Name: Połączenie mokrych i suchych technik laboratoryjnych w celu kierowania krystalizacją dużych zwiniętych cewek białkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-06T10:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Poznaj metodę łączącą techniki eksperymentalne i obliczeniowe do identyfikacji granic domen w dużych białkach zwiniętych cewkowych. To podejście usprawnia proces krystalizacji białek trudnych do ukrystalizowania.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant NIH R01 GM097204 (APV i JDH). Finansowanie JHM zostało zapewnione przez HHMI Undergraduate Research Summer Fellowship.

UWAGA: Diagram struktury koncepcyjnej lub przepływu pracy jest opisany na rysunku 1 w celach informacyjnych. Protokół można podzielić na cztery etapy: przewidywania obliczeniowe lub oparte na sekwencjach, ekspresja i oczyszczanie białek, charakterystyka biochemiczna i krystalizacja. Pokazane przykłady analizują domeny Shroom SD2 i/lub kompleksy Shroom-Rock, ale mogą być wykorzystane z dowolnym białkiem.
1. Korzystaj z uznanych narzędzi internetowych do generowania obliczeniowych prognoz granic domen zwojów
<ol>
	<li>Zbierz ewolucyjnie zróżnicowany zestaw homologów sekwencji.
	<ol>
		<li>Przejdź do www.uniprot.org i wpisz Shroom w górnym pasku wyszukiwania.</li>
		<li>Wybierz sekwencje do pobrania, zaznaczając pole obok ich numeru dostępu. Sekwencje oznaczone gwiazdką oznaczają sekwencje sprawdzone przez Uniprot i są na ogół bardziej wiarygodne. Upewnij się, że wszystkie sekwencje są kompletne i dokładne.</li>
		<li>Zapisz wybrane sekwencje, klikając przycisk Pobierz.</li>
		<li>Dopasuj kolekcję sekwencji grzybów za pomocą Clustal-Omega21 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/). Kliknij przycisk "Przeglądaj", aby wybrać plik z sekwencjami grzybów, a następnie naciśnij Prześlij.</li>
		<li>Po zakończeniu wyrównywania kliknij przycisk "Pobierz plik wyrównania".</li>
		<li>Otwórz wyrównanie wielu sekwencji wygenerowane w wersji 1.1.5 za pomocą Jalview (Plik|Wyrównanie danych wejściowych|Z pliku). W nowym oknie wyrównania pokoloruj według tożsamości (Kolor|Procent tożsamości).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obliczanie przewidywań struktury drugorzędowej, przewidywań elastycznej lub nieuporządkowanej sekwencji oraz przewidywanych regionów zwiniętych cewek w obrębie białka (białek) będących przedmiotem zainteresowania.
	<ol>
		<li>Przejdź do http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi, aby obliczyć przewidywania dotyczące zwojów. Skopiuj i wklej sekwencję w polu Sekwencja, a następnie kliknij przycisk Prześlij. 
		UWAGA: Ta analiza może potrwać kilka godzin. Ponieważ sekwencje grzybów są dość duże, może być konieczne podzielenie ich na bloki mniejsze niż 1000 aminokwasów, aby zmieścić się w ograniczeniach rozmiaru serwera internetowego. Podczas analizy Shrm2 zaleca się użycie C-końcowego 1,000 aminokwasów, ponieważ ta sekcja zawiera domenę Shrm SD2, o której wiadomo, że zawiera regiony zwiniętych cewek. Podczas powtarzania tej analizy z innymi białkami zaleca się stosowanie pełnych sekwencji białkowych, jeśli to możliwe. Jeśli nie jest to możliwe, użyj największego możliwego fragmentu lub przeanalizuj sekwencję na podstawie znanych danych biochemicznych lub funkcjonalnych.</li>
		<li>Przejdź do http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi, aby obliczyć przewidywania dotyczące zwojów. Skopiuj i wklej sekwencję w polu Sekwencja, a następnie kliknij przycisk Prześlij.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Połącz wyniki kroków od 1.1 do 1.2.2 w jedną obszerną adnotację sekwencji grzybów. 
	UWAGA: Zdecydowanie zaleca się dołączenie na tym etapie wszelkich istotnych informacji, które można uzyskać z literatury lub innych źródeł na temat funkcji białka lub oczyszczania.</li>
	<li>Korzystając z tej kompleksowej sekwencji z adnotacjami, przewiduj granice domen (lub serię możliwych granic) dla białka, starając się zmaksymalizować zachowanie i przewidywane cechy strukturalne, jednocześnie minimalizując ilość nieuporządkowanej lub elastycznej sekwencji. Jeśli jest to znane, otrzymane białko powinno zachować interesujące go właściwości funkcjonalne.</li>
</ol>
2. Ekspresja i oczyszczanie białek z granicami domen określonymi w sekcji 1
UWAGA: Celem tej sekcji jest użycie serii szybkich i łatwo mierzalnych testów do przesiewania hipotetycznych granic domen wygenerowanych w sekcji 1.
<ol>
	<li>Korzystając ze standardowych technik biologii molekularnej, wygeneruj plazmid ekspresyjny z pożądaną sekwencją kodującą w ramce w plazmidzie His 10-mRuby2-XH2 (patrz rysunek 3 dla mapy wektorowej i dodatkowych szczegółów).</li>
	<li>Zbadaj poziomy ekspresji dla każdego plazmidu ekspresyjnego przy użyciu BL21(DE3) E. coli lub innego odpowiedniego szczepu ekspresyjnego w pożywce autoindukcyjnej1 w temperaturze pokojowej przez 18-24 godziny.
	<ol>
		<li>Przekształć plazmidy ekspresyjne, a także pustą kontrolę plazmidu w BL21 (DE3) postępując zgodnie z instrukcjami dostarczonymi z komórkami lub przy użyciu solidnego protokołu transformacji, takiego jak ten tutaj (https://www.addgene.org/plasmid-protocols/bacterial-transformation/).</li>
		<li>Ze świeżo przekształconej płytki wybierz pojedynczą rodzinę i wyhoduj 5 ml kultury starterowej w temperaturze 37 °C przez noc w pożywce Lysography Bulion (LB) z 34 μg/ml kanamycyny.</li>
		<li>Następnego dnia osadzaj kulturę i myj osad świeżym LB.</li>
		<li>Dodać kulturę starterową do 50 ml pożywki autoindukcyjnej o stężeniu 34 μg/ml kanamycyny. Pozwól kulturze urosnąć do nasycenia w temperaturze pokojowej lub 37 °C. Zazwyczaj rośnie przez ~ 18-24 godziny.</li>
		<li>Osadzać komórki i zamrażać powstałe granulki komórkowe w temperaturze -80 °C na czas nieokreślony przed oczyszczeniem.</li>
		<li>Porównaj ekstrakty z całych komórek z każdego szczepu ekspresyjnego i kontroli pustego wektora za pomocą SDS-PAGE, aby określić szczep, który najefektywniej wytwarza pożądane białko fuzyjne. W przypadku białek fuzyjnych 10-mRuby2-Shroom SD2 uruchom 10% żele SDS-PAGE pod napięciem 180 V przez ~50 minut lub do momentu, gdy przód barwnika dotrze do dna żelu 22.</li>
		<li>Barwnik w żelu z Coomassie Blue, aby uwidocznić całkowitą ilość białek komórkowych w każdym szczepie23.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj wstępny etap chromatografii powinowactwa na każdym szczepie, który pomyślnie eksprymował białko fuzyjne mRuby2. Zazwyczaj etapy oczyszczania 2.3.2-2.3.7 należy przeprowadzić w temperaturze pokojowej, chyba że białko skorzysta na zmienionych warunkach, takich jak oczyszczanie w temperaturze 4 °C.
	<ol>
		<li>Rozmrozić granulki komórkowe z kroku 2.2.5.</li>
		<li>Zawiesić każdą komórkę w 1,5 ml buforu do lizy (10% glicerolu, 500 mM NaCl, 40 mM imidazolu, 20 mM Tris pH8,0, 1 mM beta-merkaptoetanolu). W razie potrzeby uzupełnić bufor do lizy inhibitorami proteazy.</li>
		<li>Dodać 30 μl 10 mg/ml lizozymu i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Sonicate postępując zgodnie z instrukcją dla używanego instrumentu.</li>
		<li>Przenieść do probówki o pojemności 1,5 ml i odwirować w wirówce stołowej przez 30 minut przy 14 000 x g w celu osadzenia nierozpuszczalnego materiału lub niezlizowanych komórek. Zapisz zarówno supernatant, jak i osad do późniejszej analizy za pomocą SDS-PAGE.</li>
		<li>Przeprowadzić oczyszczanie powinowactwa do niklu, inkubując rozpuszczalną frakcję ze 100 μl kulek Ni-NTA. Inkubuj kulki z rozpuszczalnym lizatem przez 5-10 minut, kilkakrotnie odwracając, aby wymieszać kulki.</li>
		<li>Wirować przy 800 x g przez 30 sekund w wirówce stołowej w celu granulowania kulek. Następnie przemyj granulat 3-5 razy buforem do lizy, aby usunąć niespecyficzne zanieczyszczenia.</li>
		<li>Elute rubinowe białko fuzyjne z kulek z buforem do lizy uzupełnionym 1 M imidazolem.</li>
		<li>Użyj SDS-PAGE, aby porównać zachowanie białek His-mRuby2-Shroom w "szybkim i brudnym" oczyszczaniu powyżej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Scharakteryzuj próbkę białka, aby zidentyfikować te o korzystnych właściwościach
<ol>
	<li>Za pomocą spektrofotometru ustawionego na 280 nm zmierz stężenie białka fuzyjnego Ruby, a następnie oceń jednorodność próbki, ładując 1-5 μg białka fuzyjnego na natywny żel PAGE24. Uruchom żel 10% Native PAGE w temperaturze 4 °C przez 140 minut przy napięciu 175 V.
	<ol>
		<li>Zobrazuj natywną PAGE za pomocą imagera wyposażonego w wizualizację fluorescencji, obserwując, gdzie migruje fuzja oznaczona mRuby w tym teście. 
		UWAGA: Uważaj, aby obserwować białko fuzyjne, które utknęło w studzience, ponieważ białko to jest prawdopodobnie zagregowane. Jeśli imager fluorescencyjny nie jest dostępny, często można wizualizować i obrazować skoncentrowane próbki białka znakowanego Ruby w czarnym świetle lub w lampie UV.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj ograniczoną proteolizę, aby zidentyfikować stabilnie pofałdowane domeny. Inkubować 95 μl fuzji Ruby-Shrm SD2 w temperaturze ~1 mg/ml z 5 μl 0,025% subtylizyny A.
	<ol>
		<li>Pobrać próbkę reakcji w punktach czasowych 0, 0,5, 2, 5, 15, 60 i 120 min, usuwając 10 μl z reakcji dla każdego punktu czasowego i wizualizując postęp reakcji za pomocą SDS-PAGE przy użyciu 15% żelu akrylowego.</li>
		<li>Wybarwić Coomassie Blue jak w kroku 2.2.7 i ocenić, czy można zidentyfikować gatunek odporny na proteazę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zintegruj dane z wydajności oczyszczania, zachowania w natywnym PAGE i ograniczonej proteolizy na częściowo oczyszczonych białkach fuzyjnych mRuby2-Shroom w kompleksową ocenę ogólnego zachowania tych białek w roztworze.
	<ol>
		<li>(Opcjonalnie) Jeśli dostępny jest odpowiedni test funkcjonalny, należy w tym momencie sprawdzić aktywność.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Produkcja wysokiej jakości kryształów domeny SD2 z grzybów
UWAGA: Wszystkie kroki opisane w sekcji 4.1 są wykonywane w temperaturze pokojowej, chyba że białko skorzystałoby na oczyszczeniu w innej temperaturze, zwykle 4 °C.
<ol>
	<li>Wykorzystując narośla o objętości 50 ml jako przybliżone oszacowanie potencjału ekspresji i oczyszczania, wykonaj ekspresję mRuby2-Shroom SD2 na dużą skalę w celu uzyskania 5-20 mg całkowicie oczyszczonej próbki. Zazwyczaj 2 litry kultury zapewniają odpowiedni materiał wyjściowy. Po wzroście komórki osadu przez odwirowanie przy 8 000 x g przez 10 min.
	<ol>
		<li>Zawiesić osad z 2 l wzrostu w buforze do lizy, jak poprzednio, używając ~ 2 ml lizy na gram osadu zamrożonych komórek, jeśli do lizy używa się lizozymu. Alternatywnie, zawiesić ponownie przy ~ 8 ml/g granulatu, jeśli używasz homogenizatora lub prasy francuskiej. Osadzanie resztek komórkowych przez odwirowanie przy 30 000 x g przez 30 min.</li>
		<li>Frakcję rozpuszczalną z ppkt 4.1.1 związać partiami za pomocą 10 ml żywicy Ni-NTA. Wlać do odpowiedniej kolumny grawitacyjnej i pozwolić niezwiązanym białkom odpłynąć.</li>
		<li>Przemyć żywicę 3-5 razy 40 ml buforu do lizy, a następnie przepłukać buforem do lizy uzupełnionym do 1 M NaCl.</li>
		<li>Przemyć żywicę 40 ml buforu do lizy uzupełnionego 80 mM imidazolem.</li>
		<li>Eluować białko fuzyjne rubinowo-grzybowe za pomocą 40 ml buforu do lizy uzupełnionego do 1 M imidazolu. Ręcznie frakcjonować eluowane białko na frakcje o objętości 4-10 ml.</li>
		<li>Potwierdź frakcje zawierające białko fuzyjne Ruby-Shroom za pomocą 10% SDS-PAGE.</li>
		<li>Dializuj odpowiednie frakcje (zwykle frakcje 2-4) do 8% glicerolu, 250 mM NaCl, 15 mM imidazolu, 20 mM Tris pH8,0, 1 mM β-ME, za pomocą rurki do dializy MWCO 6-8 kDa. Dodać 1 mg proteazy TEV na każde 25-50 mg białka fuzyjnego. Dializować przez noc w temperaturze pokojowej, powoli mieszając.</li>
		<li>Powtórzyć etapy oczyszczania powinowactwa do niklu 4.1.2-4.1.6. Domena Shroom SD2 powinna teraz pozostać we frakcji niezwiązanej, podczas gdy His 10-mRuby2 pozostanie związana z żywicą i znajdzie się we frakcjach elucyjnych. Potwierdź to za pomocą 12% barwienia SDS-PAGE za pomocą Coomassie Blue.</li>
		<li>Frakcje zawierające domenę Shroom SD2 dializować na 8% glicerolu, 100 mM NaCl, 20 mM Tris pH 8,0, 5 mM bufor beta-merkaptoetanolu przez noc.</li>
		<li>Przeprowadzić chromatografię anionowymienną25 przy użyciu FPLC i elucji z gradientem NaCl od 0,1-1,0 M NaCl. Analizuj ułamki za pomocą 12% SDS-PAGE.</li>
		<li>Używając koncentratora spinowego (MWCO 10 kDa lub więcej w zależności od badanego białka), zagęścić frakcje pików do ~ 0 mg / ml, a następnie przeprowadzić chromatografię wykluczania wielkości26, analizując frakcje pików za pomocą 12% SDS-PAGE.</li>
		<li>Zebrać frakcje szczytowe i dializować do 20 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 2% glicerolu, 1 mM β-ME i stężyć do 10 mg/ml przed krystalizacją. 
		Fakultatywnie: Na tym etapie należy pobrać 5 μl próbek o stężeniach 1, 2, 5 i 10 mg/ml w trakcie zagęszczania próbki. Uruchom natywną STRONĘ, ładując 2-5 μl każdej próbki, aby przyjrzeć się zachowaniu próbki na tym etapie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przesiewaj niewielką liczbę 12 warunków, aby określić optymalne stężenie białka do prób krystalizacji. Skład tych warunków opisano na rysunku 7.
	<ol>
		<li>Korzystając z 24-dołkowych tacek do krystalizacji z kroplami siedzącymi, należy przeprowadzić próby krystalizacji metodą dyfuzji parowej, pipetując 500 μl każdego z 12 warunków do oddzielnych studzienek, a następnie kropli, które początkowo zawierają 1 μl roztworu studzienki i 1 μl próbki białka na szkiełkach nakrywkowych. Więcej informacji na temat tej techniki można znaleźć wpunkcie 27.</li>
		<li>Szybko zamknij tackę przezroczystą taśmą i przenieś tackę do odpowiedniego środowiska o kontrolowanej temperaturze, które jest wolne od wibracji. Stosowana temperatura może się różnić, ale 4 °C, 16 °C i 20 °C są dość powszechne.</li>
		<li>Zbadaj krople w tackach przez następne 3 dni za pomocą mikroskopu przy powiększeniu do 100X. Pod koniec 3-dniowego okresu oceń każdą kroplę jako niezawierającą opadów (bezbarwny), lekkie opady, obfite opady (brązowy) lub kryształy. Odpowiednie stężenie białka powinno zawierać nie więcej niż 6 silnych opadów.</li>
		<li>Korzystając ze stężenia białka określonego w ppkt 4.2, należy przeprowadzić badania przesiewowe szerokiego zakresu dostępnych na rynku badań przesiewowych krystalizacji. Zastosowanie robota do obsługi cieczy lub krystalizacji znacznie przyspiesza ten proces, jednocześnie minimalizując błędy w kroplach. Wymaga również znacznie mniej białka, co pozwala użytkownikowi na badanie przesiewowe większej liczby warunków za pomocą jednej próbki.</li>
		<li>Popraw warunki początkowe zidentyfikowane na podstawie szerokich ekranów poprzez systematyczne zmienianie każdej ze zmiennych w kropli krystalizacji za pomocą 24-dołkowych tacek sitowych, tak jak poprzednio.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+expression+clones+and+auto-induction+for+protein+production+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli.</a> Methods Mol Biol. 1091, 17-32 (2014).</li>
<li>Studier, F. W., Moffatt, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+bacteriophage+T7+RNA+polymerase+to+direct+selective+high-level+expression+of+cloned+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes.</a> J Mol Biol. 189 (1), 113-130 (1986).</li>
<li>Chapman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+purification%3A+pure+but+not+simple%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Protein purification: pure but not simple.</a> Nature. 434 (7034), 795-798 (2005).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Lupas, A., Van Dyke, M., Stock, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+coiled+coils+from+protein+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Predicting coiled coils from protein sequences.</a> Science. 252 (5009), 1162-1164 (1991).</li>
<li>Offer, G., Hicks, M. R., Woolfson, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generalized+Crick+equations+for+modeling+noncanonical+coiled+coils%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Generalized Crick equations for modeling noncanonical coiled coils.</a> J Struct Biol. 137 (1-2), 41-53 (2002).</li>
<li>Lupas, A. N., Gruber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+alpha-helical+coiled+coils%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Protein+Chem%22%5BJournal%5D)">The structure of alpha-helical coiled coils.</a> Adv Protein Chem. 70, 37-78 (2005).</li>
<li>Hernandez Alvarez, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+expression+system+for+protein+crystallization+using+trimeric+coiled-coil+adaptors%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng+Des+Sel%22%5BJournal%5D)">A new expression system for protein crystallization using trimeric coiled-coil adaptors.</a> Protein Eng Des Sel. 21 (1), 11-18 (2008).</li>
<li>Slabinski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+challenge+of+protein+structure+determination--lessons+from+structural+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">The challenge of protein structure determination--lessons from structural genomics.</a> Protein Sci. 16 (11), 2472-2482 (2007).</li>
<li>Slabinski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XtalPred%3A+a+web+server+for+prediction+of+protein+crystallizability%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">XtalPred: a web server for prediction of protein crystallizability.</a> Bioinformatics. 23 (24), 3403-3405 (2007).</li>
<li>Haigo, S. L., Hildebrand, J. D., Harland, R. M., Wallingford, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shroom+induces+apical+constriction+and+is+required+for+hingepoint+formation+during+neural+tube+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Shroom induces apical constriction and is required for hingepoint formation during neural tube closure.</a> Curr Biol. 13 (24), 2125-2137 (2003).</li>
<li>Hildebrand, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shroom+regulates+epithelial+cell+shape+via+the+apical+positioning+of+an+actomyosin+network%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Shroom regulates epithelial cell shape via the apical positioning of an actomyosin network.</a> J Cell Sci. 118 (Pt 22), 5191-5203 (2005).</li>
<li>Dietz, M. L., Bernaciak, T. M., Vendetti, F., Kielec, J. M., Hildebrand, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+actin-dependent+localization+modulates+the+evolutionarily+conserved+activity+of+Shroom+family+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential actin-dependent localization modulates the evolutionarily conserved activity of Shroom family proteins.</a> J Biol Chem. 281 (29), 20542-20554 (2006).</li>
<li>Bolinger, C., Zasadil, L., Rizaldy, R., Hildebrand, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+isoforms+of+drosophila+shroom+define+spatial+requirements+for+the+induction+of+apical+constriction%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Specific isoforms of drosophila shroom define spatial requirements for the induction of apical constriction.</a> Dev Dyn. 239 (7), 2078-2093 (2010).</li>
<li>Farber, M. J., Rizaldy, R., Hildebrand, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shroom2+regulates+contractility+to+control+endothelial+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Shroom2 regulates contractility to control endothelial morphogenesis.</a> Mol Biol Cell. 22 (6), 795-805 (2011).</li>
<li>Das, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+between+Shroom3+and+Rho-kinase+is+required+for+neural+tube+morphogenesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Open%22%5BJournal%5D)">The interaction between Shroom3 and Rho-kinase is required for neural tube morphogenesis in mice.</a> Biol Open. 3 (9), 850-860 (2014).</li>
<li>Dvorsky, R., Blumenstein, L., Vetter, I. R., Ahmadian, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+the+interaction+of+ROCKI+with+the+switch+regions+of+RhoA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural insights into the interaction of ROCKI with the switch regions of RhoA.</a> J Biol Chem. 279 (8), 7098-7104 (2004).</li>
<li>Mohan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+highly+conserved+domain+of+Rock1+required+for+Shroom-mediated+regulation+of+cell+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Structure of a highly conserved domain of Rock1 required for Shroom-mediated regulation of cell morphology.</a> PLoS One. 8 (12), e81075(2013).</li>
<li>Mohan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+Shroom+domain+2+reveals+a+three-segmented+coiled-coil+required+for+dimerization%2C+Rock+binding%2C+and+apical+constriction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Structure of Shroom domain 2 reveals a three-segmented coiled-coil required for dimerization, Rock binding, and apical constriction.</a> Mol Biol Cell. 23 (11), 2131-2142 (2012).</li>
<li>Tu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+coiled-coil+domain+from+human+ROCK+I%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a coiled-coil domain from human ROCK I.</a> PLoS One. 6 (3), e18080(2011).</li>
<li>Sievers, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast%2C+scalable+generation+of+high-quality+protein+multiple+sequence+alignments+using+Clustal+Omega%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega.</a> Mol Syst Biol. 7, 539(2011).</li>
<li>Shapiro, A. L., Vinuela, E., Maizel, J. V. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+weight+estimation+of+polypeptide+chains+by+electrophoresis+in+SDS-polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels.</a> Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).</li>
<li>Diezel, W., Kopperschlager, G., Hofmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+procedure+for+protein+staining+in+polyacrylamide+gels+with+a+new+type+of+Coomassie+Brilliant+Blue%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">An improved procedure for protein staining in polyacrylamide gels with a new type of Coomassie Brilliant Blue.</a> Anal Biochem. 48 (2), 617-620 (1972).</li>
<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+and+limitations+of+clear-native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Advantages and limitations of clear-native PAGE.</a> Proteomics. 5 (17), 4338-4346 (2005).</li>
<li>Jungbauer, A., Hahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion-exchange+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Ion-exchange chromatography.</a> Methods Enzymol. 463, 349-371 (2009).</li>
<li>Yu, C. M., Mun, S., Wang, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theoretical+analysis+of+the+effects+of+reversible+dimerization+in+size+exclusion+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+A%22%5BJournal%5D)">Theoretical analysis of the effects of reversible dimerization in size exclusion chromatography.</a> J Chromatogr A. 1132 (1-2), 98-108 (2006).</li>
<li>Giege, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+historical+perspective+on+protein+crystallization+from+1840+to+the+present+day%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">A historical perspective on protein crystallization from 1840 to the present day.</a> FEBS J. 280 (24), 6456-6497 (2013).</li>
<li>Lobley, A., Sadowski, M. I., Jones, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pGenTHREADER+and+pDomTHREADER%3A+new+methods+for+improved+protein+fold+recognition+and+superfamily+discrimination%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">pGenTHREADER and pDomTHREADER: new methods for improved protein fold recognition and superfamily discrimination.</a> Bioinformatics. 25 (14), 1761-1767 (2009).</li>
<li>Marsden, R. L., McGuffin, L. J., Jones, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+protein+domain+assignment+from+amino+acid+sequence+using+predicted+secondary+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Rapid protein domain assignment from amino acid sequence using predicted secondary structure.</a> Protein Sci. 11 (12), 2814-2824 (2002).</li>
<li>Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Phyre2+web+portal+for+protein+modeling%2C+prediction+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis.</a> Nat Protoc. 10 (6), 845-858 (2015).</li>
<li>Elsliger, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+JCSG+high-throughput+structural+biology+pipeline%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+Sect+F+Struct+Biol+Cryst+Commun%22%5BJournal%5D)">The JCSG high-throughput structural biology pipeline.</a> Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 66 (Pt 10), 1137-1142 (2010).</li>
<li>Bach, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+maltose-binding+protein+as+a+molecular+chaperone+for+recombinant+intracellular+cytoplasmic+single-chain+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli maltose-binding protein as a molecular chaperone for recombinant intracellular cytoplasmic single-chain antibodies.</a> J Mol Biol. 312 (1), 79-93 (2001).</li>
<li>Strong, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+structural+genomics+of+complexes%3A+crystal+structure+of+a+PE%2FPPE+protein+complex+from+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Toward the structural genomics of complexes: crystal structure of a PE/PPE protein complex from Mycobacterium tuberculosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (21), 8060-8065 (2006).</li>
<li>Heras, B., Martin, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-crystallization+treatments+for+improving+diffraction+quality+of+protein+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Post-crystallization treatments for improving diffraction quality of protein crystals.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (Pt 9), 1173-1180 (2005).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany tutaj protokół ma na celu pomóc użytkownikowi zidentyfikować granice domen w dużych białkach o zwiniętej cewce, aby ułatwić ich krystalizację. Protokół opiera się na holistycznym włączeniu różnych danych z prognoz obliczeniowych i innych źródeł w celu wygenerowania szeregu potencjalnych granic domen. Po nich następuje zestaw eksperymentów biochemicznych, które są szybkie i niedrogie, i są wykorzystywane do dalszego udoskonalania tych początkowych hipotez. Korzystając z tego podejścia, użytkownik mógłby szybko wye...

Określanie struktury za pomocą krystalografii rentgenowskiej wniosło fundamentalny wkład w każdą dziedzinę współczesnej biologii; dostarczając atomowego spojrzenia na makrocząsteczki, które podtrzymują życie i jak oddziałują one ze sobą w różnych kontekstach; pozwalając nam zrozumieć mechanizmy powodujące choroby i dając możliwości racjonalnego projektowania leków do leczenia chorób. Krystalografia od dawna jest dominującą techniką eksperymentalną do określania struktury makromolekularnej i obecnie stanowi 89,3% strukturalnej bazy danych (www.rcsb.org). Technika ta ma wiele zalet, w tym potencjał bardzo wysokiej rozdzielczości, możliwość wizualizacji makrocząsteczek o szerokim zakresie rozmiarów, stosunkowo łatwe gromadzenie danych oraz możliwość wizualizacji, w jaki sposób makrocząsteczka oddziałuje z rozpuszczalnikiem, a także ligandami.
Pomimo licznych ulepszeń technologicznych w ekspresji białek rekombinowanych1,2, oczyszczaniu3 i biologii molekularnej używanej do generowania tych systemów4, największą przeszkodą w procesie krystalograficznym pozostaje możliwość hodowania kryształów o jakości dyfrakcyjnej. Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku białek, które zawierają duże domeny zwinięte cewki. Szacuje się, że aż 5% wszystkich aminokwasów znajduje się w zwiniętych zwojach5,6, co czyni tę cechę bardzo powszechną cechą strukturalną7, jednak białka te są często trudniejsze do oczyszczenia i krystalizacji niż białka kuliste8-10. Jest to dodatkowo spotęgowane przez fakt, że domeny zwinięte często znajdują się w kontekście większego białka, dlatego prawidłowe przewidywanie granic tych domen ma kluczowe znaczenie dla uniknięcia włączenia nieustrukturyzowanej lub elastycznej sekwencji, która często jest szkodliwa dla krystalizacji.
Tutaj prezentujemy ramy koncepcyjne łączące internetowe analizy obliczeniowe z danymi eksperymentalnymi z laboratorium, aby pomóc użytkownikom przejść przez początkowe etapy procesu krystalograficznego, w tym: jak wybrać fragment(y) białka do badań strukturalnych oraz jak przygotować i scharakteryzować próbki białek przed próbami krystalizacji. Skupiamy się na dwóch białkach zawierających duże domeny zwinięte cewki, Shroom (Shrm) i Rho-kinase (Rock). Białka te zostały wybrane, ponieważ oba zawierają domeny zwinięte i wiadomo, że tworzą biologicznie istotny kompleks11-16. Przewiduje się, że grzyb i kinaza Rho (skała) zawierają odpowiednio ~200 i 680 reszt zwiniętej cewki, z których wiele części scharakteryzowano strukturalnie17-20. Opisana tutaj metoda zapewnia usprawniony przepływ pracy w celu szybkiej identyfikacji fragmentów zwiniętej cewki zawierającej białko, które będą podatne na krystalizację, jednak opisane techniki można łatwo dostosować do większości białek lub kompleksów białkowych lub zmodyfikować w celu włączenia podejść o wysokiej przepustowości, jeśli są dostępne. Wreszcie, metody te są na ogół niedrogie i mogą być wykonywane przez użytkowników na prawie wszystkich poziomach doświadczenia.

<table><tbody><tr><td>BL21(DE3) Rosetta</td><td>Emd Millipore</td><td>70954-3</td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3) Star</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C601003</td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3) Codon Plus</td><td>Agilent Technologies</td><td>230245</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Spectrum Chemical Mfg Corp</td><td>L3008-5GM</td><td></td></tr><tr><td>Żywica Ni-NTA</td><td>Life Technologies</td><td>25216</td><td></td></tr><tr><td>SubtilisinA</td><td>Spectrum Chemical Mfg Corp</td><td>S1211-10ML</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka Cryschem Hampton</td><td>research</td><td>HR3-160</td><td></td></tr><tr><td>INTELLI-PLATE &nbsp; 96:</td> <td>Art Robbins Instruments</td><td>102-0001-03</td><td></td></tr><tr><td>PEG 3350</td><td>Hampton research</td><td>HR2-591</td><td></td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>Hampton research</td><td>HR2-515</td><td></td></tr><tr><td>PEG 400</td><td>Hampton research</td><td>HR2-603</td><td></td></tr><tr><td>PEG 4000</td><td>Hampton research</td><td>HR2-605</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1-Clover-mRuby2</td><td>Addgene</td><td>49089</td><td></td></tr><tr><td>Overnight Express Autoinduction System 1</td><td>Emd Millipore</td><td>71300</td><td></td></tr><tr><td>Lysogeny Bulion w proszku</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12795027&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

połączenie mokrych i suchych technik laboratoryjnych w celu kierowania krystalizacją dużych zwiniętych cewek białkowych

Combining Wet and Dry Lab Techniques to Guide the Crystallization of Large Coiled-coil Containing Proteins

Uzyskanie kryształów do określenia struktury może być trudnym i czasochłonnym zadaniem dla każdego białka. Białka i domeny zwinięte występują w całej przyrodzie, jednak ze względu na ich właściwości fizyczne i tendencję do agregacji, są tradycyjnie postrzegane jako szczególnie trudne do krystalizacji. Tutaj wykorzystujemy szereg szybkich i prostych technik zaprojektowanych w celu zidentyfikowania szeregu możliwych granic domen dla danego białka zwiniętego zwoju, a następnie szybko scharakteryzujemy zachowanie tych białek w roztworze. Dzięki dodatkowi silnie fluorescencyjnego znacznika (mRuby2) charakterystyka białka jest prosta i nieskomplikowana. Białko docelowe można łatwo zwizualizować w normalnym oświetleniu i określić ilościowo za pomocą odpowiedniego imagera. Celem jest szybka identyfikacja kandydatów, którzy mogą zostać usunięci z procesu krystalizacji, ponieważ jest mało prawdopodobne, że odniosą sukces, dając więcej czasu najlepszym kandydatom i mniej funduszy wydanych na białka, które nie wytwarzają kryształów. Proces ten może być iterowany w celu uwzględnienia informacji uzyskanych podczas wstępnych badań przesiewowych, może być dostosowany do wysokoprzepustowych procedur ekspresji i oczyszczania, a także jest wspomagany przez robotyczne badania przesiewowe w kierunku krystalizacji.

Schemat przedstawiający przepływ pracy wykorzystywany w tym systemie pokazano na Rysunku 1; obejmuje on trzy główne etapy. Do opracowania hipotez dotyczących granic domen białka coiled-coil, które jest przedmiotem zainteresowania, wykorzystuje się analizę obliczeniową sekwencji. Przykład adnotowanej analizy domeny SD2 białka Shrm2 przedstawiono na Rysunku 2. Celem w tym schemacie była identyfikacja możliwych granic domeny dla konserwatywnej domeny na C-ko...

Opisujemy strukturę obejmującą prostą analizę biochemiczną i obliczeniową, aby kierować charakterystyką i krystalizacją dużych domen o zwiniętych zwojach. Struktura ta może być dostosowana do białek globularnych lub rozszerzona w celu uwzględnienia różnych technik wysokoprzepustowych.

Połączenie mokrych i suchych technik laboratoryjnych w celu kierowania krystalizacją dużych zwiniętych cewek białkowych

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are ...

Ogólnym celem tej procedury jest szybka identyfikacja i przetestowanie możliwych granic domen w dużych białkach o zwiniętej cewce, aby zwiększyć prawdopodobieństwo znalezienia wewnętrznego fragmentu, który ulegnie krystalizacji. Metoda ta może pomóc naukowcom usprawnić proces krystalizacji dużych białek o zwoju spiralnym, które mogą być niezwykle trudne do skrystalizacji. Zaletą tej techniki jest to, że integruje ona zarówno metody eksperymentalne, jak i obliczeniowe w celu szybkiej identyfikacji i badań przesiewowych prawdopodobnych kandydatów do krystalizacji, zwiększając w ten sposób ich szanse na sukces.Technikę tę zademonstrują Jenna Zalewski, doktorantka w moim laboratorium, oraz Keith O'Conor, badacz w moim laboratorium. Na początek połącz dane wyjściowe z uznanych narzędzi internetowych, aby wygenerować przewidywania możliwych granic domen zwojów zwojów, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Po wygenerowaniu plazmidów ekspresyjnych i przetestowaniu ich poziomów ekspresji, jak opisano w tekście, rozpocznij oczyszczanie każdego szczepu, który pomyślnie eksprymował białko oznaczone Ruby.Aby zejść komórki, najpierw ponownie zawieś każdą rozmrożoną osadę komórkową w 1,5 mililitra buforu do lizy, który został uzupełniony inhibitorami proteazy. Dodać 30 mikrolitrów lizozymu w stężeniu 10 miligramów na mililitr i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut, a następnie sonikatować, postępując zgodnie z instrukcjami dla używanego instrumentu. Odwirować próbkę w wirówce stołowej przez 30 minut w temperaturze 14 000 razy G, aby uzyskać osadzanie nierozpuszczalnego materiału lub niezlizowanych komórek.Zachowaj zarówno supernatant, jak i osad do późniejszej analizy za pomocą SDS-PAGE. Aby przeprowadzić oczyszczanie powinowactwa do niklu, najpierw inkubuj 100 mikrolitrów kulek niklu NTA, wstępnie umytych w buforze do lizy z rozpuszczalnym lizatem przez pięć do 10 minut. Odwróć zawiesinę kilka razy, aby wymieszać kulki.Odwirować próbkę o temperaturze 800 razy G przez 30 sekund w wirówce stołowej w celu osadzenia kulek. Następnie przemyj granulat trzy do pięciu razy buforem do lizy, aby usunąć niespecyficzne zanieczyszczenia. Na koniec wymyj białko fuzyjne Ruby z kulek za pomocą buforu do lizy, uzupełnionego jednym molowym imidazolem.Użyj spektrofotometru ustawionego na 280 nanometrów, aby zmierzyć stężenie białka fuzyjnego Ruby, a następnie oceń jednorodność próbki, ładując od jednego do pięciu mikrogramów białka fuzyjnego na natywny żel PAGE. Uruchom 10% natywny żel PAGE w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 140 minut przy napięciu 175 woltów. Zobrazuj natywną PAGE za pomocą imagera wyposażonego w wizualizację fluorescencji, obserwując, gdzie w tym teście migruje fuzja oznaczona tagiem Ruby.Wykonaj ograniczoną proteolizę, aby zidentyfikować stabilnie pofałdowane domeny, najpierw inkubując 95 mikrolitrów fuzji Ruby-Shroom SD2 z pięcioma mikrolitrami 0,025 Subtylizyny A. Próbkuj reakcję w punktach czasowych zero, 0,5, dwóch, pięciu, 15, 60 i 120 minut, usuwając 10 mikrolitrów z reakcji dla każdego punktu czasowego i wizualizując postęp reakcji za pomocą SDS-PAGE przy użyciu 15% żelu akrylowego. Zabarwić żel kolorem Coomassie blue, aby ocenić, czy można zidentyfikować gatunek odporny na proteazę. Zintegruj dane z wydajności oczyszczania, zachowania w natywnym PAGE i ograniczonej proteolizy na częściowo oczyszczonych białkach fuzyjnych mRuby2-Shroom w kompleksową ocenę ogólnego zachowania tych białek w roztworze.Wykonaj ekspresje na dużą skalę za pomocą dwulitrowych kultur mRuby2-Shroom SD2 w celu uzyskania od pięciu do 20 miligramów całkowicie oczyszczonej próbki. Po wzroście komórek osadzać komórki przez odwirowanie w temperaturze 8 000 razy G przez 10 minut. Powstały osad komórkowy można przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aż będzie potrzebny.Następnie ponownie zawiesić osad w około ośmiu mililitrach buforu do lizy na gram zamrożonego osadu komórkowego. Ponownie zawieszone komórki poddać lizie za pomocą homogenizatora. Po lizie komórek osadzaj resztki komórkowe przez wirowanie w temperaturze 30 000 razy G przez 30 minut.Następnie partią zwiąż frakcję rozpuszczalną za pomocą 10 mililitrów wstępnie umytej żywicy niklowej NTA. Wlej zawiesinę kulek do odpowiedniej kolumny grawitacyjnej i pozwól, aby niezwiązane białka odsączyły się, a następnie przemyj żywicę trzy do pięciu razy 40 mililitrami buforu do lizy, a następnie przepłucz buforem do lizy uzupełnionym jednym molowym chlorkiem sodu. Wykonać końcowe płukanie żywicy 40 mililitrami buforu do lizy uzupełnionego 80 milimolowym imidazolem.Eluować białko fuzyjne rubinowo-grzybowe za pomocą 40 mililitrów buforu do lizy zawierającego jeden molowy imidazol. Ręcznie frakcjonuj eluowane białko na frakcje o pojemności od czterech do 10 mililitrów. Potwierdź frakcje zawierające białko fuzyjne Ruby-Shroom za pomocą żelu 10%SDS-PAGE.Dodaj jeden miligram proteazy TEV na każde 25 do 50 miligramów białka fuzyjnego, aby usunąć znacznik rubinowy. Następnie dializuj odpowiednie frakcje do buforu rozszczepienia TEV za pomocą rurki dializacyjnej o masie cząsteczkowej od sześciu do ośmiu kilodaltonów. Białko dializować przez noc w temperaturze pokojowej, powoli mieszając.Po dializie powtórzyć etapy oczyszczania z powinowactwa do niklu. Domena Shroom-SD2 powinna przepłynąć do frakcji niezwiązanej, podczas gdy znacznik Ruby pozostaje związany z żywicą. Za pomocą koncentratora spinowego skoncentruj frakcje pików do około 10 miligramów na mililitr, a następnie wykonaj chromatografię wykluczania wielkości, analizując frakcje pików za pomocą 12% żelu SDS-PAGE.Po zebraniu frakcji pikowych należy przeprowadzić dializę roztworu do buforu krystalizacyjnego, a następnie skoncentrować dializowane białko do 10 miligramów na mililitr przed krystalizacją. Przesiewaj niewielką liczbę 12 warunków, aby określić optymalne stężenie białka do prób krystalizacji przy użyciu 24 dobrze osadzonych tac do krystalizacji. Wykonać próby krystalizacji metodą dyfuzji parowej.Najpierw odpipetuj 500 mikrolitrów każdego z 12 warunków do oddzielnych studzienek. Na każdym cokole przygotuj krople zawierające jeden mikrolitr roztworu studzienki i jeden mikrolitr próbki białka. Szybko zaklej tackę przezroczystą taśmą, a następnie przenieś tackę do odpowiedniego środowiska o kontrolowanej temperaturze, które jest wolne od wibracji.Badaj krople w tackach przez następne trzy dni za pomocą mikroskopu przy powiększeniu do 100x. Pod koniec trzydniowego okresu należy ocenić, czy każda kropla nie zawiera opadów, lekkie opady, obfite opady lub kryształy. Odpowiednie stężenie białka nie powinno zawierać więcej niż sześć silnych wytrąceń.Korzystając z oznaczonego stężenia białka, przeprowadź badania przesiewowe szerokiej gamy dostępnych na rynku ekranów krystalizacji. Zastosowanie robota do obsługi cieczy lub krystalizacji znacznie przyspiesza ten proces, jednocześnie minimalizując błędy w kroplach. Wymaga znacznie mniej białka, co pozwala użytkownikowi na badanie przesiewowe większej liczby warunków za pomocą jednej próbki.Popraw warunki początkowe zidentyfikowane na podstawie szerokich ekranów poprzez systematyczne zmienianie każdej ze zmiennych w kropli krystalizacji za pomocą 24-dołkowych tac sitowych, tak jak poprzednio. Ograniczona proteoliza służy do identyfikacji regionów białka, które mogą być elastyczne lub w inny sposób bardziej dostępne dla proteazy. Pokazany tutaj jest wzorzec degradacji dla domeny SD2, która jest proteolitycznie wrażliwa, i innej, która jest dość stabilna.Ograniczoną proteolizę przeprowadzono w kontekście białek fuzyjnych Ruby. W tym przypadku, sekwencja łącznika między Ruby a domeną SD2 została szybko rozszczepiona, zgodnie z oczekiwaniami, ale powstałe fragmenty Ruby i SD2 pozostały w dużej mierze stabilne. Analiza za pomocą natywnej strony może szybko ujawnić dobrych kandydatów do krystalizacji.Cztery kompleksy Shroom-Rock z różnymi bateriami białkowymi przeprowadzono na natywnych żelach PAGE. Kompleks zawierający skały od 834 do 913 zachowywał się najlepiej i łatwo krystalizował, podczas gdy inne krystalizowały tylko podczas degradacji lub nie krystalizowały całkowicie. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak opracować zestaw potencjalnych granic domen dla swojego dużego białka o zwiniętej cewki i jak używać systemu Ruby do szybkiej i szybkiej identyfikacji najlepszych kandydatów do krystalizacji.Podczas gdy krystalografia pozostaje czasochłonnym przedsięwzięciem, zastosowanie tej techniki skupi się na poszukiwaniu białek, które będą krystalizować za pomocą prostych testów w celu usunięcia słabych kandydatów, co pozwoli Ci poświęcić więcej czasu na kandydatów z lepszymi perspektywami sukcesu. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby podać jak najwięcej informacji podczas wybierania możliwych granic domeny. Informacje, które zdecydujesz się wybrać podczas korzystania z tej procedury, będą się różnić dla każdego białka.Jeśli to możliwe, należy przeprowadzić inne metody, takie jak testy komórkowe lub biochemiczne, aby upewnić się, że fragmenty białka, o których mowa, nadal pełnią funkcję o znaczeniu biologicznym. Chociaż metoda ta koncentruje się na białkach typu coiled-coil, ogólny szkielet można łatwo dostosować do prawie każdego białka. Nie zapominaj, że praca z niektórymi przyrządami i odczynnikami biologicznymi może być niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak używanie rękawiczek lub noszenie okularów ochronnych.

combining-wet-dry-lab-techniques-to-guide-crystallization-large

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Struktura trójwymiarowa cząsteczki pozwala na unikalne zrozumienie sposobu jej funkcjonowania. Główną metodą wyznaczania struktury w rozdzielczości bliskiej atomowej jest krystalografia rentgenowska. W niniejszym materiale prezentujemy aktualne metody otrzymywania kryształów trójwymiarowych dowolnej makrocząsteczki, które nadają się do wyznaczenia struktury za pomocą krystalografii rentgenowskiej.

Krystalizacja białek do krystalografii rentgenowskiej

Protokoły opisują kluczowe etapy otrzymywania kryształów białka błonowego o jakości dyfrakcyjnej, począwszy od rekonstytucji białka w lipidowej fazie kubicznej (LCP), poprzez wyznaczanie warunków wstępnych za pomocą testów prekrystalizacyjnych LCP-FRAP, aż po przygotowanie prób krystalizacji w LCP i pozyskiwanie kryształów.

Krystalizacja białek błonowych w mezofazach lipidowych

Bicele są mieszaninami lipidów i amfifili, które utrzymują białka błonowe (MPs) w obrębie dwuwarstwy lipidowej, lecz wykazują unikalne zachowanie fazowe, co ułatwia wysokoprzepustowe przesiewy za pomocą robotów krystalizacyjnych. Technika ta pozwoliła na uzyskanie wielu struktur o wysokiej rozdzielczości pochodzących zarówno z organizmów prokariotycznych, jak i eukariotycznych. Niniejszy film opisuje protokoły przygotowania lipidowej mieszaniny bicel, wprowadzania białek błonowych do mieszaniny...

Wysokoprzepustowa krystalizacja białek błonowych z wykorzystaniem metody lipidowych biceli

Projektowanie leków w oparciu o strukturę odgrywa istotną rolę w opracowywaniu nowych preparatów terapeutycznych. Równoległe dążenie do uzyskania wielu celów znacznie zwiększa szanse na sukces w odkrywaniu związków wiodących. Poniższy artykuł przedstawia, w jaki sposób Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease wykorzystuje podejście wielocelowe w procesie wyznaczania struktury na podstawie genu dla podjednostki PB2 wirusa grypy typu A.

Podejście z zastosowaniem równoległego przetwarzania wielu celów w wyznaczaniu struktury na podstawie sekwencji genu podjednostki PB2 polimerazy wirusa grypy

β-beczkowate białka błony zewnętrznej (OMP) pełnią wiele funkcji w zewnętrznych błonach bakterii Gram-ujemnych, mitochondriów i chloroplastów. W tym miejscu mamy nadzieję złagodzić znane wąskie gardło w badaniach strukturalnych poprzez przedstawienie protokołów produkcji β-beczkowych OMP w ilościach wystarczających do określenia struktury za pomocą krystalografii rentgenowskiej lub spektroskopii NMR.

Od konstruktów do kryształów – w kierunku określania struktury β-baryłkowych białek błony zewnętrznej

To jest szybki, efektywny kosztowo protokół produkcji wydzielanych, glikozylowanych białek ssaków i późniejszego jednoetapowego oczyszczania z wystarczającą wydajnością jednorodnego białka do krystalografii rentgenowskiej i innych badań biofizycznych.

Wydajna ekspresja komórek ssaków i jednoetapowe oczyszczanie zewnątrzkomórkowych glikoprotein do krystalizacji

Zautomatyzowane systemy i protokoły do rutynowego przygotowania dużej liczby ekranów i nanolitrowych kropelek krystalizacji do eksperymentów dyfuzji par są opisane i omówione.

Zautomatyzowane protokoły krystalizacji makromolekularnej w Laboratorium Biologii Molekularnej MRC

Tutaj prezentujemy protokół kontrolowanej produkcji mikrokryształów białka. W procesie wykorzystuje się zautomatyzowane urządzenie pozwalające na kontrolowaną manipulację kilkoma parametrami krystalizacji. Krystalizacja białka odbywa się poprzez kontrolowane i zautomatyzowane dodawanie roztworów krystalizacyjnych przy jednoczesnym monitorowaniu i badaniu rozkładu promienia cząstek w kropli krystalizacji.

Hodowla kryształów białkowych o różnych wymiarach przy użyciu automatycznej krystalizacji połączonej z dynamicznym rozpraszaniem światła in situ

Prezentowany protokół opisuje proste podejście do badania przesiewowego warunków krystalizacji białek i wzrostu kryształów przy użyciu 96-dołkowej płytki do dializy o wysokiej przepustowości. Zastosowanie probówek dializatorów do hodowli mikrokryształów na dużą skalę wykazano również w krystalografii seryjnej i zastosowaniach MicroED.

Wysokoprzepustowa krystalizacja białek za pomocą mikrodializy

Ten protokół opisuje konfigurację do krystalizacji transportera steroli ABCG5/G8. ABCG5/G8 jest odtwarzany w postaci wodoroceli w celu krystalizacji w kropli wiszącej. Protokół nie wymaga specjalistycznych materiałów ani podłoży, dzięki czemu jest dostępny i łatwy do adaptacji w każdym laboratorium w celu określenia struktury białka za pomocą krystalografii rentgenowskiej.

Krystalizacja ABCG5/G8 w lipidowym środowisku bicelle do krystalografii rentgenowskiej

Poznaj metodę łączącą techniki eksperymentalne i obliczeniowe do identyfikacji granic domen w dużych białkach zwiniętych cewkowych. To podejście usprawnia proces krystalizacji białek trudnych do ukrystalizowania.

Połączenie mokrych i suchych technik laboratoryjnych w celu kierowania krystalizacją dużych zwiniętych cewek białkowych

Przeglądaj więcej filmów