Analiza limfocytów T CD8 ⁺ specyficznych dla małpiego wirusa niedoboru odporności u makaków rezusów za pomocą barwienia tetramerem peptydowo-MHC-I

Ogólnym celem tego testu jest wyliczenie i scharakteryzowanie populacji limfocytów T CD8-dodatnich specyficznych dla małpiego wirusa niedoboru odporności wygenerowanych przez szczepienie lub pierwotną infekcję. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii limfocytów T, takie jak częstotliwość specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8 indukowanych przez szczepienie lub infekcję. Główną zaletą tej techniki jest to, że może ona oznaczać ilościowo limfocyty T CD8 specyficzne dla antygenu w próbkach biologicznych uzyskanych bezpośrednio ex vivo, bez konieczności ponownej stymulacji in vitro.

Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku oceny limfocytów T CD8 specyficznych dla nacięcia u makaków rezusów oraz do badania odpowiedzi limfocytów T CDB w wielu warunkach chorobowych. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności z powodu niepełnej wiedzy dostępnej na temat genetyki MHC makaka rezusa oraz dlatego, że barwienie cytometryczne przepływowe wymaga precyzyjnego zastosowania przeciwciał. Rozpocznij od ponownego zawieszenia PBMC Rh w pożywce R10.

Dodaj 1,6 razy 10 do siódmych komórek na mililitr stężenia. Porcję 50 mikrolitrów komórek do odpowiedniej liczby probówek cytometrii przepływowej i dodać 50 mikrolitrów inhibitora kinazy białkowej do każdej probówki. Wirować każdą probówkę i inkubować próbki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.

Właściwa ilość miareczkowanego peptydowego tetrameru MHC musi być rozcieńczona w wystarczającej ilości mieszanki wzorcowej, aby zabarwić wszystkie probówki eksperymentalne. Dlatego ważne jest, aby przygotować 15% nadwyżkę mieszanki wzorcowej, aby uwzględnić błędy pipetowania. Podczas inkubacji komórek zagnieżdżaj agregaty białkowe w roztworze tetrameru przez odwirowanie, aby zminimalizować barwienie tła.

Następnie rozcieńczyć tetramery w wystarczającej ilości buforu barwiący, tak aby do każdej probówki do cytometrii przepływowej można było dodać 25 mikrolitrów głównej mieszanki tetramerów. Następnie należy zwirować probówki z próbkami i inkubować roztwory tetrameru PBMC w ciemności, w temperaturze pokojowej przez 45 minut. Pod koniec inkubacji dodać 50 mikrolitrów wzorcowej mieszanki barwiącej do odpowiednich probówek z próbkami.

I wymieszaj rurki do wirowania. Po 25 minutach w ciemności w temperaturze pokojowej umyj komórki buforem do mycia, osadź komórki przez odwirowanie i ostrożnie zdekantuj supernatanty, nie naruszając osadów. Zwiruj komórki w pozostałym buforze w każdej probówce i utrwal próbki za pomocą 250 mikrolitrów 2% paraformaldehydu na probówkę.

Natychmiast zwiruj i inkubuj probówki w ciemności, w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Po 20 minutach umyj komórki w świeżym buforze do płukania. Osadzać komórki przez odwirowanie i dekantować supernatant bez naruszania osadu.

Ponownie zawiesić komórki w 500 mikrolitrach buforu przepuszczalnego, wirować i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut w ciemności. Następnie umyj i ogarnij komórki. Następnie zdekantować supernatanty zgodnie z wcześniejszym opisem.

Kontynuuj dodawanie 50 mikrolitrów wewnątrzkomórkowej mieszanki wzorcowej barwienia do odpowiednich probówek. Każdą próbkę należy zawirować i inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 30 minut. Po zakończeniu inkubacji umyj i opeletuj komórki.

Próbki są teraz gotowe do pobrania w cytometrze przepływowym. Tetramery Mamu-B017.01 zazwyczaj dają słabe zabarwienie, które można znacznie poprawić poprzez wstępne potraktowanie komórek inhibitorem kinazy białkowej. Aby uniknąć barwienia tła, dopasowane komórki MHC klasy pierwszej, które zawierają lub nie zawierają specyficznej dla antygenu populacji komórek T CD8-dodatnich, powinny być znakowane odpowiednim tetramerem i wielokrotnymi rozcieńczeniami, w celu określenia optymalnej ilości, która zapewnia najlepszą separację między tetramerowo-dodatnimi i ujemnymi limfocytami T CD8-dodatnimi.

Na tych wykresach pokazano strategię bramkowania zastosowaną do analizy wielkości i fenotypu pamięci wywołanych szczepionką odpowiedzi limfocytów T CD8 specyficznych dla Gag CM9 u makaka rezusa Mamu-A 01 dodatniego. Należy zauważyć, że populacja tetramerowo-dodatnich limfocytów T CD8 jest dobrze oddzielona z minimalnym barwieniem tła. I z podzbiorami pamięci wyraźnie zaznaczonymi przez ich ekspresję CD28, CCR7 i Granzyme B w bramce tetramerowej.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w około trzy godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując tej procedury, ważne jest, aby pamiętać o dodaniu odpowiednich odczynników do każdego przeciwciała lub głównej mieszanki tetrameru oraz o pracy z probówkami eksperymentalnymi za każdym razem, jak pokazano. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie immunologii do zbadania swoistości i fenotypu limfocytów T CD8 specyficznych dla antygenu.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skonfigurować barwienie tetramerowe MHC klasy pierwszej w teście modelu makaka rezusa w badaniach nad AIDS u ludzi. Nie zapominaj, że praca z próbkami biologicznymi makaków rezusów wymaga specjalnych środków ostrożności, takich jak noszenie odpowiednich środków ochrony osobistej podczas przetwarzania próbki.