Projekt i wdrożenie zautomatyzowanego systemu oświetlenia, hodowli i pobierania próbek do zastosowań optogenetycznych drobnoustrojów

Ogólnym celem tej procedury jest zmontowanie naczynia do ciągłej hodowli, w którym reakcja na oświetlenie drobnoustrojów optogenetycznych może być mierzona za pomocą mikroskopu automatycznie w czasie rzeczywistym i przez wiele dni. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii komórkowej i inżynierii metabolicznej, takie jak to, w jaki sposób dynamiczna ekspresja genów może wywołać odpowiedzi, które różnią się od statycznej ekspresji genów. Główną zaletą tej metody jest to, że ciągły posiew umożliwia pobieranie pomiarów przez wiele dni.

Aby rozpocząć, linię uziemienia, linię danych i linię dodatniego napięcia termometru cyfrowego do płytki drukowanej. Odetnij jeden pin od żeńskiego trzypinowego złącza header i przytnij pozostałe dwa piny. go w parze otworów oznaczonych R2 i połącz dwa przylutowane piny, wkładając rezystor 4,7 kilooma do listwy pinowej.

Następnie podłącz pozostałe komponenty do płytki drukowanej. Nałóż płytkę drukowaną na mikrokontroler. Skonfiguruj obudowę światłoszczelną i zainstaluj całe oprogramowanie zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym.

Najpierw umieść długi koniec aluminiowego portu przez uszczelkę w naczyniu do hodowli i przykręć nakrętkę. Zakryj jeden krótki aluminiowy wylot portu silikonową rurką o średniej średnicy. Podłącz końcówkę destylacyjną, wkładając żeńską wtyczkę luer lock, a następnie podłączając męską wtyczkę luer lock.

Ten wylot jest dodatkowy i nie będzie używany. Połącz dwa krótkie odcinki rurki silikonowej o średniej średnicy z męskimi i żeńskimi zamkami typu luer. Następnie podłącz jeden koniec do krótkiego aluminiowego gniazda portu i podłącz końcówkę destylacji.

Naczynie zostanie zaszczepione przez tę probówkę. Następnie podłącz dwie rurki medium do końców rurki perystaltycznej o średniej średnicy i łączników. Podłącz jeden koniec do krótkiego aluminiowego portu, a drugi podłączyć.

Później zostanie on podłączony do kolby z mediami. Podłącz silikonową rurkę o średniej średnicy do najdłuższego aluminiowego portu. Rurka powinna być wystarczająco długa, aby dotrzeć do kolby z pożywką.

Podłącz kolejny krótki segment o długości kilku cali do końca, a następnie włóż go do gumowego korka na kolbie z pożywką. Zacisnąć rurkę. Po późniejszym odblokowaniu, to połączenie pozwala na mieszanie, napowietrzanie kultury i utrzymywanie dodatniego ciśnienia przez napływające pęcherzyki.

Włożyć rurkę o średniej średnicy wystarczająco długą, aby sięgała dna kolby, do korka, przez który będzie przenoszone podłoże. Podłącz kolejną rurkę o średniej średnicy do tej, a następnie rurkę o szerokiej średnicy na końcu. Podłącz końcówkę destylacyjną

Wypełnij trzeci otwór w korku krótkim odcinkiem rurki o średniej średnicy, połączonym z dwoma innymi segmentami rurki o średniej średnicy i zatkanym na końcu destylacji. Zostanie on podłączony do pompy próżniowej, a później do pompy akwariowej. Włóż męski luer lock do segmentu rurki silikonowej o wąskiej średnicy, a następnie mocno włóż rurkę PTFE.

Następnie przymocuj żeński luer lock do rurki o średniej średnicy. Przeciągnij zamek żeński wzdłuż rurki PTFE, aby połączyć zamki, a drugi z krótkim aluminiowym portem. Upewnij się, że rurka PTFE wewnątrz naczynia do hodowli zwisa poniżej drugiej co do długości rurki aluminiowej i nad dnem.

Przytnij w razie potrzeby. Z tego miejsca pobierane są próbki pożywki do kanału obrazowania, a wąskie rurki minimalizują objętość pośrednią. Następnie podłącz odsłoniętą wąską rurkę silikonową do wąskiej rurki perystaltycznej i łączników.

Do tego połącz trzy segmenty rurki o wąskiej średnicy i dwa segmenty rurki PTFE, naprzemiennie je. Podłącz go do kolby ściekowej za pomocą rurki o średniej średnicy. Następnie podłącz jeden koniec rurki silikonowej o średniej średnicy do drugiej najdłuższej rurki aluminiowego portu na drugim końcu kolby ściekowej.

Ta aluminiowa rurka ustawia objętość kultury, a nadmiar kultury przelewa się do pojemnika na ścieki. Owinąć pokrywki kolby folią aluminiową, a następnie autoklawować zestaw przez 30 minut w temperaturze 121 stopni Celsjusza i 15 PSI. Podłącz filtr próżniowy do butelki o pojemności 100 mililitrów.

Zdejmij osłonę smoczka, a następnie wyjmij białą zatyczkę ze złączki filtra próżniowego za pomocą sterylnej pęsety. Podłączyć szeroką rurkę silikonową do smoczka, drugą wolną rurkę kolby z pożywką do pompy próżniowej i upewnić się, że trzecia rurka łącząca kolbę z naczyniem do hodowli jest zaciśnięta. Napełnij filtr mediami, włącz pompę próżniową, a następnie przefiltruj resztę mediów.

Clamp średni silikonowy przewód podłączony do odkurzacza i wyłącz pompę próżniową. Usuń luery z pośredniego segmentu średniej rurki silikonowej podłączonej do pompy próżniowej i włóż niebieski koniec sterylnego filtra powietrza strzykawkowego do tej probówki. Następnie zaciśnij szeroką silikonową rurkę i odłącz od niej męski luer.

Odłączyć wtyczkę od żeńskiego luera rurki wlotowej pożywki naczynia do hodowli. Podłącz te luery, aby umożliwić pompowanie pożywki do naczynia do hodowli. Następnie wyjmij filtr z butelki o pojemności 100 mililitrów i załóż nakrętkę butelki.

Użyj tego podłoża do przygotowania kultury starterowej. Ustawić zestaw do ciągłej hodowli w pobliżu mikroskopu, tak aby kolba z pożywką znajdowała się wyżej niż naczynie do hodowli, a kolba ściekowa znajdowała się niżej niż naczynie do hodowli, aby zapobiec przepływowi wstecznemu. Bezpiecznie przyklej gumowe korki do podłoża i kolb na ścieki.

Następnie odłącz końce rurki PTFE od łączącej je wąskiej silikonowej rurki i podłącz te końce do wlotu i wylotu przygotowanego urządzenia mikroprzepływowego. Następnie wepchnij pożywkę do naczynia hodowlanego, podłączając biały koniec filtra powietrza strzykawki do pompy akwariowej. Gdy media osiągną poziom portu odpływowego, owiń rurki wlotowe i złączki medium wokół powolnej pompy perystaltycznej, a wąskie rurki i łączniki wylotowe próbki wokół szybkiej pompy perystaltycznej.

Napowietrzyć pożywkę, odkręcając rurkę powietrzną między kolbą pożywki a naczyniem do hodowli. Następnie przyklej poduszkę grzewczą i termometr do naczynia hodowlanego, aby można było kontrolować jego temperaturę. Owiń rurki z pożywką wokół naczynia do hodowli, tak aby wchodzące podłoże miało tę samą temperaturę co naczynie.

Następnie włóż naczynie do hodowli do czarnej piankowej obudowy nad matrycą LED i upewnij się, że rurki nie są ściśnięte. Użyj wtyczki sterownika bioreaktora, aby włączyć pompę powolnego medium na jedną dziesiątą każdego 30-sekundowego interwału. Natężenie przepływu będzie bardzo niskie, ale większe niż szybkość parowania.

Zacisknąć rurkę powietrza doprowadzającego między kolbą z pożywką a naczyniem do hodowli. Za pomocą pipety zaszczepić naczynie hodowlane jednym mililitrem z kultury starterowej. Następnie zaciśnij końcówkę destylacyjną tej rurki i odkręć rurkę powietrzną.

Pozwól kulturze rosnąć z dnia na dzień. Zakryj obudowę, aby nie wpadało światło. Następnego dnia użyj wtyczki sterownika bioreaktora, aby ustawić pompy perystaltyczne tak, aby obracały się przez dłuższy czas, odpowiadający żądanemu natężeniu przepływu mediów i próbek.

Pozwól, aby gęstość kultury zrównoważyła się przez noc. Następnego dnia wypełnij listę pozycji etapu i mikro menedżera zestawem nienakładających się pozycji, w których komórki pompowane do kanału mikroprzepływowego będą znajdować się w płaszczyźnie ogniskowej. Następnie otwórz wtyczkę kontrolera bio reaktora.

Wybierz żądany przebieg czasowy matrycy LED, kanały obrazowania i inne ustawienia eksperymentalne z podpowiedzi, a następnie rozpocznij zbieranie danych. Aparat ten został wykorzystany do stymulacji hodowli Saccharomyces cerevisiae, wyrażającej żółte białko fluorescencyjne w odpowiedzi na niebieskie światło za pośrednictwem indukowalnego optogenetycznego systemu transkrypcji. Uzyskano kontrast bazowy i obrazy fluorescencyjne kanału mikroprzepływowego.

Kontury komórek zostały zidentyfikowane na podstawie obrazów kontrastu fazowego, zmapowane do obrazów fluorescencyjnych, a obrazy fluorescencyjne zostały zarejestrowane w czasie rzeczywistym. Mapa cieplna pokazuje rozkład fluorescencji kultury spowodowany produkcją białka żółtej fluorescencji po aktywacji systemu optogenetycznego. Fluorescencję około 170 000 komórek analizowano z ponad 30 000 obrazów, uzyskanych z 28 pozycji etapowych w ciągu 70 godzin.

Podczas tego badania kultura była wystawiona na działanie niebieskiego światła o różnym natężeniu w odstępach sześciogodzinnych, po których następowało sześć godzin całkowitej ciemności. Komórki były wystawione na działanie światła przed pierwszym pomiarem, dlatego intensywność fluorescencji zmniejsza się w pierwszym okresie ciemności. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu ośmiu godzin, w ciągu trzech dni, jeśli jest wykonywana prawidłowo.

Podczas wykonywania tej procedury bardzo ważne jest, aby używać sterylnej techniki. Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak kontrola ze sprzężeniem zwrotnym w czasie rzeczywistym, do kontrolowania stężenia białka. Technika ta umożliwi dynamiczne badanie organizmów z konstruktami optogenetycznymi, w dłuższych okresach czasu, dłużej niż jest to możliwe przy użyciu płytek lub hodowli okresowej.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zintegrować aparat do ciągłej hodowli, światło i mikroskop, aby stymulować i badać drobnoustroje optogenetyczne.