Wykorzystanie liniowych kanałów agarozowych do badania pełzania larw Drosophila
26 listopada 2016
Larwa Drosophila to potężny system modelowy do badania neuronalnej kontroli zachowania. Publikacja ta opisuje zastosowanie liniowych kanałów agarozowych do wywoływania długotrwałych napadów liniowego pełzania oraz metody ilościowego określania dynamiki struktur larwalnych podczas powtarzających się zachowań pełzania.
Ogólnym celem tej procedury jest obserwacja stadium larwalnego Drosophila pełzającego w liniowym kanale agarozowym w celu zbadania rozwoju obwodów nerwowych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neuroetologii i biologii rozwoju, takie jak zrozumienie kodów neuronalnych, które generują wzorce motoryczne i identyfikacja kluczowych procesów genetycznych i komórkowych, które obejmują obwody neuronalne w celu kontroli ruchu. Główną zaletą tej techniki jest to, że ogranicza ona repertuar zachowań larw, dzięki czemu naukowcy mogą szczegółowo badać pojedynczy wzorzec wielogatunkowy.
Procedurę zademonstruje Zarion Marshall, technik z mojego laboratorium. Po pierwsze, ważne jest, aby ocenić stan zdrowia larwy. Trzy do czterech dni przed nagraniem wymień płytkę zbiorczą klatki dla dorosłych.
Rób to codziennie i o tej samej porze dnia. Policz jaja i nowo wyklute larwy na talerzu. Przewidywana liczba jaj wynosi od 500 do 2 000.
W razie potrzeby dostosuj liczbę dorosłych osobników w klatce. Badamy płytkę 24 godziny później, aby ustalić, czy larwy są zdrowe. Z większości jaj powinny wykluć się larwy, a larwy powinny wpełznąć do pasty drożdżowej.
Oznaki złego stanu zdrowia obejmują dużą liczbę niewyklutych jaj, martwe ciała larwalne z dala od pasty drożdżowej oraz larwy z niezwykle ciemnymi plamami w jamie brzusznej, które są wskaźnikiem reakcji immunologicznej. Jeśli larwy wydają się niezdrowe, zmień klatkę na świeżo przygotowane płytki i sprawdź genotyp dorosłego osobnika. Do eksperymentu należy zebrać nowo wyklute larwy drugiego stadium rozwojowego z jedno- lub dwudniowych płytek.
Wszystkie te etapy można wykorzystać w analizie. W przypadku tego protokołu należy mieć formę odlewniczą PDMS z kanałem liniowym. Oczyść formę odlewaną alkoholem izopropylowym.
Po wyschnięciu umieść formę w dziesięciocentymetrowej pokrywce lub podobnym pojemniku. Następnie wypełnij formę trzyprocentową agarozą schłodzoną do 55 stopni Celsjusza. Ostrożnie wlej agarozę, aby uniknąć uwięzienia pęcherzyków powietrza w formie.
Pleśń powinna być po prostu pokryta agarozą. Po zestaleniu się usuń kanały agarozy z formy. Przytnij krawędzie kanałów w kształcie dysku, a następnie zanurz kanały w wodzie.
Można je przechowywać w wodzie o temperaturze czterech stopni Celsjusza do siedmiu dni. Przed użyciem kanałów pozwól im ogrzać się do temperatury pokojowej. Wybierz kanał, który pasuje do szerokości larwy.
Kanały mają szerokość od 100 do 300 mikronów i głębokość 150 mikronów. Następnie użyj czystej żyletki, aby wyciąć pojedynczy kanał z przygotowanego dysku. Za pomocą kleszczyków przenieś kanał na szklaną szkiełko nakrywkowe o odpowiedniej wielkości lub przesuń rowkowaną stroną do góry.
Następnie użyj cienkich kleszczy, aby delikatnie podnieść larwę bez jej ściskania. Dobrze sprawdza się również pędzel z cienką końcówką. W przypadku ściśnięcia, odruchy bólowe, takie jak turlanie się lub garbienie, mogą zdominować zachowanie larwy w kanale.
Teraz umyj larwę, zanurzając ją na krótko w wodzie, a następnie umieść ją w wyciętym kanale, delikatnie drażniąc ją na miejscu. Po wejściu do kanału dostosuj orientację larwy, aby ułatwić zobrazowanie interesującej nas struktury. Następnie umieść jedną lub dwie krople wody na obu końcach kanału, aby napełnić kanał wodą.
Jeśli jakiekolwiek pęcherzyki powietrza zostaną uwięzione, delikatnie podnieś boki kanału, aby je usunąć. Aby jeszcze bardziej dostosować orientację larwy, delikatnie popchnij kanał, aby obrócić larwę. Larwa jest teraz gotowa do obrazowania.
Larwy w kanałach liniowych wykonują ciągłe napady rytmicznego pełzania. Sondy fluorescencyjne są łatwe do zbadania. Na przykład larwy wykazujące ekspresję GFP w swoich neuronach ze sterownika GAL4 wykazują dynamiczne zmiany intensywności fluorescencji emanującej ze sznura nerwowego podczas cyklu pełzania.
Ośrodkowy układ nerwowy porusza się do przodu prawie w tym samym czasie co głowa i ogon larwy, gdy fala skurczu mięśni przechodzi wzdłuż osi ciała, OUN porusza się do i z płaszczyzny ogniskowania, powodując zmianę fluorescencji rdzenia nerwowego. Zmiany we fluorescencji określono ilościowo na podstawie trzech kroków pełzających dla trzech larw. Dynamika fluorescencji rdzenia nerwowego w cyklu kroku przebiegała zgodnie z możliwym do odtworzenia wzorcem, który można wykorzystać do fenotypowania.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś wiedzieć, jak zbierać larwy pod kątem zachowania, przygotowywać kanały agarozowe i ładować larwy do kanałów, aby zwizualizować liniowe zachowanie pełzania. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o delikatnym obchodzeniu się z larwami.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie wykorzystuje larwy Drosophila jako model do analizy neuronalnej kontroli zachowania poprzez liniowe pełzanie w kanałach agarowych. Zastosowana metodologia umożliwia szczegółową obserwację ruchu larw oraz dynamiki obwodów neuronalnych zaangażowanych w kontrolę motoryczną.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuroetologia
- Biologia rozwoju
- Neuronauka
Wstęp
- Larwy Drosophila są skutecznymi modelami do badania zachowania.
- Zrozumienie kodów neuronalnych jest kluczowe dla generowania wzorców ruchowych.
- Identyfikacja procesów genetycznych i komórkowych pomaga w mapowaniu obwodów neuronalnych.
- Ograniczenie zachowania pozwala na ukierunkowane badanie konkretnych wzorców ruchowych.
Cel badania
- Obserwacja zachowania pełzania larw w kontrolowanym środowisku.
- Badanie rozwoju obwodów neuronalnych zaangażowanych w ruch.
- Odpowiedź na kluczowe pytania z zakresu neuroetologii i biologii rozwoju.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie liniowych kanałów agarozowych do obserwacji pełzania.
- Ocena stanu zdrowia larw przed rozpoczęciem eksperymentów.
- Kwantyfikacja dynamiki podczas powtarzalnych zachowań pełzania.
- Prezentacja procedury przeprowadzona przez technika laboratoryjnego.
Główne wyniki
- Skuteczne wywołanie trwałych serii pełzania u larw.
- Szczegółowa obserwacja dynamiki struktury larw podczas ruchu.
- Wnioski dotyczące mechanizmów neuronalnych kontrolujących wzorce ruchowe.
- Ustanowienie wiarygodnej metody badania zachowania larw.
Wnioski
- Metoda ta stanowi platformę do szczegółowych badań nad obwodami neuronalnymi.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia kontroli ruchu u Drosophila.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tej technice w celu zgłębienia dalszych kwestii.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Testy w liniowych kanałach agarozowych dla larw Drosophila umożliwiają precyzyjną analizę funkcji obwodów neuronalnych leżących u podstaw rytmicznych zachowań motorycznych. Podejście to wspomaga wysoką pewność walidacji celów oraz redukcję ryzyka mechanistycznego na najwcześniejszych etapach odkrywania leków opartych na neurobiologii. Powtarzalność metody i ilościowe wyniki pozycjonują ją jako wielokrotnego użytku platformę do przesiewania fenotypowego i badań translacyjnych w zakresie rozwoju układu nerwowego oraz kontroli motorycznej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia szczegółową analizę mechanizmów obwodów neuronalnych kontrolujących wzorce ruchowe.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez powiązanie zaburzeń genetycznych z mierzalnymi fenotypami behawioralnymi.
- Ułatwia mechanisticyczne ograniczanie ryzyka poprzez oddzielenie rytmicznego pełzania od zachowań zakłócających.
- Zapewnia platformę do eksploracji ścieżek neurorozwojowych w oparciu o postawione hipotezy.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Zapewnia standaryzowane, powtarzalne testy behawioralne do późniejszego przesiewania związków chemicznych lub genetycznego.
- Generuje ilościowe odczyty na poziomie segmentów i mięśni w celu uzyskania wiarygodnego fenotypowania.
- Umożliwia skalowalne przygotowanie systemów istotnych dla przebiegu choroby do analizy wysokotreściowej.
- Wspiera przygotowanie testów do oceny modulatorów neuronalnych lub mięśniowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne ze strategiami biomarkerów translacyjnych, umożliwiając obrazowanie aktywności neuronalnej in vivo podczas zachowania.
- Zapewnia ciągłość od odkryć genetycznych po walidację przedkliniczną w modelu podatnym na manipulacje.
- Wspiera postępy z uwzględnieniem ryzyka poprzez powiązanie interwencji molekularnych z wynikami funkcjonalnymi.
- Ułatwia predykcyjne ograniczanie ryzyka dla portfela związków neuroaktywnych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z procesem badawczym, od wczesnego testowania hipotez, poprzez identyfikację wiodących związków, aż po walidację przedkliniczną celów neurobehawioralnych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących funkcji obwodów neuronalnych i mapowania szlaków w systemie podatnym na modyfikacje genetyczne.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki behawioralne do opracowywania testów i oceny związków.
- Analityka: Umożliwia pomiar dynamiki fluorescencji i parametrów cyklu kroku do analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Łączy etap odkryć z pracami przedklinicznymi, umożliwiając monitorowanie aktywności neuronalnej in vivo podczas zachowania.
- Zastosowania w przedsiębiorstwach: Oferuje elastyczną platformę niezależną od genotypu, którą można dostosować do różnorodnych potrzeb badawczych i przesiewowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów neurobehawioralnych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje testy behawioralne w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności w różnych zespołach badawczych.
- Wartość strategiczna: Poprawia jakość decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez zapewnienie solidnego, ilościowego fenotypowania.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów i interwencji neuroaktywnych z uwzględnieniem ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w pracy z Drosophila, analizie behawioralnej oraz obrazowaniu fluorescencyjnym.
- Wymaga dostępu do form odlewniczych, platform do obrazowania oraz narzędzi do analizy ilościowej.
- Wymaga standaryzacji wymiarów kanałów i protokołów obrazowania pomiędzy zespołami.
- Metoda jest możliwa do dostosowania do różnych genotypów oraz geometrii kanałów zaprojektowanych przez badacza.
- Ograniczenia praktyczne obejmują ostrożne obchodzenie się z larwami, aby uniknąć artefaktów wywołanych stresem.
