Barwienie immunologiczne skrawków wypełnionych i przetworzonych biocytyną pod kątem markerów neurochemicznych

Celem tego protokołu jest przedstawienie skutecznej metody identyfikacji neuronów załatanych podczas zapisów elektrofizjologicznych przy użyciu biocytyny i barwienia immunologicznego w celu odzyskania morfologii przed ponownym barwieniem specyficznymi przeciwciałami w celu określenia tożsamości neurochemicznej. Tak więc ta metoda opisuje ważny krok potrzebny do zbadania różnorodności w strukturze i funkcji neuronów. Jest to niezbędne do zrozumienia ich roli w sieciach mózgowych.

Główną zaletą stosowania technik przetwarzania sekwencyjnego jest to, że eliminuje to utratę danych z powodu niemożności odzyskania morfologii. Pomaga to również w kierowaniu markerami neurochemicznymi, które mają być testowane w tych komórkach. Chociaż metoda ta jest opisana do morfologicznego odzyskiwania komórek w grubych skrawkach, może być również stosowana do cienkich odcinków oraz na wcześniej barwionych i montowanych próbkach.

Ogólnie rzecz biorąc, neutralne osoby, które są nowicjuszami w tej metodzie, mogą mieć trudności z ponownym uszczelnieniem somy podczas odłączania od komórki i mogą nie dać odpowiedniego czasu na udane napełnienie. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ do skutecznego wypełniania komórek biocytyną w celu odzyskania pełnej morfologii wymagane są określone techniki. Aby rozpocząć tę procedurę, w konfiguracji cęgów napięciowych należy zastosować małe, krótkie kroki napięcia za pomocą funkcji testu membrany w trybie kąpieli podczas zbliżania się do ogniwa.

Łatać na komórce, stosując odsysanie. Następnie utrzymuj komórkę na minus 70 miliwoltach. Zwróć uwagę na rozwój uszczelki gigaomowej.

Skompensuj pojemnościowe stany nieustalone, a następnie zastosuj kontrolowane ssanie za pomocą strzykawki lub ustami, aby uzyskać konfigurację całych komórek. Oszacuj pojemność całego ogniwa i rezystancję szeregową oraz zatrzymaj impulsy testowe membrany. Optymalna jest rezystancja szeregowa mniejsza niż 10 megaomów.

Zapewni to stworzenie warunków zapisu całej komórki, które umożliwią wypełnienie biocytyną. Po zakończeniu zapisów fizjologicznych przywróć konfigurację zacisku krosowego, powoli przesuwając pipetę rejestrującą małymi krokami, naprzemiennie w górę i na zewnątrz w trybie zacisku napięcia. Najważniejszym krokiem w osiągnięciu morfologicznego odzysku komórek jest zapewnienie ponownego uszczelnienia somy neuronalnej podczas odłączania pipety rejestrującej od komórki.

Korzystając z funkcji testu membranowego, zwizualizuj utratę pojemnościowych stanów nieustalonych i załamanie się reakcji prądowych na linię prostą, co wskazuje na ponowne uszczelnienie ogniwa i ustanowienie zewnętrznej łaty na końcu pipety. W międzyczasie utrzymywanie ogniwa w stanie zdepolaryzowanego potencjału ułatwi proces ponownego zamykania. Po odłączeniu pipety od celi należy utrzymać plasterek w komorze rejestrującej przez trzy do pięciu minut, aby zapewnić transport barwnika do dystalnych wyrostków dendrytycznych i aksonalnych.

Następnie przenieś plasterek na 24-dołkową płytkę zawierającą 4% PFA w celu utrwalenia. 24 do 48 godzin po utrwaleniu PFA, przenieś wszystkie utrwalone plastry do punktu zerowego jednego molowego PBS w celu przechowywania przed barwieniem immunologicznym. W tej procedurze myj tkanki trzy razy przez 10 minut każda w punkcie zerowym jednego molowca PBS.

Następnie zablokuj tkanki 10-procentową surowicą blokującą na godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie inkubuj skrawki w pierwszorzędowych przeciwciałach CB1R w temperaturze pokojowej przez noc, aby zidentyfikować ekspresję receptora kannabinoidowego typu 1. Następnie umyj skrawki mózgu trzy razy po 10 minut w 0,1 molowym PBS.

Streptawidyna i drugorzędowe przeciwciało przeciwko pierwszemu przeciwciału pierwszorzędowemu są dodawane do płytki studzienki i przechowywane przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie inkubuj skrawki w sprzężonym czerwonym barwniku streptawidyny w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc w ciemności, aby odsłonić biocytynę. Następnie umyj skrawki mózgu trzy razy po 10 minut każda w 0,1 molowym PBS.

Aby chronić kwitnienie i ułatwić ponowne barwienie w przyszłości, zamontuj sekcje na równomiernie rozmieszczonym nośniku montażowym. Uszczelnij krawędzie szkiełek nakrywkowych przezroczystym lakierem do paznokci. Na tym etapie usuń lakier do paznokci ze szklanego szkiełka za pomocą bawełnianego wacika z acetonu.

Ostrożnie usuń szkiełko nakrywkowe za pomocą kleszczyków z cienką końcówką i nałóż kilka kropelek 0,1 molowego PBS na sekcje. Bardzo ważne jest, aby nie uszkodzić tkanki procesowej podczas demontażu tkanki z wodnego podłoża montażowego. Ostrożnie usuń skrawki ze szkiełka za pomocą cienkiego pędzla i umyj je w 0,1 molowym PBS przez 24 do 48 godzin na wytrząsarce i trzymaj z dala od światła w czterech stopniach Celsjusza.

Aby zapewnić całkowite usunięcie podłoża montażowego, należy umyć sekcje raz do dwóch razy następnego dnia w 0,1 molowym PBS przez 10 minut za każdym razem. Następnie inkubować skrawki z drugim pierwszorzędowym przeciwciałem cholecystokininą przez jeden dzień. Umyj skrawki mózgu trzy razy po 10 minut w 0,1 molowym PBS.

Następnie wybarwić skrawki sprzężonym z fluoroforem drugorzędowym przeciwciałem przeciwko myszy. Upewnij się, że widma emisji wzbudzenia przeciwciała drugorzędowego nie pokrywają się ze streptawidyną i wcześniejszymi barwieniami immunofluorescencyjnymi. Następnie zamontuj sekcje w wodnym medium montażowym.

Uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego przezroczystym lakierem do paznokci. Po udanym wypełnieniu biocytyną i pierwszym procesie barwienia immunologicznego, struktura neuronalna może być wizualizowana i obrazowana, jak pokazano na obrazie konfokalnym uzyskanym przy 60-krotnym powiększeniu. Sekcja została również wybarwiona immunologicznie na CB1R wraz z biocytyną, a barwienie immunologiczne CB1R w biocytynie wyrażającej somę neuronalną jest wskazane przez grot strzałki.

Ten sam wycinek został przetworzony pod kątem immunoreaktywności CCK po tygodniu, a obraz pokazuje pomyślne odzyskanie znakowania immunologicznego CCK w kilku neuronach oznaczonych gwiazdką. Należy zauważyć, że komórka znakowana biocytyną wskazana przez grot strzałki nie wyrażała CCK. Połączony obraz paneli A, B i C pokazuje, że wszystkie trzy etykiety są solidnie wizualizowane, a nakładka między biocytyną a CB1R jest oczywista.

Obraz pokazuje, że drugi proces barwienia immunologicznego nie narusza sygnału z poprzedniego procesu barwienia. Morfologię komórki wypełnionej biocytyną uzyskano z obrazów konfokalnych przed tym barwieniem immunologicznym CCK. Co najważniejsze, oprócz somy i dendrytu można wizualizować aksony i obserwuje się wspólne znakowanie procesów aksonalnych znakowanych CB1R i biocytyną.

Próbując wykonać tę procedurę, ważne jest, aby celować w zdrowe komórki znajdujące się pod powierzchnią plasterka, aby uniknąć neuronów z przerwanymi procesami. A to może zagrozić odzyskaniu morfologii. Po opanowaniu, morfologiczne odzyskanie komórek wypełnionych biocytyną można niezawodnie uzyskać podczas rejestracji klamry krostowej.

Pomyślne wdrożenie techniki seryjnego barwienia immunologicznego poprawi efektywność odzyskiwania danych i ułatwi charakterystykę neuronów podczas standardowych nagrań z użyciem klamry. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skutecznie wykorzystywać komórki wypełnione biocytyną do odzyskiwania morfologii neuronów i określania markerów neurochemicznych.