Name: Barwienie immunologiczne skrawków wypełnionych i przetworzonych biocytyną pod kątem markerów neurochemicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Poznaj metodę barwienia immunologicznego neuronów wypełnionych biocytyną do odzyskiwania morfologii po rejestracjach elektrofizjologicznych. Technika umożliwia identyfikację markerów neurochemicznych w komórkach nerwowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować za wsparcie ze strony NIH/NINDS R01 NS069861 i NJCBIR CBIR14IRG024 dla VS.

1. Wypełnianie biocytiną podczas elektrofizjologii
UWAGA: Czytelnicy mogą zapoznać się z alternatywnymi źródłami dotyczącymi podstawowych technik rejestracji metodą patch-clamp oraz aparatury19-2, które nie zostały tutaj szczegółowo omówione. Kroki opisane w niniejszym materiale zakładają, że sprzęt i procedury do rejestracji patch-clamp zostały już przygotowane, a opis ograniczy się do szczegółów związanych z wypełnianiem biocytyną i późniejszym immunobarwieniem. Wszystkie eksperymenty opisane w niniejszym opracowaniu zostały przeprowadzone na szczurach.
<ol>
	<li>Używając wibratomu, przygotuj żywe przekroje mózgu z pożądanego obszaru o grubości 30 - 350 µm23.</li>
	<li>Przygotuj roztwór wewnętrzny zawierający 0,2% biocytyny, dodając 2 mg biocytyny do 1 mL roztworu wewnętrznego6. Dla uzyskania najlepszych wyników poddaj roztwór wewnętrzny sonikacji przez 10 - 15 min, aż biocytyna całkowicie się rozpuści. Następnie wprowadź roztwór wewnętrzny do strzykawki o objętości 1 mL wyposażonej w polipropylenowy filtr o rozmiarze porów 0,2 µm przymocowany do mikroładownika. Przechowuj tę strzykawkę wkładzie chłodzącym, aby zachować stabilność Mg-ATP i Na-GTP w roztworze wewnętrznym. 
	UWAGA: Roztwór wewnętrzny zawierający glukonian potasu (126 mM K-gluconate, 4 mM KCl, 10 mM HEPES, 4 mM Mg-ATP, 0,3 mM Na-GTP oraz 10 mM fosfokreatyny) jest optymalny dla odzyskania niektórych markerów neurochemicznych, w tym parwalbuminy, podczas znakowania immunologicznego. W naszym doświadczeniu stosowanie roztworów wewnętrznych opartych na cezie i chlorkach zmniejsza zdolność do odzyskania immunostainingu dla niektórych markerów neurochemicznych. Jako alternatywa dla biocytyny można zastosować neurobiotynę lub nieprzenikający do komórki, utrwalany, polarny marker łączący fluorofor Alexa Fluor z biocytyną.</li>
	<li>W podczerwonym kontraście interferencyjnym (DIC) zlokalizuj odpowiednią komórkę do rejestracji. Aby zminimalizować uszkodzenie aksonu, zbliż się do ciała komórki, opuszczając pipetę wzdłuż jego osi, korzystając z funkcji „approach” dostępnej w większości mikromanipulatorów. Przeprowadź rejestrację w konfiguracji whole-cell w podczerwonym kontraście interferencyjnym, stosując protokoły fizjologii patch-clamp19-2. 
	UWAGA: Unikaj zbliżania się do komórki z kierunku domniemanego aksonu, ponieważ spowoduje to jego przerwanie, co będzie widoczne jako pęcherzyk na przeciętym końcu (zielona strzałka na Rysunku 1). Ponadto unikaj stosowania wysokiego dodatniego ciśnienia w pipecie rejestrującej podczas zbliżania się do komórki, aby zminimalizować wyciek biocytyny, co skutkowałoby wysokim tłem barwienia.</li>
</ol>
<img alt="Obrazowanie neuronów z labelingiem biocytyną, trójwymiarowy układ współrzędnych, wynik mikroskopowy, skala 50 μm." src="/files/ftp_upload/54880/54880fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1. Sugerowana płaszczyzna podejścia do komórek w celu wypełnienia biocytyną. Obraz przedstawia wypełnienie komórki ziarnistej (GC) biocytyną podczas rejestracji, przetworzone w celu uwidocznienia biocytyny (na czerwono, przy użyciu streptawidyny sprzężonej z barwnikiem 594). Dendryty komórki ziarnistej są zorientowane w płaszczyźnie XY. Zwróć uwagę na przerwany akson komórki ziarnistej (zielona strzałka), spowodowany ruchem pipety w płaszczyźnie XY. Należy zauważyć, że optymalne jest podchodzenie do tego neuronu w płaszczyźnie XZ. Pasek skali: 50 µm.
<ol start="4">
	<li>W konfiguracji clampy napięciowej (voltage clamp), wyznacz pojemność całej komórki oraz oporność szeregową w odpowiedzi na krótkie (30 ms) skoki napięcia o niewielkiej amplitudzie (5 mV), korzystając z funkcji testu błony w trybie kąpieli (bath mode) w oprogramowaniu do akwizycji i analizy danych elektrofizjologicznych. Pozwoli to upewnić się, że ustanowiono warunki rejestracji whole-cell, umożliwiające wypełnienie komórki biocytyną.</li>
	<li>Przeprowadź rejestracje fizjologiczne w trybie clampy prądowej (current-clamp) lub napięciowej (voltage-clamp), zależnie od potrzeb. Optymalny minimalny czas rejestracji wynosi &gt;10 min w temperaturze 34 °C. 
	UWAGA: W przypadku badań prowadzonych w temperaturze pokojowej może być wymagany dłuższy czas rejestracji.</li>
	<li>Po zakończeniu rejestracji fizjologicznych przywróć konfigurację patch-clamp, powoli przesuwając pipetę rejestrującą małymi krokami, naprzemiennie w górę (wzdłuż osi Z) i na zewnątrz (wzdłuż osi X), w trybie clampy napięciowej.</li>
	<li>Jednocześnie monitoruj pojemność i oporność wejściową za pomocą funkcji „testu błony”, aby zaobserwować zanik przejściowych prądów pojemnościowych i spłaszczenie odpowiedzi prądowych do linii prostej, co wskazuje na ponowne zamknięcie komórki i utworzenie patcha typu outside-out na końcówce pipety. Utrzymywanie komórki przy potencjale zdepolaryzowanym (-40 mV) ułatwi proces ponownego zamknięcia. 
	UWAGA: Ta procedura usuwania komórki zazwyczaj zapewnia pełną regenerację somy i dendrytów. Nie przykładaj dodatniego ciśnienia do pipety rejestrującej podczas tej procedury ani podczas odłączania komórki od pipety. Wizualizacja somy rejestrowanej komórki w skrawku świadczy o pomyślnym rozłączeniu. Obecność szczątków komórkowych lub fragmentu błony na końcu odłączonej pipety zazwyczaj wskazuje na przemieszczenie somy i nie pozwoli na uzyskanie pełnej morfologii komórkowej.</li>
	<li>Po odłączeniu pipety od komórki, pozostaw skrawki w komorze rejestracyjnej na 3 - 5 min, aby zapewnić transport barwnika do dystalnych wypustek dendrytycznych i aksonalnych.</li>
	<li>Przenieś skrawki do płytki 24-dołkowej zawierającej 4% PFA w celu utrwalenia. 
	OSTRZEŻENIE: PFA jest rakotwórcze; należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym rękawice i maseczkę ochronną, aby uniknąć podrażnienia skóry i inhalacji. PFA jest łatwopalne i musi być przechowywane z dala od źródeł ognia. PFA nigdy nie wolno wylewać do odpływu; musi być ono zbierane jako odpad chemiczny. Utrwalanie w PFA musi odbywać się w obszarze oddzielonym od miejsc przygotowywania żywych skrawków, aby uniknąć zanieczyszczenia aparatury fizjologicznej, w tym pipet transferowych.</li>
	<li>Od 24 do 48 h po utrwaleniu w PFA przenieś skrawki do 0,1 M soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS) do przechowywania przed immunostainingiem. 
	UWAGA: Odzyskiwanie biocytyny i immunostaining przebiegają najlepiej, gdy są wykonywane wkrótce po utrwaleniu, choć barwienie przeprowadzone w ciągu 7 d od utrwalenia daje dobre wyniki. Skrawki mogą być przechowywane w PBS z dodatkiem 0,02 - 0,05% azotku sodu w przypadku barwienia wykonywanego do 90 dni i później po utrwaleniu. Chociaż nocne utrwalanie w PFA sprawdza się w przypadku większości przeciwciał, niektóre z nich mogą działać najlepiej przy skróconym czasie inkubacji w utrwalaczu. Utrwalanie w PFA przez ponad 48 h zmniejsza dostępność antygenów i obniża szanse na udany wtórny immunostaining markerów neurochemicznych. 
	OSTRZEŻENIE: Azotek sodu jest niezwykle niebezpieczny i działa drażniąco w kontakcie ze skórą, oczami, po połknięciu lub inhalacji. Silna ekspozycja może prowadzić do śmierci. Rakotwórczość i mutagenność tego związku nie są znane. Stosuj odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym rękawice, okulary ochronne, fartuch laboratoryjny i respirator przeciwpyłowy. Azotku sodu nigdy nie wolno wylewać do odpływu; musi być on zbierany jako odpad chemiczny.</li>
</ol>
2. Barwienie pierwszym przeciwciałem pierwotnym i biocytyną
(Dzień 1) 
UWAGA: Poniższa procedura immunobarwienia dotyczy przekrojów swobodnie pływających i wymaga ciągłego wstrząsania z niską prędkością (2 obroty/min, rpm) na wytrząsarce podczas wszystkich etapów inkubacji.
<ol>
	<li>Przemyć tkankę 3x przez 10 min każdorazowo w 0.1 M PBS (pH = 7.4). 
	UWAGA: 0.1 M PBS można zakupić komercyjnie lub przygotować w laboratorium w następujący sposób (na 1 L): 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.4 g Na2HPO4 oraz 0.24 g KH2PO4 w 1 L dH20. 
	UWAGA: Jeśli znany jest pożądany marker neurochemiczny, barwienie na białko/peptyd można przeprowadzić jednocześnie z barwieniem na biocytynę (kroki 2.2 - 2.4). W przypadku barwienia wyłącznie na biocytynę, przejść do kroku 2.5.</li>
	<li>OPCJONALNIE: Zablokować, używając 10% Serum Blokującego (BS; normalne serum kozie (NGS) rozcieńczone w 0.3% Triton X-10 w PBS) przez 1 h w RT. 
	UWAGA: Do każdego dołka należy wlać taką samą objętość roztworu; zalecana objętość wynosi od 250 do 50 µL/dołek. Wybór serum blokującego zależy od gatunku, w którym wytworzono przeciwciała wtórne (np. NGS jest stosowane dla koniugatów barwnikowych kozich przeciwciał anty-(odpowiedni gatunek przeciwciała pierwotnego)). Jeśli pojawi się potrzeba użycia przeciwciał wtórnych wytworzonych w różnych gatunkach do immunobarwienia sekcji, należy dodać 10% każdego normalnego serum w kroku blokowania (2) oraz 3% każdego normalnego serum do etapów inkubacji z przeciwciałami pierwotnymi i wtórnymi.</li>
	<li>(OPCJONALNIE) Inkubować sekcje w przeciwciałach pierwotnych, CB1R (poliklonalne, świnka morska) z 0.3% Triton X-10 oraz 3% BS w 0.1 M PBS w RT przez noc (O/N). CB1R jest stosowane do identyfikacji ekspresji kannabinoidowego receptora typu 1. 
	UWAGA: Krok ten jest opcjonalny i nie jest wymagany do wykazania wypełnienia biocytyną. Rycina 2 przedstawia sekcję znakowaną na biocytynę i CB1R podczas pierwszego procesu barwienia. Inkubacja przez noc w RT jest wystarczająca dla większości przeciwciał pierwotnych; jednak niektóre przeciwciała pierwotne, w tym CB1R, wymagają inkubacji przez 3 - 5 d. Jeśli inkubacja musi trwać dłużej niż 1 d, zaleca się inkubację w 4 °C, ponieważ Triton X-10 może permeabilizować skrawki i prowadzić do dezintegracji tkanki podczas przedłużonej inkubacji w temperaturze pokojowej. W co najmniej jednej sekcji dla każdej serii eksperymentów należy uwzględnić kontrolę negatywną bez przeciwciał pierwotnych w celu weryfikacji swoistości przeciwciał wtórnych. W przypadku kontroli negatywnych pomija się dodanie przeciwciał pierwotnych, ale dodaje się 0.3% Triton X-10 w 0.1 M PBS oraz BS.</li>
</ol>
<img alt="Markowanie neuronów biocytyną, CB1, CCK; obrazy mikroskopowe; analiza mapowania dendrytycznego i aksonalnego." src="/files/ftp_upload/54880/54880fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Pomyślne barwienie CCK tydzień po odzyskaniu barwienia biocytyną i Creceptor kannabinoidowy typu 1 (CB1)1(R)-znakowanie (A - C) obrazy konfokalne przy 60X przedstawiające wypełniony biocytyną neuron (A) oraz CB1immunoreaktywność R (B), wskazane przez grot strzałki. Ten sam przekrój poddano barwieniu immunohistochemicznemu na CCK po 1 tygodniu (C). Nałożenie obrazów przedstawiono w DImmunoreaktywność CCK wykazano przy użyciu barwnika dalekiej czerwieni, a następnie nadano jej pseudokolor cyjan.E) Rekonstrukcja morfologiczna komórki wypełnionej biocytyną na rys. A. Należy zwrócić uwagę, że biocytyna i CB1Barwienie R jest widoczne nawet po drugim immunostainingu CCK. Należy również zwrócić uwagę na oczekiwany rozkład CB.1Wzorce barwienia immunocytochemicznego dla R i CCK. (F - H) Powiększony obraz aksonu komórki, jak w Awykazują ścisłą ko-lokalizację biocytyny i CB1R w aksonach (groty strzałek). Pasek skali: 50 µm (A - D), 100 µm (E), i 10 µm (F - H). Obrazy zostały powielone z Yu i wsp. 20159. <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54880/54880fig2large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
(Dzień 2)
<ol start="4">
	<li>Przemyć skrawki mózgu 3x przez 10 min każdy w 0,1 M PBS (pH = 7,4).</li>
	<li>Inkubować skrawki z koniugatem streptawidyny z czerwonym barwnikiem (stężenie: 1:1 0; wzbudzenie: 594 nm z emisją w czerwonej części widma widzialnego) z dodatkiem 0,3% Triton X-10 i 3% BS w 0,1 M PBS w temperaturze 4 °C przez noc (O/N) w ciemności (zawinięte w folię aluminiową), aby uwidocznić biocytynę. OPCJONALNIE: W przypadku przeprowadzenia opcjonalnej inkubacji z przeciwciałem pierwszorzędowym w kroku 2.3, do powyższej inkubacji należy dołączyć przeciwciało drugorzędowe, kozie anty-świnka morska (stężenie: 1:50; wzbudzenie: 48 nm i emisja w kolorze zielonym). 
	UWAGA: Przeciwciało drugorzędowe będzie potrzebne tylko wtedy, gdy wykonano opcjonalne barwienie przeciwciałem pierwszorzędowym (krok 2.3). Do wizualizacji biocytyny zaleca się stosowanie koniugatu streptawidyna-fluorofor z widmem emisji w kolorze czerwonym, ponieważ ułatwia to szczegółową wizualizację cieńszych aksonów z lepszym kontrastem (Rysunki 1 - 3). Podczas podwójnego lub potrójnego barwienia immunohistorochemicznego, aby uniknąć reaktywności krzyżowej przeciwciał drugorzędowych, należy dodawać przeciwciała drugorzędowe sekwencyjnie (wystarczający jest odstęp 2 h między kolejnymi aplikacjami przeciwciał). Rysunek 3A przedstawia wypełnioną biocytyną komórkę przetworzoną bez opcjonalnego barwienia przeciwciałem pierwszorzędowym i zobrazowaną przed ponownym cięciem.</li>
</ol>
<img alt="Obrazowanie neuronów, wykres elektrofizjologiczny, analiza konektywności; znakowanie dendrytów; aktywność synaptyczna." src="/files/ftp_upload/54880/54880fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Pomyślne drugie immunostaining po odzyskaniu morfologii biocytyny i ponownym cięciu. (A1) Obraz konfokalny a 300 µm przekrój przedstawiający odzyskanie morfologii dendrytycznej komórki wypełnionej biocytyną. (A2) Przebiegi napięcia błonowego neuronu w odpowiedzi na wstrzyknięcia prądu o wartości +50 i -10 pA. (B) Odzyskanie wypełnionego biocytyną somy w 50 µm przekrój uzyskany po wycięciu 300 µm sekcja (w A1) po zamontowaniu i obrazowaniu. (B2Następne barwienie immunocytochemiczne cienkiego przekroju wykazało kolokalizację wypełnionego biocytyną somy (panel środkowy) z CCK (panel środkowy). Obraz z nałożonymi kanałami przedstawiono na panelu prawym. Pasek skali: 50 µmPanel A2 został powielony za zgodą Yu i wsp., w druku25. <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54880/54880fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
(Dzień 3)
<ol start="6">
	<li>Przemyć skrawki mózgu 3 razy po 10 min każdy w 0,1 M PBS (pH = 7,4).</li>
	<li>Aby chronić fluorescencję i ułatwić ponowne barwienie w przyszłości, zamontować skrawki w wodnym medium montażowym i zabezpieczyć krawędzie szkiełka nakrywkowego bezbarwnym lakierem do paznokci. 
	UWAGA: Najlepiej jest przeprowadzić ponowne barwienie skrawków tak wcześnie, jak to możliwe, aby uniknąć trudności z usuwaniem lakieru ze szkiełka, infekcji pleśnią oraz odwodnienia tkanki na skutek wycieku medium montażowego z preparatu. 
	OSTRZEŻENIE: Azydk sodu jest silnie toksyczny i łatwopalny w kontakcie z wodą. Należy stosować standardowe procedury operacyjne dotyczące obchodzenia się z substancjami niebezpiecznymi i ich utylizacji. 
	(Dni 4 - 7)</li>
	<li>Przeprowadzić obrazowanie konfokalne z wzbudzeniem przy 594 i 488 nm oraz przy powiększeniu 20X lub 40X, aby uwidocznić wypełnione biocytyną neurony w kolorze czerwonym oraz markery neurochemiczne (CB1R) w kolorze zielonym. Ocenić kolokalizację (Rysunek 2).</li>
	<li>Ustawić czas ekspozycji kamery na mniej niż 10 ms, aby uniknąć fotowybielania, i uzyskać stosy obrazów konfokalnych drzewk wewnątrz i zewnętrznych całej struktury neuronu. Wykorzystać stosy obrazów konfokalnych oraz oprogramowanie do śledzenia neuronów w celu rekonstrukcji morfologii neuronalnej.</li>
</ol>
3. Barwienie drugim przeciwciałem pierwszorzędowym
UWAGA: Chociaż drugi etap immunobarwienia można przeprowadzić 90 d po pierwszym barwieniu, optymalne wyniki uzyskuje się, jeśli drugie barwienie przeciwciałami pierwotnymi zostanie wykonane w ciągu 7 - 10 d.
(Po 7 – 90 d)
<ol>
	<li>Nanieś aceton na patyczek higieniczny i usuń lakier do paznokci z szkiełka przedmiotowego.</li>
	<li>Ostrożnie zdejmij szkiełko nakrywkę za pomocą pęsety z cienkimi końcami i nanieś kilka kropel 0,1 M PBS na skrawki.</li>
	<li>Ostrożnie zdejmij skrawki ze szkiełka za pomocą cienkiego pędzla i płucz je w 0,1 M PBS przez 24 - 48 h na wytrząsarce, przykrywając je folią aluminiową, w słabym świetle w temperaturze 4 oC. 
	UWAGA: Przykrycie skrawków folią aluminiową jest kluczowe, aby uniknąć fotoblaknięcia.</li>
	<li>Aby zapewnić całkowite usunięcie medium montażowego, następnego dnia płucz skrawki 1 - 2x w 0,1 M PBS przez 10 min każde płukanie.</li>
	<li>Przejdź do inkubacji z drugim przeciwciałem pierwszorzędowym (np. cholecystokininą, neuropeptydem występującym w niektórych interneuronach GABAergicznych (CCK; stężenie: 1:1 0; mysie przeciwciało monoklonalne)) przez 1 d (Rysunek 2). 
	UWAGA: Procedura ta jest podobna do kroku 2.3, ale wykorzystuje inne przeciwciało. Dodatkowo, podczas ponownego barwienia pomija się etap blokowania.</li>
	<li>Płucz skrawki mózgu trzy razy po 10 min każdy w 0,1 M PBS (pH = 7,4).</li>
	<li>Barwi za pomocą koniugowanego z fluoroforem przeciwciała wtórnego koziego anty-mysiego (stężenie: 1:50; długość fali wzbudzenia: 647 nm), upewniając się, że widma wzbudzenia i emisji przeciwciała wtórnego nie nakładają się na widma streptawidyny (stężenie: 1:1 0; długość fali wzbudzenia: 594 nm) oraz wcześniejszych barwień immunofluorescencyjnych.</li>
	<li>Zamontuj skrawki w wodnym medium montażowym i zabezpiecz krawędzie szkiełka nakrywki bezbarwnym lakierem do paznokci. 
	UWAGA: Przechowuj skrawki w temperaturze 4 °C w nieprzepuszczającym światła pudełku, aby chronić fluorescencję.</li>
</ol>

<ol><li>Garcia-Lopez, P., Garcia-Marin, V., Freire, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histological+slides+and+drawings+of+cajal%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">The histological slides and drawings of cajal.</a> Front Neuroanat. 4, 9(2010).</li>
<li>Klausberger, T., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+diversity+and+temporal+dynamics%3A+the+unity+of+hippocampal+circuit+operations%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations.</a> Science. 321 (5885), 53-57 (2008).</li>
<li>Petilla Interneuron Nomenclature, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Petilla+terminology%3A+nomenclature+of+features+of+GABAergic+interneurons+of+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex.</a> Nat Rev Neurosci. 9 (7), 557-568 (2008).</li>
<li>Armstrong, C., Soltesz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basket+cell+dichotomy+in+microcircuit+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Basket cell dichotomy in microcircuit function.</a> J Physiol. 590 (4), 683-694 (2012).</li>
<li>Povysheva, N. V., Zaitsev, A. V., Gonzalez-Burgos, G., Lewis, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+heterogeneity+of+fast-spiking+interneurons%3A+chandelier+versus+basket+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological heterogeneity of fast-spiking interneurons: chandelier versus basket cells.</a> PLoS One. 8 (8), e70553(2013).</li>
<li>Gupta, A., Elgammal, F. S., Proddutur, A., Shah, S., Santhakumar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decrease+in+tonic+inhibition+contributes+to+increase+in+dentate+semilunar+granule+cell+excitability+after+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Decrease in tonic inhibition contributes to increase in dentate semilunar granule cell excitability after brain injury.</a> J Neurosci. 32 (7), 2523-2537 (2012).</li>
<li>Fish, K. N., Hoftman, G. D., Sheikh, W., Kitchens, M., Lewis, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parvalbumin-containing+chandelier+and+basket+cell+boutons+have+distinctive+modes+of+maturation+in+monkey+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Parvalbumin-containing chandelier and basket cell boutons have distinctive modes of maturation in monkey prefrontal cortex.</a> J Neurosci. 33 (19), 8352-8358 (2013).</li>
<li>Yu, J., Swietek, B., Proddutur, A., Santhakumar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dentate+cannabinoid-sensitive+interneurons+undergo+unique+and+selective+strengthening+of+mutual+synaptic+inhibition+in+experimental+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Dentate cannabinoid-sensitive interneurons undergo unique and selective strengthening of mutual synaptic inhibition in experimental epilepsy.</a> Neurobiol Dis. 89, 23-35 (2016).</li>
<li>Yu, J., Swietek, B., Proddutur, A., Santhakumar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dentate+total+molecular+layer+interneurons+mediate+cannabinoid-sensitive+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Dentate total molecular layer interneurons mediate cannabinoid-sensitive inhibition.</a> Hippocampus. 25 (8), 884-889 (2015).</li>
<li>Varga, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+fission+of+parvalbumin+interneuron+classes+during+fast+network+events%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Functional fission of parvalbumin interneuron classes during fast network events.</a> Elife. 3, (2014).</li>
<li>Kawashima, T., Okuno, H., Bito, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+era+for+functional+labeling+of+neurons%3A+activity-dependent+promoters+have+come+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Circuits+Revealed%22%5BJournal%5D)">A new era for functional labeling of neurons: activity-dependent promoters have come of age.</a> Neural Circuits Revealed. , 109(2015).</li>
<li>Krook-Magnuson, E., Luu, L., Lee, S. H., Varga, C., Soltesz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ivy+and+neurogliaform+interneurons+are+a+major+target+of+mu-opioid+receptor+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ivy and neurogliaform interneurons are a major target of mu-opioid receptor modulation.</a> J Neurosci. 31 (42), 14861-14870 (2011).</li>
<li>Szabadics, J., Soltesz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+specificity+of+mossy+fiber+innervation+of+GABAergic+cells+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional specificity of mossy fiber innervation of GABAergic cells in the hippocampus.</a> J Neurosci. 29 (13), 4239-4251 (2009).</li>
<li>Iball, J., Ali, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocannabinoid+Release+Modulates+Electrical+Coupling+between+CCK+Cells+Connected+via+Chemical+and+Electrical+Synapses+in+CA1%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Endocannabinoid Release Modulates Electrical Coupling between CCK Cells Connected via Chemical and Electrical Synapses in CA1.</a> Front Neural Circuits. 5, 17(2011).</li>
<li>Chen, X., Cho, D. -B., Yang, P. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+staining+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22N+Am+J+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Double staining immunohistochemistry.</a> N Am J Med Sci. 2 (5), 241-245 (2010).</li>
<li>Ranjan, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+detection+of+multiple+antigens+at+single+cell+resolution+using+antibodies+generated+from+the+same+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological%22%5BJournal%5D)">Cellular detection of multiple antigens at single cell resolution using antibodies generated from the same species.</a> Journal of immunological. 379 (1), 42-47 (2012).</li>
<li>Fuccillo, D. A., Sever, J. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFuccillo%2C+DA+%22Concepts+in+Viral+Pathogenesis+II%22">Concepts in Viral Pathogenesis II</a>. , Springer. 324-330 (1986).</li>
<li>Buchwalow, I. B., Minin, E. A., Boecker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multicolor+fluorescence+immunostaining+technique+for+simultaneous+antigen+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochem%22%5BJournal%5D)">A multicolor fluorescence immunostaining technique for simultaneous antigen targeting.</a> Acta Histochem. 107 (2), 143-148 (2005).</li>
<li>Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+and+morphological+characterization+of+neuronal+microcircuits+in+acute+brain+slices+using+paired+patch-clamp+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+%28Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological and morphological characterization of neuronal microcircuits in acute brain slices using paired patch-clamp recordings.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments. (95), e52358(2015).</li>
<li>Walz, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalz%2C+W+%22Patch-clamp+analysis+%3A+advanced+techniques.+2nd+edn%22">Patch-clamp analysis : advanced techniques. 2nd edn</a>. , Humana Press. (2007).</li>
<li>Molnar, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMolnar%2C+P+%22Patch-clamp+methods+and+protocols%22">Patch-clamp methods and protocols</a>. 403, Springer Science & Business Media. (2007).</li>
<li>Martina, M., Taverna, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMartina%2C+M+%22Patch-clamp+methods+and+protocols%22">Patch-clamp methods and protocols</a>. , Humana Press. (2014).</li>
<li>Booker, S. A., Song, J., Vida, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+patch-clamp+recordings+from+morphologically-+and+neurochemically-identified+hippocampal+interneurons%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole-cell patch-clamp recordings from morphologically- and neurochemically-identified hippocampal interneurons).</a> J Vis Exp. (91), e51706(2014).</li>
<li>Jinno, S., Kosaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemical+characterization+of+hippocamposeptal+projecting+GABAergic+nonprincipal+neurons+in+the+mouse+brain%3A+a+retrograde+labeling+study%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemical characterization of hippocamposeptal projecting GABAergic nonprincipal neurons in the mouse brain: a retrograde labeling study.</a> Brain research. 945 (2), 219-231 (2002).</li>
<li>Yu, J., Proddutur, A., Swietek, B., Elgammal, F. S., Santhakumar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Reduction+in+Cannabinoid-Sensitive+Heterotypic+Inhibition+of+Dentate+Basket+Cells+in+Epilepsy%3A+Impact+on+Network+Rhythms%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Functional Reduction in Cannabinoid-Sensitive Heterotypic Inhibition of Dentate Basket Cells in Epilepsy: Impact on Network Rhythms.</a> Cereb Cortex. , (2015).</li>
<li>Proddutur, A., Yu, J., Elgammal, F. S., Santhakumar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seizure-induced+alterations+in+fast-spiking+basket+cell+GABA+currents+modulate+frequency+and+coherence+of+gamma+oscillation+in+network+simulations%5BTitle%5D)+AND+%22Chaos%22%5BJournal%5D)">Seizure-induced alterations in fast-spiking basket cell GABA currents modulate frequency and coherence of gamma oscillation in network simulations.</a> Chaos. 23 (4), 046109(2013).</li>
<li>Scharfman, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+rat+dentate+neurons+by+morphology+and+electrophysiology+in+hippocampal+slices%3A+granule+cells%2C+spiny+hilar+cells+and+aspiny+%27fast-spiking%27+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsy+Res+Suppl%22%5BJournal%5D)">Differentiation of rat dentate neurons by morphology and electrophysiology in hippocampal slices: granule cells, spiny hilar cells and aspiny 'fast-spiking' cells.</a> Epilepsy Res Suppl. 7, 93-109 (1992).</li>
<li>Tasker, J. G., Hoffman, N. W., Dudek, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+three+intracellular+markers+for+combined+electrophysiological%2C+morphological+and+immunohistochemical+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of three intracellular markers for combined electrophysiological, morphological and immunohistochemical analyses.</a> J Neurosci Methods. 38 (2-3), 129-143 (1991).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Kluczowe kroki w ramach protokołu 
Wypełnienie załatanej komórki biocytyną jest najważniejszym krokiem do zapewnienia pełnego odzyskania morfologii. Aby w pełni odzyskać komórkę, konieczne jest wybranie optymalnej orientacji plastrów, aby zminimalizować przerwanie procesów podczas krojenia. Ta orientacja może się różnić w zależności od badanego obwodu i typu ogniwa. Następnie ważne jest, aby zapewnić odpowiednią ilość czasu na dyfuzję biocytyny do dendrytów i aksonów. Niektóre...

Mózg jest znany z różnorodności strukturalnych i funkcjonalnych cech swoich poszczególnych elementów neuronalnych. Zrozumienie roli różnych typów neuronów w funkcjonowaniu i patologii mózgu wymaga charakterystyki i jednoznacznej identyfikacji neuronów. Strukturalnie cechy morfologiczne zdefiniowane przez lokalizację somato-dendrytyczną określają potencjalne dane wejściowe, które otrzymuje dany neuron, podczas gdy wzorzec arboryzacji aksonalnej identyfikuje potencjalne cele postsynaptyczne. Różnorodność strukturalna neuronów jest doceniana od czasów przełomowych badań histologicznych Ramóna y Cajala1. Pojawienie się technik rejestracji pojedynczej komórki ujawniło, że strukturalnie odrębne neurony wykazują również różnice we wzorcach zapłonu i cechach synaptycznych. Różnorodność w budowie i fizjologii jest szczególnie widoczna w neuronach hamujących GABA-ergiczne2,3. Ponadto staje się coraz bardziej oczywiste, że strukturalnie podobne neurony mogą wyrażać różne markery neurochemiczne i wykazywać odpowiadające im różnice funkcjonalne4. Podobnie, neurony z tymi samymi markerami neurochemicznymi mogą mieć odrębne struktury i funkcje5-10. Tak więc w praktyce analiza cech funkcjonalnych neuronów i ich roli w sieci pociąga za sobą zdefiniowanie zarówno tożsamości morfologicznej, jak i neurochemicznej. Nawet wraz z pojawieniem się linii myszy reporterowych ukierunkowanych na określone markery neurochemiczne, często konieczne jest określenie morfologii i tożsamości podtypu na podstawie immunohistologii11.
Standardowa metoda używana do charakteryzowania komórek zarejestrowanych w ostrych wycinkach mózgu polega na wypełnieniu ich biocytyną lub neurobiotyną podczas zapisu, utrwaleniu skrawków w paraformaldehydzie (PFA) po nagraniach i użyciu immunohistochemii do ujawnienia morfologii i neurochemii. Ponieważ grubość skrawków dla fizjologii plastrów wynosi zwykle 300 μm lub więcej, a większość przeciwciał nie przenika przez całą tę głębokość, plastry muszą zostać ponownie pocięte do 60 μm lub mniej, aby umożliwić jednoczesne barwienie immunologiczne biocytyny i markerów neurochemicznych12-14. Niestety, resekcja jest pracochłonna; ryzyko utraty tkanki podczas cięcia; i może prowadzić do zróżnicowanego kurczenia się tkanek, komplikując rekonstrukcje morfologiczne. Ponadto wcześniejsza wiedza na temat morfologii może pomóc w zawężeniu potencjalnych markerów, które prawdopodobnie będą wyrażane przez komórki. Zmodyfikowaliśmy standardowe protokoły immunohistologiczne biocytyny, aby umożliwić seryjne przetwarzanie skrawków najpierw w celu odzyskania morfologii, a następnie identyfikacji potencjalnych markerów neurochemicznych.
Immunohistochemia to nauka o dystrybucji antygenu w tkankach lub komórkach i może być wizualizowana za pomocą enzymu, etykiet fluorescencyjnych, pierwiastków radioaktywnych lub cząstek koloidu złota15. Procedura polega na użyciu przeciwciał pierwszorzędowych do specyficznego znakowania i amplifikacji jednego lub więcej specyficznych antygenów, a następnie użyciu fluorescencyjnych przeciwciał drugorzędowych skierowanych na przeciwciało pierwszorzędowe w celu wizualizacji. Ze względu na konieczność rozróżnienia widm fluorescencyjnych każdego przeciwciała drugorzędowego bez nakładania się, tylko ograniczona liczba antygenów może być badana jednocześnie. W związku z tym wcześniejsza wiedza na temat morfologii może być przydatna w wyborze potencjalnych markerów neurochemicznych do klasyfikacji komórek. Koncepcyjnie, uzasadnienie dla seryjnego przetwarzania już wybarwionych skrawków opiera się na założeniu, że znakowanie immunologiczne dla jednego białka lub peptydu nie powinno kolidować z antygenowością, a następnie znakowanie immunologiczne dla strukturalnie niezależnego peptydu16. Ten brak interferencji wynika z wiązania przeciwciał ze specyficznym epitopem białkowym na antygenie, a zatem pozwala na jednoczesne barwienie wielu antygenów w tej samej tkance. Liczba antygenów ujawnionych w procesie barwienia immunologicznego jest ograniczona przez konieczność nienakładania się widm fluorescencyjnych przeciwciał drugorzędowych oraz przez konieczność celowania w poszczególne antygeny przeciwciałami wyhodowanymi u różnych gatunków w celu wyeliminowania reaktywności krzyżowej17,18. Chociaż jest to powód stojący za szeregowym, a nie jednoczesnym znakowaniem dwoma odrębnymi przeciwciałami, które mogą wchodzić w interakcje, o ile nam wiadomo, barwienie immunologiczne dla drugiego antygenu nie zostało zgłoszone po zakończeniu znakowania immunologicznego dla jednego lub więcej antygenów na zamontowanych odcinkach. W tym miejscu opisujemy metodę seryjnego barwienia immunologicznego wcześniej wybarwionych i zamontowanych odcinków. Chociaż szczegółowo opisujemy ten proces dla procedury seryjnego znakowania immunologicznego w celu odzyskania morfologii, a następnie barwienia markerów białkowych / peptydowych w grubych sekcjach, te same procedury można również zastosować w standardowych, cienkich skrawkach histologicznych. Ponadto opisujemy praktyczne podejście do wypełniania zarejestrowanych neuronów biocytyną oraz proces usuwania elektrody z komórki po zakończeniu nagrań w celu optymalizacji wypełnienia aksonalnych i dendrytycznych trzpieni neuronów, jak przedstawiono w naszej ostatniej pracy6,8.
Najważniejszą zaletą opisanej tutaj procedury jest to, że morfologia zarejestrowanej komórki może być w pełni odzyskana i zobrazowana przed próbą resekcji lub immunologicznego barwienia wycinków. Chociaż problemy z penetracją niektórych przeciwciał mogą spowodować konieczność resekcji wycinków w celu wtórnego barwienia immunologicznego, opisane tutaj procedury wyeliminowałyby potrzebę rekonstrukcji złożonych neuronów z wielu sekcji i pozwoliłyby uniknąć problemów spowodowanych utratą tkanek i zróżnicowanym skurczem, co może zagrozić rekonstrukcji po resekcji. Dodatkową zaletą jest to, że proces ten zmniejszy koszty, czas, wysiłek i drogie przeciwciała poprzez ograniczenie barwienia immunologicznego i resekcji do wycinków, w których odzyskiwane są neurony wypełnione biocytyną. Najbardziej praktycznym aspektem jest dodatkowe barwienie immunologiczne, które można wykonać na odcinkach barwionych na kilka miesięcy przed zastosowaniem wyżej wymienionej techniki. W szczególności przywrócenie morfologii znacznie zmniejszyłoby prawdopodobieństwo, że dane fizjologiczne z komórek zostaną odrzucone z powodu niemożności uzyskania podstawowej charakterystyki morfologicznej typu komórki.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td>Barwienie immunologiczne</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fluka</td><td>60129</td><td>Barwienie immunologiczne</td></tr><tr><td>Na2HPO4&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S7907</td><td>Barwienie immunologiczne</td></tr><tr><td>KH2PO4&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>229806</td><td>Barwienie immunologiczne</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>Immunostaining</td></tr><tr><td>świnka morska anty CB1&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Af530-1</td><td>Immunostaining</td></tr><tr><td>Mysz anti CCK</td><td>CURE, UCLA</td><td>dzięki uprzejmości G. Ohning</td><td>Immunostaining</td></tr><tr><td>Rabbit anty Parvalbumin</td><td>Swant</td><td>PV27</td><td>Immunostaining</td></tr><tr><td>Streptawidyna, Alexa Fluor sprzęgany</td><td>Sondy molekularne</td><td>S11227</td><td>Barwienie immunologiczne</td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia (NGS)</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td>Barwienie immunologiczne</td></tr><tr><td>Vectashield&nbsp;</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td>Barwienie immunologiczne</td></tr><tr><td>Przeciwciała wtórne</td><td>Invitogen Sondy molekularne</td><td>Alexa Fluor Barwienie</td><td>immunologiczne</td></tr><tr><td>Wytrząsarka niskoobrotowa Labnet orbit</td><td>Bioexpress</td><td>S-2030-LS</td><td>Kleszczyki do barwienia immunologicznego</td></tr><tr><td></td><td>Dumont</td><td>11231-30</td><td>Markery immunologiczne</td></tr><tr><td></td><td>EMS</td><td>71520</td><td>Barwienie immunologiczne</td></tr><tr><td>Vibratome VT 1200 S</td><td>Leica</td><td>14048142066</td><td>Elektrofizjologia</td></tr><tr><td>Multiclamp 700B</td><td>wzmacniacz Urządzenia molekularne</td><td>Multiclamp 700B</td><td>Elektrofizjologia</td></tr><tr><td>pCLAMP 10 Oprogramowanie</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>pCLAMP 10&nbsp;</td><td>Elektrofizjologia</td></tr><tr><td>Digitizer</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>Digidata 1440 digitizer</td><td>Elektrofizjologia</td></tr><tr><td>Końcówki filtrów</td><td>Nalgene</td><td>171-0020</td><td>Elektrofizjologia</td></tr><tr><td>Sonikator</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-335-100</td><td>Elektrofizjologia</td></tr><tr><td>Mikroładowarki</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td>Elektrofizjologia</td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>Sigma</td><td>B4261</td><td>Elektrofizjologia</td></tr></tbody></table>

barwienie immunologiczne skrawków wypełnionych i przetworzonych biocytyną pod kątem markerów neurochemicznych

Immunostaining of Biocytin-filled and Processed Sections for Neurochemical Markers

Elektrofizjologiczne zapisy komórek za pomocą techniki patch clamp pozwoliły na identyfikację różnych typów neuronów na podstawie wzorców zapłonu. Włączenie biocytyny/neurobiotyny do elektrody rejestrującej pozwala na odzyskanie szczegółów morfologicznych post hoc, które są niezbędne do określenia arboryzacji dendrytycznej i regionów, do których dążą aksony zarejestrowanych neuronów. Jednak biorąc pod uwagę obecność morfologicznie podobnych neuronów o odrębnych tożsamościach i funkcjach neurochemicznych, barwienie immunohistochemiczne białek specyficznych dla typu komórki jest niezbędne do ostatecznej identyfikacji neuronów. Aby utrzymać łączność sieciową, wycinki mózgu do zapisów fizjologicznych są przygotowywane o grubości 300 μm lub większej. Jednak ta grubość często utrudnia immunohistologiczną obróbkę końcową ze względu na problemy z penetracją przeciwciał, co wymaga resekcji tkanki. Resekcja wycinków jest trudną sztuką, często prowadzącą do utraty tkanki i morfologii komórek, z których uzyskano dane elektrofizjologiczne, co sprawia, że dane stają się bezużyteczne. Ponieważ odzyskanie morfologii ograniczyłoby utratę danych i pomogłoby w selekcji markerów neuronalnych, przyjęliśmy strategię polegającą najpierw na odzyskaniu morfologii komórki, a następnie na wtórnym barwieniu immunologicznym. Wprowadzamy praktyczne podejście do wypełniania biocytyną podczas zapisów fizjologicznych i późniejszego seryjnego barwienia immunologicznego w celu odzyskania morfologii, a następnie ponownego barwienia skrawków w celu określenia tożsamości neurochemicznej. Donosimy, że sekcje, które zostały wypełnione biocytyną, utrwalone paraformaldehydem (PFA), wybarwione i przykryte, mogą zostać usunięte i ponownie wybarwione drugim pierwotnym przeciwciałem kilka dni później. To ponowne barwienie polega na usunięciu szkiełka nakrywkowego, umyciu skrawków w roztworze buforowym oraz inkubacji przeciwciał pierwszorzędowych i wtórnych w celu ujawnienia tożsamości neurochemicznej. Metoda ta jest korzystna w eliminowaniu utraty danych z powodu niemożności odzyskania morfologii oraz w zawężaniu markerów neurochemicznych, które mają być badane na podstawie morfologii.

Po pomyślnym zakończeniu sekcje zachowują wypełnienie biocytyną oraz immunoznakowanie wykonane w kroku 2 i mogą być obrazowane przy użyciu mikroskopii konfokalnej lub epifluorescencyjnej. Dodatkowo, przetworzone sekcje wykażą również immunobarwienie przeciwko antygenowi znakowanemu podczas późniejszej procedury w kroku 3. Na przekroju przedstawionym na Rysunku 2 morfologia neuronu wypełnionego biocytyną w grubym przekroju (300 µm) została ujawniona przy użyciu streptawidy...

Ten protokół przedstawia metodę morfologicznego odzyskiwania neuronów załatanych podczas zapisów elektrofizjologicznych za pomocą wypełnienia biocytyną i późniejszego immunohistochemicznego przetwarzania końcowego. Pokazujemy, że grube skrawki wypełnione biocytyną, które zostały wybarwione i przykryte, mogą być ponownie wybarwione drugim pierwotnym przeciwciałem kilka dni lub miesięcy później.

Barwienie immunologiczne skrawków wypełnionych i przetworzonych biocytyną pod kątem markerów neurochemicznych

Electrophysiological recordings of cells using the patch clamp technique have allowed for the identification of different neuronal types based on firing ...

Celem tego protokołu jest przedstawienie skutecznej metody identyfikacji neuronów załatanych podczas zapisów elektrofizjologicznych przy użyciu biocytyny i barwienia immunologicznego w celu odzyskania morfologii przed ponownym barwieniem specyficznymi przeciwciałami w celu określenia tożsamości neurochemicznej. Tak więc ta metoda opisuje ważny krok potrzebny do zbadania różnorodności w strukturze i funkcji neuronów. Jest to niezbędne do zrozumienia ich roli w sieciach mózgowych.Główną zaletą stosowania technik przetwarzania sekwencyjnego jest to, że eliminuje to utratę danych z powodu niemożności odzyskania morfologii. Pomaga to również w kierowaniu markerami neurochemicznymi, które mają być testowane w tych komórkach. Chociaż metoda ta jest opisana do morfologicznego odzyskiwania komórek w grubych skrawkach, może być również stosowana do cienkich odcinków oraz na wcześniej barwionych i montowanych próbkach.Ogólnie rzecz biorąc, neutralne osoby, które są nowicjuszami w tej metodzie, mogą mieć trudności z ponownym uszczelnieniem somy podczas odłączania od komórki i mogą nie dać odpowiedniego czasu na udane napełnienie. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ do skutecznego wypełniania komórek biocytyną w celu odzyskania pełnej morfologii wymagane są określone techniki. Aby rozpocząć tę procedurę, w konfiguracji cęgów napięciowych należy zastosować małe, krótkie kroki napięcia za pomocą funkcji testu membrany w trybie kąpieli podczas zbliżania się do ogniwa.Łatać na komórce, stosując odsysanie. Następnie utrzymuj komórkę na minus 70 miliwoltach. Zwróć uwagę na rozwój uszczelki gigaomowej.Skompensuj pojemnościowe stany nieustalone, a następnie zastosuj kontrolowane ssanie za pomocą strzykawki lub ustami, aby uzyskać konfigurację całych komórek. Oszacuj pojemność całego ogniwa i rezystancję szeregową oraz zatrzymaj impulsy testowe membrany. Optymalna jest rezystancja szeregowa mniejsza niż 10 megaomów.Zapewni to stworzenie warunków zapisu całej komórki, które umożliwią wypełnienie biocytyną. Po zakończeniu zapisów fizjologicznych przywróć konfigurację zacisku krosowego, powoli przesuwając pipetę rejestrującą małymi krokami, naprzemiennie w górę i na zewnątrz w trybie zacisku napięcia. Najważniejszym krokiem w osiągnięciu morfologicznego odzysku komórek jest zapewnienie ponownego uszczelnienia somy neuronalnej podczas odłączania pipety rejestrującej od komórki.Korzystając z funkcji testu membranowego, zwizualizuj utratę pojemnościowych stanów nieustalonych i załamanie się reakcji prądowych na linię prostą, co wskazuje na ponowne uszczelnienie ogniwa i ustanowienie zewnętrznej łaty na końcu pipety. W międzyczasie utrzymywanie ogniwa w stanie zdepolaryzowanego potencjału ułatwi proces ponownego zamykania. Po odłączeniu pipety od celi należy utrzymać plasterek w komorze rejestrującej przez trzy do pięciu minut, aby zapewnić transport barwnika do dystalnych wyrostków dendrytycznych i aksonalnych.Następnie przenieś plasterek na 24-dołkową płytkę zawierającą 4% PFA w celu utrwalenia. 24 do 48 godzin po utrwaleniu PFA, przenieś wszystkie utrwalone plastry do punktu zerowego jednego molowego PBS w celu przechowywania przed barwieniem immunologicznym. W tej procedurze myj tkanki trzy razy przez 10 minut każda w punkcie zerowym jednego molowca PBS.Następnie zablokuj tkanki 10-procentową surowicą blokującą na godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie inkubuj skrawki w pierwszorzędowych przeciwciałach CB1R w temperaturze pokojowej przez noc, aby zidentyfikować ekspresję receptora kannabinoidowego typu 1. Następnie umyj skrawki mózgu trzy razy po 10 minut w 0,1 molowym PBS.Streptawidyna i drugorzędowe przeciwciało przeciwko pierwszemu przeciwciału pierwszorzędowemu są dodawane do płytki studzienki i przechowywane przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie inkubuj skrawki w sprzężonym czerwonym barwniku streptawidyny w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc w ciemności, aby odsłonić biocytynę. Następnie umyj skrawki mózgu trzy razy po 10 minut każda w 0,1 molowym PBS.Aby chronić kwitnienie i ułatwić ponowne barwienie w przyszłości, zamontuj sekcje na równomiernie rozmieszczonym nośniku montażowym. Uszczelnij krawędzie szkiełek nakrywkowych przezroczystym lakierem do paznokci. Na tym etapie usuń lakier do paznokci ze szklanego szkiełka za pomocą bawełnianego wacika z acetonu.Ostrożnie usuń szkiełko nakrywkowe za pomocą kleszczyków z cienką końcówką i nałóż kilka kropelek 0,1 molowego PBS na sekcje. Bardzo ważne jest, aby nie uszkodzić tkanki procesowej podczas demontażu tkanki z wodnego podłoża montażowego. Ostrożnie usuń skrawki ze szkiełka za pomocą cienkiego pędzla i umyj je w 0,1 molowym PBS przez 24 do 48 godzin na wytrząsarce i trzymaj z dala od światła w czterech stopniach Celsjusza.Aby zapewnić całkowite usunięcie podłoża montażowego, należy umyć sekcje raz do dwóch razy następnego dnia w 0,1 molowym PBS przez 10 minut za każdym razem. Następnie inkubować skrawki z drugim pierwszorzędowym przeciwciałem cholecystokininą przez jeden dzień. Umyj skrawki mózgu trzy razy po 10 minut w 0,1 molowym PBS.Następnie wybarwić skrawki sprzężonym z fluoroforem drugorzędowym przeciwciałem przeciwko myszy. Upewnij się, że widma emisji wzbudzenia przeciwciała drugorzędowego nie pokrywają się ze streptawidyną i wcześniejszymi barwieniami immunofluorescencyjnymi. Następnie zamontuj sekcje w wodnym medium montażowym.Uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego przezroczystym lakierem do paznokci. Po udanym wypełnieniu biocytyną i pierwszym procesie barwienia immunologicznego, struktura neuronalna może być wizualizowana i obrazowana, jak pokazano na obrazie konfokalnym uzyskanym przy 60-krotnym powiększeniu. Sekcja została również wybarwiona immunologicznie na CB1R wraz z biocytyną, a barwienie immunologiczne CB1R w biocytynie wyrażającej somę neuronalną jest wskazane przez grot strzałki.Ten sam wycinek został przetworzony pod kątem immunoreaktywności CCK po tygodniu, a obraz pokazuje pomyślne odzyskanie znakowania immunologicznego CCK w kilku neuronach oznaczonych gwiazdką. Należy zauważyć, że komórka znakowana biocytyną wskazana przez grot strzałki nie wyrażała CCK. Połączony obraz paneli A, B i C pokazuje, że wszystkie trzy etykiety są solidnie wizualizowane, a nakładka między biocytyną a CB1R jest oczywista.Obraz pokazuje, że drugi proces barwienia immunologicznego nie narusza sygnału z poprzedniego procesu barwienia. Morfologię komórki wypełnionej biocytyną uzyskano z obrazów konfokalnych przed tym barwieniem immunologicznym CCK. Co najważniejsze, oprócz somy i dendrytu można wizualizować aksony i obserwuje się wspólne znakowanie procesów aksonalnych znakowanych CB1R i biocytyną.Próbując wykonać tę procedurę, ważne jest, aby celować w zdrowe komórki znajdujące się pod powierzchnią plasterka, aby uniknąć neuronów z przerwanymi procesami. A to może zagrozić odzyskaniu morfologii. Po opanowaniu, morfologiczne odzyskanie komórek wypełnionych biocytyną można niezawodnie uzyskać podczas rejestracji klamry krostowej.Pomyślne wdrożenie techniki seryjnego barwienia immunologicznego poprawi efektywność odzyskiwania danych i ułatwi charakterystykę neuronów podczas standardowych nagrań z użyciem klamry. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skutecznie wykorzystywać komórki wypełnione biocytyną do odzyskiwania morfologii neuronów i określania markerów neurochemicznych.

immunostaining-biocytin-filled-processed-sections-for-neurochemical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Wielkoskalowa immunodetekcja białek docelowych w całym mózgu naczelnych jest możliwa dzięki zastosowaniu nowatorskich metod zatapiania i krojenia tkanek w połączeniu z wykorzystaniem innowacyjnego urządzenia do masowego barwienia wielu wolnopływających skrawków jednocześnie.

Seryjne barwienie immunohistochemiczne do wielkoskalowej detekcji białek w całym mózgu małpy

Opisano technikę pozwalającą na ilościowe określenie odpowiedzi fizjologicznej neuronów ssaków in vivo podczas ruchu oraz korelację fizjologii neuronu z jego morfologią, fenotypem neurochemicznym i mikroobwodami synaptycznymi.

Charakterystyka fizjologiczna, morfologiczna i neurochemiczna neuronów modulowanych przez ruch

Ten film demonstruje procedurę barwienia nowo rozmnożonych nerwowych komórek macierzystych w skrawkach tkanki mózgowej za pomocą inkorporacji EdU, a następnie immunofluorescencji w celu wizualizacji określonych białek, zwiększając zrozumienie dynamiki i proliferacji komórek.

Barwienie immunofluorescencyjne do wizualizacji rozproszyłych nerwowych komórek macierzystych w wycinkach mózgu myszy

Ten film pokazuje proces wizualizacji interneuronu wypełnionego biocytyną w sekcji hipokampa szczura, podkreślając jego tożsamość neurochemiczną dzięki zastosowaniu specyficznych przeciwciał i mikroskopii fluorescencyjnej.

Barwienie immunologiczne interneuronów w odcinku hipokampa szczura

Ten film pokazuje immunohistochemiczne barwienie włókien cholinergicznych w jądrze podstawnym regionu Meynerta w sekcjach mózgu myszy. Skrawki są blokowane i leczone pierwotną przeciwko acetylotransferazie choliny, a następnie biotynylowanym przeciwciałom drugorzędowym. Dodaje się kompleksy awidyna-biotyna-peroksydaza, które wiążą się z przeciwciałami drugorzędowymi, a następnie z substratem chromogennym. Skrawki są następnie odwadniane i montowane przed wizualizacją pod mikroskopem.

Immunohistochemiczne barwienie włókien nerwowych w jądrze podstawnym Meynera mózgu myszy

Ten film pokazuje procedurę barwienia utrwalonych wycinków mózgu szczura zawierających interneurony wypełnione biocytyną. Protokół obejmuje inkubację z kompleksem awidyny-biotyny (ABC), barwienie za pomocą HRP i substratu chromogennego, konserwację struktur tetratlenkiem osmu i zatopienie tkanki w żywicy w celu obrazowania.

Znakowanie interneuronów wypełnionych biocytyną w wycinkach hipokampa szczurów w celu wizualizacji

Źródło: Núñez, F. J., et al. Ocena biomarkerów w glejaku za pomocą immunohistochemii na zatopionych w parafinie kulturach neurosfery glejaka 3D. J. Vis. Exp. (2019). Ten film przedstawia immunohistochemiczną technikę znakowania biomarkerów nowotworowych w neurosferach guza mózgu zanurzonych w parafinie. Skrawki neurosfery poddawane są usuwaniu parafiny i nawadnianiu, a następnie leczeniu w celu odsłonięcia miejsc biomarkerów. Następnie stosuje się przeciwciała pierwszorzędowe i drugorzędowe w...

Barwienie immunohistochemiczne biomarkerów w skrawkach neurosfery guza mózgu

Aby zrozumieć strukturę sieci neuronowych, konieczna jest funkcjonalna i morfologiczna charakterystyka poszczególnych neuronów. Tutaj demonstrujemy znakowanie biocytyny przykłasomalnej, które umożliwia zapisy elektrofizjologiczne w konfiguracji zewnątrzkomórkowej, zachowując jednocześnie zdolność do wewnątrzkomórkowego znakowania neuronu w celu rekonstrukcji post hoc architektury dendrytycznej i aksonalnej.

Znakowanie biocytyny Juxtasomal w celu zbadania zależności struktura-funkcja poszczególnych neuronów korowych

Ten protokół wprowadzający opisuje odczynniki, sprzęt i techniki wymagane do przeprowadzenia immunohistochemicznego barwienia mózgów gryzoni, używając jako przykładu markerów dla mikrogleju i elementów neuronalnych.

Podstawa immunohistochemii na kriowyciętej tkance mózgowej szczura: przykładowe barwienie mikrogleju i neuronów

Opisany tutaj protokół opisuje analizę immunofluorescencyjną, odzyskiwanie biocytyny i wysokiej jakości rekonstrukcje interneuronów CA2 w hipokampie po wewnątrzkomórkowych zapisach elektrofizjologicznych in vitro, co pozwala na badanie charakterystyki neuronów i ostatecznie anatomii neuronalnej.

Odzyskiwanie biocytyny i rekonstrukcje 3D wypełnionych interneuronów CA2 w hipokampie

Poznaj metodę barwienia immunologicznego neuronów wypełnionych biocytyną do odzyskiwania morfologii po rejestracjach elektrofizjologicznych. Technika umożliwia identyfikację markerów neurochemicznych w komórkach nerwowych.

Barwienie immunologiczne skrawków wypełnionych i przetworzonych biocytyną pod kątem markerów neurochemicznych

Przeglądaj więcej filmów