Pomiar azotynów i azotanów, metabolitów na szlaku tlenku azotu, w materiałach biologicznych metodą chemiluminescencji

Celem tego protokołu jest wykorzystanie chemiluminescencji do ilościowego oznaczania tlenku azotu w próbkach biologicznych poprzez ilościowe określenie poziomów azotynów i azotanów przy użyciu roztworów redukujących trijodek i chlorek wanadu. Protokół ten zapewnia potężne narzędzie do śledzenia metabolizmu i sygnalizacji tlenku azotu, zarówno regionalnie, jak i podłużnie z różnych próbek biologicznych. Główną zaletą tej techniki jest jej prostota i wysoka czułość.

Tę procedurę zademonstruje Katelyn Cassel, nasza członkini IRTA. Pokaże nam, jak mierzyć azotyny metodą chemiluminescencji sprzężonej z roztworem trijodku. Na początek przygotuj roztwór konserwujący azotyny.

Przygotować roztwór zawierający jeden żelazocyjanek potasu o stężeniu 118 milimolowym i żelazocyjanek potasu o masie 890 milimolowych w wodzie destylowanej. Rozpuścić ciała stałe, aż roztwór stanie się klarownożółty bez kryształów. Następnie dodać ten roztwór do NP 40 w stosunku 9 do 1 objętość do objętości.

Delikatnie wymieszaj roztwór, aby uniknąć pienienia. Nigdy nie wiruj tej mieszaniny. Roztwór konserwujący azotyny można stosować przez około tydzień, jeśli jest przechowywany w temperaturze 4 stopni Celsjusza.

Protokół może być stosowany na wielu świeżo uzyskanych próbkach biologicznych. W tym przypadku świeżo pobraną krew odwirowano w celu uzyskania próbki osocza do badań. Bardzo ważne jest, aby jak najszybciej przetworzyć krew lub wszelkie próbki biologiczne zawierające dużą ilość białek hemowych, takich jak hemoglobina lub mioglobina, ponieważ białka hemowe będą reagować z azotynem i niszczyć azotyny.

Teraz, aby zachować większość endogennego azotynu krwi, natychmiast wymieszaj osocze z roztworem zachowującym azotyny w stosunku 1 do 4 objętości. Na każdym etapie tego przygotowania próbkę można zamrozić na suchym lodzie. Aby odbiałczać próbkę, należy ją wymieszać z równą częścią zimnego metanolu.

Następnie odwirować próbkę o sile 13000 G przez 15 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza, aby wytrącić białka. Weź supernatant i użyj go do pomiaru azotynów. W przypadku czułego pomiaru azotynów za najbardziej skuteczny uważa się roztwór redukujący trójjodek.

Przygotowując go, upewnij się, że wszystkie kryształy się rozpuszczą. Roztwór należy przechowywać w ciemnej butelce i zużyć w ciągu tygodnia od przygotowania. Roztwór redukujący chlorek wanadu zapewnia największą precyzję pomiaru azotanów.

Roztwór azotynów o stężeniu 1 mikromolowym służy do oznaczania krzywej wzorcowej dla azotynów, a także azotanów. Skonfiguruj analizator tlenku azotu zgodnie z instrukcją producenta. Najpierw otwórz zbiornik tlenu, włącz przyrząd i podłącz go do pułapki kwasowej, która zawiera jeden molowy wodorotlenek sodu.

Następnie otwórz zbiornik helu, a następnie podłącz szklaną komorę reakcyjną do zbiornika helu. Teraz załaduj komorę reakcyjną roztworem trójjodku do pomiaru azotynów. Dodaj środek przeciwpieniący.

Dostosuj natężenie przepływu gazu, aby spowolnić bulgotanie. A następnie podłącz pułapkę kwasu do komory reakcyjnej. Metodą prób i błędów wyreguluj przepływ helu w prawo, aby dopasować go do ssania instrumentu.

Teraz uruchom płynne oprogramowanie oparte na programowaniu wizualnym. Najpierw włącz komunikację między instrumentem a oprogramowaniem akwizycyjnym z menu Dane, a następnie z menu głównego na panelu przednim rozpocznij analizę. Poczekaj, aż chłodnica fotopowielacza ostygnie poniżej minus 12 stopni Celsjusza i fotopowielacz się ustabilizuje.

Po około 30 minutach linia bazowa ustabilizuje się z dokładnością do 1 lub 2 miliwoltów. Stabilność wartości jest krytyczna, a nie sama wartość. Po ustabilizowaniu się analizatora należy użyć dobrze umytej strzykawki Hamiltona do wstrzykiwania roztworów.

Najpierw wstrzyknąć co najmniej trzy różne objętości 1 mikromolowego wzorca azotynów. Wstrzyknąć roztwory do roztworu redukującego przez przegrodę. Wstrzyknąć każdy wzorzec lub próbkę dwukrotnie.

Jeśli przewiduje się wysokie poziomy azotynów i próbki, należy rozważyć wstrzyknięcie dużej czwartej objętości wzorcowego roztworu azotynów w celu lepszego określenia nachylenia krzywej wzorcowej. Zawsze obserwuj wynik i poczekaj, aż analizator ponownie ustabilizuje się do linii podstawowej przed wstrzyknięciem następnej próbki. Zajmuje to co najmniej minutę.

Aby uzyskać dokładne wyniki, należy używać objętości próbek, które osiągają wartość szczytową poniżej 700 miliwoltów. Pomiędzy kolejnymi strzykawkami należy dokładnie umyć strzykawkę wodą dejonizowaną. Bardzo ważne jest dokładne umycie strzykawki.

Po wykonaniu wszystkich pomiarów naciśnij opcję stop w oprogramowaniu. Dane zostaną automatycznie zapisane. Naciśnięcie przycisku abort spowoduje zakończenie pomiaru bez zapisywania danych.

Zamknąć kurek odcinający na górze naczynia reakcyjnego i odłączyć rurkę łączącą pułapkę kwasu z naczyniem reakcyjnym. Po zakończeniu eksperymentu przełącz analizator w tryb czuwania. Naciśnij przycisk analizy na panelu głównym i potwierdź, że przechodzi w tryb czuwania.

Następnie wyłącz dopływ tlenu. Odłącz rurkę od zbiornika O2 od pułapki kwasu. Następnie wypłukać roztwór trijodku za pomocą helu.

Następnie zamknij i odłącz zbiornik helu od szklanego naczynia reakcyjnego. Na koniec wyczyść naczynie etanolem i wodą w razie potrzeby. Badanie wzorców wraz z próbkami osocza pokazuje, że natychmiast po ich wstrzyknięciu napięcie fotopowielacza wzrasta i wraca do linii podstawowej po zredukowaniu wszystkich azotynów, co może trwać nawet minutę.

Aby określić ilościowo sygnał, na podstawie wzorców skonstruowano krzywą standardową, wykorzystując obszar pod szczytem skoku napięcia. Korzystając z krzywej standardowej, kwantyfikacja próbek była bardzo powtarzalna między ich zduplikowanymi iniekcjami. Chemiluminescencja jest uważana za złoty standard określania stężeń azotynów.

Po opanowaniu granica czułości azotynów wynosi zaledwie dwadzieścia milimolów. Najważniejszą rzeczą w pracy z chemiluminescencją jest precyzja. Ze względu na wysoką czułość metody, każdy pojedynczy błąd będzie miał wpływ na efekt końcowy.

Więc nie spiesz się i nie spiesz się. Po tym, jak ta technika została opracowana na początku 2000 roku, utorowała drogę naukowcom do zbadania szlaków metabolicznych tlenku azotu i dowiedzenia się, że niedobór tlenku azotu powoduje wiele chorób, zwłaszcza chorób sercowo-naczyniowych.