Szybkie różnicowanie neuronalne indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do pomiaru aktywności sieci na układach mikroelektrod
8 stycznia 2017
Modyfikujemy i wdrażamy wcześniej opublikowany protokół opisujący szybkie, powtarzalne i efektywne różnicowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) w pobudzające neurony korowe12. W szczególności nasza modyfikacja pozwala na kontrolę gęstości komórek neuronalnych i wykorzystanie ich na układach mikroelektrod do pomiaru właściwości elektrofizjologicznych na poziomie sieci.
Ogólnym celem tego protokołu różnicowania neuronów jest wygenerowanie sieci neuronalnych z indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych rosnących na układach mikroelektrod w szybki i kontrolowany sposób. Metoda ta może być wykorzystana do odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinach neuronauki. Może być wykorzystywany do badania mechanizmów biologicznych leżących u podstaw zaburzeń neurologicznych, ale może być również wykorzystywany do rozwiązywania bardziej podstawowych pytań neurobiologicznych.
Główną zaletą tej techniki jest szybkie różnicowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w neurony w sposób kontrolowany. Pierwszego dnia ciepłe podłoże DMEM/F12, CDS i E8 z 1% penicyliną streptomycyną do temperatury pokojowej. Następnie dodaj doksycyklinę do pożywki E8, aby uzyskać końcowe stężenie czterech mikrogramów na mililitr, a następnie dodaj inhibitor skały do mieszaniny.
Odessać zużytą pożywkę RTTANGN2 dodatnich hiPSC i dodać jeden mililitr CDS do komórek. Następnie inkubuj komórki przez trzy do pięciu minut w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod mikroskopem sprawdź, czy komórki odłączają się od siebie.
Następnie dodaj dwa mililitry DMEM/F12 do studzienki. Delikatnie zawiesić komórki za pomocą pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów, a następnie przenieść do probówki o pojemności 15 mililitrów. Następnie dodaj siedem mililitrów DMEM / F12 do zawiesiny komórek i wiruj komórki przy 200 x g przez pięć minut.
Po pięciu minutach odessać supernatant i dodać dwa mililitry przygotowanej pożywki E8. Oddziel hiPSC, przykładając końcówkę pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów do boku rurki o pojemności 15 mililitrów i delikatnie zawieszając komórki. Pod mikroskopem sprawdź, czy komórki są zdysocjowane.
Następnie określ liczbę komórek na mililitr za pomocą hemocytometru. W przypadku sześciu dołków MEA rozcieńczyć komórki, aby uzyskać zawiesinę komórek 7,5 razy 10 do piątej komórki na mililitr. W przypadku szkiełek nakrywkowych rozcieńczyć komórki, aby uzyskać zawiesinę komórek cztery razy od 10 do czwartej komórki na mililitr.
Odessać rozcieńczoną lamininę ze szkiełek nakrywkowych i sześciu dołków MEA. W przypadku sześciu dołków MEA należy pokryć ogniwa, dodając 100 mikrolitrów zawiesiny ogniw do obszaru elektrody aktywnej w każdym dołku. Następnie płytkie komórki, dodając 500 mikrolitrów zawiesiny komórek do każdego dołka z 24-dołkowej płytki.
Następnie umieść sześć dołków MEA lub płytkę 24-dołkową w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po dwóch godzinach ostrożnie dodać 500 mikrolitrów przygotowanej pożywki E8 do każdego dołka z sześciu dołków MEA. Następnie umieść sześć studzienek MEA na noc w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Trzeciego dnia podgrzej 0,05% trypsyny-EDTA do temperatury pokojowej. Ciepły DPBS i DMEM/F12 z 1% streptomycyną penicyliny do 37 stopni Celsjusza. Następnie odessać zużytą pożywkę z hodowli astrocytów szczura.
Umyj kulturę, dodając pięć mililitrów DPBS i delikatnie ją roztrząśnij. Następnie odessaj DPBS i dodaj pięć mililitrów 0,05% trypsyny-EDTA. Delikatnie przetrząśnij trypsyną-EDTA.
Następnie inkubuj komórki w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć do 10 minut. Następnie sprawdź pod mikroskopem, czy komórki są odłączone. Odłączyć ostatnie komórki, uderzając kilka razy w kolbę.
Następnie dodać pięć mililitrów DMEM/F12 do kolby. Spróbuj delikatnie ocenić komórki wewnątrz kolby za pomocą 10-mililitrowej pipety. Następnie zbierz zawiesinę komórek w 15-mililitrowej probówce.
Obracaj probówkę o masie 200 x g przez osiem minut. Następnie odessać supernatent i ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze DMEM/F12. Określ liczbę komórek na mililitr za pomocą hemocytometru.
Następnie dodaj 7,5 razy 10 do czwartych astrocytów do każdej studzienki z sześciu dołków MEA. I dodaj dwa razy 10 do czwartego astrocytu do każdej studzienki 24-dołkowej płytki. Inkubuj komórki przez noc w wilgotnym inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Pozyskaj dane przy 1 200-krotnym wzmocnieniu i próbkuj sygnał przy 10 kilohercach za pomocą karty akwizycji danych MCS. Rejestruj 20 minut aktywności elektrofizjologicznej neuronów pochodzących z hiPSC hodowanych na MEA. Podczas rejestracji utrzymuj temperaturę na poziomie 37 stopni Celsjusza i zapobiegaj parowaniu medium i zmianom pH poprzez dostarczanie stałego, powolnego przepływu nawilżonego gazu do MEA.
Następnie przeanalizuj dane za pomocą niestandardowego pakietu oprogramowania. Rysunek ten przedstawia zmiany ekspresji markerów neuronalnych MAP2 w synapsynie podczas procesu różnicowania, co wskazuje na dojrzewanie neuronów. Ten wykres pokazuje, że ekspresja synapsyny jest mierzona dla poszczególnych komórek, która wzrosła podczas procesu różnicowania.
Synapsynasyna, która ulega ekspresji w komórkach po trzech tygodniach różnicowania, kolokalizuje się z PSD-95, co wskazuje na obecność funkcjonalnych synaps. W tym przypadku przeprowadzono zacisk krosowy całych komórek w różnych punktach czasowych podczas procesu różnicowania, aby zmierzyć aktywność elektrofizjologiczną komórek. Komórki były w stanie generować potencjały czynnościowe w różnych punktach czasowych.
A odsetek komórek impulsowych zwiększony w czasie pokazuje, że większość komórek jest w stanie generować potencjały czynnościowe, nawet we wczesnym etapie różnicowania. Patch clamp został również wykorzystany do pomiaru pobudzających prądów postsynaptycznych odbieranych przez komórki. Liczba danych wejściowych, które otrzymują komórki, wzrosła podczas procesu różnicowania.
Zarówno częstotliwość, jak i amplituda pobudzających prądów postsynaptycznych wzrastały w procesie różnicowania. Aktywność elektrofizjologiczną komórek różnicujących się na układach mikroelektrod mierzono w trakcie procesu różnicowania. W tym przypadku aktywność sieci neuronalnej wzrosła podczas procesu różnicowania i wykazała zdarzenia synchroniczne po 23 dniach.
Po opanowaniu technika ta może być wykorzystana do różnicowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w funkcjonalne sieci neuronowe w ciągu trzech do czterech tygodni. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o sterylnej pracy i delikatnym traktowaniu komórek. Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak testy farmakologiczne, aby uratować fenotyp obserwowany w liniach komórkowych pacjentów.
Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom z dziedziny neurobiologii do oficjalnego badania defektów aktywności sieci w zaburzeniach neurologicznych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak różnicować, indukować pluripotencjalne komórki macierzyste do neuronów w szybki i kontrolowany sposób.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia zmodyfikowany protokół szybkiej różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSCs) w pobudzające neurony korowe. Metoda ta pozwala na kontrolowanie gęstości komórek neuronalnych i jest kompatybilna z macierzami mikroelektrod służącymi do pomiaru właściwości elektrofizjologicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórek macierzystych
- Elektrofizjologia
Wstęp
- Ludzkie indukowane pluripotentne komórki macierzyste (hiPSCs) mogą różnicować się w różne typy neuronów.
- Zrozumienie sieci neuronalnych jest kluczowe dla badania schorzeń neurologicznych.
- Macierze mikroelektrod (MEAs) ułatwiają pomiar aktywności neuronalnej.
- Szybkie protokoły różnicowania zwiększają efektywność badań.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody generowania sieci neuronalnych z hiPSC.
- Umożliwienie badania mechanizmów neurobiologicznych i zaburzeń neurologicznych.
- Dostarczenie protokołu zapewniającego kontrolę nad gęstością komórek.
Zastosowane metody
- Przygotowanie pośrodków hodowlanych i techniki dysocjacji komórek.
- Wysiew hiPSC na matryce mikroelektrodowe.
- Monitorowanie markerów różnicowania i dojrzewania neuronów.
- Rejestracje elektrofizjologiczne w celu oceny aktywności neuronów.
Główne wyniki
- Skuteczne różnicowanie hiPSC w funkcjonalne neurony.
- Zwiększona ekspresja markerów neuronalnych podczas różnicowania.
- Wykazanie potencjałów czynnościowych i aktywności synaptycznej w zróżnicowanych neuronach.
- Wzrost aktywności sieci neuronalnej w czasie, wskazujący na dojrzewanie.
Wnioski
- Zmodyfikowany protokół umożliwia efektywne generowanie sieci neuronalnych.
- Technikę tę można zastosować do badania różnych zagadnień neurobiologicznych.
- Utrzymanie warunków sterylnych i delikatne obchodzenie się z próbkami są kluczowe dla osiągnięcia sukcesu.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Szybka i kontrolowana różnicowanie hiPSC w funkcjonalne sieci neuronalne rozwiązuje krytyczny problem wąskiego gardła w procesie odkrywania leków ukierunkowanych na neurobiologię. Niniejszy protokół umożliwia powtarzalne generowanie dojrzałych, pobudzających neuronów ludzkich, odpowiednich do wysokoprzepływnych analiz elektrofizjologicznych, co zwiększa pewność prognostyczną w badaniach nad zaburzeniami neurologicznymi we wczesnej fazie. Podejście to usprawnia podejmowanie decyzji w zakresie portfolio poprzez dostarczenie skalowalnych, istotnych dla danej choroby ludzkich modeli do badań mechanistycznych i farmakologicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie istotnych dla choroby mechanizmów neuronalnych z wykorzystaniem pobudzeniowych neuronów pochodzenia ludzkiego.
- Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez pomiar elektrofizjologicznych wyników na poziomie sieciowym.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego dzięki zastosowaniu kontrolowanych, jednorodnych populacji neuronalnych.
- Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie wyboru i triage'u celów neurologicznych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia standaryzowane, powtarzalne hodowle neuronalne do późniejszego przesiewania związków.
- Umożliwia ilościowe odczyty elektrofizjologiczne za pomocą matryc mikroelektrod.
- Pozwala na skalowalność testów i porównywalność między badaniami dzięki ścisłej kontroli gęstości komórek.
- Wspiera rzetelną ocenę interwencji farmakologicznych w ludzkich sieciach neuronalnych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje aktywność sieci neuronowych in vitro z funkcjonalnymi punktami końcowymi istotnymi dla przebiegu choroby.
- Łączy etap odkrywania z walidacją przedkliniczną, umożliwiając badania mechanistyczne na liniach komórkowych pochodzących od pacjentów.
- Zmniejsza ryzyko translacyjne poprzez modelowanie dysfunkcji ludzkich sieci neuronowych obserwowanych w zaburzeniach neurologicznych.
- Ułatwia odkrywanie biomarkerów dzięki podłużnym pomiarom elektrofizjologicznym.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół wpisuje się w kontinuum od etapu odkryć do badań przedklinicznych, umożliwiając szybkie generowanie funkcjonalnych ludzkich sieci neuronalnych do walidacji celów terapeutycznych, przesiewu oraz badań mechanistycznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków w ludzkich układach neuronalnych.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowe do analizy, powtarzalne kultury neuronalne z ilościowymi wynikami aktywności sieci.
- Analityka: Dostarcza pomiary elektrofizjologiczne i analizy statystyczne do porównywania warunków.
- Badania translacyjne: Łączy ustalenia in vitro z mechanizmami chorób i potencjalnymi biomarkerami.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy skalowalną, wielokrotnego użytku platformę dla różnorodnych programów badań neurologicznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów neurologicznych.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność testów neuronalnych.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez umożliwienie generowania wiarygodnych danych na wczesnym etapie.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów dotyczących zaburzeń neurologicznych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli komórek macierzystych, różnicowaniu neuronów oraz analizie elektrofizjologicznej.
- Wymagany jest dostęp do aparatury z macierzą mikroelektrod oraz specjalistycznego oprogramowania do analizy danych.
- Konieczna jest rygorystyczna standaryzacja gęstości komórek i protokołów różnicowania pomiędzy zespołami badawczymi.
- Możliwa może być konieczność adaptacji protokołu dla różnych linii hiPSC lub modeli chorobowych.
- Ograniczenia obejmują konieczność stosowania technik sterylnych oraz delikatnego obchodzenia się z komórkami w celu zapewnienia powtarzalności wyników.
