Połączenie mokrych i suchych technik laboratoryjnych w celu kierowania krystalizacją dużych zwiniętych cewek białkowych

Ogólnym celem tej procedury jest szybka identyfikacja i przetestowanie możliwych granic domen w dużych białkach o zwiniętej cewce, aby zwiększyć prawdopodobieństwo znalezienia wewnętrznego fragmentu, który ulegnie krystalizacji. Metoda ta może pomóc naukowcom usprawnić proces krystalizacji dużych białek o zwoju spiralnym, które mogą być niezwykle trudne do skrystalizacji. Zaletą tej techniki jest to, że integruje ona zarówno metody eksperymentalne, jak i obliczeniowe w celu szybkiej identyfikacji i badań przesiewowych prawdopodobnych kandydatów do krystalizacji, zwiększając w ten sposób ich szanse na sukces.

Technikę tę zademonstrują Jenna Zalewski, doktorantka w moim laboratorium, oraz Keith O'Conor, badacz w moim laboratorium. Na początek połącz dane wyjściowe z uznanych narzędzi internetowych, aby wygenerować przewidywania możliwych granic domen zwojów zwojów, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Po wygenerowaniu plazmidów ekspresyjnych i przetestowaniu ich poziomów ekspresji, jak opisano w tekście, rozpocznij oczyszczanie każdego szczepu, który pomyślnie eksprymował białko oznaczone Ruby.

Aby zejść komórki, najpierw ponownie zawieś każdą rozmrożoną osadę komórkową w 1,5 mililitra buforu do lizy, który został uzupełniony inhibitorami proteazy. Dodać 30 mikrolitrów lizozymu w stężeniu 10 miligramów na mililitr i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut, a następnie sonikatować, postępując zgodnie z instrukcjami dla używanego instrumentu. Odwirować próbkę w wirówce stołowej przez 30 minut w temperaturze 14 000 razy G, aby uzyskać osadzanie nierozpuszczalnego materiału lub niezlizowanych komórek.

Zachowaj zarówno supernatant, jak i osad do późniejszej analizy za pomocą SDS-PAGE. Aby przeprowadzić oczyszczanie powinowactwa do niklu, najpierw inkubuj 100 mikrolitrów kulek niklu NTA, wstępnie umytych w buforze do lizy z rozpuszczalnym lizatem przez pięć do 10 minut. Odwróć zawiesinę kilka razy, aby wymieszać kulki.

Odwirować próbkę o temperaturze 800 razy G przez 30 sekund w wirówce stołowej w celu osadzenia kulek. Następnie przemyj granulat trzy do pięciu razy buforem do lizy, aby usunąć niespecyficzne zanieczyszczenia. Na koniec wymyj białko fuzyjne Ruby z kulek za pomocą buforu do lizy, uzupełnionego jednym molowym imidazolem.

Użyj spektrofotometru ustawionego na 280 nanometrów, aby zmierzyć stężenie białka fuzyjnego Ruby, a następnie oceń jednorodność próbki, ładując od jednego do pięciu mikrogramów białka fuzyjnego na natywny żel PAGE. Uruchom 10% natywny żel PAGE w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 140 minut przy napięciu 175 woltów. Zobrazuj natywną PAGE za pomocą imagera wyposażonego w wizualizację fluorescencji, obserwując, gdzie w tym teście migruje fuzja oznaczona tagiem Ruby.

Wykonaj ograniczoną proteolizę, aby zidentyfikować stabilnie pofałdowane domeny, najpierw inkubując 95 mikrolitrów fuzji Ruby-Shroom SD2 z pięcioma mikrolitrami 0,025 Subtylizyny A. Próbkuj reakcję w punktach czasowych zero, 0,5, dwóch, pięciu, 15, 60 i 120 minut, usuwając 10 mikrolitrów z reakcji dla każdego punktu czasowego i wizualizując postęp reakcji za pomocą SDS-PAGE przy użyciu 15% żelu akrylowego. Zabarwić żel kolorem Coomassie blue, aby ocenić, czy można zidentyfikować gatunek odporny na proteazę. Zintegruj dane z wydajności oczyszczania, zachowania w natywnym PAGE i ograniczonej proteolizy na częściowo oczyszczonych białkach fuzyjnych mRuby2-Shroom w kompleksową ocenę ogólnego zachowania tych białek w roztworze.

Wykonaj ekspresje na dużą skalę za pomocą dwulitrowych kultur mRuby2-Shroom SD2 w celu uzyskania od pięciu do 20 miligramów całkowicie oczyszczonej próbki. Po wzroście komórek osadzać komórki przez odwirowanie w temperaturze 8 000 razy G przez 10 minut. Powstały osad komórkowy można przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aż będzie potrzebny.

Następnie ponownie zawiesić osad w około ośmiu mililitrach buforu do lizy na gram zamrożonego osadu komórkowego. Ponownie zawieszone komórki poddać lizie za pomocą homogenizatora. Po lizie komórek osadzaj resztki komórkowe przez wirowanie w temperaturze 30 000 razy G przez 30 minut.

Następnie partią zwiąż frakcję rozpuszczalną za pomocą 10 mililitrów wstępnie umytej żywicy niklowej NTA. Wlej zawiesinę kulek do odpowiedniej kolumny grawitacyjnej i pozwól, aby niezwiązane białka odsączyły się, a następnie przemyj żywicę trzy do pięciu razy 40 mililitrami buforu do lizy, a następnie przepłucz buforem do lizy uzupełnionym jednym molowym chlorkiem sodu. Wykonać końcowe płukanie żywicy 40 mililitrami buforu do lizy uzupełnionego 80 milimolowym imidazolem.

Eluować białko fuzyjne rubinowo-grzybowe za pomocą 40 mililitrów buforu do lizy zawierającego jeden molowy imidazol. Ręcznie frakcjonuj eluowane białko na frakcje o pojemności od czterech do 10 mililitrów. Potwierdź frakcje zawierające białko fuzyjne Ruby-Shroom za pomocą żelu 10%SDS-PAGE.

Dodaj jeden miligram proteazy TEV na każde 25 do 50 miligramów białka fuzyjnego, aby usunąć znacznik rubinowy. Następnie dializuj odpowiednie frakcje do buforu rozszczepienia TEV za pomocą rurki dializacyjnej o masie cząsteczkowej od sześciu do ośmiu kilodaltonów. Białko dializować przez noc w temperaturze pokojowej, powoli mieszając.

Po dializie powtórzyć etapy oczyszczania z powinowactwa do niklu. Domena Shroom-SD2 powinna przepłynąć do frakcji niezwiązanej, podczas gdy znacznik Ruby pozostaje związany z żywicą. Za pomocą koncentratora spinowego skoncentruj frakcje pików do około 10 miligramów na mililitr, a następnie wykonaj chromatografię wykluczania wielkości, analizując frakcje pików za pomocą 12% żelu SDS-PAGE.

Po zebraniu frakcji pikowych należy przeprowadzić dializę roztworu do buforu krystalizacyjnego, a następnie skoncentrować dializowane białko do 10 miligramów na mililitr przed krystalizacją. Przesiewaj niewielką liczbę 12 warunków, aby określić optymalne stężenie białka do prób krystalizacji przy użyciu 24 dobrze osadzonych tac do krystalizacji. Wykonać próby krystalizacji metodą dyfuzji parowej.

Najpierw odpipetuj 500 mikrolitrów każdego z 12 warunków do oddzielnych studzienek. Na każdym cokole przygotuj krople zawierające jeden mikrolitr roztworu studzienki i jeden mikrolitr próbki białka. Szybko zaklej tackę przezroczystą taśmą, a następnie przenieś tackę do odpowiedniego środowiska o kontrolowanej temperaturze, które jest wolne od wibracji.

Badaj krople w tackach przez następne trzy dni za pomocą mikroskopu przy powiększeniu do 100x. Pod koniec trzydniowego okresu należy ocenić, czy każda kropla nie zawiera opadów, lekkie opady, obfite opady lub kryształy. Odpowiednie stężenie białka nie powinno zawierać więcej niż sześć silnych wytrąceń.

Korzystając z oznaczonego stężenia białka, przeprowadź badania przesiewowe szerokiej gamy dostępnych na rynku ekranów krystalizacji. Zastosowanie robota do obsługi cieczy lub krystalizacji znacznie przyspiesza ten proces, jednocześnie minimalizując błędy w kroplach. Wymaga znacznie mniej białka, co pozwala użytkownikowi na badanie przesiewowe większej liczby warunków za pomocą jednej próbki.

Popraw warunki początkowe zidentyfikowane na podstawie szerokich ekranów poprzez systematyczne zmienianie każdej ze zmiennych w kropli krystalizacji za pomocą 24-dołkowych tac sitowych, tak jak poprzednio. Ograniczona proteoliza służy do identyfikacji regionów białka, które mogą być elastyczne lub w inny sposób bardziej dostępne dla proteazy. Pokazany tutaj jest wzorzec degradacji dla domeny SD2, która jest proteolitycznie wrażliwa, i innej, która jest dość stabilna.

Ograniczoną proteolizę przeprowadzono w kontekście białek fuzyjnych Ruby. W tym przypadku, sekwencja łącznika między Ruby a domeną SD2 została szybko rozszczepiona, zgodnie z oczekiwaniami, ale powstałe fragmenty Ruby i SD2 pozostały w dużej mierze stabilne. Analiza za pomocą natywnej strony może szybko ujawnić dobrych kandydatów do krystalizacji.

Cztery kompleksy Shroom-Rock z różnymi bateriami białkowymi przeprowadzono na natywnych żelach PAGE. Kompleks zawierający skały od 834 do 913 zachowywał się najlepiej i łatwo krystalizował, podczas gdy inne krystalizowały tylko podczas degradacji lub nie krystalizowały całkowicie. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak opracować zestaw potencjalnych granic domen dla swojego dużego białka o zwiniętej cewki i jak używać systemu Ruby do szybkiej i szybkiej identyfikacji najlepszych kandydatów do krystalizacji.

Podczas gdy krystalografia pozostaje czasochłonnym przedsięwzięciem, zastosowanie tej techniki skupi się na poszukiwaniu białek, które będą krystalizować za pomocą prostych testów w celu usunięcia słabych kandydatów, co pozwoli Ci poświęcić więcej czasu na kandydatów z lepszymi perspektywami sukcesu. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby podać jak najwięcej informacji podczas wybierania możliwych granic domeny. Informacje, które zdecydujesz się wybrać podczas korzystania z tej procedury, będą się różnić dla każdego białka.

Jeśli to możliwe, należy przeprowadzić inne metody, takie jak testy komórkowe lub biochemiczne, aby upewnić się, że fragmenty białka, o których mowa, nadal pełnią funkcję o znaczeniu biologicznym. Chociaż metoda ta koncentruje się na białkach typu coiled-coil, ogólny szkielet można łatwo dostosować do prawie każdego białka. Nie zapominaj, że praca z niektórymi przyrządami i odczynnikami biologicznymi może być niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak używanie rękawiczek lub noszenie okularów ochronnych.