Name: Wykorzystanie liniowych kanałów agarozowych do badania pełzania larw Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: Odkryj metodę liniowych kanałów agarozowych do badania pełzania larw Drosophila. Technika ta umożliwia szczegółową analizę obwodów nerwowych kontrolujących wzorce ruchowe w neuroetologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Chrisowi Wredenowi i Michelle Bland za komentarze do manuskryptu i za pomoc techniczną.

1. Przygotowanie larw
<ol>
	<li>Na tydzień przed nagraniem zachowania ustaw krzyżówkę (minimum 25 dziewic i 5 samców). Utrzymywać wszystkie krzyżówki i potomstwo w temperaturze 25 °C. 
	UWAGA: Temperatura warunków hodowli może ulec zmianie, ale opisana poniżej linia czasowa musiałaby zostać dostosowana, aby uwzględnić zmiany w szybkości rozwoju.</li>
	<li>5 dni przed nagraniem, z samego rana, umieść krzyż w klatce zbiorczej z nakrętką na agar/sok i odrobiną (0,5-1 ml) pasty drożdżowej na środku nasadki agarowej/soku.
	<ol>
		<li>Aby zrobić klatkę zbiorczą, wbij otwory w kwadratową butelkę Drosophila o pojemności 6 uncji</li> polietylenu.
		<li>Aby zrobić nakrętki agarowe/sokowe, wymieszaj 18 g agaru z 600 ml wody w kolbie stożkowej. W osobnej kolbie wymieszać 20 g sacharozy z 200 ml soku jabłkowego. Kuchenka mikrofalowa aż do rozpuszczenia ciał stałych. Połączyć i wymieszać, pozwalając mieszaninie ostygnąć do temperatury 60 °C. Dodać 20 ml 10% p-hydroksybenzoesanu metylu w 95% etanolu i wymieszać. Dodać ~7 ml do dolnej połowy okrągłej szalki Petriego o wymiarach 35 x 10 mm. Pozostawić agar/sok do zestalenia się przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Aby zrobić pastę drożdżową, dodaj równe części objętości suchych drożdży i wody. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sprawdź stan zdrowia kolekcji larwalnych.
	<ol>
		<li>Rano, 4 i 3 dni przed nagraniem, zdejmij nakrętkę i umieść nową nakrętkę na klatce. Zmieniaj czapki o tej samej porze każdego dnia, aby uzyskać 24-godzinną kolekcję jaj i nowo wyklutych larw.</li>
		<li>Po zdjęciu każdej nasadki zbadaj ją, aby zobaczyć, ile jaj składa krzyżówka. Spodziewaj się od 500 do 2,000 jaj. W razie potrzeby dostosuj liczbę osób dorosłych. 
		UWAGA: Z kilku jaj powinny wykluć się larwy, a nowo wyklute larwy zostaną znalezione z dala od pasty drożdżowej.</li>
		<li>Starzej każdą czapkę przez 24 godziny. Ponownie zbadaj kapelusz, aby ustalić, czy larwy są zdrowe. 
		UWAGA: Z większości jaj powinny wykluć się larwy, a larwy powinny wpełznąć do pasty drożdżowej. Oznaki złego stanu zdrowia obejmują dużą liczbę niewyklutych jaj, martwe ciała larwalne z dala od pasty drożdżowej oraz larwy ze znacznymi ciemnymi plamami w jamie brzusznej, wskazujące na reakcję immunologiczną. Jeśli larwy są niezdrowe, zmień klatkę, przygotuj świeże nakrętki/pastę drożdżową i sprawdź genotyp.</li>
		<li>Wyrzuć stare nakrętki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbieraj larwy do nagrań behawioralnych.
	<ol>
		<li>Zarówno na 2, jak i 1 dzień przed nagraniem zdejmij nasadkę i zastąp ją nową.</li>
		<li>Oznaczyć każdą zdjętą nakrętkę i przechowywać w temperaturze 25 °C. W ten sposób powstanie zainscenizowana seria larw do nagrań behawioralnych. W kanałach można stosować larwy od nowo wyklutych (0-4 godziny po wykluciu) do drugiego stadium rozwojowego (24-48 godzin po wykluciu). Zachowaj wersaliki dla nagrań w kolejnych dniach.</li>
		<li>Wyrzuć wszystkie nakrętki po 48 godzinach.</li>
		<li>W razie potrzeby powtórz kroki 1.4.1-1.4.3 dla maksymalnie 5 dodatkowych d. Po tym czasie produkowanych jest mniej zapłodnionych jaj.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie kanałów
<ol>
	<li>Przygotować formę odlewniczą PDMS (polidimetylosiloksan, elastomer silikonowy) z kanałem liniowym (rysunek 1A). Formy odlewnicze PDMS są dostępne w laboratorium Heckscher na życzenie.
	<ol>
		<li>Oczyść formę odlewaną alkoholem izopropylowym. Wysuszyć na powietrzu, osuszyć chusteczkami laboratoryjnymi lub użyć powietrza z puszki.</li>
		<li>Umieść formę odlewniczą w pokrywie na szalkę Petriego o średnicy 10 cm lub innym pojemniku.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj i wlej roztwór agarozy.
	<ol>
		<li>Przygotuj 3% roztwór agarozy w wodzie (3 g w 100 ml), podgrzewając w kuchence mikrofalowej, aż do całkowitego rozpuszczenia.</li>
		<li>Schłodzić do temperatury 55 °C, pozwalając pęcherzykom wypłynąć na powierzchnię.</li>
		<li>Wlej mieszaninę agarozy na szalkę Petriego zawierającą formę odlewniczą, tak aby forma była po prostu przykryta. Niech agaroza zastygnie, aż stężeje.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuń kanały agarozy z formy odlewniczej. Przytnij krawędzie krążka agarozy żyletką.
	<ol>
		<li>Umieść kanały na 10-centymetrowej szalce Petriego zanurzonej w wodzie. Można je przechowywać w temperaturze 4 °C przez 7 dni.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Wczytywanie larwy do kanału w celu zarejestrowania zachowania
UWAGA: Jeśli przechowujesz kanały w temperaturze 4 °C, pozwól kanałom przejść do RT przed użyciem do nagrywania behawioralnego.
<ol>
	<li>Użyj czystej żyletki, aby wyciąć pojedynczy kanał z tych przygotowanych w kroku 2 (Rysunek 2A).</li>
	<li>Użyj kleszczy, aby umieścić kanał rowkowaną stroną do góry na szklanym szkiełku nakrywkowym (Rysunek 2B). Rozmiar i grubość szkiełka nakrywkowego zależy od konkretnego zakresu używanego do obrazowania.</li>
	<li>Za pomocą cienkich kleszczyków wybierz larwę z nasadki agarowej/soku przygotowanej w kroku 1 i umieść ją w wyciętym kanale (ryc. 2C).
	<ol>
		<li>Nie ściskaj larwy. Podnieś go delikatnie końcówką zęba kleszcza. Możliwe jest również manipulowanie larwami za pomocą pędzla z drobnym czubkiem. 
		UWAGA: Jest to ważne, ponieważ larwy są bardzo wrażliwe na dotyk. Jeśli nie obchodzi się z nimi ostrożnie, reakcje nocyceptywne mogą zdominować ich zachowanie w ciągu pierwszych kilku sekund eksperymentu.</li>
		<li>Umyj larwy, zanurzając je na krótko w wodzie.</li>
		<li>Po umieszczeniu larwy w przeciętym kanale, użyj końcówki zęba kleszcza, aby delikatnie wciągnąć larwę do zagajnika kanałowego. 
		UWAGA: W przypadku większości zastosowań szerokość larwy i szerokość kanału powinny się zgadzać. Średnia szerokość larw na różnych etapach rozwoju jest następująca: 0 godzin po wylęgu - 140 μm, 24 godziny po wylęgu - 180 μm, 48 godzin po wylęgu - 320 μm, 72 godziny po wylęgu - 500 μm, 96 godzin po wylęgu - 750 μm8. Kanały występują w następujących szerokościach: 100, 150, 200, 250 i 300 μm, a wszystkie kanały mają głębokość 150 μm.</li>
		<li>Użyj końcówki zęba kleszcza lub pędzla, aby wyregulować pozycję larwy w kanale. Może być zorientowany w dowolnym kierunku: brzusznie do góry, brzusznie w dół, brzusznie w jedną stronę, w zależności od tego, jaka struktura ma być zobrazowana.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Za pomocą kleszczy delikatnie odwróć kanał tak, aby larwa znalazła się teraz na szkle nakrywkowym. Umieść jedną lub dwie krople wody na końcach kanału, tak aby wypełnił się wodą (Rysunek 2D).
	<ol>
		<li>Delikatnie podnieś boki kanału, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza.</li>
		<li>Dostosuj orientację larwy. Aby to zrobić, delikatnie popchnij kanał, ale nie szkło nakrywkowe, aby zwinąć larwę. Jeśli to nie zmieni orientacji, zdejmij szklankę nakrywkową i wyreguluj pozycję larw. Larwa jest gotowa do zobrazowania.</li>
		<li>Zobrazuj kanał/szkiełko nakrywkowe pod mikroskopem odwróconym. W przypadku obrazowania pod mikroskopem pionowym wystarczy odwrócić kanał/szkiełko nakrywkowe.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Cecha pomiaru zainteresowania w rejestrowaniu zachowań
<ol>
	<li>W przypadku interesującej nas struktury (np. ogona, ośrodkowego układu nerwowego) należy zmierzyć cechę będącą przedmiotem zainteresowania (np. intensywność fluorescencji, lokalizację) w czasie. 
	UWAGA: Struktury, takie jak głowa i ogon, mogą być opisywane ręcznie. Na przykład głowę można zidentyfikować jako zawierającą ciemne haczyki ustne w kształcie litery H, a ogon można zidentyfikować jako zawierający tylne kolce tchawicy. W artykule skupiono się na rdzeniu nerwowym. Użyj neuronalnej linii GAL4 elav-GAL4 do napędzania transgenu UAS-myr-GFP (elav>GFP)9,10 w celu fluorescencyjnego znakowania ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Ośrodkowy układ nerwowy zawiera dwa przednie płaty mózgowe połączone ze sznurem nerwowym, który rozciąga się do tylnego (ryc. 3).</li>
	<li>Zmierz intensywność pikseli rdzenia nerwowego (f(NC)) w każdym punkcie czasowym (t). Poniżej opisano podejście do ręcznej adnotacji, ale ten krok można zautomatyzować.
	<ol>
		<li>Na Fidżi (lub podobnym oprogramowaniu) w menu "Analizuj" użyj opcji "Ustaw pomiary... ", aby podać średnią wartość szarości i pozycję przekroju.</li>
		<li>Ręcznie narysuj ramkę na środku sznura nerwowego w pierwszej klatce filmu (Rysunek 3). Ten krok można również zautomatyzować za pomocą algorytmów segmentacji i rejestracji obrazów.</li>
		<li>Użyj polecenia "Zmierz" w menu "Analizuj", aby zgłosić średnią intensywność pikseli w obszarze zainteresowania w ramce. Spowoduje to wygenerowanie okna "Wyniki".</li>
		<li>W następnej klatce ręcznie zmień położenie pola bez zmiany rozmiaru za pomocą strzałek. Użyj ponownie polecenia "Zmierz". Zaktualizowane wyniki zostaną wyświetlone w oknie "Wyniki". Powtórz ten krok dla każdej interesującej Cię klatki.</li>
		<li>Zapisz "Wyniki" za pomocą opcji "Zapisz jako... ' z menu Plik. Wyniki zostaną wyeksportowane jako plik .xls.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Analizuj pomiary
<ol>
	<li>Znormalizuj każdą wartość f(NC) do wartości z zakresu od 0 do 1 (z(t)).
	<ol>
		<li>W arkuszu kalkulacyjnym (lub innym programie) otwórz plik Results.xls. Ten plik będzie zawierał dwie kolumny reprezentujące numer klatki i średnią intensywność fluorescencji.</li>
		<li>Utwórz nową kolumnę i użyj wzoru z(t) = f(NC[t])-min(f[NC])/max(f[NC])-min(f[NC]), aby wygenerować znormalizowaną wartość fluorescencji odpowiadającą każdemu punktowi czasowemu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określ okres kroku dla każdego kroku w nagraniu. 
	UWAGA: Cykl kroku to jednostka powtarzających się ruchów całego ciała podczas czołgania się do przodu (i do tyłu). Zgodnie z konwencją krok do przodu zaczyna się (i kończy) ruchem do przodu ogona, głowy i innych narządów wewnętrznych, takich jak jelito lub OUN1.
	<ol>
		<li>Ręcznie sprawdź zapis behawioralny i zapisz czasy inicjacji (i) każdego kroku (i(Cykl kroku[n])). 
		UWAGA: W poniższym przykładzie wykorzystano ruch OUN do przodu jako inicjację cyklu kroku (ryc. 3).</li>
		<li>Dla każdego kroku oblicz okres: Δt(Cykl kroku) = i(Cykl kroku [n+1])-i(Cykl kroku [n]).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oblicz procent cyklu kroku, który upłynął dla każdego punktu czasowego nagrania.
	<ol>
		<li>Utwórz dodatkową kolumnę w pliku arkusza kalkulacyjnego reprezentującą czas, jaki upłynął od rozpoczęcia cyklu kroku (c). Ustaw czas od inicjacji kroku na zero na początku każdego kroku (c(Cykl kroku[n]) = 0). Dostosuj odpowiednio czasy po zainicjowaniu.</li>
		<li>Utwórz dodatkową kolumnę w pliku arkusza kalkulacyjnego reprezentującą procent ukończonego cyklu kroku (% cyklu kroku). Podziel skorygowane czasy przez okres kroku i pomnóż przez 100, aby przeliczyć na procent upływającego cyklu kroku: % cyklu kroku = (c(Cykl kroku [n]))/ (Δt (Cykl kroku) * 100).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Generuj wykresy współrzędnych biegunowych, aby przedstawić dynamikę interesujących struktur w cyklu pełzania
<ol>
	<li>W MATLAB użyj okna dialogowego "Importuj dane" na karcie Strona główna, aby zaimportować zaktualizowane Results.xls.</li>
	<li>Utwórz nową tablicę "Theta" zawierającą procentowe wartości cyklu kroku (% cyklu kroku). ("Theta = Var1", gdzie Var1 reprezentuje % cyklu kroku).</li>
	<li>Spraw, aby nowa tablica "Rho" zawierała znormalizowane wartości fluorescencji (z(t)). ("Rho = Var2", gdzie Var2 reprezentuje z(t)).</li>
	<li>Użyj polecenia 'polarplot', aby utworzyć wykresy współrzędnych biegunowych z procentowym cyklem kroku jako kątem i fluorescencją jako promieniem ("polarplot(Theta, Rho)").</li>
</ol>

<ol><li>Heckscher, E. S., Lockery, S. R., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Drosophila+larval+crawling+at+the+level+of+organism%2C+segment%2C+and+somatic+body+wall+musculature%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Characterization of Drosophila larval crawling at the level of organism, segment, and somatic body wall musculature.</a> J Neurosci. 32 (36), 12460-12471 (2012).</li>
<li>Marder, E., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+rhythmic+motor+pattern+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+rev%22%5BJournal%5D)">Principles of rhythmic motor pattern generation.</a> Physiol rev. 76 (3), 687(1996).</li>
<li>Mullins, O. J., Hackett, J. T., Buchanan, J. T., Friesen, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+control+of+swimming+behavior%3A+Comparison+of+vertebrate+and+invertebrate+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Neuronal control of swimming behavior: Comparison of vertebrate and invertebrate model systems.</a> Prog Neurobiol. 93 (2), 244-269 (2011).</li>
<li>Ohyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multilevel+multimodal+circuit+enhances+action+selection+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A multilevel multimodal circuit enhances action selection in Drosophila.</a> Nature. 520 (7549), 633-639 (2015).</li>
<li>Landgraf, M., Thor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Drosophila+motoneurons%3A+specification+and+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+cell+devl+bio%22%5BJournal%5D)">Development of Drosophila motoneurons: specification and morphology.</a> Semin cell devl bio. 17 (1), 3-11 (2006).</li>
<li>Heckscher, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Even-Skipped%28%2B%29+Interneurons+Are+Core+Components+of+a+Sensorimotor+Circuit+that+Maintains+Left-Right+Symmetric+Muscle+Contraction+Amplitude%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Even-Skipped(+) Interneurons Are Core Components of a Sensorimotor Circuit that Maintains Left-Right Symmetric Muscle Contraction Amplitude.</a> Neuron. 88 (2), 1-16 (2015).</li>
<li>Green, C. H., Burnet, B., Connolly, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+patterns+of+inter-and+intraspecific+variation+in+the+behaviour+of+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Anim+Behav%22%5BJournal%5D)">Organization and patterns of inter-and intraspecific variation in the behaviour of Drosophila larvae.</a> Anim Behav. 31 (1), 282-291 (1983).</li>
<li>Graf, S. A., Sokolowski, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rover%2FSitter+Drosophila+melanogaster+Larval+Foraging+Polymorphism+as+a+Function+of+Larval+Development%2C+Food-Patch+Quality%2C+and+Starvation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Insect+Behav%22%5BJournal%5D)">Rover/Sitter Drosophila melanogaster Larval Foraging Polymorphism as a Function of Larval Development, Food-Patch Quality, and Starvation.</a> J Insect Behav. 2 (3), 301-313 (1989).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).</li>
<li>Rebay, I., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yan+Functions+as+a+General+Inhibitor+of+Differentiation+and+Is+Negatively+Regulated+by+Activation+of+the+Rasl+%2F+MAPK+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Yan Functions as a General Inhibitor of Differentiation and Is Negatively Regulated by Activation of the Rasl / MAPK Pathway.</a> Cell. 81 (6), 857-866 (1995).</li>
<li>Chen, T. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Tufte, E. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTufte%2C+ER+%22The+visual+display+of+quantitative+information%22">The visual display of quantitative information</a>. , Graphics Press. Cheshire, CT. (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zbudowano urządzenie mikroprzepływowe do tworzenia liniowych kanałów agarozowych, które mogą pomieścić larwy Drosophila (ryc. 1). Kiedy larwy Drosophila są umieszczane w tych liniowych kanałach agarozowych, ich repertuar behawioralny ogranicza się do pełzania, co pozwala na szczegółową obserwację dynamiki struktur larwalnych w cyklu pełzania.
Udane nagranie ma miejsce, gdy larwa wykonuje serię rytmicznych kroków (ryc. 3). Jeśli tak się nie st...

Ogólnym celem tej metody jest szczegółowe zbadanie pełzania larw Drosophila. Eksperymenty nad lokomocją, odegrały ważną rolę w opracowywaniu i testowaniu teorii kontroli motorycznej2. Tradycyjnie lokomocja była badana u zwierząt wodnych (np. pijawki, minoga, kijanki)3. Powtarzalność lokomocji u tych zwierząt pozwoliła na badanie rytmogenezy, analizę zdarzeń biofizycznych napędzających lokomocję oraz monitorowanie wzorców odpalania neuronów, które towarzyszą lokomocji.
Wykorzystanie larw Drosophila do badań lokomocji prezentuje unikalną kombinację zalet w porównaniu z innymi systemami modelowymi: łatwa genetyka, dobrze scharakteryzowany rozwój, ciało, które jest optycznie czyste w pierwszym i drugim stadium rozwoju, oraz trwająca transmisyjna mikroskopijna mikroskopowa rekonstrukcja całego układu nerwowego4-6. Jednak poruszanie się larw Drosophila na płaskich, otwartych powierzchniach jest nieco złożone, obejmuje przerwy, skręty i meandrujące pełzanie7. W niniejszej publikacji przedstawiono metodę wykorzystania liniowych kanałów agarozowych do kierowania zachowaniami lokomotorycznymi larw Drosophila w taki sposób, aby larwy wykonywały trwałe, proste, rytmiczne pełzanie.
Badanie zachowania larw Drosophila w kanałach agarozowych, zamiast zachowania na płaskich, otwartych powierzchniach, ma kilka zalet. Po pierwsze, pozwala naukowcom na konkretny wybór zachowań pełzających spośród wielu ruchów, które są częścią repertuaru zachowań larw. Po drugie, dostosowując szerokość kanału w stosunku do wielkości ciała larwy, można dostosować prędkość pełzania. Po trzecie, kanały pozwalają na oglądanie larwy od strony grzbietowej, brzusznej lub bocznej, w zależności od tego, jak larwa jest załadowana i zorientowana w kanale. Ta wszechstronność w orientacji larw pozwala na to, aby każda struktura będąca przedmiotem zainteresowania była stale widoczna podczas pełzania. Po czwarte, kanały można stosować z szeroką gamą mikroskopów i obiektywów. Na przykład kanały liniowe mogą być używane do obrazowania o niskiej rozdzielczości na stereoskopach jasnego pola i/lub do obrazowania o wysokiej rozdzielczości w mikroskopach konfokalnych z wirującym dyskiem1. Po piąte, metoda ta może być stosowana w połączeniu z optogenetycznymi/termogenetycznymi manipulacjami neuronalnymi w dowolnym tle genetycznym. Wreszcie, ponieważ zarówno ciało larwalne (w pierwszym i drugim stadium rozwoju), jak i kanały agarozowe są optycznie czyste, kanały mogą być wykorzystywane do badania ruchów dynamicznych lub zmian intensywności fluorescencji struktur larwalnych znakowanych przez genetycznie kodowane sondy fluorescencyjne.
Opisana metoda jest odpowiednia do szczegółowych badań kinematycznych zachowania larw Drosophila w pierwszym i drugim stadium rozwojowym. W niniejszej publikacji przeanalizowano dynamiczne zmiany intensywności fluorescencji OUN podczas pełzania larw do przodu, aby zademonstrować wykorzystanie kanałów i jako prekursora neuronalnego obrazowania wapnia.

<table><tbody><tr><td>6 uncji kwadratowa butelka Drosophila</td><td>Scimart</td><td>DR-103</td><td></td></tr><tr><td>agar</td><td>sigma</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>sacharoza</td><td>sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>sok</td><td></td><td></td> jabłkowy <td>nie z koncentratu</td></tr><tr><td>Tegosept</td><td>Fisher</td><td>T2300</td><td>p-hydroksybenzoesan metylu</td></tr><tr><td>35 x 10 mm okrągła szalka Petriego</td><td>Fisher</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Drożdże</td><td></td><td></td><td></td>piekarskie</tr><tr><td>PDMS forma odlewnicza</td><td>FlowJem</td><td></td><td>można zamówić u autorów</td></tr><tr><td>Alkohol izopropylowy</td><td>Chusteczki</td> laboratoryjne Fisher <td>A417-1</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher</td><td>06-666-11</td><td></td></tr><tr><td>powietrze w puszce</td><td>Fisher</td><td>18-431</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego 10 cm</td><td>BioPioneer</td><td>GS82-1473-001</td><td></td></tr><tr><td>agaroza</td><td>Fisher</td><td>50-444-176</td><td></td></tr><tr><td>żyletka</td><td>Fisher</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>kleszcze</td><td>FST</td><td>11241-40</td><td></td></tr><tr><td>22 x 40 szkło osłonowe, #1.5</td><td>Fisher</td><td>50-365-605</td><td></td></tr><tr><td>Fidżi (wersja 1.51d)</td><td>NIH</td><td></td><td>fiji.sc</td></tr><tr><td>Excel 2016</td><td>Microsoft</td><td></td><td>www.microsoftstore.com</td></tr><tr><td>MATLAB R2016</td><td>Mathworks</td><td></td><td>www.mathworks.com</td></tr></tbody></table>

wykorzystanie liniowych kanałów agarozowych do badania pełzania larw drosophila

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Pełzanie larw Drosophila staje się potężnym modelem do badania neuronalnej kontroli zachowań sensomotorycznych. Jednak pełzanie larw po płaskich, otwartych powierzchniach jest złożone, obejmujące: zatrzymywanie się, skręcanie i meandrowanie. Ta złożoność repertuaru ruchu utrudnia szczegółową analizę zdarzeń zachodzących podczas pojedynczego cyklu kroku kraulowego. Aby pokonać tę przeszkodę, stworzono liniowe kanały agarozowe, które ograniczają zachowanie larw do prostego, ciągłego, rytmicznego pełzania. Zasadniczo, ponieważ zarówno kanały agarozowe, jak i ciało larwalne Drosophila są optycznie czyste, ruch struktur larwalnych znakowanych przez genetycznie kodowane sondy fluorescencyjne może być monitorowany w nienaruszonych, swobodnie poruszających się larwach. W przeszłości larwy umieszczano w kanałach liniowych i analizowano pełzanie na poziomie całego organizmu, segmentu i mięśni1. W przyszłości larwy pełzające w kanałach mogą być wykorzystywane do obrazowania wapnia w celu monitorowania aktywności neuronalnej. Co więcej, metody te mogą być stosowane w przypadku larw o dowolnym genotypie i w dowolnym kanale zaprojektowanym przez badaczy. W związku z tym przedstawiony poniżej protokół ma szerokie zastosowanie w badaniach z wykorzystaniem larwy Drosophila jako modelu do zrozumienia kontroli motorycznej.

Niniejszy artykuł opisuje metodę kierowania zachowaniem larw Drosophila przy użyciu kanałów agarozowych oraz pomiaru dynamiki struktur larwalnych w trakcie cyklu pełzania. Larwy w kanałach liniowych wykonują przedłużone serie rytmicznego pełzania (Rysunek 3). Ponieważ zarówno larwy, jak i kanały są optycznie przejrzyste, kanały mogą być wykorzystywane z larwami wykazującymi ekspresję sond fluorescencyjnych w dowolnej interesującej strukturze. Rejestrowaliśmy larw...

Larwa Drosophila to potężny system modelowy do badania neuronalnej kontroli zachowania. Publikacja ta opisuje zastosowanie liniowych kanałów agarozowych do wywoływania długotrwałych napadów liniowego pełzania oraz metody ilościowego określania dynamiki struktur larwalnych podczas powtarzających się zachowań pełzania.

Wykorzystanie liniowych kanałów agarozowych do badania pełzania larw Drosophila

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest obserwacja larw Drosophila pełznących w liniowym kanale agarozowym w celu zbadania rozwoju obwodów neuronalnych. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu neuroetologii i biologii rozwoju, takie jak zrozumienie kodów neuronalnych generujących wzorce ruchowe oraz identyfikacja kluczowych procesów genetycznych i komórkowych, które kształtują obwody neuronalne odpowiedzialne za kontrolę ruchu. Główną zaletą tej techniki jest ograniczenie repertuaru behawioralnego larw, co pozwala badaczom na szczegółową analizę pojedynczego wzorca wieloczłonowego.Procedurę zaprezentuje Zarion Marshall, technik z mojego laboratorium. Przede wszystkim ważne jest ocenić stan zdrowia larwy. Na trzy do czterech dni przed nagraniem należy wymienić płytkę zbierającą w klatce dla osobników dorosłych.Powtarzaj tę czynność codziennie o tej samej porze. Policz jaja oraz nowo wyklute larwy na płytce. Oczekiwana liczba jaj wynosi od 500 do 2 000.Dostosuj liczbę osobników dorosłych w klatce według potrzeb. Płytkę badamy po 24 godzinach, aby ocenić, czy larwy są zdrowe. Większość jaj powinna wykluć się w larwy, a larwy powinny wgryźć się w pastę drożdżową.Objawy złego stanu zdrowia obejmują dużą liczbę niewyklutych jaj, martwe ciała larw oddalone od pasty drożdżowej oraz larwy z nietypowo ciemnymi plamami w obręzi brzucha, co świadczy o reakcji immunologicznej. Jeśli larwy wydają się niezdrowe, należy wymienić klatkę, używając świeżo przygotowanych płytek, i sprawdzić genotyp osobników dorosłych. Do eksperymentu należy zebrać nowo wyklute larwy drugiego stadium z płytek w wieku od jednego do dwóch dni.Wszystkie te etapy mogą zostać wykorzystane w analizie. Do wykonania niniejszego protokołu przygotuj formę odlewniczą z PDMS do kanałów liniowych. Oczyść formę odlewniczą alkoholem izopropylowym.Po wyschnięciu umieść formę w pokrywce o średnicy dziesięciu centymetrów lub w podobnym pojemniku. Następnie wypełnij formę 3% agarozy schłodzonej do 55 °C. Wlewaj agarozę ostrożnie, aby uniknąć uwięzienia pęcherzyków powietrza w formie.Forma powinna być ledwo przykryta agarozą. Po zestaleniu należy wyjąć kanały agarowe z formy. Przyciąć krawędzie kanałów o kształcie dysku, a następnie zanurzyć je w wodzie.Można je przechowywać w wodzie w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez maksymalnie siedem dni. Przed użyciem kanałów należy pozwolić im ogrzać się do temperatury pokojowej. Wybierz kanał odpowiadający szerokości larwy.Kanały mają szerokość od 100 do 300 mikronów i wszystkie mają głębokość 150 mikronów. Następnie należy użyć czystego ostrza żyletki, aby wyciąć pojedynczy kanał z przygotowanego dysku. Za pomocą pęsety przenieść kanał na odpowiedniej wielkości szklaną lamellę lub slajd, stroną z rowkiem do góry.Następnie za pomocą precyzyjnej pęsety delikatnie chwyć larvę, uważając, aby jej nie ścisnąć. Dobrze sprawdzi się również pędzel z cienkim włosiem. W przypadku ściśnięcia, w zachowaniu larwy w kanale mogą dominować odruchy bólowe, takie jak rolowanie się lub kulenie.Następnie należy opłukać larwę, krótko zanurzając ją w wodzie, a następnie umieścić ją w przeciętym kanale, delikatnie przesuwając ją do odpowiedniej pozycji. Po umieszczeniu w kanale należy skorygować orientację larwy tak, aby struktura, która jest przedmiotem badania, była łatwa do zobrazowania. Następnie należy nanieść jedną lub dwie krople wody na obu końcach kanału, aby wypełnić go wodą.Jeśli uwięzną pęcherzyki powietrza, delikatnie unieś boki kanału, aby je usunąć. Aby dodatkowo skorygować orientację larwy, delikatnie potrząśnij kanałem, aby larwa się obróciła. Larwa jest teraz gotowa do obrazowania.Larwy w kanałach liniowych wykonują trwałe serie rytmicznego pełzania. Sondy fluorescencyjne są łatwe do analizy. Na przykład larwy wykazujące ekspresję GFP w neuronach pod wpływem sterownika GAL4 wykazują dynamiczne zmiany intensywności fluorescencji emitowanej przez sznur nerwowy podczas cyklu pełzania.Układ nerwowy (CNS) przesuwa się do przodu niemal w tym samym czasie co głowa i ogon larwy; gdy fala skurczów mięśni przechodzi wzdłuż osi ciała, CNS przemieszcza się w głąb i poza płaszczyznę ostrości, co powoduje zmianę fluorescencji rdzenia nerwowego. Zmiany fluorescencji ilościowo określono na podstawie trzech kroków pełzania dla trzech larw. Dynamika fluorescencji rdzenia nerwowego w cyklu kroku następowała według powtarzalnego wzorca, który można wykorzystać do fenotypowania.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś zrozumieć, jak zbierać larwy do badań behawioralnych, jak przygotowywać kanały agarowe oraz jak wprowadzać larwy do kanałów w celu wizualizacji liniowego zachowania pełzania. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby obchodzić się z larwami delikatnie.

using-linear-agarose-channels-to-study-drosophila-larval-crawling

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W niniejszym artykule wideo opisujemy nową metodę umożliwiającą tworzenie gradientów substancji zapachowych o stabilnych i kontrolowalnych geometriach. Krótko ilustrujemy, w jaki sposób gradienty te mogą być wykorzystane do wykrywania wad węchu (całkowitej i częściowej anosmii) oraz do badania bardziej subtelnych cech zachowań chemotaktycznych.

Wysokorozdzielczy pomiar zachowań sterowanych węchem u larw Drosophila

Drosophila melanogaster to genetycznie i behawioralnie podatny system modelowy, który od ponad wieku jest wykorzystywany do zrozumienia molekularnych i komórkowych podstaw wielu ważnych procesów biologicznych 1. Drosophila została szeroko wykorzystana w celu uzyskania wglądu w genetyczne podstawy zachowania much.

Metody oceny zachowania Drosophila

Opracowaliśmy system mikroskopu śledzącego w czasie rzeczywistym, który umożliwia rejestrację i kwantyfikację zachowania C. elegans z wysoką rozdzielczością i przy dużych prędkościach. Opracowaliśmy również metody obliczeniowe pozwalające na redukcję wymiarowości obrazów nicieni do podstawowego zestawu pomiarów, które w pełni opisują kształt organizmu.

Śledzenie i pomiar zachowania C. elegans

Ten film opisuje, jak śledzić swobodnie chodzące muchy, aby ocenić ich ogólną zdolność poruszania się. Prezentowany protokół demonstruje konfigurację testu i analizę danych za pomocą oprogramowania do śledzenia wideo.

Śledzenie swobodnie chodzących much: metoda oceny lokomocji u Drosophila

Ten film pokazuje badanie zachowania nawigacyjnego larw Drosophila w odpowiedzi na optogenetyczną stymulację węchowych neuronów czuciowych (ORN). Transgeniczne larwy Drosophila wykazujące ekspresję światłoczułych kanałów jonowych w ORN są umieszczane na agarozie w obrębie areny behawioralnej. Stymulacja optogenetyczna światłem otwiera kanały, powodując napływ kationów, który wyzwala przekazywanie sygnału do mózgu, a zachowanie nawigacyjne jest rejestrowane.

Zachowania nawigacyjne larw Drosophila w odpowiedzi na optogenetyczną stymulację węchowych neuronów czuciowych

Obwód żywieniowy u larw Drosophila melanogaster służy prostemu, ale potężnemu modelowi, który pozwala na skorelowanie zmian w tempie karmienia ze zmianami w obwodach nerwowych stomatogastrycznych. Obwód ten składa się z centralnych neuronów serotoninergicznych, które wysyłają projekcje do haczyków ustnych, a także do jelita przedniego.

Analiza funkcjonalna obwodu żerowania larw u Drosophila

Tutaj opisujemy prostą i powszechnie dostępną technikę mikroskopową, która pozwala uzyskać wysokiej jakości cyfrowe wideo z fenotypami dorosłych i larw zmutowanych Drosophila z perspektywy bocznej.

Akwizycja wysokiej jakości cyfrowego wideo larw Drosophila i zachowań dorosłych z perspektywy bocznej

Dostarczamy szczegółowy protokół do badania długości ścieżki żerowania Drosophila melanogaster. Omawiamy przygotowanie i postępowanie ze zwierzętami doświadczalnymi, sposób wykonywania testu i analizy danych.

Protokół długości ścieżki żerowania dla larw Drosophila melanogaster

Ten protokół analizuje zachowanie nawigacyjne larwy Drosophila w odpowiedzi na jednoczesną optogenetyczną stymulację jej neuronów węchowych. Światło o długości fali 630 nm służy do aktywacji pojedynczych neuronów węchowych wyrażających rodopsynę z przesuniętym ku czerwieni kanałem. Ruch larw jest jednocześnie śledzony, rejestrowany cyfrowo i analizowany za pomocą specjalnie napisanego oprogramowania.

Śledzenie zachowań larw Drosophila w odpowiedzi na optogenetyczną stymulację neuronów węchowych

Ten protokół wprowadza test plamki świetlnej do zbadania fototaktycznego zachowania larw Drosophila. W tym teście plamka świetlna jest generowana jako stymulacja światłem, a proces unikania światła larwalnego jest rejestrowany przez system obrazowania oparty na świetle podczerwonym.

Test punktowy świetlny do analizy fototaksji larw Drosophila

Odkryj metodę liniowych kanałów agarozowych do badania pełzania larw Drosophila. Technika ta umożliwia szczegółową analizę obwodów nerwowych kontrolujących wzorce ruchowe w neuroetologii.

Wykorzystanie liniowych kanałów agarozowych do badania pełzania larw Drosophila

Przeglądaj więcej filmów