Name: Projekt i wdrożenie zautomatyzowanego systemu oświetlenia, hodowli i pobierania próbek do zastosowań optogenetycznych drobnoustrojów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Poznaj metodę automatycznej hodowli ciągłej drobnoustrojów optogenetycznych z pomiarem ekspresji genów w czasie rzeczywistym. System umożliwia wielodniowe obserwacje dynamicznych odpowiedzi komórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Molly Lazar i Verónice Delgado za pomoc w testowaniu protokołu, Kieranowi Sweeneyowi za pomocne dyskusje i redakcję, oraz Taylor Scott, My An-adirekkun i Stephanie Geller za krytyczną lekturę rękopisu. Megan Nicole McClean, Ph.D. otrzymała nagrodę Career Award w Scientific Interface przyznaną przez Burroughs Wellcome Fund.

<ol><li>Motta-Mena, L. B., Reade, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optogenetic+gene+expression+system+with+rapid+activation+and+deactivation+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics.</a> Nature chemical biology. 10 (3), 196-202 (2014).</li>
<li>Hughes, R. M., Bolger, S., Tapadia, H., Tucker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-mediated+control+of+DNA+transcription+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Light-mediated control of DNA transcription in yeast.</a> Methods. 58 (4), 385-391 (2012).</li>
<li>Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+light-switchable+gene+promoter+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">A light-switchable gene promoter system.</a> Nature biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).</li>
<li>Polstein, L. R., Gersbach, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Light-inducible+spatiotemporal+control+of+gene+activation+by+customizable+zinc+finger+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">a Light-inducible spatiotemporal control of gene activation by customizable zinc finger transcription factors.</a> J Am Chem Soc. 134 (40), 16480-16483 (2012).</li>
<li>Polstein, L. R., Gersbach, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+A+light-inducible+CRISPR-Cas9+system+for+control+of+endogenous+gene+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">a A light-inducible CRISPR-Cas9 system for control of endogenous gene activation.</a> Nature Chemical Biology. 11 (3), 198-200 (2015).</li>
<li>Yang, X., Jost, A. P. T., Weiner, O. D., Tang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+light-inducible+organelle-targeting+system+for+dynamically+activating+and+inactivating+signaling+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">A light-inducible organelle-targeting system for dynamically activating and inactivating signaling in budding yeast.</a> Molecular biology of the cell. 24 (15), 2419-2430 (2013).</li>
<li>Lee, S., Park, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+protein+inactivation+by+optogenetic+trapping+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Reversible protein inactivation by optogenetic trapping in cells.</a> Nature methods. 11 (6), 633-636 (2014).</li>
<li>Kennedy, M. J., Hughes, R. M., Peteya, L. A., Schwartz, J. W., Ehlers, M. D., Tucker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+blue-light-mediated+induction+of+protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells.</a> Nature Methods. 7 (12), 973-975 (2010).</li>
<li>Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+protein-protein+interactions+in+live+cells+using+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Induction of protein-protein interactions in live cells using light.</a> Nat Biotechnol. 27 (10), 941-945 (2009).</li>
<li>Zoltowski, B. D., Motta-Mena, L. B., Gardner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+light-induced+dimerization+of+a+bacterial+LOV-HTH+DNA-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Blue light-induced dimerization of a bacterial LOV-HTH DNA-binding protein.</a> Biochemistry. 52 (38), 6653-6661 (2013).</li>
<li>Renicke, C., Schuster, D., Usherenko, S., Essen, L. O., Taxis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+LOV2+Domain-Based+Optogenetic+Tool+to+Control+Protein+Degradation+and+Cellular+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">A LOV2 Domain-Based Optogenetic Tool to Control Protein Degradation and Cellular Function.</a> Chemistry & Biology. 20 (4), 619-626 (2013).</li>
<li>Novick, A., Szilard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Description+of+the+chemostat%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">Description of the chemostat.</a> Science (New York, N.Y.). 112 (2920), 715-716 (1950).</li>
<li>Monod, J. La technique de culture continue. Théorie et applications. Ann. Inst. Pasteur. 79 (4), 390-410 (1950).</li>
<li>Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+light-switchable+gene+promoter+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A light-switchable gene promoter system.</a> Nature Biotechnology. 20, 1041-1044 (2002).</li>
<li>Kennedy, M. J., Hughes, R. M., Peteya, L. A., Schwartz, J. W., Ehlers, M. D., Tucker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+blue-light-mediated+induction+of+protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells.</a> Nature Methods. 7, 973-975 (2010).</li>
<li>Olson, E. J., Tabor, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+characterization+methods+overcome+key+challenges+in+synthetic+and+systems+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Optogenetic characterization methods overcome key challenges in synthetic and systems biology.</a> Nature chemical biology. 10 (7), 502-511 (2014).</li>
<li>Botstein, D., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast%3A+An+experimental+organism+for+21st+century+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Yeast: An experimental organism for 21st century biology.</a> Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).</li>
<li>Galanie, S., Smolke, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+yeast-based+production+of+medicinal+protoberberine+alkaloids%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+cell+factories%22%5BJournal%5D)">Optimization of yeast-based production of medicinal protoberberine alkaloids.</a> Microbial cell factories. 14 (1), 144(2015).</li>
<li>Gerngross, T. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+production+of+human+therapeutic+proteins+in+yeasts+and+filamentous+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Advances in the production of human therapeutic proteins in yeasts and filamentous fungi.</a> Nature biotechnology. 22 (11), 1409-1414 (2004).</li>
<li>van Maris, A. J. A., Abbott, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alcoholic+fermentation+of+carbon+sources+in+biomass+hydrolysates+by+Saccharomyces+cerevisiae%3A+current+status%5BTitle%5D)+AND+%22Antonie+van+Leeuwenhoek%22%5BJournal%5D)">Alcoholic fermentation of carbon sources in biomass hydrolysates by Saccharomyces cerevisiae: current status.</a> Antonie van Leeuwenhoek. 90 (4), 391-418 (2006).</li>
<li>Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+control+of+microscopes+using+%C2%B5Manager%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Computer control of microscopes using µManager.</a> Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 14 (2010).</li>
<li>Edelstein, A. D., Tsuchida, M. A., Amodaj, N., Pinkard, H., Vale, R. D., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.jbmethods.org/jbm/article/view/36/0">Advanced methods of microscope control using µManager software.</a> Journal of biological methods. 1 (2), (2014).</li>
<li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. <a target="_blank" href="http://ieeexplore.ieee.org/document/1438429/">Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxygen-plasma treatment and correlation with bond strength.</a> Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).</li>
<li>Saldanha, A. J., Brauer, M. J., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+homeostasis+in+batch+and+steady-state+culture+of+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Nutritional homeostasis in batch and steady-state culture of yeast.</a> Molecular Biology of the Cell. 15, 4089-4104 (2004).</li>
<li>Boer, V. M., Tai, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+responses+of+Saccharomyces+cerevisaie+to+preferred+and+nonpreferred+nitrogen+sources+in+glucose-limited+chemostat+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Research%22%5BJournal%5D)">Transcriptional responses of Saccharomyces cerevisaie to preferred and nonpreferred nitrogen sources in glucose-limited chemostat cultures.</a> FEMS Yeast Research. 7, 604-620 (2007).</li>
<li>Boer, V. M., Amini, S., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+genotype+and+nutrition+on+survival+and+metabolism+of+starving+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Influence of genotype and nutrition on survival and metabolism of starving yeast.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 6930-6935 (2008).</li>
<li>Brauer, M. J., Huttenhower, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+growth+rate%2C+cell+cycle%2C+stress+response+and+metabolic+activity+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Coordination of growth rate, cell cycle, stress response and metabolic activity in yeast.</a> Molecular Biology of the Cell. 19, 352-367 (2008).</li>
<li>Gresham, D., Dunham, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enduring+utility+of+continuous+culturing+in+experimental+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">The enduring utility of continuous culturing in experimental evolution.</a> Genomics. 104 (6), 399-405 (2014).</li>
<li>Liu, H., Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoexcited+CRY2+interacts+with+CIB1+to+regulate+transcription+and+floral+initiation+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">Photoexcited CRY2 interacts with CIB1 to regulate transcription and floral initiation in Arabidopsis.</a> Science (New York, N.Y.). 322 (5907), 1535-1539 (2008).</li>
<li>McIsaac, R. S., Oakes, B. L., Wang, X., Dummit, K. A., Botstein, D., Noyes, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+gene+expression+perturbation+systems+with+rapid%2C+tunable%2C+single-gene+specificity+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Synthetic gene expression perturbation systems with rapid, tunable, single-gene specificity in yeast.</a> Nucleic Acids Research. 41 (4), 1-10 (2013).</li>
<li>McIsaac, R. S., Petti, A. A., Bussemaker, H. J., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perturbation-based+analysis+and+modeling+of+combinatorial+regulation+in+the+yeast+sulfur+assimilation+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Perturbation-based analysis and modeling of combinatorial regulation in the yeast sulfur assimilation pathway.</a> Molecular biology of the cell. 23 (15), 2993-3007 (2012).</li>
<li>McIsaac, R. S., Silverman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast-acting+and+nearly+gratuitous+induction+of+gene+expression+and+protein+depletion+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Fast-acting and nearly gratuitous induction of gene expression and protein depletion in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular biology of the cell. 22 (22), 4447-4459 (2011).</li>
<li>Melendez, J., Patel, M., Oakes, B. L., Xu, P., Morton, P., McClean, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+optogenetic+control+of+intracellular+protein+concentration+in+microbial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+biology+quantitative+biosciences+from+nano+to+macro%22%5BJournal%5D)">Real-time optogenetic control of intracellular protein concentration in microbial cell cultures.</a> Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 6 (3), 366-372 (2014).</li>
<li>Brauer, M. J., Huttenhower, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+growth+rate%2C+cell+cycle%2C+stress+response%2C+and+metabolic+activity+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast.</a> Molecular biology of the cell. 19 (1), 352-367 (2008).</li>
<li>Boer, V. M., Crutchfield, C. A., Bradley, P. H., Botstein, D., Rabinowitz, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth-limiting+intracellular+metabolites+in+yeast+growing+under+diverse+nutrient+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations.</a> Molecular biology of the cell. 21 (1), 198-211 (2010).</li>
<li>Markham, B. E., Byrne, W. J., Methods, E. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/j.2050-0416.1967.tb03043.x/pdf">Uptake, storage and utilization of phosphate by yeast.</a> Journal of the Institute of Brewing. 73, 271-273 (1967).</li>
<li>Kazemi Seresht, A., Palmqvist, E. A., Olsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+phosphate+scarcity+on+pharmaceutical+protein+production+in+S.+cerevisiae%3A+linking+transcriptomic+insights+to+phenotypic+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+cell+factories%22%5BJournal%5D)">The impact of phosphate scarcity on pharmaceutical protein production in S. cerevisiae: linking transcriptomic insights to phenotypic responses.</a> Microbial cell factories. 10 (1), 104(2011).</li>
<li>Shimizu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+Systems+of+Bacteria+such+as+Escherichia+coli+in+Response+to+Nutrient+Limitation+and+Environmental+Stresses%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolites%22%5BJournal%5D)">Regulation Systems of Bacteria such as Escherichia coli in Response to Nutrient Limitation and Environmental Stresses.</a> Metabolites. 4 (1), 1-35 (2013).</li>
<li>Olson, E. J., Hartsough, L. A., Landry, B. P., Shroff, R., Tabor, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+bacterial+gene+circuit+dynamics+with+optically+programmed+gene+expression+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Characterizing bacterial gene circuit dynamics with optically programmed gene expression signals.</a> Nature methods. 11 (4), 449-455 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zaprojektowaliśmy to urządzenie z myślą o elastyczności. Cały użyty kod jest darmowy i open-source. Domyślny proces analizy obrazu w celu segmentacji komórek jest prosty i przebiega szybko. Analizę niestandardową można zaimplementować, rejestrując dane wejściowe użytkownika podczas analizowania reprezentatywnego obrazu za pomocą graficznego interfejsu użytkownika FIJI, konwertując dane wejściowe na skrypt beanshell, a następnie ustawiając wtyczkę tak, aby wywoływała skrypt. Po wywołaniu skryptowi temu zostanie wysłana ta...

Systemy optogenetyczne wykorzystują światło do kontrolowania rosnącej listy procesów komórkowych, w tym ekspresji genów,1,2,3,4,5 lokalizacja białka,6 aktywność białka,6,7,8 Wiązanie białek,8,9,10 i degradacja białka. 11 Metoda hodowli komórek w kontrolowanym środowisku z zaprogramowaną stymulacją optyczną i mierzenia ich reakcji w biologicznie istotnych skalach czasowych jest niezbędna, aby wykorzystać potencjał tych narzędzi do badań w biologii komórki i biotechnologii. Nasza metoda wykorzystuje chemostazę do utrzymania stałego tempa wzrostu komórek w dobrze wymieszanym, napowietrzonym i kontrolowanym temperaturze szklanym naczyniu do hodowli12,13, które jest wystawione na zaprogramowane oświetlenie. Obrazujemy poszczególne komórki w ściekach z hodowli za pomocą odwróconego mikroskopu, aby zmierzyć reakcję kultury na zaprogramowane oświetlenie. Hodowla, pobieranie próbek, obrazowanie i analiza obrazu są w pełni zautomatyzowane, dzięki czemu intensywność fluorescencji i morfologia komórkowa hodowli komórek ściekowych mogą być mierzone przez wiele dni bez udziału użytkownika.
Ten protokół może być zaimplementowany w większości laboratoriów zaznajomionych z hodowlą komórek i mikroskopią, a używany aparat jest tani i wykonany z łatwo dostępnych komponentów. Przezroczyste naczynie do hodowli umieszcza się nad matrycą diod elektroluminescencyjnych (LED) zdolnych do emitowania 1 μW/cm,2-10 mW/cm2 światła. Mikroorganizmy są stale hodowane w naczyniu hodowlanym; Jedna pompa perystaltyczna służy do dodawania pożywki z szybkością rozcieńczenia, druga służy do pobierania kultury z mniejszą szybkością do mikroskopu, a różnica ucieka przez wylot przelewowy. Poduszka grzewcza utrzymuje temperaturę. Powietrze jest stale pompowane do naczynia hodowlanego w celu utrzymania dodatniego ciśnienia, a także wymieszania i napowietrzenia kultury. Z wyjątkiem pompy powietrza, zasilanie tych urządzeń jest regulowane przez mikrokontroler, który odbiera również dane wejściowe z termometru i podłączonego komputera stacjonarnego. Hodowla komórkowa w ściekach jest pompowana do urządzenia mikroprzepływowego na stoliku mikroskopu odwróconego. Obrazy niefluorescencyjne i fluorescencyjne są rejestrowane automatycznie. Komórki na obrazach są scharakteryzowane przez algorytm, który lokalizuje każdą komórkę jako obszar zainteresowania (ROI) i mierzy właściwości każdego ROI.
Aby zademonstrować zastosowanie tego protokołu, zmierzyliśmy reakcję na różne intensywności światła komórek Saccharomyces cerevisiae zaprojektowanych za pomocą reagującego na niebieskie światło systemu optogenetycznego, który kontroluje transkrypcję białka fluorescencyjnego. S. cerevisiae, powszechnie znane jako drożdże piekarskie, zostały wybrane, ponieważ istnieje już wiele systemów optogenetycznych do kontrolowania ekspresji genów w tym systemie14,15,16. Co więcej, ten organizm modelowy jest powszechnie używany do badań z zakresu biologii systemów17 oraz jako podwozie do zastosowań biotechnologicznych18,19,20. Nasze reprezentatywne wyniki pokazują, że protokół ten może być używany do kontrolowania transkrypcji kultury przez wiele dni poprzez zmianę intensywności światła wejściowego i pomiar produkcji reportera fluorescencyjnego.

<table><tbody><tr><td>Obszerny podręcznik laboratoryjny</td><td>GitHub</td><td>NA</td><td>Obszerny, regularnie aktualizowany podręcznik laboratoryjny jest dostępny w " Pliki chemostatu optogenetycznego" Repozytorium GitHub (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). Obejmuje to również opis formy mikroprzepływowej użytej do wygenerowania reprezentatywnych wyników.</td></tr><tr><td>Fritzing Design Viewer</td><td>Fritzing</td><td>NA</td><td>Darmowe oprogramowanie typu open source do przeglądania i edycji projektów płytek drukowanych typu .fzz jest dostępne pod adresem "http://fritzing.org/download/"</td></tr><tr><td>Arduino Uno R3 (Atmega328 - zmontowany)</td><td>Mikrokontroler Adafruit</td><td>50</td><td>. 1 wymagane.</td></tr><tr><td>Zestaw nagłówków Arduino Stackable</td><td>SparkFun Electronics</td><td>10007</td><td>Żeńskie złącza pinowe do podłączenia płytki drukowanej do mikrokontrolera. 1 wymagane.</td></tr><tr><td>Lutownica regulowana 30W 110V - XY-258 110V</td><td>Adafruit</td><td>180</td><td>Do wykonywania połączeń elektrycznych z płytką PCB. Wymagane 1.</td></tr><tr><td>Podstawka pod lutownicę</td><td>Adafruit</td><td>150</td><td>Do wykonywania połączeń elektrycznych z płytką drukowaną. Wymagane 1.</td></tr><tr><td>Mini szpula lutownicza - 60/40 ołowiowa kalafonia do 0,031" średnica - 100g</td><td>Adafruit</td><td>145</td><td>Do wykonywania połączeń elektrycznych z płytką drukowaną. 1 wymagane.</td></tr><tr><td>0,1 &mu; Kondensator F</td><td>SparkFun Electronics</td><td>COM-08375</td><td>Stabilizuje napięcie na płytce drukowanej. Wymagane 1.</td></tr><tr><td>10 &mu; Kondensator F</td><td>SparkFun Electronics</td><td>COM-00523</td><td>Stabilizuje napięcie na płytce drukowanej.</td></tr><tr><td>MAX7219CNG Sterownik wyświetlacza LED Matrix/Digit - sterownik LED MAX7219</td><td>Maxim</td><td>MAX7219CNG</td><td>. Wymagane 1.</td></tr><tr><td>Wymagane 8-pinowe gniazdo IC</td><td>Mouser Electronics</td><td>575-144308</td><td>16. Zostaną one ułożone jeden na drugim, aby podeprzeć naczynie hodowlane nad matrycą LED.</td></tr><tr><td>24-pinowe gniazdo IC</td><td>Mouser Electronics</td><td>535-24-3518-10</td><td>Opcjonalnie. Użyj tego, aby odwracalnie podłączyć sterownik MAXIM 7219CNG do płytki drukowanej.</td></tr><tr><td>Multimetr cyfrowy</td><td>Adafruit</td><td>2034</td><td>Do rozwiązywania problemów z elektroniką. Wymagane 1.</td></tr><tr><td>Złącza header typu break away - 40-pin męskie (długo centrowane, PTH, 0.1")</td><td>SparkFun Electronics</td><td>PRT-12693</td><td>Męskie złącza pinowe do podłączenia matrycy LED do płytki drukowanej. Końce można przycinać za pomocą przecinaków do drutu. Wymagany 1 zestaw.&nbsp;</td></tr><tr><td>Przecinaki do drutu ukośnego</td><td>Adafruit</td><td>152</td><td>Do przycinania długich listew pinowych i cięcia zasilających. 1 wymagane.</td></tr><tr><td>Przewody połączeniowe Premium żeńskie/żeńskie - 40 x 12" (300mm)</td> <td>Adafruit</td><td>793</td><td>Taśma przewodząca do podłączenia płytki stykowej do matrycy LED. Może być łączony od końca do końca za pomocą męskich listew pinowych, aby był dłuższy. 1 Argument wymagany.</td></tr><tr><td>Półwymiarowa płytka do krojenia chleba</td><td>Adafruit</td><td>64</td><td>Matryca LED połączy się z tym, a naczynie do hodowli będzie spoczywać nad nią.</td></tr><tr><td>Miniaturowe źródło światła LED 8x8 Blue Matrix</td><td>Adafruit</td><td>956</td><td>. Dominująca długość fali to 470nm (niebieska). 1 Argument wymagany. Alternatywne miniaturowe matryce LED tego samego dostawcy są dostępne z dominującymi długościami fal: 624 nm (czerwony), 588 nm (żółty), 525 nm (zielony), 572 nm (żółto-zielony) i biały.</td></tr><tr><td>Wymagane 3-pinowe złącze header</td><td>SparkFun Electronics</td><td>13875</td><td>8.</td></tr><tr><td>Zestaw rezystorów - 1/4W (łącznie 500)</td><td>SparkFun Electronics</td><td>10969</td><td>Do elektroniki. 1 wymagany.</td></tr><tr><td>&nbsp; IRL520N</td><td>Międzynarodowy prostownik</td> MOSFET <td>IRL520N</td><td>Przełącznik regulacji napięcia do sterowania prądem DC. 4 Wymagane.</td></tr><tr><td>Przewód połączeniowy - asortyment (Solid Core, 22 AWG)</td><td>SparkFun Electronics</td><td>PRT 11367</td><td>Przewód do elektroniki. 1 wymagany.</td></tr><tr><td>Zasilacz impulsowy 5V 2A (2000mA) - Adafruit</td><td></td><td>276</td> z certyfikatem UL <td>Zasilacz do poduszki grzewczej i Arduino. Wymagane 2.</td></tr><tr><td>Regulowany zasilacz impulsowy 12 VDC 1000mA - na liście UL</td><td>Adafruit</td><td>798</td><td>Do pomp perystaltycznych. 2 wymagane.</td></tr><tr><td>Elektryczna Poduszka Grzewcza - 10cm x 5cm</td><td>Adafruit</td><td>1481</td><td>Do podgrzewania bioreaktora. Wymagana 1.</td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna o zmiennym przepływie o niskim przepływie</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-876-1</td><td>Do pompowania mediów. Wymagana 1</td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna o zmiennym przepływie o średnim przepływie</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-876-2</td><td>Do pompowania kultur. 1 wymagane.</td></tr><tr><td>Regulowany zasilacz impulsowy 9 VDC 1000mA - z certyfikatem UL</td><td>Adafruit</td><td>63</td><td>Do zasilania mikrokontrolera. Zamówienie 1.</td></tr><tr><td>Wodoodporny DS18B20 wysokotemperaturowy Cyfrowy czujnik temperatury + dodatki</td><td>Adafruit</td><td>642</td><td>Termometr do bioreaktora. 1 wymagany.</td></tr><tr><td>Micromanager</td><td>Micromanager</td><td>NA</td><td>Bezpłatne oprogramowanie sterujące mikroskopem o otwartym kodzie źródłowym jest dostępne pod adresem "https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release"</td></tr><tr><td>FIJI</td><td>ImageJ</td><td>NA</td><td>Bezpłatne oprogramowanie do analizy obrazu o otwartym kodzie źródłowym jest dostępne pod adresem "http://fiji.sc/"</td></tr><tr><td>Zintegrowane środowisko programistyczne Arduino</td><td></td><td>NA</td><td>Bezpłatne IDE o otwartym kodzie źródłowym jest dostępne pod adresem "https://www.arduino.cc/en/Main/Software"</td></tr><tr><td>Niestandardowy kod</td><td>GitHub</td><td>NA</td><td>Niestandardowy kod mikrokontrolera i wtyczka "Kontroler bioreaktora" są dostępne w " Pliki chemostatu optogenetycznego" Repozytorium GitHub (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).</td></tr><tr><td>USB A do B - 6 stóp</td><td>SparkFun Electronics</td><td>CAB-00512</td><td>Służy do pobierania danych do mikrokontrolera. 1 wymagane.</td></tr><tr><td>bioreactorTimecourse_example.csv</td><td>GitHub</td><td>NA</td><td>Zaletą ładowania wartości matrycy LED z pliku CSV jest to, że wtyczka może wywołać program w celu zaktualizowania tych wartości na podstawie wyników analizy obrazu, a wartości te można ponownie załadować do mikrokontrolera, umożliwiając sterowanie zwrotne. Jest on dostępny w " Pliki chemostatu optogenetycznego" Repozytorium GitHub (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).</td></tr><tr><td>Żele Tota-frost (papier dyfuzyjny)</td><td>B& H</td><td>B& H # LOFSFTL MFR # T1-72</td><td>Do matrycy LED. 1 wymagane.</td></tr><tr><td>Arkusz montażowy Crosslink 1/4x12x24in</td><td>Grainger, inc</td><td>20JL37</td><td>pianka do obudowy naczynia do hodowli. Wymagane 4.</td></tr><tr><td>Standardowy czujnik mocy fotodiody, Si, 200 - 1100 nm, 50 mW&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>S120VC</td><td>Do pomiaru natężenia światła. Wymagane 1.</td></tr><tr><td>Taśma opisowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>159015N</td><td>Do etykietowania i zabezpieczania elementów sypkich. 1 wymagane.</td></tr><tr><td>Kompaktowa konsola miernika mocy i energii, cyfrowy 4-calowy wyświetlacz LCD</td><td></td><td>PM100D</td><td>Do pomiaru natężenia światła. Wymagane 1.</td></tr><tr><td>100 ml szklana butelka do hybrydyzacji GL45</td><td>Bellco Glass, Inc.</td><td>(7910-40150)</td><td>Zbiornik bioreaktora. 1 wymagany.</td></tr><tr><td>Sześcioportowy montaż</td><td>Bellco Glass, Inc.</td><td>Niestandardowe&nbsp;</td><td>Do zbiornika bioreaktora. Specyfikacja rurki: .125 "OD x .055" ID. Port A: 1,0 "długości nad ślimakiem nasadki i do dna rury. Porty B, C, E, F: 1,0 cala długości powyżej ślimaka nasadki, 33 mm długości poniżej. Port D: 1,0" długości nad ślimakiem kołpaka, 65 mm&nbsp; długo poniżej. 1 Argument wymagany. Zawiera polipropylenową nakrętkę o średnicy 45 mm i białą silikonową uszczelkę, aby zapewnić szczelne uszczelnienie między nakrętką a naczyniem.</td></tr><tr><td>Magiczna taśma klejąca 3105, 3/4 x 300 cali, opakowanie 3 sztuk</td><td>Amazon</td><td>B0009F3P3U</td><td>przezroczysta taśma klejąca. Jest to dostępne u wielu innych dostawców. Służy do zakrycia oznaczeń na naczyniu hodowlanym oraz do mocowania szkła nakrywkowego z kanałem PDMS do aluminiowej ramy nośnej.</td></tr><tr><td>1/16 "ID x 3/16" OD x 1/16" Wall Tygon Sanitarne rurki silikonowe</td><td>United States Plastic Corp.</td><td>57288</td><td>Przewody. Wymagane ~25'.</td></tr><tr><td>Zatyczka z białej gumy Cole-Parmer Twistit, rozmiar 10</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-62992-32</td><td>Korek do kolby na pożywkę i korek do kolby ścieków. 2 Wymagane.</td></tr><tr><td>Kolba laboratoryjna 2L</td><td>Pyrex</td><td>4980</td><td>Kolba na podłoża i kolba ściekowa. Wymagane 2.</td></tr><tr><td>Szczypta dzienna</td><td>Fisher Scientific</td><td>5867</td><td>Do zaciskania rurek. 3 wymagane.</td></tr><tr><td>Wymienny zespół przewodów 1/16" ID</td><td>Traceable Products</td><td>3372</td><td>Pompy perystaltyczne są dostarczane z zestawem rurek, ale zużywają się one po tygodniach użytkowania.</td></tr><tr><td>Wymienny zespół przewodów 1/50" ID</td><td>Traceable Products</td><td>3371</td><td>Pompy perystaltyczne są dostarczane z zestawem rurek, ale zużywają się one po tygodniach użytkowania.</td></tr><tr><td>Męski luer z pierścieniem blokującym x 1/16" króciec węża, nylon, 25/pk</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45505-00</td><td>Złącza. Wymagane jest ~10 luerów.</td></tr><tr><td>Męski luer z pierścieniem blokującym x 1/8" króciec węża, nylon, 25/pk</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45505-04</td><td>Złącza. 5 wymaganych, po jednym dla każdego gumowego otworu korka do wypełnienia rurką.</td></tr><tr><td>Żeński adapter króćca do węża luer x 1/16", nylon, 25/pk</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45502-00</td><td>Złącza. Wymagane ~10 luerów.</td></tr><tr><td>Żeński adapter luer x 3/16" z króćcem węża</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45502-08</td><td>Złącza. Wymagane ~10 luerów.</td></tr><tr><td>Cole-Parmer Luer Akcesorium, żeńska nasadka Luer, nylon, 25/opk</td><td>Cole-Parmer</td><td>SC-45502-28</td><td></td></tr><tr><td>Cole-Parmer Luer Accessory, męska wtyczka Luer Lock, nylon, 25/pk</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45505-56</td><td></td></tr><tr><td>Rurka PTFE z mikrootworem, 0,022"ID x 0,042"OD, 100 ft/rolka</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-06417-21</td><td>Rurka. Wymagana 1 rolka.</td></tr><tr><td>Rurka silikonowa utwardzana platyną Masterflex, L/S 13, 25 ft</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-96410-13</td><td>Rurka. Wymagane ~25'.</td></tr><tr><td>3/16 "ID x 1/4" OD x 1/32" Wall Tygon Sanitarne rurki silikonowe</td><td>United States Plastic Corp.</td><td>57293</td><td>Przewody. Wymagane ~1'</td></tr>.<tr><td>Filtr próżniowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>974107</td><td>Filtr próżniowy Nalgene do sterylnych mediów filtracyjnych.</td></tr><tr><td>Aquel Oxy-Boost 200</td><td>Rena Aquatic Supply</td><td>AP200</td><td>Pompa powietrza o regulowanym przepływie z podwójną membraną do napowietrzania i mieszania mediów. 1 wymagany.&nbsp;</td></tr><tr><td>0,2 &mu; Filtr strzykawkowy m porów</td><td>Corning International</td><td>431229</td><td>Gwarantuje to, że powietrze z pompy akwariowej nie zanieczyszcza aparatu. 1 wymagane.</td></tr><tr><td>Zestaw elastomerów silikonowych Slygard 184</td><td>Dow Corning</td><td>Slygard 184</td><td>Do urządzenia mikroprzepływowego. 1 wymagany.</td></tr><tr><td>Amerykańska maszynka do golenia GEM Scientific Jednoostrzowe żyletki</td><td>Fisher Scientific</td><td>17989000</td><td>Do cięcia rur i PDMS. Wymagane 1 ostrze.</td></tr><tr><td>Dziurkacz Harris Uni-Core 1,2 mm ID</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHAWB100028 ALDRICH</td><td>Do wykrawania wlotu/wylotu w urządzeniu mikroprzepływowym. 1 wymagany.</td></tr><tr><td>Szklosz mikroskopu 22x60-1.5</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-G</td><td>Do urządzenia mikroprzepływowego. 1 wymagane.</td></tr><tr><td>Prostokątna aluminiowa rama z kwadratowym oknem</td><td>Niestandardowe</td><td>Do</td><td>obsługi kanału mikroprzepływowego. Wymiary zewnętrzne: 3 cale x 1,25 cala. Wymiary wewnętrzne (część wycięta): 7/8 cala x 7/8 cala Grubość: ~1/32 cala</td></tr></tbody></table>

projekt i wdrożenie zautomatyzowanego systemu oświetlenia, hodowli i pobierania próbek do zastosowań optogenetycznych drobnoustrojów

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

Systemy optogenetyczne wykorzystują genetycznie kodowane białka, które zmieniają konformację w odpowiedzi na określone długości fal światła, aby zmienić procesy komórkowe. Istnieje zapotrzebowanie na systemy hodowli i pomiarów, które obejmują zaprogramowane oświetlenie i stymulację systemów optogenetycznych. Przedstawiamy protokół budowy i użytkowania aparatu do ciągłej hodowli w celu oświetlenia komórek drobnoustrojów zaprogramowanymi dawkami światła oraz automatycznego pozyskiwania i analizy obrazów komórek w ściekach. Działanie tego aparatu jako chemostatu pozwala na ścisłą kontrolę tempa wzrostu i środowiska komórkowego. Ścieki z ciągłej hodowli komórkowej są regularnie pobierane, a komórki są obrazowane za pomocą mikroskopii wielokanałowej. Hodowla, pobieranie próbek, obrazowanie i analiza obrazu są w pełni zautomatyzowane, dzięki czemu dynamiczne reakcje w intensywności fluorescencji i morfologii komórkowej komórek pobranych ze ścieków hodowlanych są mierzone przez wiele dni bez udziału użytkownika. Wykazujemy użyteczność tego aparatu hodowlanego poprzez dynamiczną indukcję produkcji białek w szczepie Saccharomyces cerevisiae zmodyfikowanym za pomocą systemu optogenetycznego, który aktywuje transkrypcję.

Aparaturę tę wykorzystano do stymulacji hodowli S. cerevisiae wykazującej ekspresję żółtego białka fluorescencyjnego (YFP) w odpowiedzi na światło niebieskie za pomocą indukowalnego optogenetycznego systemu transkrypcyjnego opartego na parze białek CRY2/CIB130. Komórki hodowano chemostatycznie w pożywce z ograniczoną zawartością fosforanów przy średnim współczynniku rozcieńczenia 0,2 ± 0,008. Ograniczenie fosforanów jest powszechnie stosowane w eksperyment...

Zaprojektowaliśmy aparat do ciągłej hodowli do użytku z systemami optogenetycznymi do oświetlania kultur mikrobów i regularnego obrazowania komórek w ściekach za pomocą mikroskopu odwróconego. Hodowla, pobieranie próbek, obrazowanie i analiza obrazu są w pełni zautomatyzowane, dzięki czemu dynamiczne reakcje na oświetlenie mogą być mierzone przez kilka dni.

Projekt i wdrożenie zautomatyzowanego systemu oświetlenia, hodowli i pobierania próbek do zastosowań optogenetycznych drobnoustrojów

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

Ogólnym celem tej procedury jest zmontowanie naczynia do ciągłej hodowli, w którym reakcja na oświetlenie drobnoustrojów optogenetycznych może być mierzona za pomocą mikroskopu automatycznie w czasie rzeczywistym i przez wiele dni. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii komórkowej i inżynierii metabolicznej, takie jak to, w jaki sposób dynamiczna ekspresja genów może wywołać odpowiedzi, które różnią się od statycznej ekspresji genów. Główną zaletą tej metody jest to, że ciągły posiew umożliwia pobieranie pomiarów przez wiele dni.Aby rozpocząć, linię uziemienia, linię danych i linię dodatniego napięcia termometru cyfrowego do płytki drukowanej. Odetnij jeden pin od żeńskiego trzypinowego złącza header i przytnij pozostałe dwa piny. go w parze otworów oznaczonych R2 i połącz dwa przylutowane piny, wkładając rezystor 4,7 kilooma do listwy pinowej.Następnie podłącz pozostałe komponenty do płytki drukowanej. Nałóż płytkę drukowaną na mikrokontroler. Skonfiguruj obudowę światłoszczelną i zainstaluj całe oprogramowanie zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym.Najpierw umieść długi koniec aluminiowego portu przez uszczelkę w naczyniu do hodowli i przykręć nakrętkę. Zakryj jeden krótki aluminiowy wylot portu silikonową rurką o średniej średnicy. Podłącz końcówkę destylacyjną, wkładając żeńską wtyczkę luer lock, a następnie podłączając męską wtyczkę luer lock.Ten wylot jest dodatkowy i nie będzie używany. Połącz dwa krótkie odcinki rurki silikonowej o średniej średnicy z męskimi i żeńskimi zamkami typu luer. Następnie podłącz jeden koniec do krótkiego aluminiowego gniazda portu i podłącz końcówkę destylacji.Naczynie zostanie zaszczepione przez tę probówkę. Następnie podłącz dwie rurki medium do końców rurki perystaltycznej o średniej średnicy i łączników. Podłącz jeden koniec do krótkiego aluminiowego portu, a drugi podłączyć.Później zostanie on podłączony do kolby z mediami. Podłącz silikonową rurkę o średniej średnicy do najdłuższego aluminiowego portu. Rurka powinna być wystarczająco długa, aby dotrzeć do kolby z pożywką.Podłącz kolejny krótki segment o długości kilku cali do końca, a następnie włóż go do gumowego korka na kolbie z pożywką. Zacisnąć rurkę. Po późniejszym odblokowaniu, to połączenie pozwala na mieszanie, napowietrzanie kultury i utrzymywanie dodatniego ciśnienia przez napływające pęcherzyki.Włożyć rurkę o średniej średnicy wystarczająco długą, aby sięgała dna kolby, do korka, przez który będzie przenoszone podłoże. Podłącz kolejną rurkę o średniej średnicy do tej, a następnie rurkę o szerokiej średnicy na końcu. Podłącz końcówkę destylacyjną.Wypełnij trzeci otwór w korku krótkim odcinkiem rurki o średniej średnicy, połączonym z dwoma innymi segmentami rurki o średniej średnicy i zatkanym na końcu destylacji. Zostanie on podłączony do pompy próżniowej, a później do pompy akwariowej. Włóż męski luer lock do segmentu rurki silikonowej o wąskiej średnicy, a następnie mocno włóż rurkę PTFE.Następnie przymocuj żeński luer lock do rurki o średniej średnicy. Przeciągnij zamek żeński wzdłuż rurki PTFE, aby połączyć zamki, a drugi z krótkim aluminiowym portem. Upewnij się, że rurka PTFE wewnątrz naczynia do hodowli zwisa poniżej drugiej co do długości rurki aluminiowej i nad dnem.Przytnij w razie potrzeby. Z tego miejsca pobierane są próbki pożywki do kanału obrazowania, a wąskie rurki minimalizują objętość pośrednią. Następnie podłącz odsłoniętą wąską rurkę silikonową do wąskiej rurki perystaltycznej i łączników.Do tego połącz trzy segmenty rurki o wąskiej średnicy i dwa segmenty rurki PTFE, naprzemiennie je. Podłącz go do kolby ściekowej za pomocą rurki o średniej średnicy. Następnie podłącz jeden koniec rurki silikonowej o średniej średnicy do drugiej najdłuższej rurki aluminiowego portu na drugim końcu kolby ściekowej.Ta aluminiowa rurka ustawia objętość kultury, a nadmiar kultury przelewa się do pojemnika na ścieki. Owinąć pokrywki kolby folią aluminiową, a następnie autoklawować zestaw przez 30 minut w temperaturze 121 stopni Celsjusza i 15 PSI. Podłącz filtr próżniowy do butelki o pojemności 100 mililitrów.Zdejmij osłonę smoczka, a następnie wyjmij białą zatyczkę ze złączki filtra próżniowego za pomocą sterylnej pęsety. Podłączyć szeroką rurkę silikonową do smoczka, drugą wolną rurkę kolby z pożywką do pompy próżniowej i upewnić się, że trzecia rurka łącząca kolbę z naczyniem do hodowli jest zaciśnięta. Napełnij filtr mediami, włącz pompę próżniową, a następnie przefiltruj resztę mediów.Clamp średni silikonowy przewód podłączony do odkurzacza i wyłącz pompę próżniową. Usuń luery z pośredniego segmentu średniej rurki silikonowej podłączonej do pompy próżniowej i włóż niebieski koniec sterylnego filtra powietrza strzykawkowego do tej probówki. Następnie zaciśnij szeroką silikonową rurkę i odłącz od niej męski luer.Odłączyć wtyczkę od żeńskiego luera rurki wlotowej pożywki naczynia do hodowli. Podłącz te luery, aby umożliwić pompowanie pożywki do naczynia do hodowli. Następnie wyjmij filtr z butelki o pojemności 100 mililitrów i załóż nakrętkę butelki.Użyj tego podłoża do przygotowania kultury starterowej. Ustawić zestaw do ciągłej hodowli w pobliżu mikroskopu, tak aby kolba z pożywką znajdowała się wyżej niż naczynie do hodowli, a kolba ściekowa znajdowała się niżej niż naczynie do hodowli, aby zapobiec przepływowi wstecznemu. Bezpiecznie przyklej gumowe korki do podłoża i kolb na ścieki.Następnie odłącz końce rurki PTFE od łączącej je wąskiej silikonowej rurki i podłącz te końce do wlotu i wylotu przygotowanego urządzenia mikroprzepływowego. Następnie wepchnij pożywkę do naczynia hodowlanego, podłączając biały koniec filtra powietrza strzykawki do pompy akwariowej. Gdy media osiągną poziom portu odpływowego, owiń rurki wlotowe i złączki medium wokół powolnej pompy perystaltycznej, a wąskie rurki i łączniki wylotowe próbki wokół szybkiej pompy perystaltycznej.Napowietrzyć pożywkę, odkręcając rurkę powietrzną między kolbą pożywki a naczyniem do hodowli. Następnie przyklej poduszkę grzewczą i termometr do naczynia hodowlanego, aby można było kontrolować jego temperaturę. Owiń rurki z pożywką wokół naczynia do hodowli, tak aby wchodzące podłoże miało tę samą temperaturę co naczynie.Następnie włóż naczynie do hodowli do czarnej piankowej obudowy nad matrycą LED i upewnij się, że rurki nie są ściśnięte. Użyj wtyczki sterownika bioreaktora, aby włączyć pompę powolnego medium na jedną dziesiątą każdego 30-sekundowego interwału. Natężenie przepływu będzie bardzo niskie, ale większe niż szybkość parowania.Zacisknąć rurkę powietrza doprowadzającego między kolbą z pożywką a naczyniem do hodowli. Za pomocą pipety zaszczepić naczynie hodowlane jednym mililitrem z kultury starterowej. Następnie zaciśnij końcówkę destylacyjną tej rurki i odkręć rurkę powietrzną.Pozwól kulturze rosnąć z dnia na dzień. Zakryj obudowę, aby nie wpadało światło. Następnego dnia użyj wtyczki sterownika bioreaktora, aby ustawić pompy perystaltyczne tak, aby obracały się przez dłuższy czas, odpowiadający żądanemu natężeniu przepływu mediów i próbek.Pozwól, aby gęstość kultury zrównoważyła się przez noc. Następnego dnia wypełnij listę pozycji etapu i mikro menedżera zestawem nienakładających się pozycji, w których komórki pompowane do kanału mikroprzepływowego będą znajdować się w płaszczyźnie ogniskowej. Następnie otwórz wtyczkę kontrolera bio reaktora.Wybierz żądany przebieg czasowy matrycy LED, kanały obrazowania i inne ustawienia eksperymentalne z podpowiedzi, a następnie rozpocznij zbieranie danych. Aparat ten został wykorzystany do stymulacji hodowli Saccharomyces cerevisiae, wyrażającej żółte białko fluorescencyjne w odpowiedzi na niebieskie światło za pośrednictwem indukowalnego optogenetycznego systemu transkrypcji. Uzyskano kontrast bazowy i obrazy fluorescencyjne kanału mikroprzepływowego.Kontury komórek zostały zidentyfikowane na podstawie obrazów kontrastu fazowego, zmapowane do obrazów fluorescencyjnych, a obrazy fluorescencyjne zostały zarejestrowane w czasie rzeczywistym. Mapa cieplna pokazuje rozkład fluorescencji kultury spowodowany produkcją białka żółtej fluorescencji po aktywacji systemu optogenetycznego. Fluorescencję około 170 000 komórek analizowano z ponad 30 000 obrazów, uzyskanych z 28 pozycji etapowych w ciągu 70 godzin.Podczas tego badania kultura była wystawiona na działanie niebieskiego światła o różnym natężeniu w odstępach sześciogodzinnych, po których następowało sześć godzin całkowitej ciemności. Komórki były wystawione na działanie światła przed pierwszym pomiarem, dlatego intensywność fluorescencji zmniejsza się w pierwszym okresie ciemności. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu ośmiu godzin, w ciągu trzech dni, jeśli jest wykonywana prawidłowo.Podczas wykonywania tej procedury bardzo ważne jest, aby używać sterylnej techniki. Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak kontrola ze sprzężeniem zwrotnym w czasie rzeczywistym, do kontrolowania stężenia białka. Technika ta umożliwi dynamiczne badanie organizmów z konstruktami optogenetycznymi, w dłuższych okresach czasu, dłużej niż jest to możliwe przy użyciu płytek lub hodowli okresowej.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zintegrować aparat do ciągłej hodowli, światło i mikroskop, aby stymulować i badać drobnoustroje optogenetyczne.

design-implementation-an-automated-illuminating-culturing-sampling

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Optogenetyka stała się potężnym narzędziem do wykorzystania w eksperymentach neuronauki behawioralnej. Protokół ten oferuje przewodnik krok po kroku po projektowaniu i konfiguracji systemów laserowych oraz zapewnia pełny protokół przeprowadzania wielokrotnych i jednoczesnych stymulacji optogenetycznych in vivo zgodnych z większością paradygmatów testów behawioralnych gryzoni.

In vivo (in vivo) Stymulacja optogenetyczna ośrodkowego układu nerwowego gryzoni

Tutaj prezentujemy protokół do analizy transferu informacji oscylacyjnych między komórkami za pomocą kontroli optogenetycznej i monitorowania ekspresji genów na żywo. Podejście to stanowi unikalną platformę do testowania funkcjonalnego znaczenia programów dynamicznej ekspresji genów w systemach wielokomórkowych.

Metoda optogenetyczna do kontroli i analizy wzorców ekspresji genów w interakcjach międzykomórkowych

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzać eksperymenty optogenetyczne w celu kontrolowania ekspresji genów za pomocą światła czerwonego i dalekiego czerwonego przy użyciu PhyB i PIF3. W zestawie znajdują się instrukcje krok po kroku, jak zbudować prosty i elastyczny system oświetlenia, który umożliwia kontrolę ekspresji genów lub innej optogenetyki za pomocą komputera.

Budowa prostego i wszechstronnego systemu oświetlenia do eksperymentów optogenetycznych

Niezawodna kontrola komórek ssaków reagujących na światło wymaga standaryzacji metod optogenetycznych. Aby osiągnąć ten cel, badanie to nakreśla linię budowy obwodów genowych, inżynierii komórkowej, obsługi sprzętu optogenetycznego i testów weryfikacyjnych w celu standaryzacji badania ekspresji genów indukowanej światłem przy użyciu optogenetycznego obwodu genowego o ujemnym sprzężeniu zwrotnym jako studium przypadku.

Niezawodna inżynieria i kontrola stabilnych optogenetycznych obwodów genowych w komórkach ssaków

Bioluminescencja - światło emitowane przez enzym lucyferazy utleniający substrat o małych cząsteczkach, lucyferynę - może być wykorzystane do aktywacji białek fotosensorycznych, dodając w ten sposób kolejny wymiar do stymulacji świetlnej i umożliwiając manipulowanie wieloma funkcjami zależnymi od światła w komórkach w skalach czasowych i przestrzennych.

Optogenetyka bioluminescencyjna 2.0: wykorzystanie bioluminescencji do aktywacji białek fotosensorycznych in vitro i in vivo

Optogenetyczna kontrola metabolizmu mikrobiologicznego oferuje elastyczną dynamiczną kontrolę nad procesami fermentacji. Niniejszy protokół pokazuje, jak skonfigurować fermentację regulowaną niebieskim światłem do produkcji chemicznej i białkowej w różnych skalach objętościowych.

Fermentacja kontrolowana światłem do produkcji mikrobiologicznej, chemicznej i białkowej

Opisujemy powtarzalny, zautomatyzowany i bezstronny system obrazowania do charakteryzowania funkcji połączeń nerwowo-mięśniowych przy użyciu ludzkiej tkanki mięśniowej i optogenetycznych neuronów ruchowych. System ten pozwala na funkcjonalną kwantyfikację połączeń nerwowo-mięśniowych w czasie i wykrywa zmniejszone funkcje nerwowo-mięśniowe spowodowane przez neurotoksyny i surowicę pacjenta z miastenią.

Inżynieria i charakterystyka modelu optogenetycznego ludzkiego połączenia nerwowo-mięśniowego

Ten protokół obejmuje transfekcję czujników cAMP i bPAC-nLuc, białka optogenetycznego, w celu dokładnego śledzenia jego dystrybucji komórkowej i odpowiedzi na stymulację światłem. Innowacyjne podejście polegające na stworzeniu mapy odpowiedzi cAMP przy użyciu systemu skanowania punktowego ma potencjał do przyspieszenia badań nad białkami optogenetycznymi w różnych dziedzinach.

Mapowanie dystrybucji komórkowej białka optogenetycznego za pomocą siatki stymulacji świetlnej

Ten protokół przedstawia kroki do wykorzystania zautomatyzowanej platformy Lustro do przeprowadzenia wysokoprzepustowej charakterystyki systemów optogenetycznych u drożdży.

Wysokoprzepustowe eksperymenty optogenetyczne na drożdżach z wykorzystaniem zautomatyzowanej platformy Lustro

Ten protokół opisuje zastosowanie zaprojektowanej domeny przełącznika allosterycznego aktywowanego niebieskim światłem (LightR) do odwracalnej czasoprzestrzennej kontroli aktywności białek. Wykorzystując kinazę tyrozynową Src jako model, badanie to oferuje skomplikowany protokół do opracowania i scharakteryzowania regulowanego światłem Src (LightR-Src). Pokazuje to wszechstronność tego podejścia w różnych klasach enzymów.

Czasoprzestrzenna kontrola aktywności białek poprzez optogenetyczną regulację allosteryczną

Badanie opisuje metodę eksperymentów o wysokiej przepustowości z wykorzystą matrycę LED drukowaną w 3D, aby zoptymalizować ekspresję genów indukowanych światłem w HEK293T komórkach.

Szybka optymalizacja systemu indukowalnego światłem do kontroli ekspresji genów ssaków

Poznaj metodę automatycznej hodowli ciągłej drobnoustrojów optogenetycznych z pomiarem ekspresji genów w czasie rzeczywistym. System umożliwia wielodniowe obserwacje dynamicznych odpowiedzi komórkowych.

Projekt i wdrożenie zautomatyzowanego systemu oświetlenia, hodowli i pobierania próbek do zastosowań optogenetycznych drobnoustrojów (Wideo) | JoVE Journal

Projekt i wdrożenie zautomatyzowanego systemu oświetlenia, hodowli i pobierania próbek do zastosowań optogenetycznych drobnoustrojów

Przeglądaj więcej filmów