Name: Szybkie różnicowanie neuronalne indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do pomiaru aktywności sieci na układach mikroelektrod (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Poznaj szybką metodę różnicowania komórek iPSC w neurony korowe z kontrolą gęstości komórkowej na układach mikroelektrod. Technika umożliwia badanie aktywności sieci neuronowych i mechanizmów chorób neurologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Jessice Classen za przeprowadzenie eksperymentów z klamrą na całej komórce. Detektory hiPSC użyte w naszych eksperymentach zostały dostarczone dzięki uprzejmości Huiqing Zhou i Willema van den Akkera z Uniwersytetu Radboud w Nijmegen. Wektory transferu użyte w tym protokole zostały udostępnione dzięki uprzejmości Olivera Brüstle, Philippa Kocha i Julii Ladewig z Centrum Medycznego Uniwersytetu w Bonn.

<ol><li>Ahfeldt, T., Litterman, N. K., Rubin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+human+disease+using+human+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Studying human disease using human neurons.</a> Brain Res. , (2016).</li>
<li>Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+transplantable+neural+precursors+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 19 (12), 1129-1133 (2001).</li>
<li>Perrier, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+midbrain+dopamine+neurons+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101 (34), 12543-12548 (2004).</li>
<li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+genomic+and+functional+analyses+reveal+neuronal+subtype+differentiation+bias+in+human+embryonic+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Integrative genomic and functional analyses reveal neuronal subtype differentiation bias in human embryonic stem cell lines.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104 (34), 13821-13826 (2007).</li>
<li>Chambers, S. M., Fasano, C. A., Papapetrou, E. P., Tomishima, M., Sadelain, M., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).</li>
<li>Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cerebral+cortex+neurons+and+neural+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks.</a> Nat Protoc. 7, 1836-1846 (2012).</li>
<li>Espuny-Camacho, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyramidal+neurons+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+integrate+efficiently+into+mouse+brain+circuits+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo.</a> Neuron. 77 (3), 440-456 (2013).</li>
<li>Maroof, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+and+functional+maturation+of+cortical+interneurons+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (5), 559-572 (2013).</li>
<li>Johnson, M. A., Weick, J. P., Pearce, R. A., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+neural+development+from+human+embryonic+stem+cells%3A+accelerated+synaptic+activity+via+astrocyte+coculture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional neural development from human embryonic stem cells: accelerated synaptic activity via astrocyte coculture.</a> J Neurosci. 27 (12), 3069-3077 (2007).</li>
<li>Hu, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+follows+developmental+principles+but+with+variable+potency%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 107 (9), 4335-4340 (2010).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-371-3+expression+predicts+neural+differentiation+propensity+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8 (6), 695-706 (2011).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+single-step+induction+of+functional+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells.</a> Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).</li>
<li>Odawara, A., Saitoh, Y., Alhebshi, A. H., Gotoh, M., Suzuki, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+electrophysiological+activity+and+pharmacological+response+of+a+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+neuron+and+astrocyte+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Long-term electrophysiological activity and pharmacological response of a human induced pluripotent stem cell-derived neuron and astrocyte co-culture.</a> Biochem Biophys Res Commun. 443 (4), 1176-1181 (2014).</li>
<li>Odawara, A., Katoh, H., Matsuda, N., Suzuki, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+maturation+and+drug+responses+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cortical+neuronal+networks+in+long-term+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Physiological maturation and drug responses of human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks in long-term culture.</a> Sci Rep. 6, 26181(2016).</li>
<li>Amin, H., Maccione, A., Marinaro, F., Zordan, S., Nieus, T., Berdondini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+Responses+and+Spontaneous+Activity+of+Human+iPS-Derived+Neuronal+Networks+Characterized+for+3-month+Culture+with+4096-Electrode+Arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Electrical Responses and Spontaneous Activity of Human iPS-Derived Neuronal Networks Characterized for 3-month Culture with 4096-Electrode Arrays.</a> Front Neurosci. 10, (2016).</li>
<li>Heikkila, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+neuronal+cells+form+spontaneously+active+neuronal+networks+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived neuronal cells form spontaneously active neuronal networks in vitro.</a> Exp Neurol. 218 (1), 109-116 (2009).</li>
<li>Massobrio, P., Massobrio, G., Martinoia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-program+approach+for+simulating+recorded+extracellular+signals+generated+by+neurons+coupled+to+microelectrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Neurocomputing%22%5BJournal%5D)">Multi-program approach for simulating recorded extracellular signals generated by neurons coupled to microelectrode arrays.</a> Neurocomputing. 70, 2467-2476 (2007).</li>
<li>Wang, L., Riss, M., Buitrago, J. O., Claverol-Tinturé, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysics+of+microchannel-enabled+neuron-electrode+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Biophysics of microchannel-enabled neuron-electrode interfaces.</a> J Neural Eng. 9 (2), (2012).</li>
<li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).</li>
<li>Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+mouse+cortical+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of mouse cortical astrocytes.</a> J. Vis. Exp. (71), e50079(2013).</li>
<li>Pacifici, M., Peruzzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+rat+embryonic+neural+cells%3A+a+quick+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of rat embryonic neural cells: a quick protocol.</a> J Vis Exp. (63), e3965(2012).</li>
<li>Ba, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARHGAP12+functions+as+a+developmental+brake+on+excitatory+synapse+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">ARHGAP12 functions as a developmental brake on excitatory synapse function.</a> Cell Rep. 14 (6), 1355-1368 (2016).</li>
<li>Bologna, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+neuronal+activity+by+SPYCODE+multi-channel+data+analyzer%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Netw%22%5BJournal%5D)">Investigating neuronal activity by SPYCODE multi-channel data analyzer.</a> Neural Netw. 23 (6), 685-697 (2010).</li>
<li>Ba, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRIO+loss+of+function+is+associated+with+mild+intellectual+disability+and+affects+dendritic+branching+and+synapse+function%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">TRIO loss of function is associated with mild intellectual disability and affects dendritic branching and synapse function.</a> Hum Mol Genet. 25 (5), 892-902 (2016).</li>
<li>Benevento, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+methylation+by+the+Kleefstra+syndrome+protein+EHMT1+mediates+homeostatic+synaptic+scaling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Histone methylation by the Kleefstra syndrome protein EHMT1 mediates homeostatic synaptic scaling.</a> Neuron. 91 (2), 341-355 (2016).</li>
<li>Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. -J., Zhang, S. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+transplantable+astroglial+subtypes+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells.</a> Nature biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).</li>
<li>Frega, M., Tedesco, M., Massobrio, P., Pesce, M., Martinoia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+dynamics+of+3D+engineered+neuronal+cultures%3A+a+new+experimental+model+for+in-vitro+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Network dynamics of 3D engineered neuronal cultures: a new experimental model for in-vitro electrophysiology.</a> Sci Rep. 4, 5489(2014).</li>
<li>Tedesco, M., Frega, M., Martinoia, S., Pesce, M., Massobrio, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interfacing+3D+engineered+neuronal+cultures+to+micro-electrode+arrays%3A+an+innovative+in+vitro+experimental+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Interfacing 3D engineered neuronal cultures to micro-electrode arrays: an innovative in vitro experimental model.</a> J Vis Exp. (104), e53080(2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu wdrożyliśmy skuteczny protokół różnicowania hiPSC opublikowany przez Zhang et al. (2013)12 do pomiaru aktywności sieciowej sieci neuronalnych pochodzących z hiPSC na MEA. Dostosowaliśmy oryginalny protokół, tworząc linię rtTA/Ngn2-dodatnią hiPSC przed wywołaniem różnicowania neuronów. Ten dodatkowy krok pozwala nam kontrolować gęstość komórek neuronalnych na MEA. Kontrola nad gęstością neuronów była ważnym warunkiem wstępnym dostosowania protokołu do MEA i zapewnienia spójności. Aby zmierzyć aktywność sieci neuronalnych za pomocą MEA, neurony muszą tworzyć gęste sieci bezpośrednio na elektrodach MEA17,18. To z konieczności wymaga ścisłej kontroli gęstości posiewu neuronów. Linia rtTA/Ngn2-dodatnia hiPSC pozwala na kontrolę gęstości neuronów, ponieważ taktyka ta nie opiera się na ostrych transdukcjach lentiwirusowych hiPSC przed różnicowaniem; linia rtTA/Ngn2-dodatnia hiPSC prawie eliminuje wszelkie różnice w końcowej wydajności, wynikające na przykład z toksyczności lentiwirusowej i zmiennej skuteczności infekcji.
Kolejnym krytycznym etapem procedury eksperymentalnej jest liczba astrocytów szczurów, które są współhodowane z różnicującymi się hiPSC. Astrocyty aktywnie przyczyniają się do udoskonalania rozwijających się obwodów nerwowych poprzez kontrolowanie tworzenia, utrzymywania i eliminowania synaps, z których wszystkie są ważnymi procesami dla funkcjonowania neuronów. Protokół przedstawiony w tym artykule jest wysoce zależny od astrocytów: aby w pełni dojrzeć i utworzyć funkcjonalne synapsy, neurony wymagają wsparcia ze strony astrocytów. Doświadczyliśmy, że liczba astrocytów powinna być w przybliżeniu równa liczbie neuronów pochodzących z hiPSC, aby wspierać dojrzewanie neuronów i tworzenie sieci neuronalnych wykazujących spontaniczną aktywność. Ponieważ nasz protokół astrocytów daje pierwotne hodowle komórek o ograniczonej żywotności, izolacja astrocytów szczurów musi być przeprowadzana regularnie.
Nasza adaptacja protokołu opublikowanego przez Zhang et al. (2013)12 do użytku z technologią MEA prawdopodobnie znacznie poprawi naszą zdolność do badania aktywności sieciowej sieci pochodzących z hiPSC. Wcześniej protokoły stosowane do badania sieci neuronalnych pochodzących z hiPSC za pomocą MEA opierały się na czasochłonnych procedurach różnicowania13-16. Protokół z Zhang et al. (2013) zapewnia szybką alternatywę, a nasza modyfikacja usuwa źródło zmienności, co sprawia, że obecnie bardziej wykonalne jest stosowanie neuronów pochodzących z hiPSC w połączeniu z technologią MEA, zwłaszcza w badaniach wysokoprzepustowych lub farmakologicznych. Ponadto, ponieważ metoda opublikowana przez Zhang i in. (2013)12 daje jednorodną populację neuronów korowych górnej warstwy, nasz dostosowany protokół umożliwia ukierunkowane badania nad aktywnością sieci tego konkretnego podzbioru neuronów.
Niemniej jednak takie podejście ma również kilka ograniczeń. Po pierwsze, jednorodność kultur można również uznać za wadę, ponieważ jest mniej prawdopodobne, że kultury będą przypominać sieci in vivo , w których różne klasy neuronów (tj. neurony hamujące i pobudzające) tworzą sieć heterogeniczną. Aby jeszcze bardziej zwiększyć wykorzystanie neuronów pochodzących z hiPSC za pomocą technologii MEA, ważne będzie opracowanie protokołów szybkiego różnicowania (opartych na transgenach) dla innych populacji komórek neuronalnych. Jeśli protokoły staną się dostępne, sieci in vitro będą bardziej naśladować sieci in vivo . Po drugie, obecnie astrocyty szczurów muszą być dodawane do neuronów pochodzących z hiPSC w celu wsparcia wzrostu, a zatem powstała sieć neuronalna nie jest ludzką siecią neuronalną sensu stricto. Wiarygodne protokoły różnicowania hiPSC w astrocyty mogą w przyszłości rozwiązać ten problem26. Po trzecie, dwuwymiarowe sieci neuronowe, jak opisano tutaj, są ograniczonym modelem do badania złożonych trójwymiarowych sieci neuronalnych in vivo . Na szczęście dostępne są już protokoły opisujące trójwymiarowe hodowle pierwotnych neuronów szczurów w połączeniu z technologią MEA27,28. Perspektywicznie, połączenie protokołów szybkiego różnicowania w celu uzyskania neuronów i astrocytów pochodzących z hiPSC z technikami hodowli trójwymiarowej i technologią MEA powinno dostarczyć nowych informacji na temat mechanizmów biologicznych leżących u podstaw zaburzeń neurologicznych.

Rozwój protokołów różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) do generowania ludzkich neuronów in vitro dostarczył potężnego nowego narzędzia do badania zaburzeń neurologicznych. Do niedawna badania nad tymi zaburzeniami były poważnie utrudnione ze względu na brak systemów modelowych wykorzystujących ludzkie neurony. Chociaż gryzonie mogą być wykorzystywane do badania zaburzeń neurologicznych, wyników takich badań nie można łatwo przełożyć na ludzi1. Biorąc pod uwagę te ograniczenia, neurony pochodzące z hiPSC są obiecującym modelem alternatywnym, który można wykorzystać do wyjaśnienia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw zaburzeń neurologicznych oraz do badań przesiewowych leków in vitro.
W ciągu ostatniej dekady opracowano kilka protokołów do przekształcania hiPSC w neurony2-8. Jednak protokoły te są nadal ograniczone pod wieloma względami. Po pierwsze, protokoły są często czasochłonne: generowanie neuronów o odpowiedniej dojrzałości (tj. tworzeniu synaps) i aktywności funkcjonalnej wymaga miesięcy procedur hodowlanych, co utrudnia badania na dużą skalę9. Ponadto wydajność konwersji hiPSC do neuronów jest niska. Protokoły często dają niejednorodną populację neuronów, a zatem nie pozwalają na badania określonych podzbiorów komórek neuronalnych. Co więcej, protokoły nie są powtarzalne, co daje różne wyniki dla różnych linii iPSC10,11. Wreszcie, etap dojrzewania i właściwości funkcjonalne powstałych neuronów są również zmienne 10.
Aby rozwiązać te problemy, Zhang et al. (2013)12 opracowali protokół, który szybko i powtarzalnie generuje ludzkie neurony z hiPSC poprzez nadekspresję czynnika transkrypcyjnego neurogeniny-2. Jak podają autorzy, różnicowanie zachodzi stosunkowo szybko (zaledwie 2-3 tygodnie po indukowaniu ekspresji neurogeniny-2), protokół jest powtarzalny (właściwości neuronalne są niezależne od wyjściowej linii hiPSC), a konwersja hiPSC do neuronu jest wysoce wydajna (prawie 100%). Populacja neuronów generowanych za pomocą ich protokołu jest jednorodna (przypominająca neurony korowe górnej warstwy), co pozwala na badanie specyficznego dla typu komórki wkładu w zaburzenia neuronalne. Co więcej, ich neurony pochodzące z hiPSC wykazywały dojrzałe właściwości (np. zdolność do tworzenia synaps i silną aktywność funkcjonalną) już po 20 dniach.
Scharakteryzowanie właściwości elektrofizjologicznych neuronów pochodzących z hiPSC na poziomie sieci jest ważnym warunkiem wstępnym, zanim technologia hiPSC będzie mogła zostać wykorzystana do badania chorób ludzkich. Z tego powodu wiele grup badawczych rozpoczęło ostatnio badania neuronów pochodzących z komórek macierzystych na poziomie sieci za pomocą urządzeń z matrycą mikroelektrod (MEA) (Multichannel Systems, Reutlingen, Niemcy)13-16. Elektrody MEA są osadzone w podłożu, na którym można hodować komórki neuronalne. MEA mogą być wykorzystywane do badania właściwości elektrofizjologicznych sieci neuronalnych i rozwoju ich aktywności in vitro. Obecnie MEA są używane tylko w połączeniu z protokołami różnicowania, które potrzebują kilku miesięcy, aby uzyskać dojrzałe sieci. W związku z tym połączenie MEA z protokołem szybkiego różnicowania powinno ułatwić wykorzystanie tej technologii w badaniach zaburzeń neurologicznych na dużą skalę.
Tutaj prezentujemy modyfikację protokołu Zhang et al. (2013)12 i dostosowujemy go do użytku na MEA. W szczególności, zamiast polegać na ostrej transdukcji lentiwirusowej, zamiast tego stworzyliśmy linie hiPSC stabilnie wyrażające rtTA/Ngn2 przed wywołaniem różnicowania. Zrobiliśmy to przede wszystkim po to, aby mieć powtarzalną kontrolę nad gęstością komórek neuronalnych, ponieważ gęstość komórek neuronalnych ma kluczowe znaczenie dla tworzenia sieci neuronalnej i dobrego kontaktu między neuronami a elektrodami MEA17,18. Chociaż protokół Zhang i wsp. jest bardzo skuteczny w odniesieniu do konwersji transdukowanych hiPSC, jest z natury zmienny w odniesieniu do końcowej wydajności neuronów z liczby początkowo posianych hiPSC (patrz rysunek 2E w Zhang i wsp.).12. Dzięki stabilnej linii eliminujemy wiele problemów powodujących zmienność, takich jak toksyczność lentiwirusowa i skuteczność infekcji. Następnie zoptymalizowaliśmy parametry, które niezawodnie wytwarzają sieci neuronowe pochodzące z hiPSC na MEA, uzyskując dojrzewanie sieci (np. zdarzenia synchroniczne obejmujące większość kanałów) do trzeciego tygodnia. Ten szybki i niezawodny protokół powinien umożliwić bezpośrednie porównania neuronów pochodzących z różnych (tj. specyficznych dla pacjenta) linii hiPSC, a także zapewnić solidną spójność w badaniach farmakologicznych.

<table><tbody><tr><td>Lebovitz's L-15 medium</td><td>Gibco</td><td>11415-064</td><td></td></tr><tr><td>B-27 suplement</td><td>Gibco</td><td>0080085SA</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-Lizyna (PDL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+/Mg2+-free HBSS&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>0,05% Trypsyna-EDTA&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>2,5% Trypsyna</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>DMEM o wysokiej zawartości glukozy</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>FBS (surowica bydlęca płodu)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>70 &mikro; m sitko komórkowe</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>wektor pakowania lentiwirusowego psPAX2</td><td></td><td>Addgene Plasmid #12260</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G wektor pakowania lentiwirusa</td><td>Addgene Plazmid</td><td>#12259</td><td></td></tr><tr><td>Macierz błony podstawnej</td><td>Gibco</td><td>A1413201</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320-074</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do odrwadniania komórek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6964</td><td></td></tr><tr><td>E8 medium</td><td>Gibco</td><td>A1517001</td><td></td></tr><tr><td>inhibitor ROCK</td><td>Gibco</td><td>A2644501&nbsp;</td><td>Alternatywnie można zastosować inhibitory ROCK, takie jak tiazowiwina.</td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268-5G</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8168-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9620-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Vitronectin</td><td>Gibco</td><td>A14700</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowe</td><td>MEA Wielokanałowe systemy</td><td>60-6wellMEA200/30iR-Ti-tcr</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe szklane</td><td>VWR</td><td>631-0899</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-Ornityna (PLO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3655-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Doksycyklina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891-5G</td><td></td></tr><tr><td>Suplement N-2</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Aminokwasy endogenne</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>NT-3, ludzki rekombinant</td><td>Promokine</td><td>C66425</td><td></td></tr><tr><td>BDNF, ludzka rekombinowana</td><td>Promokine</td><td>C66212</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>L-alanylo-L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka neuropodstawowa</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Cytozyna &beta;-D-arabinofuranozyd&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1768-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Proste kleszcze z cienką końcówką</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe z cienką końcówką&nbsp;</td><td>Narzędzia Fine Science</td><td>91500-09</td><td></td></tr></tbody></table>

szybkie różnicowanie neuronalne indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do pomiaru aktywności sieci na układach mikroelektrod

Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays

Neurony pochodzące z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) stanowią obiecujące nowe narzędzie do badania zaburzeń neurologicznych. W ciągu ostatniej dekady opracowano wiele protokołów różnicowania hiPSC w neurony. Jednak protokoły te są często powolne, charakteryzują się dużą zmiennością, niską odtwarzalnością i niską wydajnością. Ponadto neurony uzyskane za pomocą tych protokołów są często niedojrzałe i brakuje im odpowiedniej aktywności funkcjonalnej zarówno na poziomie pojedynczej komórki, jak i sieci, chyba że neurony są hodowane przez kilka miesięcy. Częściowo ze względu na te ograniczenia, właściwości funkcjonalne sieci neuronalnych pochodzących z hiPSC nadal nie są dobrze scharakteryzowane. W tym miejscu adaptujemy niedawno opublikowany protokół, który opisuje wytwarzanie ludzkich neuronów z hiPSC poprzez wymuszoną ekspresję czynnika transkrypcyjnego neurogeniny-212. Protokół ten jest szybki (daje dojrzałe neurony w ciągu 3 tygodni) i jest skuteczny, z prawie 100% wydajnością konwersji transdukowanych komórek (>95% komórek DAPI-dodatnich ma dodatni MAP2). Co więcej, protokół daje jednorodną populację neuronów pobudzających, która pozwoliłaby na zbadanie specyficznego dla typu komórki wkładu w zaburzenia neurologiczne. Zmodyfikowaliśmy oryginalny protokół, generując stabilnie transdukowane komórki hiPSC, co dało nam wyraźną kontrolę nad całkowitą liczbą neuronów. Komórki te są następnie wykorzystywane do generowania sieci neuronowych pochodzących z hiPSC na układach mikroelektrod. W ten sposób można zmierzyć i scharakteryzować spontaniczną aktywność elektrofizjologiczną sieci neuronalnych pochodzących z hiPSC, zachowując przy tym międzyeksperymentalną spójność pod względem gęstości komórek. Przedstawiony protokół ma szerokie zastosowanie, szczególnie w badaniach mechanistycznych i farmakologicznych nad ludzkimi sieciami neuronowymi.

W niniejszej pracy z powodzeniem zmodyfikowano protokół, w którym hiPSC są różnicowane bezpośrednio w neurony korowe poprzez nadekspresję czynnika transkrypcyjnego neurogenin-212, a następnie dostosowano go do zastosowania z MEA. Podejście to jest szybkie i wydajne, co pozwala na uzyskanie funkcjonalnych neuronów oraz aktywności sieci już w trzecim tygodniu po indukowaniu różnicowania.
W trakcie protokołu różnicowania komórki zaczęły morfologicznie przypominać neurony: formowały się małe wypustki, a neurony zaczęły łączyć się ze sobą (Rycina 1A). Ustaliliśmy profil neurofizjologiczny neuronów pochodzących z linii hiPSC zdrowej grupy kontrolnej, mierząc ich morfologię neuronalną oraz właściwości synaptyczne podczas rozwoju. Neurony pochodne z hiPSC barwiono pod kątem MAP2 oraz synapsyny-1/2 w różnych dniach po rozpoczęciu różnicowania (Rycina 2A). Uzyskane neurony wykazują dojrzałą morfologię neuronalną już 3 tygodnie po indukcji różnicowania. Liczbę punktów synapsyny-1/2 (miara liczby synaps) określono na podstawie immunocytochemicznych barwień na synapsynę-1/2. Liczba punktów synapsyny-1/2 zwiększała się w czasie, co sugeruje, że poziom łączności neuronalnej również rośnie (Rycina 2B). Liczba punktów synapsyny-1/2 23 dni po indukcji różnicowania była podobna w dwóch niezależnych liniach IPS (Rycina 2C). W 23 DIV większość punktów synapsyny-1/2 znajdowała się bezpośrednio obok punktów PSD-95, co wskazuje na obecność funkcjonalnych synaps (Rycina 2D).
Zgodnie z wynikami opisanymi przez Zhang et al., wygenerowaliśmy populację pobudzających neuronów korowych warstw przypowierzchniowych, co potwierdzono za pomocą pan-neuronalnych markerów oraz markerów specyficznych dla podtypów korowych, takich jak BRN2 i SATB2 (warstwa II/III). Nie zaobserwowano neuronów wykazujących pozytywną reakcję na markery głębokich warstw CTIP2 (warstwa V) lub Foxp2 (warstwa VI) (Rysunek 2E i F)
Aby scharakteryzować aktywność elektrofizjologiczną neuronów pochodzących z hiPSC, zastosowano rejestrację prądową i napięciową w konfiguracji whole-cell, i.e. mierzono właściwości wewnętrzne oraz pobudzający wkład synaptyczny do tych neuronów w trakcie ich rozwoju. Neurony były zdolne do generowania potencjałów czynnościowych już tydzień po rozpoczęciu różnicowania, a odsetek komórek wykazujących aktywność impulsową wzrastał w czasie (Rycyna 2G oraz H). Ponadto neurony otrzymywały pobudzający wkład synaptyczny już tydzień po indukowaniu różnicowania: zarówno częstotliwość, jak i amplituda pobudzającego wkładu synaptycznego zwiększały się w trakcie rozwoju (Rycina 2I - K).
Aby lepiej zrozumieć, w jaki sposób aktywność pojedynczych komórek łączy się w funkcje na poziomie sieci, niezbędne jest zbadanie, jak neurony współpracują ze sobą. In vitro sieci neuronalne hodowane na MEA stanowią cenny model eksperymentalny do badania dynamiki neuronalnej. Nagrano 20 minut aktywności elektrofizjologicznej sieci neuronów pochodzących z linii kontrolnej hiPSC od zdrowego dawcy, hodowanych na MEA z 6 dołkami (Rycina 2M). Kilka tygodni po indukcji różnicowania neurony pochodzące z hiPSC zdrowej grupy kontrolnej utworzyły funkcjonalnie aktywne sieci neuronalne, wykazując zdarzenia spontaniczne (0,62 ± 0,05 impulsu/s; Rycina 2N). Na tym etapie rozwoju (t.j. 16 dni po rozpoczęciu dyferencjacji) nie wykryto zdarzeń synchronicznych obejmujących wszystkie kanały MEA (Rysunek 2O). Poziom aktywności sieci wzrósł w trakcie rozwoju: w czwartej tygodniu po indukcji różnicowania sieci neuronalne wykazywały wysoki poziom aktywności spontanicznej (2,5 ± 0,1 impulsu/s; Rycina 2N) we wszystkich dołkach urządzenia. Sieci wykazywały również synchroniczne wyładowania sieciowe (4,1 ± 0,1 wyładowania/min, Rycina 2O) o długim czasie trwania (210 ± 50 ms).
<img alt="Postęp wzrostu komórek, dni 1, 3, 7, obrazy mikroskopowe A; układ chipa mikroprzepływowego B, gęstość komórek C." src="/files/ftp_upload/54900/54900fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Różnicowanie hiPSC w neurony. A. Trzy punkty czasowe różnicowania hiPSC w neurony na szkiełkach podstawkowych. B. Wysiew hiPSC na MEA. C. Astrocyty przy 10% konfluencji w kolbie T75 (należy zauważyć, że komórki tworzą mozaikową monowarstwę). Paski skali: 150 µm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54900/54900fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Proces różnicowania neuronalnego; MAP2/Synapsin, PSD-95/Synapsin in vitro; obrazy fluorescencyjne, elektrofizjologia." src="/files/ftp_upload/54900/54900fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2. Charakterystyka neuronów pochodzących z hiPSC. A. Neurony pochodne z hiPSC wybarwiono pod kątem MAP2 (zielony) i synapsyny-1/2 (czerwony) w różnych dniach po rozpoczęciu różnicowania. Pasek skali: 10 µm. B. Ilościowe oznaczenie punktów synapsyny w dwóch niezależnych eksperymentach. W każdym eksperymencie przeanalizowano co najmniej 10 komórek. C. Ilościowe oznaczenie punktów synapsyny w 23. dniu in vitro (DIV23) w neuronach pochodzących z dwóch niezależnych linii iPSC. D. Neurony pochodzące z hiPSC barwiono pod kątem PSD-95 (zielony) i synapsyny-1/2 (czerwony) 23 dni po rozpoczęciu różnicowania. Punkty synapsyny znajdują się w bezpośrednim sąsiedztwie punktów PSD-95. E. Neurony pochodzące z hiPSC wybarwiono pod kątem MAP2 (zielony) i BRN2 (czerwony) lub SATB2 (czerwony) 23 dni po rozpoczęciu różnicowania. F. Procent komórek wykazujących pozytywny wynik dla MAP2, które były pozytywne dla wskazanych markerów. G. Reprezentatywne zapisy metodą clampingu prądowego wykazujące, że potencjały czynnościowe mogą być generowane już w 7. dniu od rozpoczęcia różnicowania. H. Procent komórek w różnych dniach po indukcji różnicowania, które wykazują jeden lub więcej potencjałów czynnościowych. I. Reprezentatywne przebiegi prądów pobudzających postsynaptycznych (EPSC) rejestrowanych w neuronach pochodzących z hiPSC w różnych dniach po różnicowaniu. J. Częstotliwość pobudzających prądów postsynaptycznych podczas rozwoju. K. Amplituda pobudzających prądów postsynaptycznych podczas rozwoju. L. Reprezentatywne zapisy EPSC bez (kontrola) i z dodatkiem CNQX (CNQX). M. Neurony pochodzące z jednej linii hiPSC hodowano na 6-dołkowym MEA; aktywność sieci przedstawiono dla sieci neuronalnych pochodzących z hiPSC w 16. i 23. dniu po indukcji różnicowania. Aktywność zarejestrowana z każdego dołka (częstotliwość próbkowania 10 kHz) oznaczono innym kolorem (pokazano 5 minut z 20 minut rejestracji). N. Częstość wyładowań 16 i 23 dni po indukcji różnicowania. O. Szybkość pękania w 16. i 23. dniu po indukcji różnicowania. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54900/54900fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Biorąc pod uwagę uzyskane wyniki, jakość otrzymanych neuronów pochodzących z hiPSC można ocenić poprzez stworzenie profilu neurofizjologicznego komórek. Oznacza to, że od trzech do czterech tygodni po rozpoczęciu różnicowania można ocenić morfologię, ekspresję synapsyny-1/2 oraz elektrofizjologię neuronów. W tym punkcie czasowym oczekuje się, że neurony pochodzące z hiPSC wykażą morfologię przypominającą neurony, będą pozytywne pod kątem MAP2, synapsyny/PSD-95 podczas przeprowadzania immunocytochemii oraz będą wykazywać spontaniczną aktywność elektrofizjologiczną (zarówno na poziomie pojedynczych komórek, jak i sieci).

Modyfikujemy i wdrażamy wcześniej opublikowany protokół opisujący szybkie, powtarzalne i efektywne różnicowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) w pobudzające neurony korowe12. W szczególności nasza modyfikacja pozwala na kontrolę gęstości komórek neuronalnych i wykorzystanie ich na układach mikroelektrod do pomiaru właściwości elektrofizjologicznych na poziomie sieci.

Szybkie różnicowanie neuronalne indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do pomiaru aktywności sieci na układach mikroelektrod

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, ...

Ogólnym celem tego protokołu różnicowania neuronów jest wygenerowanie sieci neuronalnych z indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych rosnących na układach mikroelektrod w szybki i kontrolowany sposób. Metoda ta może być wykorzystana do odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinach neuronauki. Może być wykorzystywany do badania mechanizmów biologicznych leżących u podstaw zaburzeń neurologicznych, ale może być również wykorzystywany do rozwiązywania bardziej podstawowych pytań neurobiologicznych.Główną zaletą tej techniki jest szybkie różnicowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w neurony w sposób kontrolowany. Pierwszego dnia ciepłe podłoże DMEM/F12, CDS i E8 z 1% penicyliną streptomycyną do temperatury pokojowej. Następnie dodaj doksycyklinę do pożywki E8, aby uzyskać końcowe stężenie czterech mikrogramów na mililitr, a następnie dodaj inhibitor skały do mieszaniny.Odessać zużytą pożywkę RTTANGN2 dodatnich hiPSC i dodać jeden mililitr CDS do komórek. Następnie inkubuj komórki przez trzy do pięciu minut w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod mikroskopem sprawdź, czy komórki odłączają się od siebie.Następnie dodaj dwa mililitry DMEM/F12 do studzienki. Delikatnie zawiesić komórki za pomocą pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów, a następnie przenieść do probówki o pojemności 15 mililitrów. Następnie dodaj siedem mililitrów DMEM / F12 do zawiesiny komórek i wiruj komórki przy 200 x g przez pięć minut.Po pięciu minutach odessać supernatant i dodać dwa mililitry przygotowanej pożywki E8. Oddziel hiPSC, przykładając końcówkę pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów do boku rurki o pojemności 15 mililitrów i delikatnie zawieszając komórki. Pod mikroskopem sprawdź, czy komórki są zdysocjowane.Następnie określ liczbę komórek na mililitr za pomocą hemocytometru. W przypadku sześciu dołków MEA rozcieńczyć komórki, aby uzyskać zawiesinę komórek 7,5 razy 10 do piątej komórki na mililitr. W przypadku szkiełek nakrywkowych rozcieńczyć komórki, aby uzyskać zawiesinę komórek cztery razy od 10 do czwartej komórki na mililitr.Odessać rozcieńczoną lamininę ze szkiełek nakrywkowych i sześciu dołków MEA. W przypadku sześciu dołków MEA należy pokryć ogniwa, dodając 100 mikrolitrów zawiesiny ogniw do obszaru elektrody aktywnej w każdym dołku. Następnie płytkie komórki, dodając 500 mikrolitrów zawiesiny komórek do każdego dołka z 24-dołkowej płytki.Następnie umieść sześć dołków MEA lub płytkę 24-dołkową w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po dwóch godzinach ostrożnie dodać 500 mikrolitrów przygotowanej pożywki E8 do każdego dołka z sześciu dołków MEA. Następnie umieść sześć studzienek MEA na noc w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza.Trzeciego dnia podgrzej 0,05% trypsyny-EDTA do temperatury pokojowej. Ciepły DPBS i DMEM/F12 z 1% streptomycyną penicyliny do 37 stopni Celsjusza. Następnie odessać zużytą pożywkę z hodowli astrocytów szczura.Umyj kulturę, dodając pięć mililitrów DPBS i delikatnie ją roztrząśnij. Następnie odessaj DPBS i dodaj pięć mililitrów 0,05% trypsyny-EDTA. Delikatnie przetrząśnij trypsyną-EDTA.Następnie inkubuj komórki w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć do 10 minut. Następnie sprawdź pod mikroskopem, czy komórki są odłączone. Odłączyć ostatnie komórki, uderzając kilka razy w kolbę.Następnie dodać pięć mililitrów DMEM/F12 do kolby. Spróbuj delikatnie ocenić komórki wewnątrz kolby za pomocą 10-mililitrowej pipety. Następnie zbierz zawiesinę komórek w 15-mililitrowej probówce.Obracaj probówkę o masie 200 x g przez osiem minut. Następnie odessać supernatent i ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze DMEM/F12. Określ liczbę komórek na mililitr za pomocą hemocytometru.Następnie dodaj 7,5 razy 10 do czwartych astrocytów do każdej studzienki z sześciu dołków MEA. I dodaj dwa razy 10 do czwartego astrocytu do każdej studzienki 24-dołkowej płytki. Inkubuj komórki przez noc w wilgotnym inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza.Pozyskaj dane przy 1 200-krotnym wzmocnieniu i próbkuj sygnał przy 10 kilohercach za pomocą karty akwizycji danych MCS. Rejestruj 20 minut aktywności elektrofizjologicznej neuronów pochodzących z hiPSC hodowanych na MEA. Podczas rejestracji utrzymuj temperaturę na poziomie 37 stopni Celsjusza i zapobiegaj parowaniu medium i zmianom pH poprzez dostarczanie stałego, powolnego przepływu nawilżonego gazu do MEA.Następnie przeanalizuj dane za pomocą niestandardowego pakietu oprogramowania. Rysunek ten przedstawia zmiany ekspresji markerów neuronalnych MAP2 w synapsynie podczas procesu różnicowania, co wskazuje na dojrzewanie neuronów. Ten wykres pokazuje, że ekspresja synapsyny jest mierzona dla poszczególnych komórek, która wzrosła podczas procesu różnicowania.Synapsynasyna, która ulega ekspresji w komórkach po trzech tygodniach różnicowania, kolokalizuje się z PSD-95, co wskazuje na obecność funkcjonalnych synaps. W tym przypadku przeprowadzono zacisk krosowy całych komórek w różnych punktach czasowych podczas procesu różnicowania, aby zmierzyć aktywność elektrofizjologiczną komórek. Komórki były w stanie generować potencjały czynnościowe w różnych punktach czasowych.A odsetek komórek impulsowych zwiększony w czasie pokazuje, że większość komórek jest w stanie generować potencjały czynnościowe, nawet we wczesnym etapie różnicowania. Patch clamp został również wykorzystany do pomiaru pobudzających prądów postsynaptycznych odbieranych przez komórki. Liczba danych wejściowych, które otrzymują komórki, wzrosła podczas procesu różnicowania.Zarówno częstotliwość, jak i amplituda pobudzających prądów postsynaptycznych wzrastały w procesie różnicowania. Aktywność elektrofizjologiczną komórek różnicujących się na układach mikroelektrod mierzono w trakcie procesu różnicowania. W tym przypadku aktywność sieci neuronalnej wzrosła podczas procesu różnicowania i wykazała zdarzenia synchroniczne po 23 dniach.Po opanowaniu technika ta może być wykorzystana do różnicowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w funkcjonalne sieci neuronowe w ciągu trzech do czterech tygodni. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o sterylnej pracy i delikatnym traktowaniu komórek. Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak testy farmakologiczne, aby uratować fenotyp obserwowany w liniach komórkowych pacjentów.Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom z dziedziny neurobiologii do oficjalnego badania defektów aktywności sieci w zaburzeniach neurologicznych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak różnicować, indukować pluripotencjalne komórki macierzyste do neuronów w szybki i kontrolowany sposób.

rapid-neuronal-differentiation-induced-pluripotent-stem-cells-for

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Ten film pokazuje rozwój hodowli neuronów 3D połączonej z planarnym układem mikroelektrod z neuronami hipokampa. Izolowane neurony tworzą sieć 2D w obszarze aktywnym układu mikroelektrod i przylegają do szklanych mikrokulek w wielodołkowej płytce z wkładką membranową. Po przeniesieniu tych pokrytych neuronami mikrokulek do elektrody, organizują się one w połączoną sieć neuronową 3D.

Budowa trójwymiarowych sieci neuronowych sprzężonych z układami mikroelektrod

Film demonstruje metodę generowania pobudzających neuronów korowych z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC). Po indukcji doksycykliny hiPSC wykazują nadekspresję neurogeniny-2, czynnika transkrypcyjnego specyficznego dla neuronów. Dzięki zastosowaniu specyficznych pożywek i wspólnej hodowli z astrocytami, proces ten ułatwia różnicowanie się hiPSC w neurony z połączeniami synaptycznymi.

Różnicowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w neurony na układach mikroelektrod

Wideo pokazuje, jak używać zestawu mikroelektrod (MEA) do rejestrowania aktywności elektrofizjologicznej neuronów pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC). Aktywność elektrofizjologiczna z wielodołkowego MEA zawierającego kokulturę neuronów i astrocytów jest rejestrowana w celu wykrycia potencjałów czynnościowych z wielu neuronów w sieci, potwierdzając pomyślne różnicowanie hiPSC w neurony.

Pomiar aktywności elektrofizjologicznej sieci neuronalnych za pomocą układów mikroelektrod

Ten manuskrypt opisuje protokół do budowy in vitro modułowych sieci składających się z przestrzennie ograniczonych, funkcjonalnie połączonych obwodów neuronalnych. Maska polimerowa służy do modelowania warstwy białka w celu promowania adhezji komórkowej nad substratem hodowlanym. Platerowane neurony rosną na pokrytych obszarach, tworząc spontaniczne połączenia i wykazując aktywność elektrofizjologiczną.

Projektowanie, obróbka powierzchniowa, posiewanie komórkowe i hodowla modułowych sieci neuronowych składających się z funkcjonalnie połączonych obwodów

Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) są uważane za potężne narzędzie do badań przesiewowych leków i substancji chemicznych oraz do rozwoju nowych modeli in vitro do testowania toksyczności, w tym neurotoksyczności. W tym miejscu opisano szczegółowy protokół różnicowania hiPSC w neurony i komórki glejowe.

Protokół różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w mieszane kultury neuronów i gleju do badań neurotoksyczności

Komórki neuronalne myszy hodowane na układach wieloelektrodowych wykazują zwiększoną reakcję po stymulacji elektrycznej. Protokół ten pokazuje, jak hodować neurony, jak rejestrować aktywność i jak ustanowić protokół trenowania sieci w celu reagowania na wzorce stymulacji.

Zależny od czasu wzrost odpowiedzi sieci na stymulację kultur komórek neuronalnych na układach mikroelektrod

Ten protokół demonstruje użycie podzielonych na przedziały mikroprzepływowych chipów, formowanych wtryskowo w cyklicznym kopolimerze olefin, do hodowanych neuronów zróżnicowanych od ludzkich komórek macierzystych. Chipy te są wstępnie zmontowane i łatwiejsze w użyciu niż tradycyjne urządzenia z poli(dimetylosiloksanu) z przedziałami. Opisano tutaj wiele powszechnych paradygmatów eksperymentalnych, w tym znakowanie wirusów, izolację płynów, aksotomię i barwienie immunologiczne.

Podział neuronów pochodzących z ludzkich komórek macierzystych na wstępnie zmontowane plastikowe chipy mikroprzepływowe

Ten protokół opisuje szczegółową procedurę ponownego zawieszania i hodowli neuronów pochodzących z ludzkich komórek macierzystych, które wcześniej były odróżniane od progenitorów nerwowych in vitro przez wiele tygodni. Procedura ułatwia oparte na obrazowaniu testy neurytów, synaps i markerów neuronalnych o późnej ekspresji w formacie zgodnym z mikroskopią świetlną i badaniami przesiewowymi o wysokiej zawartości.

Powtórzenie po różnicowaniu ludzkich neuronów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych w celu przeprowadzenia badań przesiewowych neurytogenezy i dojrzewania synaps o wysokiej zawartości

Ten artykuł zawiera zestaw protokołów do rozwoju ludzkich sieci indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych (hiPSC-CM) hodowanych na wielodołkowych płytkach MEA w celu odwracalnego elektroportowania błony komórkowej do pomiarów potencjału czynnościowego. Nagrania o wysokiej przepustowości są uzyskiwane z tych samych lokalizacji komórkowych wielokrotnie przez kilka dni.

Sieci kardiomiocytów pochodzące z ludzkich iPSC na wielodołkowych układach mikroelektrod do powtarzalnych zapisów potencjału czynnościowego

Opisujemy metodę różnicowania rdzenia kręgowego, indukowanych przez człowieka astrocytów i neuronów pochodzących z pluripotencjalnych źródeł oraz ich wspólnej hodowli do zapisu elektrofizjologicznego.

Stworzenie platformy elektrofizjologicznej do modelowania ALS z wykorzystaniem specyficznych regionalnie astrocytów i neuronów pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół ma na celu stabilne umieszczanie grzbietowo-brzusznych zrośniętych asembloidów na wieloelektrodowych układach do modelowania padaczki in vitro.

Wieloelektrodowa platforma matrycowa do modelowania padaczki przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych zespołów mózgowych pochodzących z komórek macierzystych

Poznaj szybką metodę różnicowania komórek iPSC w neurony korowe z kontrolą gęstości komórkowej na układach mikroelektrod. Technika umożliwia badanie aktywności sieci neuronowych i mechanizmów chorób neurologicznych.

Szybkie różnicowanie neuronalne indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do pomiaru aktywności sieci na układach mikroelektrod (Wideo) | JoVE Journal

Szybkie różnicowanie neuronalne indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do pomiaru aktywności sieci na układach mikroelektrod

Przeglądaj więcej filmów