Name: Pomiar azotynów i azotanów, metabolitów na szlaku tlenku azotu, w materiałach biologicznych metodą chemiluminescencji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Naucz się mierzyć azotyny i azotany w próbkach biologicznych metodą chemiluminescencji z użyciem roztworów redukujących. Ta technika umożliwia śledzenie metabolizmu tlenku azotu z wysoką czułością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować za krytyczny wkład dr A. Dejama i M. M. Pelletiera w rozwój zastosowania roztworu konserwującego azotyny do pomiarów azotynów we krwi.

Wszystkie protokoły, w tym wykorzystanie zwierząt, zostały zatwierdzone do użytku przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt NIDDK, a ludzka krew została pobrana z banku krwi NIH od zdrowych dawców.
1. Przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworu konserwującego azotyny
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór zawierający 890 mM żelazocyjanku potasu (K3Fe(CN)6) i 118 mM NEM (N-etylomaleimidu) w wodzie destylowanej. Dobrze rozpuścić, aż stanie się jasnożółty bez kryształów. Dodać NP-40 (oktylofenoksylopolietylenoksyetanol) w stosunku 1:9 (v/v, NP-40/roztwór). Delikatnie wymieszać, aby uniknąć pienienia się i przechowywać w temperaturze 4 °C przez około tydzień).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobieranie i przygotowanie próbek krwi
	<ol>
		<li>Pobrać krew za pomocą igły o sile co najmniej 20 G, aby uniknąć hemolizy z heparyną zapobiegającą krzepnięciu (5 U/ml). W przypadku próbki krwi pełnej należy natychmiast zmieszać krew z roztworem konserwującym azotyny w stosunku 1:4 (v/v roztwór/krew).</li>
		<li>W przypadku próbek osocza i krwinek czerwonych należy odwirowywać pobraną krew przez 5 minut w temperaturze 4 000 x g w temperaturze 4 °C w celu oddzielenia krwinek czerwonych (RBC) i osocza. Pobrać supernatant (osocze) i wymieszać go z roztworem konserwującym azotyny, jak opisano powyżej, w celu oznaczenia poziomu azotynów w osoczu.</li>
		<li>Ostrożnie usunąć resztki osocza i kożucha z próbki i odpipetować próbkę RBC z dna probówki, aby uniknąć zanieczyszczenia innymi typami krwinek, za pomocą odciętej końcówki pipety, a następnie przenieść ją do probówki zawierającej roztwór konserwujący azotyny w takim samym stosunku jak powyżej.</li>
		<li>Każdą próbkę (osocze i erytrocyty) zmieszać z zimnym metanolem w stosunku 1:1 lub 1:2 (v/v próbka/metanol) i odwirować je w temperaturze 13 000 x g w temperaturze 4 °C przez 15 minut w celu wytrącenia białek. Pobrać supernatant i użyć go do pomiaru azotynów lub w razie potrzeby zamrozić przygotowane próbki na suchym lodzie i przechowywać w temperaturze -80 °C. 
		nuta: Azotyn szybko reaguje z oksyhemoglobiną (oxyHb) we krwi, tworząc azotan. Ponieważ oxyHb jest zawsze obecny w dużym nadmiarze nad azotynami, reakcja ta prowadzi do prawie całkowitego unicestwienia natywnego azotynu krwi w czasie ~ 10 min. Aby zachować większość endogennych azotynów krwi, roztwór zachowujący azotyny dodaje się do próbek krwi pełnej natychmiast po pobraniu krwi. Roztwór szybko ziści czerwone krwinki i utleniają oxyHb do methemoglobiny (metHb), nieaktywnej formy hemoglobiny, która nie reaguje chemicznie z azotynami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie próbek z innych rodzajów płynów ustrojowych
	<ol>
		<li>Po pobraniu próbki do odpowiedniego pojemnika dobrze wymieszać z roztworem konserwującym azotyny, odbiałizować i natychmiast odmierzyć lub zamrozić i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobieranie i przygotowanie próbek tkanek
	<ol>
		<li>Pobrać tkanki od zwierząt poddanych fuzji roztworem soli fizjologicznej (10 j. heparyny/ml). Wyciąć około 1 g pożądanej tkanki i homogenizować za pomocą homogenizatora ręcznego lub homogenizatora automatycznego.</li>
		<li>W razie potrzeby dodać znaną ilość roztworu konserwującego azotyny, aby uzyskać gładką jednorodność.</li>
		<li>Po homogenizacji tkanek wytrącić białka za pomocą zimnego metanolu (stosunek 1:1 lub 1:2 v/v próbka/metanol), jak opisano powyżej, a następnie odwirować próbki przy 13 000 x g w temperaturze 4 °C przez 15 minut.</li>
		<li>Zbierz supernatant i zmierz poziom azotynów. W razie potrzeby próbki należy zamrozić na dowolnym etapie przygotowania na suchym lodzie i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworów redukujących
<ol>
	<li>Roztwór redukujący tri-jodek (I3) do oznaczania azotynów i R-(X)-NO1,3,4
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór 301 mM KI razem z 138 mM I2 roztworem w wodzie. Mieszać z lodowatym kwasem octowym w stosunku 2:7 (v/v roztwór/kwas) na mieszadle magnetycznym przez ~ 30 min, aż wszystkie kryształy się rozpuszczą. Najlepiej przechowywać w ciemnej butelce, ponieważ jodek jest wrażliwy na światło, i zużyć w ciągu tygodnia od przygotowania. 
		nuta: To rozwiązanie zredukuje azotyny do NO, a także uwolni NO z grup funkcyjnych R-SNO, R-NNO i Fe-NO (R-(X)-NO), ale nie wpłynie to na azotany. Sygnał z powyższych grup funkcyjnych opartych na NO można oddzielić od prawdziwego sygnału azotynowego poprzez potraktowanie połowy próbki zakwaszonym sulfanilamidem (AS) i porównanie sygnału traktowanego i nietraktowanego ZA. AS nieodwracalnie tworzy kation diazonium z azotynami, a kompleks ten nie może być zredukowany przez roztwór I3. Do leczenia AS należy przygotować 290 mM roztwór sulfanilamidu w 1 M HCl i dodać go do podwielokrotności próbki w stosunku 1:9 (v/v AS/próbkę). Zmierzyć sygnał CL w częściach próbki poddanych działaniu AS i niepoddanych obróbce. Obliczyć rzeczywisty sygnał azotynów jako różnicę między częścią próbki poddaną działaniu AS i niepoddanej działaniu substancji ZA. Azotyny można również mierzyć przy użyciu selektywnego roztworu mieszaniny kwasu askorbinowego i octowego, redukującego azotyny, jak opisano w części 2.2. Jednak ze względu na zwykle niewielką ilość obecnych gatunków R-(X)-NO, pomiary przy użyciu próbek niepoddanych działaniu substancji czynnej są w większości przypadków bardzo dobrym przybliżeniem całkowitej zawartości azotynów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kwas askorbinowy / kwas octowy (4A) roztwór do selektywnego oznaczania azotynów2
	<ol>
		<li>Przygotuj 500 mM kwasu askorbinowego w wodzie. Roztwór ten należy zmieszać z lodowatym kwasem octowym w stosunku 1:7 (v/v, kwas askorbinowy / kwas octowy) w celu przygotowania mieszaniny reakcyjnej. 
		nuta: Roztwór ten jest specyficzny dla azotynów, nie uwalnia NO z żadnych gatunków R-(X)-NO ani azotanów. Jednak roztwór kwasu askorbinowego i octowego musi być przygotowywany na świeżo każdego dnia przed pomiarami, ponieważ kwas askorbinowy łatwo utlenia się w roztworze. 
		Zakończenie redukcji azotynów zależy od stężenia kwasu askorbinowego; i co najmniej 50 mM kwasu askorbinowego jest zalecane do całkowitej redukcji azotynów w osoczu. Zaleca się jednak przeprowadzenie kilku eksperymentów pilotażowych z różnymi stężeniami wzorców kwasu askorbinowego i azotynów w oczekiwanym zakresie stężeń azotynów przed pomiarami próbki końcowej. Należy pamiętać, że kwas askorbinowy nieznacznie ubywa podczas pomiarów, dlatego zaleca się częste zmiany mieszaniny reakcyjnej w szklanej komorze reakcyjnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Roztwór redukujący chlorek wanadu(III) do oznaczania azotanów9
	<ol>
		<li>Przygotować 51 mM roztwór VCl3 w 1 M HCl. Przefiltrować roztwór przez filtr 200 μm i przechowywać w ciemnej butelce, zużyć w ciągu dwóch tygodni. 
		nuta: Roztwór ten zmniejszy ilość azotanów, azotynów i wszystkich gatunków R-(X)-NO, więc jeśli porównywalne ilości azotynów lub innych gatunków R-(X)-NO są obecne razem z azotanem, końcową zawartość azotanów należy obliczyć jako różnicę między sygnałami CL uzyskanymi za pomocą roztworów redukującychVCl 3 i I3</li>.
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Konfiguracja i pomiary analizatora chemiluminescencji (CL)
<ol>
	<li>Roztwór wzorcowy
	<ol>
		<li>Przygotować 1 μM roztwór azotynu sodu (NaNO2). Ten sam roztwór można zastosować do oznaczania azotynów i azotanów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Korzystanie z analizatora NO 
	nuta: Obecnie na rynku dostępne są dwa analizatory NO, które są wystarczająco czułe do celów badań biologicznych - Sievers NOA i Ecophysics CLD 88Y. Oba działają na tej samej zasadzie; główna różnica polega na tym, że CLD 88Y wykorzystuje tlen z powietrza w pomieszczeniu do wytwarzania ozonu (O3), podczas gdy NOA wymaga do tego celu zewnętrznego zbiornika tlenu. Poniższa procedura opisuje konfigurację dla Sievers NOA.
	<ol>
		<li>Konfiguracja instrumentu
		<ol>
			<li>Przeprowadzić wstępną konfigurację analizatora NO zgodnie z zaleceniami producenta, jak pokazano na rysunku 1.</li>
			<li>Otwórz zbiornik Ø2 podłączony do przyrządu. Wybierz "analiza" i "enter" z menu głównego na panelu przednim. Na następnym ekranie wybierz "start" i naciśnij "enter". Podłącz pułapkę kwasu (zawierającą 1 M NaOH) do przyrządu, jak pokazano na rysunku 1.</li>
			<li>Poczekaj, aż fotopowielacz ostygnie do temperatury poniżej -12 °C, a komora reakcyjna zostanie opróżniona do 6 Torr. Osiągnięcie stabilnej płaskiej linii podstawowej zajmuje około 30 minut. Linia podstawowa musi ustabilizować się w zakresie 1 - 2 mV, jej wartość nominalna jest mniej ważna niż jej stabilność. 
			nuta: W przypadku pomiaru azotanów włączyć łaźnię chłodzącą (ustawioną na 4 °C, która służy jako wymrażarka dla kwasów i par wodnych) i łaźnię wodną do ogrzewania (główna komora reakcyjna, 95 °C). Szybkość redukcji azotanu do NO w roztworze VCl3 jest zależna od temperatury i jest bardzo powolna w temperaturze pokojowej, dlatego do obserwacji reakcji potrzebny jest znaczny wzrost temperatury.</li>
			<li>Otwórz zbiornik He i podłącz szklaną komorę reakcyjną do pułapki kwasu, jak pokazano na rysunku 1. Napełnić komorę reakcyjną odpowiednim roztworem redukcyjnym, zredukować bulgotanie do minimum i podłączyć komorę reakcyjną do pułapki kwasu. Korzystając metodą prób i błędów, dostosuj szybkość bulgotania He do szybkości ssania instrumentu (zwykle ~ 200 ml / min dla NOA Sieversa).</li>
			<li>Włącz komputer sterujący urządzeniem i uruchom oprogramowanie Liquid oparte na Labview. Aby włączyć komunikację między instrumentem a oprogramowaniem akwizycyjnym, naciśnij "enter" w "menu danych", aż na ekranie pojawi się "wyjście włączone", a następnie naciśnij "wyczyść", aby powrócić do ekranu danych.</li>
			<li>Poczekaj, aż na ekranie pojawi się stabilny ślad linii podstawowej i rozpocznij wstrzykiwanie próbek i wzorców azotynów do roztworu redukującego przez przegrodę. Zawsze czekaj, aż osiągniesz stabilny poziom bazowy po szczycie. Może to potrwać do 2 minut. Oprogramowanie Liquid ma opcję "oznaczania" czasów wstrzykiwania i adnotacji do wstrzyknięcia, a następnie eksportuje te komentarze do osobnego pliku (filename.info) jako użyteczne uzupełnienie pliku danych (nazwa_pliku.data).</li>
			<li>Po zmierzeniu próbek i wzorców wybierz opcję "stop" w menu oprogramowania Liquid — spowoduje to zapisanie danych z pliku tymczasowego do stałego pliku znanego jako "nazwa_pliku.data". Wciśnięcie opcji "abort" spowoduje zakończenie pomiaru bez zapisywania pozyskanych danych do trwałego pliku.</li>
			<li>Aby zakończyć eksperyment, odłącz maszynę od naczynia reakcyjnego, wyłączając zawór odcinający na górze naczynia reakcyjnego i odłącz rurkę między pułapką kwasu a naczyniem reakcyjnym (patrz rysunek 1). Teraz zatrzymaj analizator NOA - naciśnij "wyczyść", przejdź do "analizy", przełącz maszynę w tryb "czuwania" i "potwierdź" czuwanie. Przy regularnym użytkowaniu przyrząd można pozostawić w trybie czuwania na kilka tygodni. Wyłącz dopływ tlenu. Następnie wypłukać roztwór redukujący z komory reakcyjnej, odłączyć i zamknąć zbiornik He ze szklanego naczynia reakcyjnego i zakończyć czyszczenie naczynia reakcyjnego.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wzorce i iniekcje próbek
		<ol>
			<li>Wstrzyknąć 50 μl 1 μM roztworu azotynów do mieszaniny reakcyjnej za pomocą dobrze umytej strzykawki Hamiltona. Należy odczekać co najmniej 1 - 2 minuty między wstrzyknięciami, aby uzyskać dobre oddzielenie pików. Powtórz wstrzykiwanie 50 μl, aby uzyskać duplikaty do każdego punktu danych. Po każdym wstrzyknięciu należy umyć strzykawkę wodą dejonizowaną.</li>
			<li>Aby uzyskać pełny zestaw danych dla krzywej wzorcowej, należy kontynuować podwójne wstrzykiwania 100, 150 μl (dodatkowe 200 μl może być potrzebne, jeśli spodziewane są wysokie stężenia azotynów lub azotanów) roztworu azotynów 1 μM. W każdym przypadku należy poczekać, aż sygnał spadnie z powrotem do linii bazowej, a następnie uzyskać 1-2 minuty linii bazowej, aby uzyskać dobrą separację pików. 
			nuta: Wzorce azotynów można mierzyć w dowolnym momencie podczas eksperymentów. Zaleca się jednak uzyskanie krzywej wzorcowej przed pomiarem danych, ponieważ służy ona również do niezależnego sprawdzenia funkcjonalności przyrządu. 
			Po zebraniu danych ilość wstrzykniętej próbki powinna prowadzić do dobrze zaznaczonych pików. Należy jednak pamiętać, że fotopowielacz jest liniowy tylko do ~800 mV, więc żaden z pików nie powinien być wyższy niż ~700 mV. Można to osiągnąć poprzez zmniejszenie ilości wstrzykiwanej próbki lub rozcieńczenie próbki wodą dejonizowaną. Każdy punkt powinien być mierzony co najmniej dwukrotnie.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Piknova, B., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+Nitrite+in+Blood+Samples+Using+the+Ferricyanide-Based+Hemoglobin+Oxidation+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Measurement of Nitrite in Blood Samples Using the Ferricyanide-Based Hemoglobin Oxidation Assay.</a> Methods Mol Biol. 704, 39-56 (2011).</li>
<li>Nagababu, E., Rifkind, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+plasma+nitrite+by+chemiluminescence+without+interference+of+S-%2C+N-nitroso+and+nitrated+species%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Measurement of plasma nitrite by chemiluminescence without interference of S-, N-nitroso and nitrated species.</a> Free Radic Biol Med. 42, 1146-1154 (2007).</li>
<li>Pinder, A. G., Rogers, S. C., Khalatbari, A., Ingram, T. E., James, P. E. The measurement of nitric oxide and its metabolites in biological samples by ozone-based chemiluminescence. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPinder%2C+AG+%22Methods+in+Molecular+Biology%2C+Redox-Mediated+Signal+Transduction%22">Methods in Molecular Biology, Redox-Mediated Signal Transduction</a>. Hancock, J. T. 476, Humana press. Totowa, NJ. 11-28 (2008).</li>
<li>Pelletier, M. M., Kleinbongard, P., Ring-wood, L., Hito, R., Hunter, C. J., Schechter, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+measurement+of+blood+and+plasma+nitrite+by+chemiluminescence%3A+pitfalls+and+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">The measurement of blood and plasma nitrite by chemiluminescence: pitfalls and solutions.</a> Free Radic Biol Med. 41, 541-548 (2006).</li>
<li>Mac Arthur, P. H., Shiva, S., Gladwin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+circulating+nitrite+and+S-nitrosothiols+by+reductive+chemiluminescence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B%22%5BJournal%5D)">Measurement of circulating nitrite and S-nitrosothiols by reductive chemiluminescence.</a> J Chromatogr B. 851, 93-105 (2007).</li>
<li>Bryan, N. S., Grisham, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+detect+nitric+oxide+and+its+metabolites+in+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Methods to detect nitric oxide and its metabolites in biological samples.</a> Free Radic Biol Med. 43, 645-657 (2007).</li>
<li>Hendgen-Cotta, U., Grau, M., Rasaaf, T., Gharinin, P., Kelm, M., Kleinbongard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductive+gas-phase+chemiluminescence+and+flow+injection+analysis+for+measurement+of+nitric+oxide+pool+in+biological+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Method+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Reductive gas-phase chemiluminescence and flow injection analysis for measurement of nitric oxide pool in biological matrices.</a> Method Enzymol. 441, 295-315 (2008).</li>
<li>Yang, B. K., Vivas, E. X., Reiter, C. D., Gladwin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodologies+for+the+sensitive+and+specific+measurement+of+S-nitrosothiols%2C+iron-nitrosyls+and+Nitrite+in+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Res%22%5BJournal%5D)">Methodologies for the sensitive and specific measurement of S-nitrosothiols, iron-nitrosyls and Nitrite in biological samples.</a> Free Radic Res. 37, 1-10 (2003).</li>
<li>Smárason, A. K. 1, Allman, K. G., Young, D., Redman, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+levels+of+serum+nitrate%2C+a+stable+end+product+of+nitric+oxide%2C+in+women+with+pre-eclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Obstet+Gynaecol%22%5BJournal%5D)">Elevated levels of serum nitrate, a stable end product of nitric oxide, in women with pre-eclampsia.</a> Br J Obstet Gynaecol. 104 (5), 538-543 (1997).</li>
<li>Beckman, J. S., Congert, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Measurement+of+Dilute+Nitric+Oxide+in+Solution+with+an+Ozone+Chemiluminescent+Detector%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%3A+A+companion+to+Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Direct Measurement of Dilute Nitric Oxide in Solution with an Ozone Chemiluminescent Detector.</a> Methods: A companion to Methods in Enzymology. 7, 35-39 (1995).</li>
<li>Bates, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+measurements+by+chemiluminescence+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroprotocols%3A+A+companion+to+Methods+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide measurements by chemiluminescence detection.</a> Neuroprotocols: A companion to Methods in Neuroscience. 1, 141-149 (1992).</li>
</ol>

Dr Alan Schechter jest wymieniony jako współwynalazca kilku patentów wydanych dla National Institutes of Health na stosowanie soli azotynów w leczeniu chorób sercowo-naczyniowych. Otrzymuje tantiemy na podstawie licencji NIH na te patenty na rozwój kliniczny, ale nie otrzymuje żadnego innego wynagrodzenia.

Kluczowe kroki w ramach protokołu
Podwielokrotności wszystkich roztworów (w tym wody) użytych do przygotowania, rozcieńczenia lub innej obróbki oryginalnych próbek muszą zostać zachowane i sprawdzone pod kątem ewentualnego zanieczyszczenia azotynami lub (częściej) azotanami. Odkryliśmy, że większość zanieczyszczeń pochodzi z wody, a wiele chemikaliów stosowanych do obróbki próbki (w szczególności żelazocyjanek) zawiera również znaczne ilości zanieczyszczeń azotanami w niektórych partiach, co zakł...

Azotyny, a w mniejszym stopniu poziomy azotanów we krwi odzwierciedlają ogólny stan metabolizmu organizmu. Stężenia azotynów we krwi i większości narządów i tkanek są tylko w wysokim zakresie nanomolowym lub nisko mikromolowym, azotany są zwykle obecne w znacznie większych ilościach - w zakresie mikromolowym. Zmiany poziomu azotynów spowodowane postępem choroby lub zmianami w nawykach żywieniowych są dość małe i można je zmierzyć tylko przy użyciu bardzo czułej metody. Ze względu na ich bardzo różne poziomy i różne procesy metaboliczne, niezbędne jest oddzielne oznaczanie poziomów azotynów i azotanów. Tak zwane "oznaczanie NOx", w którym azotyny i azotany są mierzone razem, ma bardzo małą wartość.
Opracowano kilka metod ilościowego oznaczania azotynów w różnych próbkach biologicznych — najczęstszą jest najstarsza, oparta na reakcji Griessa, która została pierwotnie opisana w 1879 roku. Nawet przy nowoczesnych modyfikacjach granica czułości azotynów osiągalna metodą Griessa mieści się w niskim zakresie mikromolowym. Chemiluminescencja (CL) w połączeniu z roztworem redukującym tri-jodek jest obecnie uważana za najbardziej czułą metodę, umożliwiającą kwantyfikację w niskim zakresie nanomolowym stężeń azotynów1-8,10,11. Ta sama metoda CL, w połączeniu z roztworem redukującym chlorek wanadu(III), może być stosowana do czułych pomiarów azotanów, z precyzją w zakresie nanomolowym9.
CL wykrywa wolne gazy NO. W związku z tym azotyny, azotany, R-nitrozotiole (R-SNO), R-nitrozoaminy (R-NNO) lub związki metal-NO (w dalszej części manuskryptu określane jako "R-(X)-NO") muszą zostać przekształcone w wolny gaz NO w celu ilościowego określenia ich pierwotnych ilości za pomocą CL. Konwersję do NO uzyskuje się przy użyciu kilku różnych roztworów redukujących, w zależności od charakteru metabolitu NO. Po konwersji wolny gaz NO jest usuwany z naczynia reakcyjnego przez gaz nośny (He,N2 lub Ar) do komory reakcyjnej analizatora CL, w której ozon (O3) jest łączony z NO, tworząc dwutlenek azotu (NO2) w stanie aktywnym. Po powrocie do stanu podstawowego, NO2* emituje w podczerwieni, a wyemitowany foton jest wykrywany przez fotopowielacz (PMT) instrumentu CL. Natężenie emitowanego światła jest wprost proporcjonalne do stężenia NO w komorze reakcyjnej, co pozwala na obliczenie stężenia pierwotnych form przy użyciu odpowiednich krzywych kalibracyjnych.
W naszym protokole najpierw prezentujemy oznaczanie azotynów i azotanów na podstawie CL w najczęściej używanych warunkach klinicznych — we krwi i osoczu, a następnie omawiamy, jak oznaczać te jony w próbkach tkanek. Wyjaśniamy również szczegółowo, jak zachować pierwotne fizjologiczne stężenie azotynów w środowiskach reagujących z azotynami, takich jak krew i jej kompartmenty, osocze i czerwone krwinki.

<table><tbody><tr><td>żelazocyjanek potasu; K3Fe(CN)6</td><td>Sigma</td><td>702587</td><td></td></tr><tr><td>NEM; N-etylomaleimid</td><td>Sigma</td><td>4260</td><td></td></tr><tr><td>NP-40; Glikol 4-nonylofenylopolietylenowy</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>sulfanilamid; Jak&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9251</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>kwas octowy, lodowaty</td><td>Sigma</td><td>A9967</td><td></td></tr><tr><td>kwas askorbinowy&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A7506</td><td></td></tr><tr><td>jodek potasu; KI</td><td>Sigma</td><td>60399</td><td></td></tr><tr><td>jod; I2</td><td>Sigma</td><td>207772</td><td>światłoczuły, toksyczny</td></tr><tr><td>azotyn sodu; NaNO2</td><td>Sigma</td><td>563218</td><td></td></tr><tr><td>chlorek wanadu(III); VCl3</td><td>Sigma</td><td>208272</td><td>światłoczuły, toksyczny</td></tr><tr><td>GentleMac</td><td>Miltenyi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sievers NOA 280i</td><td>GE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CLD 88Y</td><td>&nbsp; Ekofizyka&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar azotynów i azotanów, metabolitów na szlaku tlenku azotu, w materiałach biologicznych metodą chemiluminescencji

Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method

Tlenek azotu (NO) jest jedną z głównych cząsteczek regulujących homeostazę naczyń krwionośnych, a także neuroprzekaźnikiem. Wytwarzany enzymatycznie NO jest utleniany do azotynów i azotanów w wyniku interakcji z różnymi białkami tlenowo-hemowymi i innymi, wciąż nieznanymi szlakami. Odwrotny proces, redukcja azotynów i azotanów do NO, został odkryty u ssaków w ciągu ostatniej dekady i zyskuje na popularności jako jedna z możliwych ścieżek zapobiegania lub łagodzenia całego szeregu zaburzeń sercowo-naczyniowych, metabolicznych i mięśniowych, które uważa się za związane ze zmniejszonym poziomem NO. Dlatego ważne jest, aby oszacować ilość NO i jego metabolitów w różnych przedziałach ciała - krwi, płynach ustrojowych i różnych tkankach. Krew, ze względu na jej łatwą dostępność, jest preferowanym komorem używanym do oznaczania metabolitów NO. Ze względu na krótki czas życia (kilka milisekund) i niskie stężenie subnanomolowe, bezpośrednie wiarygodne pomiary NO we krwi in vivo stanowią duże trudności techniczne. W związku z tym dostępność NO jest zwykle szacowana na podstawie ilości produktów utleniania, azotynów i azotanów. Te dwa metabolity są zawsze mierzone oddzielnie. Istnieje kilka dobrze znanych metod określania ich stężeń w płynach biologicznych i tkankach. W niniejszej pracy przedstawiono protokół dla metody chemiluminescencji (CL), opartej na spektrofotometrycznej detekcji NO po redukcji azotynów lub azotanów odpowiednio roztworami chlorku trijodku lub wanadu(III). Czułość wykrywania azotynów i azotanów mieści się w niskim zakresie nanomolowym, co sprawia, że CL jest obecnie najbardziej czułą metodą określania zmian w szlakach metabolicznych NO. Wyjaśniamy szczegółowo, jak przygotować próbki z płynów biologicznych i tkanek w celu zachowania oryginalnych ilości azotynów i azotanów obecnych w momencie pobierania oraz jak określić ich odpowiednie ilości w próbkach. Wyjaśniono również ograniczenia techniki CL.

Rysunek 2 przedstawia reprezentatywne wyniki uzyskane dla wzorców oraz pięciu różnych próbek. Jak pokazano na tym rysunku, napięcie fotopowielacza wzrasta natychmiast po wstrzyknięciu roztworu zawierającego azotyny (wzorców lub próbek) do roztworu redukującego (czasy wtryskiwania są zaznaczone czerwonymi strzałkami pod krzywą) i powraca do wartości linii bazowej po zredukowaniu wszystkich azotynów obecnych w wstrzykniętym roztworze. Z tego rysunku wynika również, że do uz...

Tlenek azotu (NO) jest ważną cząsteczką sygnałową w homeostazie naczyń krwionośnych. Produkcja in vivo NIE jest zbyt niska do bezpośredniego pomiaru. Chemiluminescencja dostarcza użytecznych informacji na temat cyklu NO poprzez pomiar jego prekursorów i produktów utleniania, azotynów i azotanów. Wyjaśniono oznaczanie azotynów / azotanów w tkankach i płynach ustrojowych.

Pomiar azotynów i azotanów, metabolitów na szlaku tlenku azotu, w materiałach biologicznych metodą chemiluminescencji

Nitric oxide (NO) is one of the main regulator molecules in vascular homeostasis and also a neurotransmitter. Enzymatically produced NO is oxidized into ...

Celem tego protokołu jest wykorzystanie chemiluminescencji do ilościowego oznaczania tlenku azotu w próbkach biologicznych poprzez ilościowe określenie poziomów azotynów i azotanów przy użyciu roztworów redukujących trijodek i chlorek wanadu. Protokół ten zapewnia potężne narzędzie do śledzenia metabolizmu i sygnalizacji tlenku azotu, zarówno regionalnie, jak i podłużnie z różnych próbek biologicznych. Główną zaletą tej techniki jest jej prostota i wysoka czułość.Tę procedurę zademonstruje Katelyn Cassel, nasza członkini IRTA. Pokaże nam, jak mierzyć azotyny metodą chemiluminescencji sprzężonej z roztworem trijodku. Na początek przygotuj roztwór konserwujący azotyny.Przygotować roztwór zawierający jeden żelazocyjanek potasu o stężeniu 118 milimolowym i żelazocyjanek potasu o masie 890 milimolowych w wodzie destylowanej. Rozpuścić ciała stałe, aż roztwór stanie się klarownożółty bez kryształów. Następnie dodać ten roztwór do NP 40 w stosunku 9 do 1 objętość do objętości.Delikatnie wymieszaj roztwór, aby uniknąć pienienia. Nigdy nie wiruj tej mieszaniny. Roztwór konserwujący azotyny można stosować przez około tydzień, jeśli jest przechowywany w temperaturze 4 stopni Celsjusza.Protokół może być stosowany na wielu świeżo uzyskanych próbkach biologicznych. W tym przypadku świeżo pobraną krew odwirowano w celu uzyskania próbki osocza do badań. Bardzo ważne jest, aby jak najszybciej przetworzyć krew lub wszelkie próbki biologiczne zawierające dużą ilość białek hemowych, takich jak hemoglobina lub mioglobina, ponieważ białka hemowe będą reagować z azotynem i niszczyć azotyny.Teraz, aby zachować większość endogennego azotynu krwi, natychmiast wymieszaj osocze z roztworem zachowującym azotyny w stosunku 1 do 4 objętości. Na każdym etapie tego przygotowania próbkę można zamrozić na suchym lodzie. Aby odbiałczać próbkę, należy ją wymieszać z równą częścią zimnego metanolu.Następnie odwirować próbkę o sile 13000 G przez 15 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza, aby wytrącić białka. Weź supernatant i użyj go do pomiaru azotynów. W przypadku czułego pomiaru azotynów za najbardziej skuteczny uważa się roztwór redukujący trójjodek.Przygotowując go, upewnij się, że wszystkie kryształy się rozpuszczą. Roztwór należy przechowywać w ciemnej butelce i zużyć w ciągu tygodnia od przygotowania. Roztwór redukujący chlorek wanadu zapewnia największą precyzję pomiaru azotanów.Roztwór azotynów o stężeniu 1 mikromolowym służy do oznaczania krzywej wzorcowej dla azotynów, a także azotanów. Skonfiguruj analizator tlenku azotu zgodnie z instrukcją producenta. Najpierw otwórz zbiornik tlenu, włącz przyrząd i podłącz go do pułapki kwasowej, która zawiera jeden molowy wodorotlenek sodu.Następnie otwórz zbiornik helu, a następnie podłącz szklaną komorę reakcyjną do zbiornika helu. Teraz załaduj komorę reakcyjną roztworem trójjodku do pomiaru azotynów. Dodaj środek przeciwpieniący.Dostosuj natężenie przepływu gazu, aby spowolnić bulgotanie. A następnie podłącz pułapkę kwasu do komory reakcyjnej. Metodą prób i błędów wyreguluj przepływ helu w prawo, aby dopasować go do ssania instrumentu.Teraz uruchom płynne oprogramowanie oparte na programowaniu wizualnym. Najpierw włącz komunikację między instrumentem a oprogramowaniem akwizycyjnym z menu Dane, a następnie z menu głównego na panelu przednim rozpocznij analizę. Poczekaj, aż chłodnica fotopowielacza ostygnie poniżej minus 12 stopni Celsjusza i fotopowielacz się ustabilizuje.Po około 30 minutach linia bazowa ustabilizuje się z dokładnością do 1 lub 2 miliwoltów. Stabilność wartości jest krytyczna, a nie sama wartość. Po ustabilizowaniu się analizatora należy użyć dobrze umytej strzykawki Hamiltona do wstrzykiwania roztworów.Najpierw wstrzyknąć co najmniej trzy różne objętości 1 mikromolowego wzorca azotynów. Wstrzyknąć roztwory do roztworu redukującego przez przegrodę. Wstrzyknąć każdy wzorzec lub próbkę dwukrotnie.Jeśli przewiduje się wysokie poziomy azotynów i próbki, należy rozważyć wstrzyknięcie dużej czwartej objętości wzorcowego roztworu azotynów w celu lepszego określenia nachylenia krzywej wzorcowej. Zawsze obserwuj wynik i poczekaj, aż analizator ponownie ustabilizuje się do linii podstawowej przed wstrzyknięciem następnej próbki. Zajmuje to co najmniej minutę.Aby uzyskać dokładne wyniki, należy używać objętości próbek, które osiągają wartość szczytową poniżej 700 miliwoltów. Pomiędzy kolejnymi strzykawkami należy dokładnie umyć strzykawkę wodą dejonizowaną. Bardzo ważne jest dokładne umycie strzykawki.Po wykonaniu wszystkich pomiarów naciśnij opcję stop w oprogramowaniu. Dane zostaną automatycznie zapisane. Naciśnięcie przycisku abort spowoduje zakończenie pomiaru bez zapisywania danych.Zamknąć kurek odcinający na górze naczynia reakcyjnego i odłączyć rurkę łączącą pułapkę kwasu z naczyniem reakcyjnym. Po zakończeniu eksperymentu przełącz analizator w tryb czuwania. Naciśnij przycisk analizy na panelu głównym i potwierdź, że przechodzi w tryb czuwania.Następnie wyłącz dopływ tlenu. Odłącz rurkę od zbiornika O2 od pułapki kwasu. Następnie wypłukać roztwór trijodku za pomocą helu.Następnie zamknij i odłącz zbiornik helu od szklanego naczynia reakcyjnego. Na koniec wyczyść naczynie etanolem i wodą w razie potrzeby. Badanie wzorców wraz z próbkami osocza pokazuje, że natychmiast po ich wstrzyknięciu napięcie fotopowielacza wzrasta i wraca do linii podstawowej po zredukowaniu wszystkich azotynów, co może trwać nawet minutę.Aby określić ilościowo sygnał, na podstawie wzorców skonstruowano krzywą standardową, wykorzystując obszar pod szczytem skoku napięcia. Korzystając z krzywej standardowej, kwantyfikacja próbek była bardzo powtarzalna między ich zduplikowanymi iniekcjami. Chemiluminescencja jest uważana za złoty standard określania stężeń azotynów.Po opanowaniu granica czułości azotynów wynosi zaledwie dwadzieścia milimolów. Najważniejszą rzeczą w pracy z chemiluminescencją jest precyzja. Ze względu na wysoką czułość metody, każdy pojedynczy błąd będzie miał wpływ na efekt końcowy.Więc nie spiesz się i nie spiesz się. Po tym, jak ta technika została opracowana na początku 2000 roku, utorowała drogę naukowcom do zbadania szlaków metabolicznych tlenku azotu i dowiedzenia się, że niedobór tlenku azotu powoduje wiele chorób, zwłaszcza chorób sercowo-naczyniowych.

measuring-nitrite-nitrate-metabolites-nitric-oxide-pathway-biological

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Endogenna produkcja tlenku azotu (NO) reguluje szeroki wachlarz funkcji biologicznych. Coraz wyraźniej staje się jasne, że zaburzenia lub dysregulacja sygnalizacji opartej na NO są zaangażowane w wiele ludzkich chorób. Metody ilościowego oznaczania odpowiednich metabolitów NO mogą dostarczyć nowych diagnostycznych lub prognostycznych biomarkerów chorób ludzkich.

Techniki analityczne do badania bioaktywności tlenku azotu

Poziomy cząsteczki sygnalizacji komórkowej stanu zapalnego, tlenku azotu (NO), są powszechnie oznaczane za pomocą odczynnika Griess. W tym protokole stworzyliśmy zmodyfikowany test Griessa wykorzystujący żywą tkankę mózgową Drosophila w celu wykrycia wydzielania NO w prostej, wymiernej i wysoce powtarzalnej metodzie.

Nowatorskie badanie ilościowe poziomu tlenku azotu w odpowiedzi neurozapalnej na całej pulce

W tym artykule opisujemy dostosowaną, stosunkowo łatwą metodę wykorzystującą barwnik fluorescencyjny diaminofluoresceiny-2 dioctan (DAF-2DA) i dihydroetydyd (DHE) do jednoczesnego wykrywania i wizualizacji wewnątrz komórkowego tlenku azotu (NO) i anionu ponadtlenkowego (O2.−) w świeżo wyizolowanych nienaruszonych aortach mysiego modelu otyłości.

En Face Wykrywanie tlenku azotu i ponadtlenku w warstwie śródbłonka nienaruszonych tętnic

Poprzednie prace sugerują, że skład izotopowy atmosferycznych tlenków azotu może rozróżniać wpływ różnych źródeł w środowisku. Przedstawiamy zautomatyzowaną, mobilną, opartą na terenie metodę zapewniającą wysoką skuteczność zbierania atmosferycznej analizy izotopowej NOx dla N w rozdzielczości godzinowej.

Zautomatyzowany, mobilny system zbierania o wysokiej rozdzielczości do analizy izotopowej azotu NOx

Ten artykuł opisuje protokoły fumigacji tlenkiem azotu (NO) do zwalczania szkodników po zbiorach. Komory fumigacyjne przepłukuje się azotem (N2) w celu ustalenia warunków bardzo niskiego poziomu tlenu przed wstrzyknięciem NO. Na koniec komory przepłukuje sięN2 w celu rozcieńczenia NO przed wystawieniem produktów na działanie powietrza atmosferycznego, aby zapobiec narażeniu na NO2.

Procedury fumigacji laboratoryjnej w celu zwalczania szkodników gazowym tlenkiem azotu

α-hydroksylacja rakotwórczych nitrozoamin przez cytochrom P450s jest akceptowanym szlakiem metabolicznym, który wytwarza produkty pośrednie uszkadzające DNA, które powodują mutacje. Jednak nowe dane wskazują, że może dojść do dalszego utleniania do nitrozamidów. Opisujemy ogólną metodę wykrywania nitrozamidów wytwarzanych w wyniku katalizowanego in vitro metabolizmem nitrozoamin katalizowanym cytochromem P450.

Ogólna metoda wykrywania powstawania nitrozamidów w metabolizmie nitrozoamin in vitro przez cytochrom P450

Szczegółowo przedstawiono szereg metod do określania potencjalnego wskaźnika DNRA na podstawie 14analiz NH4+/15NH4+. NH4+ jest przekształcany wN2Ow kilku etapach i analizowany za pomocą kwadrupolowej chromatografii gazowej ze spektrometrią mas.

Pomiar potencjalnych szybkości dysymilacyjnej redukcji azotanów do amonu na podstawie 14analiz NH4+/15NH4+ poprzez sekwencyjną konwersję doN2O

Przedstawiamy protokoły dla trzech różnych metod homogenizacji czterech różnych grup mięśni szkieletowych tkanki mięśniowej szczura do pomiaru i porównania poziomów azotanów i azotynów. Ponadto porównujemy różne masy próbek, aby zbadać, czy wielkość próbki tkanki wpływa na wyniki homogenizacji.

Przygotowanie homogenatów mięśni szkieletowych szczurów do pomiarów azotanów i azotynów

Tutaj prezentujemy protokoły wykrywania tlenku azotu i jego biologicznie istotnych pochodnych za pomocą testów opartych na chemiluminescencji o wysokiej czułości.

Testy oparte na chemiluminescencji do wykrywania tlenku azotu i jego pochodnych z autooksydacji i związków nitrozowanych

Ten protokół opisuje metodę ilościowego określania produkcji tlenku azotu (NO) w kulturach nabłonka dróg oddechowych zróżnicowanych na granicy powietrze-ciecz (ALI) poprzez pomiar azotynów w sekretach wierzchołkowych za pomocą testu chemiluminescencyjnego opartego na trijodku.

Ocena produkcji tlenku azotu w kulturach ludzkich komórek nabłonkowych przewodów oddechowych zróżnicowanych na granicy powietrze-płyn

Naucz się mierzyć azotyny i azotany w próbkach biologicznych metodą chemiluminescencji z użyciem roztworów redukujących. Ta technika umożliwia śledzenie metabolizmu tlenku azotu z wysoką czułością.

Pomiar azotynów i azotanów, metabolitów na szlaku tlenku azotu, w materiałach biologicznych metodą chemiluminescencji

Przeglądaj więcej filmów