Postępuj zgodnie z procedurami osadzania i dołączania zgodnie z opisem w reference15. Zaimpregnować próbkę rosnącym stężeniem żywicy epoksydowej w acetonie (25%, 50% i 75%) i zatopić próbkę w 100% żywicy epoksydowej w kapsułkach żelatynowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Badania znakowania immunologicznego
	<ol>
		<li>Kriowiale o pojemności 1,8 ml należy przenieść w tacce z polistyrenu (aby uniknąć nagłego wzrostu temperatury) do zamrażarki o temperaturze -30 °C.</li>
		<li>Umieść kriowiale na 2 godziny w zamrażarce o temperaturze -30 °C.</li>
		<li>W zamrażarce o temperaturze -30 °C wymieszać kriowial okrężnymi ruchami ręki i szybko wlać pożywkę do zamrażania do polipropylenowej fiolki (wysokość 5 cm i średnica 1,5 cm).</li>
		<li>Zastąp pożywkę do zamrażania 2 ml świeżej pożywki do zamrażania.</li>
		<li>Umieść fiolkę z polipropylenu na 2 godziny w zamrażarce w temperaturze -30°C.</li>
		<li>Przepłukać fiolkę z polipropylenu przez 1 godzinę 2 ml 100% acetonu i trzy razy przez 1 godzinę 2 ml 100% etanolu.</li>
		<li>Postępuj zgodnie z procedurami osadzania i dołączania zgodnie z opisem w reference15. Zaimpregnować próbkę rosnącym stężeniem żywicy akrylowej (25%, 50% i 75% acetonu) i zanurzyć próbkę w 100% żywicy akrylowej w kapsułkach żelatynowych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. Wizualizacja próbek
<ol>
	<li>Po zatopieniu należy wykonać ultracienkie skrawki próbek o długości fali 80 nm za pomocą ultramikrotomu. Porównaj skrawki z 2% cytrynianem ołowiu w temperaturze pokojowej przez 1 min15.</li>
	<li>Użyj mikroskopu elektronowego 80 kV lub 120 kV, aby obserwować sekcje15.</li>
</ol>

<ol><li>Palade, G. E., Porter, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+endoplasmic+reticulum.+I.+Its+identification+in+cells+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Studies on the endoplasmic reticulum. I. Its identification in cells in situ.</a> J Exp Med. 100 (6), 641-656 (1954).</li>
<li>Kellenberger, E., Johansen, R., Maeder, M., Bohrmann, B., Stauffer, E., Villiger, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artefacts+and+morphological+changes+during+chemical+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Artefacts and morphological changes during chemical fixation.</a> J Microsc. 168 (Pt 2), 181-201 (1992).</li>
<li>Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+high+pressure+frozen+samples%3A+bridging+the+gap+between+cellular+ultrastructure+and+atomic+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of high pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution.</a> Histochem Cell Biol. 130 (5), 877-889 (2008).</li>
<li>McDonald, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Out+with+the+old+and+in+with+the+new%3A+rapid+specimen+preparation+procedures+for+electron+microscopy+of+sectioned+biological+material%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Out with the old and in with the new: rapid specimen preparation procedures for electron microscopy of sectioned biological material.</a> Protoplasma. 251, 429-448 (2014).</li>
<li>Studer, D., Graber, W., Al-Amoudi, A., Eggli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+for+cryofixation+by+high-pressure+freezing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">A new approach for cryofixation by high-pressure freezing.</a> J Microsc. 203 (Pt 3), 285-294 (2001).</li>
<li>Bernales, S., McDonald, K. L., Walter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+counterbalances+endoplasmic+reticulum+expansion+during+the+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Autophagy counterbalances endoplasmic reticulum expansion during the unfolded protein response.</a> PLoS Biol. 4 (12), 2311-2324 (2006).</li>
<li>Kissová, I., Salin, B., Schaeffer, J., Bhatia, S., Manon, S., Camougrand, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+and+non-selective+autophagic+degradation+of+mitochondria+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Selective and non-selective autophagic degradation of mitochondria in yeast.</a> Autophagy. 3 (4), 329-336 (2007).</li>
<li>Gilkey, J. C., Staehling, A. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jemt.1060030206/abstract">Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure.</a> Microsc Res Tech. 3 (2), 177-210 (1986).</li>
<li>Nogales, E., Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM%3A+A+Unique+Tool+for+the+Visualization+of+Macromolecular+Complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM: A Unique Tool for the Visualization of Macromolecular Complexity.</a> Mol Cell. 58 (4), 677-689 (2015).</li>
<li>Baba, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy in yeast.</a> Methods Enzymol. 451, 133-149 (2008).</li>
<li>Leunissen, J. L. M., Yi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-pressurized+rapid+freezing+%28SPRF%29%3A+a+novel+cryofixation+method+for+specimen+preparation+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Self-pressurized rapid freezing (SPRF): a novel cryofixation method for specimen preparation in electron microscopy.</a> J Microsc. 235 (1), 25-35 (2009).</li>
<li>Lefebvre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LdFlabarin+a+new+BAR+domain+membrane+protein+of+Leishmania+flagellum%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">LdFlabarin a new BAR domain membrane protein of Leishmania flagellum.</a> PLoS One. 8 (9), 1-12 (2013).</li>
<li>Tetaud, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TbFlabarin%2C+a+flagellar+protein+of+Trypanosoma+brucei%2C+highlights+differences+between+Leishmania+and+Trypanosoma+flagellar-targeting+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Parasitol%22%5BJournal%5D)">TbFlabarin, a flagellar protein of Trypanosoma brucei, highlights differences between Leishmania and Trypanosoma flagellar-targeting signals.</a> Exp Parasitol. 166, 97-107 (2016).</li>
<li>Wasmer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-state+NMR+spectroscopy+reveals+that+E+coli+inclusion+bodies+of+HET-s%28218-289%29+are+amyloids%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Solid-state NMR spectroscopy reveals that E coli inclusion bodies of HET-s(218-289) are amyloids.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 48 (26), 4858-4860 (2009).</li>
<li>Lefebvre-Legendre, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failure+to+assemble+the+alpha+3+beta+3+subcomplex+of+the+ATP+synthase+leads+to+accumulation+of+the+alpha+and+beta+subunits+within+inclusion+bodies+and+the+loss+of+mitochondrial+cristae+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Failure to assemble the alpha 3 beta 3 subcomplex of the ATP synthase leads to accumulation of the alpha and beta subunits within inclusion bodies and the loss of mitochondrial cristae in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Biol Chem. 280 (18), 18386-18389 (2005).</li>
<li>Paumard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ATP+synthase+is+involved+in+generating+mitochondrial+cristae+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The ATP synthase is involved in generating mitochondrial cristae morphology.</a> EMBO J. 21 (3), 221-230 (2002).</li>
<li>Gabriel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Fox2-dependent+fatty+acid+%C3%9F-oxidation+pathway+coexists+both+in+peroxisomes+and+mitochondria+of+the+ascomycete+yeast+Candida+lusitaniae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A Fox2-dependent fatty acid ß-oxidation pathway coexists both in peroxisomes and mitochondria of the ascomycete yeast Candida lusitaniae.</a> PLoS One. 9 (12), 1-27 (2014).</li>
<li>Dubochet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physics+of+rapid+cooling+and+its+implications+for+cryoimmobilization+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The physics of rapid cooling and its implications for cryoimmobilization of cells.</a> Methods Cell Biol. 79, 7-21 (2007).</li>
<li>Meryman, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+living+cells%3A+principles+and+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of living cells: principles and practice.</a> Transfusion. 47 (5), 935-945 (2007).</li>
<li>Vanhecke, D., Graber, W., Studer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Close-to-native+ultrastructural+preservation+by+high+pressure+freezing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Close-to-native ultrastructural preservation by high pressure freezing.</a> Methods Cell Biol. 88, 151-164 (2008).</li>
<li>Bobik, K., Dunlap, J. R., Burch-Smith, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+high-pressure+freezing+and+quick+freeze+substitution+of+plant+tissues+for+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution of plant tissues for transmission electron microscopy.</a> J Vis Exp. (92), e51844(2014).</li>
<li>Pinan-Lucarré, B., Clavé, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+autophagy+in+the+filamentous+fungus+Podospora+anserina%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Monitoring autophagy in the filamentous fungus Podospora anserina.</a> Methods Enzymol. 451, 251-270 (2008).</li>
<li>Follet-Gueye, M. L., Pagny, S., Faye, L., Gomord, V., Driouich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+chemical+fixation+method+suitable+for+immunogold+localization+of+green+fluorescent+protein+in+the+Golgi+apparatus+of+tobacco+Bright+Yellow+%28BY-2%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">An improved chemical fixation method suitable for immunogold localization of green fluorescent protein in the Golgi apparatus of tobacco Bright Yellow (BY-2) cells.</a> J Histochem Cytochem. 51 (7), 931-940 (2003).</li>
<li>Jesus, D. M., Moussatche, N., Condit, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+high+pressure+freezing+and+freeze+substitution+method+to+preserve+the+labile+vaccinia+virus+nucleocapsid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">An improved high pressure freezing and freeze substitution method to preserve the labile vaccinia virus nucleocapsid.</a> J Struct Biol. 195 (1), 41-48 (2016).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

TEM to potężna metoda obserwacji ultrastrukturalnej organelli, komórek i tkanek. Kriofiksacja/substytucja przez wymrażanie jest obecnie najlepszą metodą zachowania zarówno ultrastruktury, jak i antygenowości białek. Utrwalacze chemiczne wnikają i działają bardzo powoli, umożliwiając w ten sposób przegrupowania strukturalne przed całkowitą stabilizacją ultrastruktury2. I odwrotnie, kriofiksacja/substytucja przez zamrożenie natychmiast stabilizuje struktury komórkowe4. Techni...

Przygotowanie próbki jest kluczowe dla powodzenia każdego badania mikroskopowego elektronowego. Konwencjonalna fiksacja EM była podstawową metodą utrwalania tkanek lub komórek w transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM)1. Po pierwsze, aldehydy i tetratlenek osmu są używane do chemicznego utrwalania materiału w temperaturze pokojowej. Następnie materiał jest odwadniany rozpuszczalnikami organicznymi, infiltrowany i zatapiany w żywicy epoksydowej. Ta metoda jest zależna od szybkości przenikania utrwalików do komórki. W związku z tym zwykle obserwuje się artefakty i ekstrakcję zawartości komórkowej2.
Kriofiksacja jest zdecydowanie lepszą alternatywą dla zachowania struktur komórkowych3, zachowując je w stanie nienaruszonym. Najwyższą jakość obrazów TEM4 w cienkich skrawkach żywicy można uzyskać metodą kriofiksacji/substytucji przez zamrożenie. Celem tej techniki jest uzyskanie zeszklonych próbek biologicznych bez tworzenia się kryształków lodu lub zawierających kryształki lodu na tyle małe, aby nie uszkodzić ultrastruktury komórek. Zamrażanie wysokociśnieniowe (HPF) i ultraszybka kriofiksacja, która jest również nazywana zamrażaniem wgłębnym (PF), to dwie metody kriofiksacji próbek. HPF natychmiast unieruchamia cząsteczki w komórce i pozwala uniknąć uszkodzeń spowodowanych konwencjonalnym utrwalaniem EM. Opracowano kilka typów zamrażarek i automatycznych urządzeń zastępczych5. Zamrażarki i materiały eksploatacyjne (ciekły azot, nośniki próbek itp.) są drogie, ale pozwalają na wytwarzanie wysokiej jakości mikrofotografii elektronowych6,7. PF to technika, która była używana na początku lat pięćdziesiątych XX wieku i jest opisywana w literaturze jako prosta i tania8. Podczas procedury PF przygotowana próbka jest zamrażana w szybkim tempie w celu uzyskania kryształków lodu o wielkości mniejszej niż 3 do 5 nm. W tym celu próbkę zanurza się w ciekłym kriogenie, takim jak etan, propan lub mieszanina etanu i propanu. Od 1950 roku wprowadzono ulepszenia PF, aby uczynić tę technikę dostępną dla większej liczby użytkowników. Zamrażanie wysokociśnieniowe jest obecnie jedynym realnym sposobem zamrażania dużej liczby próbek grubszych niż 50 μm (do grubości 200 μm dla próbek w kształcie dysku)5, podczas gdy PF jest szeroko stosowany do obrazowania małych obiektów (<100 nm), takich jak kompleksy makromolekularne zawieszone w cienkiej warstwie amorficznego lodu9. Większe próbki, na przykład komórki eukariotyczne, mogą być kriofiksowane przez PF, ale wymagają uchwytów na próbki, takich jak kapilarne rurki miedziane lub systemy warstwowe8,10,11. 
Tutaj prezentowana jest szybka, łatwa w użyciu i tania technologia zamrażania/zamrażania przez zamrożenie, która jest używana do różnych hodowli komórek zawiesinowych.

<table><tbody><tr><td>Siatki</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>T400-Cu</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopia elektronowa</td><td>Formvar</td> Nauki <td>15800</td><td></td></tr><tr><td>Propan N35</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ciekły azot</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Igła preparcyjna z podwójną</td><td>krawędzią Nauki o mikroskopii elektronowej</td><td>72947</td><td></td></tr><tr><td>Kriowiale</td><td>Nauki o mikroskopii elektronowej</td><td>61802-02</td><td></td></tr><tr><td>Tetroksynek osmu</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>19130</td><td></td></tr><tr><td>Szklana fiolka 8,5 ml</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>64252</td><td></td></tr><tr><td>Octan uranylu</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>48851</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Sigma</td><td>32201</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 100%</td> <td>Sigma</td><td>32221</td><td></td></tr><tr><td>Szkło </td><td>Prowadnice VWR international</td><td>631-9439</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Żywica akrylowa</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>104371</td><td></td></tr><tr><td>Żywica epoksydowa M</td><td>Sigma</td><td>10951</td><td></td></tr><tr><td>Żywica epoksydowa M utwardzacz</td><td>Sigma</td><td>10953</td><td></td></tr><tr><td>Ftalan dibutylu&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>80102</td><td></td></tr><tr><td>Żywica epoksydowa M akceler</td><td>Sigma</td><td>10952</td><td></td></tr><tr><td>Krystalizator</td><td>Fischer scientific</td><td>08-762-9</td><td></td></tr><tr><td>Papier Joseph</td><td>VWR international</td><td>111-5009</td><td></td></tr><tr><td>Kubki mosiężne</td><td></td><td></td><td>zrób to sam sklep lub wykonane samodzielnie</td></tr><tr><td>Saccharomyces cerevisiae</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shizosacharomyces cerevisiae</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypanosoma brucei</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leishmania amazonensis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hermetyczne pudełko</td><td>Fischer scientific</td><td>7135-0001&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Maska oczyszczająca powietrze</td><td>Fischer scientific</td><td>3M 7502&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Wkład do respiratora</td><td>Fischer scientific</td><td>3M 6001</td><td></td></tr><tr><td>Filtr cząstek stałych</td><td>Fischer scientific</td><td>3M 5N11&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

zamrażanie wgłębne: narzędzie do badań ultrastrukturalnych i immunolokalizacyjnych komórek zawiesinowych w transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

Transmisyjna Mikroskopia Elektronowa (TEM) jest niezwykłym narzędziem do badania ultrastruktury komórek, w celu lokalizacji białek i wizualizacji kompleksów makromolekularnych w bardzo wysokiej rozdzielczości. Jednak, aby zbliżyć się jak najbardziej do stanu rodzimego, wymagane jest doskonałe zachowanie próbki. Na przykład konwencjonalna fiksacja za pomocą mikroskopii elektronowej (EM) za pomocą aldehydów nie zapewnia dobrego zachowania ultrastrukturalnego. Powolna penetracja utrwalaczy indukuje reorganizację komórek i utratę różnych składników komórek. Dlatego konwencjonalne utrwalanie EM nie pozwala na natychmiastową stabilizację i zachowanie struktur i antygenowości. Najlepszym wyborem do badania zdarzeń wewnątrzkomórkowych jest zastosowanie kriofiksacji, a następnie metody utrwalania przez zamrożenie, która utrzymuje komórki w ich naturalnym stanie. Zamrażanie/zamrażanie pod wysokim ciśnieniem, które zachowuje integralność ultrastruktury komórkowej, jest najczęściej stosowaną metodą, ale wymaga drogiego sprzętu. W tym miejscu przedstawiono łatwą w użyciu i tanią metodę utrwalania przez zamrażanie, a następnie substytucję przez zamrożenie w hodowlach komórek zawiesinowych.

W niniejszym artykule przedstawiono łatwą w użyciu i niskokosztową metodę mrożenia szokowego (plunge freezing) do badań ultrastrukturalnych (Rycina 1 i Rycina 2) oraz immunoznakowania (Rycina 3). Wykazujemy, że do procedury substytucji zamrażania nie jest wymagany specjalistyczny sprzęt, a procedura ogrzewania trwa mniej niż 6 h, w przeciwieństwie do 24 h w przypadku użycia dedykowanego systemu.
...

Ten manuskrypt opisuje łatwą w użyciu i tanią metodę kriofiksacji do wizualizacji komórek zawiesinowych za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Zamrażanie wgłębne: narzędzie do badań ultrastrukturalnych i immunolokalizacyjnych komórek zawiesinowych w transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

Celem poniższych eksperymentów jest zaproponowanie narzędzia do badań ultrastrukturalnych i immunolokalizacyjnych komórek zawiesinowych do wizualizacji w transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Ta technika jest łatwa w użyciu, tania i zapewnia doskonałe zachowanie struktury komórkowej. Jest to hodowla komórek zawiesinowych.Najpierw komórki są zbierane przez różne wirowania w celu uzyskania osadu w probówce mikrowirówkowej. W drugim etapie próbka jest szybko zamrażana przez zamrażanie wgłębne, które unieruchamia komórki i ogranicza tworzenie się kryształków lodu. Następnie przeprowadza się substytucję przez zamrażanie w celu zastąpienia wody rozpuszczalnikiem zawierającym tetratlenek osmu jako utrwalacz stabilizujący struktury komórkowe.Wyniki pokazują, że zamrażanie wgłębne i substytucja przez zamrażanie doskonale zachowują infrastrukturę komórek. Utrwalanie chemiczne było podstawową metodą utrwalania tkanek lub komórek w transmisyjnej mikroskopii elektronowej, ale dzięki tej metodzie zwykle obserwuje się artefakty i ekstrakcję zawartości komórkowej. Alternatywą dla utrwalania chemicznego jest kriofiksacja.Metoda ta stanowi najlepszy wybór do uzyskania najwyższej jakości morfologii

plunge-freezing-tool-for-ultrastructural-immunolocalization-studies

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przedstawiamy tutaj sposób wykorzystania kriotomografii elektronowej (ECT) do badania ultrastruktury komórek bakteryjnych w stanach zbliżonych do naturalnych, z rozdzielczością „makrocząsteczkową” (~4 nm).

Kriotomografia elektronowa komórek bakteryjnych

Aby zachować procesy neuronalne do analizy ultrastrukturalnej, opisujemy protokół posiewu pierwotnych neuronów na siatkach mikroskopii elektronowej, po którym następuje błyskawiczne zamrażanie, co daje próbki zawieszone w warstwie lodu szklistego. Próbki te można badać za pomocą mikroskopu krioelektronowego w celu wizualizacji struktur w skali nanometrowej.

Przygotowanie neuronów pierwotnych do wizualizacji neurytów w stanie zamrożono-uwodnionym za pomocą tomografii krioelektronowej

Opisano podstawowe techniki i udoskonalenia przetwarzania próbek biologicznych i nanomateriałów do badania metodą zamrażania i pękania za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Technika ta jest preferowaną metodą ujawniania cech ultrastrukturalnych i specjalizacji błon biologicznych oraz uzyskiwania danych wymiarowych i przestrzennych na poziomie ultrastrukturalnym w materiałoznawstwie i produktach nanotechnologii.

Podstawowe elementy techniczne zamrażania-pękania/wytrawiania przez zamrożenie w biologicznej mikroskopii elektronowej

Uzyskanie wysokiej jakości obrazów z transmisyjnej mikroskopii elektronowej jest wyzwaniem, szczególnie w przypadku komórek roślinnych, które mają obfite duże wakuole wypełnione wodą i napowietrzone przestrzenie. Tandemowe zamrażanie wysokociśnieniowe i szybkie zastępowanie przez zamrażanie znacznie skracają czas przygotowania próbek roślinnych do TEM, jednocześnie wytwarzając próbki o doskonałej konserwacji ultrastrukturalnej.

Tandemowe zamrażanie wysokociśnieniowe i szybkie zamrażanie podstawiania tkanek roślinnych do transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Opracowaliśmy nowatorską technikę w mikroskopii elektronowej, "flash-and-freeze", która umożliwia wizualizację dynamiki membrany z rozdzielczością czasową ms. Technika ta łączy optogenetyczną stymulację neuronów z zamrażaniem pod wysokim ciśnieniem. W tym miejscu demonstrujemy procedury i szczegółowo opisujemy protokoły.

Flash-and-Freeze: nowatorska technika uchwycenia dynamiki membrany za pomocą mikroskopii elektronowej

Prezentowany tutaj jest protokół hodowli komórek na membranach z azotku krzemu i zamrażania wgłębnego przed obrazowaniem fluorescencji rentgenowskiej za pomocą synchrotronowej kriogenicznej nanosondy rentgenowskiej. Gdy zapewniona jest tylko nanoanaliza w temperaturze pokojowej, zamrożone próbki można dalej liofilizować . Są to kluczowe kroki w celu uzyskania informacji na temat wewnątrzkomórkowego składu pierwiastków.

Hodowla komórkowa na membranach z azotku krzemu i kriopreparatyka do nanoanalizy synchrotronowej fluorescencji rentgenowskiej

Tutaj przedstawiono protokół opisujący etapy przygotowania próbki i zbierania danych wymagane w kriogenicznej tomografii rentgenowskiej (SXT) do obrazowania ultrastruktury całych komórek kriokonserwowanych w rozdzielczości połowy tonu 25 nm.

Kartograficzny opis 3D komórki za pomocą kriomiękkiej tomografii rentgenowskiej

Tutaj pokazujemy, jak używać urządzenia do zamrażania kanapek do szybkiego zamrażania próbek biologicznych, w tym bakterii, drożdży, hodowanych komórek, izolowanych komórek, tkanek zwierzęcych i ludzkich oraz wirusów. Pokazujemy również, jak przygotować próbki do ultracienkiego cięcia po szybkim zamrożeniu.

Szybkie zamrażanie za pomocą urządzenia do zamrażania kanapkowego w celu dobrego ultrastrukturalnego zachowania próbek biologicznych w mikroskopii elektronowej

Ten manuskrypt przedstawia metodę ręcznego zamrażania próbek biologicznych do kriogenicznej mikroskopii elektronowej z pojedynczymi cząstkami.

Ręczne zamrażanie próbek biologicznych metodą blot and plunge do kriogenicznej mikroskopii elektronowej pojedynczych cząstek

Tutaj prezentujemy proces frezowania wiązki jonów z korelacją 3D, który kieruje przygotowaniem próbek komórkowych do tomografii krioelektronowej. Pozycja 3D fluorescencyjnie znakowanych białek będących przedmiotem zainteresowania jest najpierw określana za pomocą mikroskopii kriofluorescencyjnej, a następnie kierowana do mielenia. Protokół jest odpowiedni dla komórek ssaków, drożdży i bakterii.

Przygotowanie próbki za pomocą korelacyjnego mielenia wiązki jonów w 3D do tomografii krioelektronowej o wysokiej rozdzielczości

Ten protokół wideo ilustruje, jak wykonać skaningową tomografię elektronową mikroskopii transmisyjnej na próbkach wirusologicznych. Dla optymalnych rezultatów próbki przygotowuje się przez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem i późniejszą podstawienie zamrożenia.

Skaningowa transmisyjna tomografia elektronowa w wirusologii: obrazowanie 3D próbek zamrożonych i zamrożonych pod wysokim ciśnieniem

Poznaj metodę zamrażania wgłębnego do badań ultrastrukturalnych i immunolokalizacyjnych komórek zawiesinowych w transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Technika zapewnia doskonałą preservację struktur komórkowych przy niskich kosztach.

Zamrażanie wgłębne: narzędzie do badań ultrastrukturalnych i immunolokalizacyjnych komórek zawiesinowych w transmisyjnej mikroskopii elektronowej (Wideo) | JoVE Journal

Zamrażanie wgłębne: narzędzie do badań ultrastrukturalnych i immunolokalizacyjnych komórek zawiesinowych w transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Przeglądaj więcej filmów