Name: Analiza przestrzenna i czasowa aktywnego ERK w linii rozrodczej C. elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Poznaj metodę immunofluorescencji do lokalizacji aktywnego ERK w gonadach C. elegans. Technika umożliwia ilościową analizę wzorców sygnału ERK in vivo oraz badanie wpływu leków i perturbacji genowych na rozwój komórek płciowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca w Arur Lab jest wspierana przez granty z National Institutes of Health, NIHGM98200; Instytut Badań nad Profilaktyką Raka w Teksasie, CPRIT RP160023; Nagroda Naukowego Amerykańskiego Towarzystwa Onkologicznego (ACS RSG014-044-DDC); oraz przez Fundusze Anny Fuller.

Opisany tutaj protokół dotyczy przede wszystkim modelowego systemu bezkręgowców C. elegans i jest zgodny ze wszystkimi wytycznymi etycznymi określonymi przez instytucję.
1. Opieka nad zwierzętami
<ol>
	<li>Utrzymuj robocze kultury podstawowe C. elegans na agarze Nematode Growth Ground20,21 (NGM, patrz tabela materiałów) wysianym E. coli OP50.</li>
	<li>Utrzymuj stada robaków w temperaturach od 16 °C do 25 °C. 
	UWAGA: Hodowla robaków w wyższych temperaturach skutkuje szybszym tempem wzrostu, często nieprawidłowym rozwojem linii zarodkowej i mniejszymi rozmiarami lęgów. Dodatkowo, genotypy wrażliwe na temperaturę będą wykazywać różne fenotypy w różnych temperaturach.</li>
	<li>Przenoś robaki na nowe płytki NGM co 2 - 3 dni, w zależności od ich tempa wzrostu, aby utrzymać stały dopływ dobrze odżywionych robaków. 
	UWAGA: W każdym eksperymencie obejmującym poziomy dpERK, robaki NIE powinny być pozyskiwane z wygłodzonej lub zatłoczonej płytki. Stłoczenie lub głód wpływa na sygnalizację insuliny u robaków22, a sygnalizacja insuliny reguluje aktywność ERK12. W ten sposób robaki z wygłodzonych lub przepełnionych talerzy spowodują zmienne i trudne do odtworzenia wzory barwienia.</li>
</ol>
2. Sekcja dorosłych robaków w celu uzyskania gonad
<ol>
	<li>Pobrać 100 - 150 WT (N2) lub pożądany genotyp robaków w pożądanym i specyficznym stadium rozwoju (L1, L2, L3, L4, dorosłe itp.) w 100 μl buforu M9 w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Napełnij probówkę mikrowirówki 900 μl buforu M9 (patrz tabela materiałów). Odwirować probówki o stężeniu 1 000 x g w mikrowirówce przez 1 minutę w temperaturze otoczenia.</li>
	<li>Delikatnie usunąć 900 μl buforu M9 i wyrzucić. Usuń bufor pod mikroskopem preparacyjnym, aby upewnić się, że robaki nie zostaną przypadkowo usunięte.</li>
	<li>Powtórz kroki 2.2 - 2.3 jeszcze dwa razy, za każdym razem z nowym buforem M9. Gwarantuje to, że wszelkie bakterie, które zostały przeniesione wraz z robakami, zostaną skutecznie zmyte.</li>
	<li>Po końcowym płukaniu należy wyjąć z probówki 900 μl buforu M9 i wyrzucić.</li>
	<li>Pozostałe 100 μl buforu M9 zawierającego 100 - 150 robaków z końcówką do mikropipet o pojemności 200 μl przenieść do szklanego naczynia do zegarka z płaskim dnem. Przed użyciem należy upewnić się, że końcówka mikropipety została przecięta w miejscu oznaczonym 10 μl. Brak przecięcia końcówki spowoduje ścinanie robaków.</li>
	<li>Dodać 1 - 3 μl 0,1 M lewamizolu do szklanego naczynia zegarka zawierającego robaki w buforze M9. Delikatnie zakręć lewamizolem i M9, aby umożliwić równomierne mieszanie, aż robaki przestaną się poruszać. 
	UWAGA: Zapasy lewamizolu mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C w celu długotrwałego przechowywania. W tym przypadku należy zastosować wyższe stężenie 1 - 3 mM niż opisane w literaturze23 0,2 - 0,25 mM lewamizolu w celu uzyskania szybkiej utraty mobilności u zwierząt. Jeśli zwierzęta zbyt długo obdzierają się ze skóry w płynnej zawiesinie, wynikające z tego wzorce dpERK w gonadach mogą być zmienne (z powodu stresu lub braku odżywiania, lub obu). Bardziej powtarzalne wzory barwienia uzyskano przy użyciu 1 - 3 mM lewamizolu do sekcji.</li>
	<li>Podłącz dwie igły 25 G do dwóch strzykawek o pojemności 1 ml (rozmiar strzykawki nie ma znaczenia, grubość igły ma kluczowe znaczenie). Umieścić po jednej strzykawce w każdej ręce (Rysunek 2).</li>
	<li>Pod mikroskopem preparacyjnym umieść każdą igłę pod i nad każdym robakiem, jak pokazano na rysunku 2 i umieść drobne nacięcie na robaku w pobliżu drugiej opuszki gardłowej ruchem przypominającym nożyce. Po jednym nacięciu robaka przejdź do następnego zwierzęcia, aż wszystkie zwierzęta w naczyniu zostaną przynajmniej raz pokrojone. 
	UWAGA: Należy pamiętać, że kroki 2.8 - 2.9 są zależne od czasu. Wytnij wszystkie robaki w naczyniu w czasie krótszym niż pięć minut, aby uzyskać powtarzalny wzór dpECK. Dłuższe czasy rozbioru spowodują wyłączenie sygnału dpERK, szczególnie w strefie 1. Dostosuj liczbę robaków na rundę sekcji (tj. 50 robaków vs. 150), jeśli to konieczne, aby pozostać w wyznaczonym przedziale czasowym.
	<ol>
		<li>W przypadku, gdy wyciśnięta gonada nie jest widoczna podczas sekcji, nie próbuj kolejnego cięcia w tym samym zwierzęciu. Zwykle powoduje to tylko ścinanie zwierzęcia i nie powoduje wytłaczania gonady. Zamiast tego przejdź do następnego zwierzęcia. Robaki, w których gonady nie wytłaczają się, pojawią się jako takie na szkiełkach, które zostaną wykonane w sekcji 6 i mogą być ignorowane podczas obrazowania 
		UWAGA: Na wszystkich etapach sekcji i przetwarzania ważne jest, aby pamiętać, że gonada pozostanie przyczepiona do ciała/tuszy. Nie rozdzielaj gonady i ciała na siłę za pomocą igły. Często nieprawidłowe rozdarcie tkanki gonad w próbie odcięcia gonady od organizmu może skutkować fałszywym sygnałem przeciwciała. Ciało/tusza mogą być ignorowane podczas etapów obrazowania (sekcja 6), a obrazowana jest tylko gonada. Dodatkowo, czasami komórki jelitowe mogą również służyć jako wewnętrzne kontrole/kontrole somatyczne dla testowanego przeciwciała.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Fiksacja gonad
<ol>
	<li>Po zakończeniu sekcji dodać 2 ml 3% paraformaldehydu (PFA) bezpośrednio do szklanego naczynia zegarka zawierającego 100 μl M9 i wypreparowanych zwierząt i przykryć Parafilmem. Umieść zakrytą szklaną miskę zegarka w dygestoriach chemicznych. 
	ostrożność: PFA jest niebezpieczną substancją chemiczną. Dlatego utrwalanie powinno odbywać się w dygestoriach chemicznych.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
	<li>Za pomocą jednorazowej pipety Pasteura ze szkła 9" dodaj 3 ml 1x PBS-T (patrz tabela materiałów) do szklanej naczynia zegarka zawierającej wypreparowane zwierzęta. Wymieszaj, wciągając roztwór PFA i 1x PBS-T z wypreparowanymi zwierzętami do pipety Pasteura i delikatnie uwalniając z powrotem do szklanego naczynia zegarka. Nie obracaj rurek podczas prania.</li>
	<li>Za pomocą świeżej szklanej pipety Pasteura pobrać 5 ml płynu (zawierającego wypreparowane robaki, PFA i 1x PBS-T) ze szklanego naczynia zegarka do pipety Pasteura i przenieść zawartość do świeżej szklanej stożkowej probówki o pojemności 5 ml.</li>
	<li>Odwiruj stożkowe probówki przez 30 sekund w wirówce klinicznej o stężeniu 1,000 x g. Użyj szklanych pipet Pasteura i stożkowych probówek, ponieważ wypreparowane gonady przyklejają się do plastiku.</li>
	<li>Usunąć i wyrzucić szwaczony szwaczek, uważając, aby nie przeszkadzać rozbiorowanym zwierzętom. Usuń płyn po każdym myciu ze stożkowej rurki pod mikroskopem preparacyjnym, aby nie wpływać na wypreparowane gonady i zminimalizować ich utratę.</li>
	<li>Używając świeżej pipety Pasteura, dodaj 5 ml 1x PBS-T do stożkowych probówek. Odwirować stożkowe probówki w wirówce klinicznej przez 30 s przy 1,000 x g. Usunąć i wyrzucić szwaczony szwaczek, uważając, aby nie przeszkadzać rozbiorowanym zwierzętom.</li>
	<li>Powtórz krok 3.7 w sumie trzy razy.</li>
	<li>Używając świeżej pipety Pasteura, dodaj 2 ml 100% metanolu do probówek i delikatnie wymieszaj gonady z metanolem, pobierając do pipety Pasteura. Inkubować probówkę w temperaturze -20 °C przez minimum 1 h. 
	UWAGA: Wypreparowane gonady można przechowywać w metanolu do 2 dni w celu barwienia dpECK. Przechowywanie przez więcej niż 2 dni i do 2 tygodni jest zgodne z innymi aplikacjami do barwienia przeciwciał, takimi jak przeciwciało anty-Lamina, ale nie z przeciwciałem dpECK.</li>
	<li>Po upływie pożądanego czasu inkubacji powtórzyć krok 3.7 w sumie trzy razy w celu umycia gonad. Nie obracaj rurek podczas prania. Po końcowym umyciu pozostaw 500 μL 1x PBS-T w stożkowej probówce o pojemności 5 ml.</li>
	<li>Za pomocą świeżej pipety Pasteura przenieś zawartość stożkowej szklanej probówki do świeżej szklanej probówki o pojemności 1 ml (6 mm x 50 mm). Pozwól wypreparowanym zwierzętom osiąść grawitacyjnie przez 5 - 10 minut.</li>
	<li>Używając świeżej pipety Pasteura i pod mikroskopem preparacyjnym, usuń jak najwięcej płynu ze szklanych probówek o pojemności 1 ml, nie naruszając wypreparowanych gonad.</li>
</ol>
4. Blokowanie i leczenie przeciwciałami pierwotnymi
<ol>
	<li>Dodaj 100 μl 30% normalnej surowicy koziej (NGS) rozcieńczonej w 1x PBS-T (patrz tabela materiałów) do wypreparowanych zwierząt w szklanych probówkach o pojemności 1 ml. 30% NGS służy jako bufor blokujący. Przykryj probówkę Parafilmem, aby uniknąć odparowania płynu. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę lub w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>Po upływie pożądanego czasu inkubacji usunąć bufor blokujący za pomocą świeżej pipety Pasteura, usuwając jak najwięcej płynu. Użyj mikroskopu preparacyjnego, aby upewnić się, że gonady nie zostały pobrane w pipecie Pasteura.</li>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciało MAPKYT (patrz Tabela materiałów, określane w niniejszej metodzie jako dpERK) w stosunku 1:400 w 30% NGS. Przygotować wystarczającą ilość rozcieńczenia przeciwciała, aby użyć 100 μl na probówkę. Niewykorzystane, rozcieńczone przeciwciało można przechowywać w temperaturze 4 °C przez tydzień.</li>
	<li>Dodać 100 μl rozcieńczonego roztworu przeciwciała anty-dpERK do szklanych probówek o pojemności 1 ml zawierających wypreparowane zwierzęta. Uszczelnij probówki za pomocą Parafilm. Inkubować probówki w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>Po całonocnej inkubacji dodać 800 μl 1x PBST do probówek w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Pobrać próbkę do świeżej szklanej pipety Pasteura i delikatnie zwolnić, aby upewnić się, że gonady są równomiernie zawieszone w 1x PBS-T. Niech gonady osiądą na dnie z grawitacją. Usunąć supernatant. Gwarantuje to, że wypreparowane gonady są myte, ale nie uszkadzane podczas procesu.</li>
	<li>Powtórz kroki 4.5 - 4.6, co daje w sumie trzy prania. Nie obracaj rurek podczas prania. Po trzecim praniu należy usunąć i wyrzucić jak najwięcej supernatantu, nie przeszkadzając wypreparowanym zwierzętom. Upewnij się, że za każdym razem używana jest świeża pipeta Pasteura.</li>
</ol>
5. Wtórne leczenie przeciwciałami
<ol>
	<li>Podczas płukania przeciwciał pierwszorzędowych należy przygotować rozcieńczenie dla przeciwciała drugorzędowego. Rozcieńczyć drugorzędowe przeciwciało anty-mysie w stosunku 1:500 w 30% NGS. Podobnie jak w przypadku przeciwciała pierwszorzędowego, użyj 100 μl na probówkę. Niewykorzystane przeciwciało można przechowywać w temperaturze 4 °C przez tydzień.</li>
	<li>Dodać 100 μl roztworu przeciwciał drugorzędowych do 1 ml szklanych probówek zawierających wypreparowane zwierzęta. Przykryj każdą tubkę Parafilmem, a następnie zawiń probówki w folię aluminiową, aby zawartość probówki była ciemna. Inkubować probówki w temperaturze pokojowej przez 2 godziny lub alternatywnie w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>Po pożądanym czasie inkubacji dodać 800 μL 1x PBS-T do probówek i powtórzyć kroki 4,5 - 4,6, w sumie trzy razy. Po ostatnim płukaniu usunąć i wyrzucić jak najwięcej supernatantu pod mikroskopem preparacyjnym przy użyciu świeżej pipety Pasteura.</li>
	<li>Przygotuj roztwór DAPI podczas płukania dla przeciwciała wtórnego. Rozcieńczyć 1 μl DAPI (z 1,000x zapasu 1 mg/ml przechowywanego w temperaturze -20 °C) w 1 ml 1x PBST.</li>
	<li>Dodać 800 μl rozcieńczonego roztworu DAPI do probówek zawierających wypreparowane zwierzęta. Przykryj wylot probówki Parafilmem i zawiń każdą tubkę w folię aluminiową. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut.</li>
	<li>Po inkubacji z DAPI usunąć jak najwięcej roztworu DAPI za pomocą świeżej pipety Pasteura, pod mikroskopem preparacyjnym, aby nie przeszkadzać wypreparowanym zwierzętom.</li>
	<li>Dodaj 1 kroplę roztworu montażowego do rurek. Owiń każdą tubę folią aluminiową. 
	UWAGA: W celu wizualizacji barwienia dpERK należy natychmiast zamontować barwione gonady do mikroskopii. W przypadku innych zastosowań przeciwciał, takich jak fosforylowana seryna 10 histon H3, gonady można przechowywać w pożywce montażowej do 2 tygodni w temperaturze 4 °C w ciemności.</li>
</ol>
6. Montaż preparatów i obrazowanie
<ol>
	<li>Umieść warstwę taśmy laboratoryjnej wzdłuż, na wierzchu, dwóch szklanych szkiełek mikroskopowych (25 mm x 75 mm x 1 mm), jak pokazano na rysunku 3. Umieść świeże, czyste szkło mikroskopowe między dwoma zaklejonymi taśmą szkiełkami. 
	UWAGA: Grubość taśmy pomaga wytworzyć podkładkę agarozową na środkowym suwaku. Grubość podkładki agarozowej jest prawie równa grubości taśmy, ponieważ taśma służy jako przekładka do tworzenia podkładki agarozowej.</li>
	<li>Upuść ~ 200 μL stopionej 2% agarozy (wytworzonej w wodzie destylowanej) na szkiełko mikroskopowe pośrodku. Szybko umieść świeże, czyste szkiełko agarozy, prostopadle do i na górze. </li>
	<li>Niech agaroza zastygnie (1 - 2 min).</li>
	<li>Zdejmij górne szkiełko mikroskopu bardzo delikatnie, tak aby podkładka agarozowa nie została zniszczona. Podkładka agarozowa może pozostać przymocowana do górnego lub dolnego suwaka. Nie ma znaczenia, do której prowadnicy pozostaje przyczepiona podkładka agarozowa, o ile jest to gładka powierzchnia agarozy.</li>
	<li>Za pomocą pipety Pasteura przenieś wypreparowane zwierzęta na podkładkę agarozową. Usunąć nadmiar płynu ze szkiełka za pomocą pipety Pasteura pod mikroskopem preparacyjnym.</li>
	<li>Za pomocą włosków rzęs lub drobno narysowanych naczyń włosowatych odepchnij gonady i jelita od siebie, aby rozłożyć gonady na szkiełku.</li>
	<li>Przykryj szkiełko mikroskopowe szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 24 mm x 50 mm. Należy upewnić się, że szkiełko nakrywkowe jest delikatnie opuszczane na szkiełko, tak aby między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem powstawały minimalne pęcherzyki powietrza.</li>
	<li>Przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc w pudełku na szkiełka podstawowe (nieprzezroczyste pudełko na szkiełka podstawowe z szkiełkami leżącymi płasko, szkiełkiem nakrywkowym do góry), aby umożliwić odparowanie nadmiaru płynu i nieznaczne spłaszczenie gonad (ze względu na ciężar szkiełka nakrywkowego na gonadach). Nieznaczne spłaszczenie gonad pozwala na lepsze obrazowanie okrągłej rurki gonadalnej.
	<ol>
		<li>Po zamontowaniu szkiełka nakrywkowego nie należy naciskać palcami na górną część szkiełka nakrywkowego. Często powoduje to zniekształcenia gonad i utratę sygnału dpRK.</li>
		<li>Spłaszcz gonady przez noc tylko w celu bardziej efektywnego obrazowania. Slajdy są gotowe do oglądania zaraz po ich złożeniu. Aby natychmiast zrobić zdjęcia, delikatnie wchłoń nadmiar płynu między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem z rogów za pomocą czystej chusteczki laboratoryjnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po upływie nocy uszczelnij szkiełko i szkiełko nakrywkowe przezroczystym lakierem nawierzchniowym do paznokci w czterech rogach szkiełka nakrywkowego i granicy szkiełka. Uszczelka lakieru do paznokci/szkiełka nakrywkowego zapewnia, że szkiełko nakrywkowe nie przesuwa się podczas obrazowania i chroni przed zniszczeniem próbek.</li>
	<li>Zobrazuj gonady za pomocą mikroskopu złożonego z prędkością 63X. Jednak obiektyw, soczewkę i mikroskop można zmieniać w zależności od dostępności mikroskopów i zastosowania użytkownika. Ponieważ rozmiar całej gonady od regionu proliferacyjnego do oocytów jest większy, niż można uchwycić na jednym obrazie, obrazy są wykonywane jako montaż z nakładającymi się granicami, jak pokazano na rysunku 4. 11-14, 18.
	<ol>
		<li>W wielu przypadkach tuszę należy edytować po ostatecznym obrazowaniu i złożeniu, o ile nie zostaną wprowadzone żadne poważne zmiany w obrazie linii zarodkowej. Przechowuj surowe obrazy wzdłuż zmontowanego obrazu, aby umożliwić porównanie "przed" montażem/edycją i "po" montażu/edycji obrazów. 
		UWAGA: Obrazy mikroskopowe nie mogą być zmieniane pod kątem siły sygnału lub nasycenia podczas montażu montażu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Chang, L., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+MAP+kinase+signalling+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mammalian MAP kinase signalling cascades.</a> Nature. 410, 37-40 (2001).</li>
<li>McKay, M. M., Morrison, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+signals+from+RTKs+to+ERK%2FMAPK%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Integrating signals from RTKs to ERK/MAPK.</a> Oncogene. 26, 3113-3121 (2007).</li>
<li>Sundaram, M. V. Canonical RTK-Ras-ERK signaling and related alternative pathways. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSundaram%2C+MV+%22WormBook%22">WormBook</a>. , 1-38 (2013).</li>
<li>Fabregat, I., Roncero, C., Fernandez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+apoptosis%3A+a+dysregulated+balance+in+liver+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Int%22%5BJournal%5D)">Survival and apoptosis: a dysregulated balance in liver cancer.</a> Liver Int. 27, 155-162 (2007).</li>
<li>Hackett, A., Rowe, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGFR1+Pfeiffer+syndrome+without+craniosynostosis%3A+an+additional+case+report%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Dysmorphol%22%5BJournal%5D)">FGFR1 Pfeiffer syndrome without craniosynostosis: an additional case report.</a> Clin Dysmorphol. 15, 207-210 (2006).</li>
<li>Murphy, L. O., Blenis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAPK+signal+specificity%3A+the+right+place+at+the+right+time%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">MAPK signal specificity: the right place at the right time.</a> Trends Biochem Sci. 31, 268-275 (2006).</li>
<li>Vogels, A., Fryns, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pfeiffer+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Orphanet+J+Rare+Dis%22%5BJournal%5D)">Pfeiffer syndrome.</a> Orphanet J Rare Dis. 1, 19(2006).</li>
<li>Klesse, L. J., Meyers, K. A., Marshall, C. J., Parada, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+growth+factor+induces+survival+and+differentiation+through+two+distinct+signaling+cascades+in+PC12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Nerve growth factor induces survival and differentiation through two distinct signaling cascades in PC12 cells.</a> Oncogene. 18, 2055-2068 (1999).</li>
<li>Marshall, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+of+receptor+tyrosine+kinase+signaling%3A+transient+versus+sustained+extracellular+signal-regulated+kinase+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Specificity of receptor tyrosine kinase signaling: transient versus sustained extracellular signal-regulated kinase activation.</a> Cell. 80, 179-185 (1995).</li>
<li>Chang, C., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+vulval+development+as+a+model+system+to+study+the+cancer+biology+of+EGFR+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">C. elegans vulval development as a model system to study the cancer biology of EGFR signaling.</a> Cancer Metastasis Rev. 18, 203-213 (1999).</li>
<li>Lee, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+functions+and+dynamic+activation+of+MPK-1+extracellular+signal-regulated+kinase+signaling+in+Caenorhabditis+elegans+germline+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Multiple functions and dynamic activation of MPK-1 extracellular signal-regulated kinase signaling in Caenorhabditis elegans germline development.</a> Genetics. 177, 2039-2062 (2007).</li>
<li>Lopez, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DAF-2+and+ERK+couple+nutrient+availability+to+meiotic+progression+during+Caenorhabditis+elegans+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">DAF-2 and ERK couple nutrient availability to meiotic progression during Caenorhabditis elegans oogenesis.</a> Dev Cell. 27, 227-240 (2013).</li>
<li>Miller, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sperm+cytoskeletal+protein+that+signals+oocyte+meiotic+maturation+and+ovulation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A sperm cytoskeletal protein that signals oocyte meiotic maturation and ovulation.</a> Science. 291, 2144-2147 (2001).</li>
<li>Ohmachi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+ksr-1+and+ksr-2+have+both+unique+and+redundant+functions+and+are+required+for+MPK-1+ERK+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">C. elegans ksr-1 and ksr-2 have both unique and redundant functions and are required for MPK-1 ERK phosphorylation.</a> Curr Biol. 12, 427-433 (2002).</li>
<li>Church, D. L., Guan, K. L., Lambie, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+genes+of+the+MAP+kinase+cascade%2C+mek-2%2C+mpk-1%2Fsur-1+and+let-60+ras%2C+are+required+for+meiotic+cell+cycle+progression+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Three genes of the MAP kinase cascade, mek-2, mpk-1/sur-1 and let-60 ras, are required for meiotic cell cycle progression in Caenorhabditis elegans.</a> Development. 121, 2525-2535 (1995).</li>
<li>Hubbard, E. J., Greenstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+gonad%3A+a+test+tube+for+cell+and+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans gonad: a test tube for cell and developmental biology.</a> Dev Dyn. 218, 2-22 (2000).</li>
<li>Arur, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MPK-1+ERK+controls+membrane+organization+in+C.+elegans+oogenesis+via+a+sex-determination+module%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">MPK-1 ERK controls membrane organization in C. elegans oogenesis via a sex-determination module.</a> Dev Cell. 20, 677-688 (2011).</li>
<li>Arur, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+ERK+substrates+execute+single+biological+processes+in+Caenorhabditis+elegans+germ-line+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Multiple ERK substrates execute single biological processes in Caenorhabditis elegans germ-line development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4776-4781 (2009).</li>
<li>Mattingly, H. H., Chen, J. J., Arur, S., Shvartsman, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Transport+Model+for+Estimating+the+Time+Course+of+ERK+Activation+in+the+C.+elegans+Germline%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">A Transport Model for Estimating the Time Course of ERK Activation in the C. elegans Germline.</a> Biophys J. 109, 2436-2445 (2015).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
<li>Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStiernagle%2C+T+%22WormBook%22">WormBook</a>. , 1-11 (2006).</li>
<li>Dorman, J. B., Albinder, B., Shroyer, T., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+age-1+and+daf-2+genes+function+in+a+common+pathway+to+control+the+lifespan+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The age-1 and daf-2 genes function in a common pathway to control the lifespan of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 141, 1399-1406 (1995).</li>
<li>Francis, R., Barton, M. K., Kimble, J., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gld-1%2C+a+tumor+suppressor+gene+required+for+oocyte+development+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">gld-1, a tumor suppressor gene required for oocyte development in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 139, 579-606 (1995).</li>
<li>Seydoux, G., Dunn, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptionally+repressed+germ+cells+lack+a+subpopulation+of+phosphorylated+RNA+polymerase+II+in+early+embryos+of+Caenorhabditis+elegans+and+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Transcriptionally repressed germ cells lack a subpopulation of phosphorylated RNA polymerase II in early embryos of Caenorhabditis elegans and Drosophila melanogaster.</a> Development. 124, 2191-2201 (1997).</li>
</ol>

Autorzy stwierdzili, że nie istnieją konkurencyjne interesy.

Active ERK (dpERK) podąża za stereotypowym przestrzennym i dynamicznym wzorcem lokalizacji w linii zarodkowej C. elegans . Ten stereotypowy wzorzec przestrzenny dpERK (ryc. 5) i amplituda dorosłej gonady C. elegans mogą być skutecznie skorelowane z wieloma procesami biologicznymi, które ERK reguluje. Na przykład niezdolność do aktywacji ERK w strefie 2 powoduje zatrzymanie oocytów w profazie mejozy, fenotypu obserwowanego w żeńskich liniach zarodkowych, które nie określają plemników, a tym samym nie aktywują ERK w dojrzałych oocytach (ryc. 5). Krycie z samcami skutkuje efektywną akumulacją dpERK w strefie 2 w żeńskich liniach rozrodczych11,13, w połączeniu z początkiem dojrzewania oocytów i owulacji. Tak więc analiza wzorców przestrzennych i czasowej aktywacji dpERK w przypadku pewnych zaburzeń genetycznych (takich jak inaktywacja genów za pośrednictwem interferencji RNA) lub zabiegów chemicznych pozwala na identyfikację czynników regulujących sygnalizację ERK, a tym samym procesy biologiczne zależne od ERK. Takie analizy umożliwiają również odkrycie nowych interakcji genetycznych między szlakami sygnałowymi.
Krytycznym wąskim gardłem dla każdej analizy opartej na obrazowaniu jest dostępność funkcjonalnych odczynników, takich jak przeciwciała, które są specyficzne dla danego zastosowania. Jeśli taki odczynnik istnieje, metody takie jak opisana powyżej mogą być łatwo dostosowane do analizy wzorca lokalizacji dla dowolnego białka będącego przedmiotem zainteresowania. Zastosowanie jest zatem ograniczone dostępnością działającego przeciwciała. Dodatkowo, ponieważ metoda opisuje rozbiór i barwienie w danym czasie rozwojowym, umożliwia ona uchwycenie informacji tylko w jednym przedziale czasowym i nie rzuca światła na dynamikę lub regulację białek w czasie rzeczywistym ani tempo obrotu białek.
Opisana powyżej metoda została zaadaptowana z Francis et al.23, która różni się od metody Seydoux i Dunna24 do ekstruzji gonad i barwienia przeciwciał. Metoda oparta na Francis i wsp. będzie nazywana dla porównania "metodą zawiesiny", a metoda Seydoux i Dunna nazywana "metodą krakingu zamrażalnego". Metoda zawiesiny okazała się bardzo skuteczna w naszych rękach w uzyskiwaniu powtarzalnych wzorców lokalizacji cząsteczek sygnałowych, takich jak dpERK, które są z natury bardziej wrażliwe na trudne warunki obsługi. W przypadku lokalizacji dpERK, z naszego doświadczenia wynika, że sygnał w strefie 1 jest praktycznie niewykrywalny metodą freeze crackingu. Ponadto suszenie próbki, które często może wystąpić w przypadku metody krakingu przez wymrażanie, powoduje fałszywe sygnały przeciwciał. Metoda zawiesinowa minimalizuje wysuszanie próbki, ponieważ gonady są zawieszone w cieczy przez cały proces. Odkryliśmy również, że metoda zawiesinowa jest przydatna do obrazowania wielu różnych genotypów na jednym szkiełku. Na przykład, jeśli dwa genotypy, takie jak hermafrodyty i samice, mają być bezpośrednio porównane pod kątem lokalizacji dpRK, oba genotypy można mieszać ze sobą i przetwarzać. Jest to możliwe, ponieważ fenotypy są odrębne i można je odróżnić za pomocą morfologii DAPI. Barwienie w tej samej probówce, a następnie obrazowanie na tym samym szkiełku pozwala na bezpośrednie porównanie gonad z różnych genotypów. Alternatywnie, jeśli morfologie DAPI nie są rozróżnialne, można zastosować dwuetapowe barwienie przeciwciałami. Najpierw każdy pojedynczy genotyp jest traktowany dwoma odrębnymi przeciwciałami, przeciwciałem A dla WT i przeciwciałem B dla mutanta (oba przeciwciała muszą być wyhodowane w gospodarzu innym niż przeciwciało dpERK). Po wybarwieniu dwóch genotypów przeciwciałem pierwotnym i umyciu, można je wymieszać razem w jednej probówce, a następnie wybarwić przeciwciałem dpECK, a następnie zastosować wtórne leczenie przeciwciałami w celu uwidocznienia wszystkich przeciwciał w probówce. Możliwość porównywania różnych genotypów na jednym szkiełku, zwłaszcza gdy dokonywane są dedukcje wzorców aktywacji, zapewnia dokładne interpretacje, na które nie mają wpływu różne warunki barwienia.
Chociaż jest to korzystne, w całej metodzie zawieszenia istnieje wiele etapów, które wymagają ostrożnej manipulacji. Bardzo ważne jest, aby sekcje odbywały się w sposób efektywny czasowo; Co ważne, sekcje nie powinny trwać dłużej niż 5 minut. Dłuższe czasy analizy skutkują zmiennym sygnałem dpERK, który często może być błędnie interpretowany jako regulowane zmiany w aktywacji ERK, a nie jako awarie techniczne. Bardzo ważne jest, aby zacząć od ponad 100 do 150 zwierząt na każdą sekcję, ponieważ na różnych etapach płukania gonady mogą łatwo zostać utracone z probówek z powodu błędów pipetowania. Utratę gonad można zmniejszyć albo przez preparację w wielu małych partiach (takich jak trzy partie po 50 zwierząt każda), które można połączyć, albo przez rozbiór jednej dużej partii 150 sztuk. Kolejnym wyzwaniem jest sprawienie, aby gonady leżały w dobrze rozmieszczonej formacji na szkiełku, tak aby można było zobrazować całą dystalną gonadę. Aby to umożliwić, użyj rzęsy na zapałce lub wyciągniętej pipety, aby rozmieścić gonady. Należy jednak zachować ostrożność, aby nie uszkodzić gonad podczas tego procesu. Często przy użyciu tych technik potrzeba wielu prób, aby opanować sekcje, a także ułożenie gonad na szkiełkach.
Po opanowaniu tej techniki służy ona jako potężna metoda do różnych analiz biologicznych i może być używana do badania nie tylko poziomów dpECK. Na przykład metoda ta może być wykorzystana do wizualizacji aktywnych poziomów p38 lub aktywnych poziomów CDK lub dowolnego białka, dla którego istnieje odczynnik przeciwciała. Ponadto metodę tę można połączyć z przesiewowym badaniem przesiewowym inhibicji chemicznej u całych zwierząt w celu oznaczenia nowych inhibitorów lub aktywatorów szlaku poprzez oznaczanie poziomów dpERK. Pozwoli to na odczyt in vivo zarówno reakcji, jak i wrażliwości na wszelkie inhibitory, które mogą wchodzić w interakcje ze szlakiem sygnałowym RTK-RAS-ERK. Co więcej, metoda ta może być stosowana w kombinacjach przeciwciał z wieloma wyjściami sygnalizacyjnymi, które mogą być używane i wizualizowane w tym samym czasie. Użycie wielu przeciwciał umożliwia korelację między wieloma szlakami, ich statusem aktywacji i wynikami w tej samej tkance, umożliwiając lepsze zrozumienie tych interakcji. To tylko kilka przykładów dalszych zastosowań tej metody, ale system ten może być modyfikowany w celu badania wielu zainteresowań badawczych.

Szlak kinazy tyrozynowej receptora (RTK)-mięsaka RAt (RAS)-Kinazy regulowanej sygnałem zewnątrzkomórkowym (ERK) przekazuje sygnały zewnątrzkomórkowe przez konserwatywną kaskadę kinazy, która powoduje fosforylację i aktywację ERK1-3. Białka ERK należą do konserwatywnej rodziny kinaz MAP (Mitogen Activated Protein) seryny/treoniny skierowanej proliną i są bezpośrednio aktywowane przez MEK poprzez podwójną fosforylację treoniny (T) i tyrozyny (Y) konserwatywnego motywu TEY. Aktywny ERK (określany jako difosforylowany ERK lub dpERK) następnie reguluje wiele procesów komórkowych i rozwojowych poprzez fosforylację baterii dalszych substratów1-3. Tak więc nieprawidłowa aktywność ERK prowadzi do wielu wad komórkowych i rozwojowych4-7.
Ścisła regulacja aktywności ERK jest kluczowa dla normalnego rozwoju: w systemach ssaków zbyt duża aktywność ERK prowadzi do nadmiernej proliferacji komórek, co prowadzi do wzrostu onkogennego; zbyt mała aktywność prowadzi do śmierci komórki4,6. Dodatkowo, zmiany w czasie trwania aktywności ERK mogą również prowadzić do odmiennych wyników: w komórkach PC12 aktywacja ERK przez 30 minut lub krócej indukuje proliferację komórek, ale aktywacja ERK przez 60 minut lub dłużej indukuje różnicowanie neuronów8,9. Ścisła regulacja aktywności ERK jest zatem wyraźnie niezbędna dla prawidłowego rozwoju i homeostazy.
C. elegans to potężny i genetycznie plastyczny system modelowy do analizy funkcji i regulacji szlaku sygnałowego RTK-RAS-ERK3,10-15. W porównaniu z systemami ssaków, które zawierają wiele genów dla RAS i ERK, C. elegans zawiera jeden gen RAS (let-60) i jeden gen ERK (mpk-1), co czyni go genetycznie łatwiejszym systemem, w którym można przeanalizować funkcję tego szlaku3,10-14. Linia zarodkowa C. elegans jest zasadniczo rurką, która składa się z mitotycznych komórek macierzystych na jej dystalnym końcu i dojrzałych oocytów na jej bliższym końcu (ryc. 1)16. Komórki rozrodcze inicjują mejozę tuż proksymalnie do dystalnej strefy mitotycznej i przechodzą przez rozszerzoną profazę mejotyczną (pachyten), po czym zaczynają tworzyć oocyty w okolicy pętli, ostatecznie przechodząc dojrzewanie oocytów w regionie proksymalnym16.
Badania genetyczne z wielu laboratoriów, w tym z naszego, wykazały, że szlak RTK-RAS-ERK jest niezbędny do rozwoju linii zarodkowej u C. elegans12,13,15,17-19. W szczególności odkryliśmy, że ERK kontroluje i koordynuje co najmniej dziewięć odrębnych procesów biologicznych podczas rozwoju linii zarodkowej, począwszy od przełączników rozwojowych, takich jak apoptoza komórek rozrodczych, po procesy biologiczne komórek, takie jak wzrost oocytów11,18. Podobnie jak w systemach ssaków, zbyt duża aktywność ERK w linii rozrodczej C. elegans powoduje produkcję wielu małych oocytów, podczas gdy zbyt mała aktywność powoduje powstanie jednego dużego oocytu11. Tak więc ścisła regulacja dpERK jest niezbędna do prawidłowego rozwoju linii zarodkowej. Aktywna forma ERK, uwidoczniona przez przeciwciało specyficzne dla dpERK, wykazuje stereotypowy, dynamiczny, bimodalny wzorzec lokalizacji: dpERK jest wysoki w środkowym pachytenie (strefa 1, ryc. 1), niski w regionie pętli i ponownie wysoki w dojrzałych oocytach (strefa 2, ryc. 1). Niedawno odkryliśmy, że odżywianie działa poprzez receptor insulinopodobnego czynnika wzrostu-1 (daf-2) w celu aktywacji ERK w strefie 112; wcześniejsze prace wykazały, że sygnał plemnika (poprzez kinazę tyrozynową receptora Efryny) aktywuje ERK w strefie 213.
Biorąc pod uwagę, że aktywny ERK funkcjonuje jako reostat w linii zarodkowej regulujący wzrost oocytów, lokalizacja przestrzenna i czasowa, a także amplituda dpERK, jest kluczem do zrozumienia jego normalnego wyniku sygnalizacji. Za pomocą opisanej tutaj metody można łatwo monitorować zmiany w stereotypowej lokalizacji dpERK i wyprowadzać prognozy dotyczące wpływu zaburzeń środowiskowych lub genetycznych na aktywność ERK, a tym samym na funkcjonowanie. W związku z tym oznaczanie dpERK umożliwia kompleksowe zrozumienie jego roli podczas rozwoju linii zarodkowej.

<table><tbody><tr><td>Agaroza</td><td>Sigma Inc.</td><td>A9539</td><td>Rozpuścić 2 g w 100 ml, aby uzyskać 2% roztwór</td></tr><tr><td>Szklane naczynie do zegarka z płaskim dnem</td><td>Agar Scientific</td><td>AGL4161</td><td>Używamy szkła, ponieważ wypreparowane gonady często przyklejają się do plastikowych</td></tr><tr><td>igieł 25 G</td> Strzykawki <td>BD PrecisionGlide</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>(mogą mieć 1 lub 5 ml)</td><td>Strzykawki BD</td><td>1 ml: BD 309659</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe (25 x 75 x 1,0 mm)</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe (24 x 50 mm)</td><td>Corning</td><td>2935-245</td><td></td></tr><tr><td>Szklana rurka stożkowa 5 ml</td><td>Corning</td><td>8060-5</td><td></td></tr><tr><td>9-calowa jednorazowa pipeta Pasteura</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>Kliniczna wirówka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>stołowa Szklane probówki (6 x 50 mm)</td><td>Fisherbrand</td><td>14-958-A</td><td></td></tr><tr><td>*M9 roztwór</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lewamizol</td><td>Sigma</td><td>L9756</td><td></td></tr><tr><td>3% paraformaldehyd (PFA)</td><td>Usługi mikroskopii elektronowej</td><td>17500</td><td>Otrzymywany jako 16% roztwór w ampułkach i rozcieńczany do 3% w buforze fosforanu potasu</td></tr><tr><td>1x PBS-T</td><td>1x PBS z 0,1% Tween 20</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Usługi mikroskopii elektronowej</td><td>18510</td><td></td></tr><tr><td>Koza normalna surowica (NGS)</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>5425</td><td>Rozcieńczona do 30% w 1x przeciwciałie PBS-T</td></tr><tr><td>MAPKYT (dpERK)&nbsp;</td><td>Sigma Inc.</td><td>M9692</td><td>Rozcieńczenie 1:400 w 30% NGS</td></tr><tr><td>Przeciwciało drugorzędowe</td><td>Invitrogen</td><td>A-11005</td><td>Rozcieńczenie 1:500 w 30% NGS</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>*M9 Receptura</td><td></td><td></td> bufora <td>3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O do 1 L.&nbsp;</td></tr><tr><td>**PBS (1x)</td><td></td><td></td><td>8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4, 0,24 g KH2PO4, 0,133 g CaCl2, 0,10 g MgCl2, H2O do 1 l</td></tr><tr><td>pożywki do wzrostu nicieni (NGM)</td><td></td><td></td><td>3 g NaCl, 17 g agaru, 2,5 g peptonu, 975 ml wody w 2 l kolbie Erlenmayera. Autoklaw przez 50 min. Ostudzić i dodać 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 5 mg/ml cholesterolu, 1 ml 1 M MgSO4 i 25 ml 1 M KPO4.&nbsp;</td></tr></tbody></table>

analiza przestrzenna i czasowa aktywnego erk w linii rozrodczej c. elegans

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Ewolucyjnie zachowany szlak sygnału zewnątrzkomórkowego transdukujący RTK-RAS-ERK jest ważną kaskadą sygnalizacji kinazy, która kontroluje wiele procesów komórkowych i rozwojowych, głównie poprzez aktywację ERK, końcowej kinazy szlaku. Ścisła regulacja aktywności ERK jest niezbędna do prawidłowego rozwoju i homeostazy; nadmiernie aktywny ERK powoduje nadmierną proliferację komórkową, podczas gdy niedostateczna ERK powoduje śmierć komórki. C. elegans to potężny system modelowy, który pomógł scharakteryzować funkcję i regulację szlaku sygnałowego RTK-RAS-ERK podczas rozwoju. W szczególności szlak RTK-RAS-ERK jest niezbędny do rozwoju linii zarodkowej C. elegans, na czym skupia się ta metoda. Stosując przeciwciała specyficzne dla aktywnej, difosforylowanej formy ERK (dpERK), można uwidocznić stereotypowy wzorzec lokalizacji w linii zarodkowej. Ponieważ wzorzec ten jest kontrolowany zarówno przestrzennie, jak i czasowo, zdolność do powtarzalnego oznaczania dpERK jest przydatna do identyfikacji regulatorów szlaku, które wpływają na czas trwania i amplitudę sygnału dpERK, a tym samym na rozwój linii zarodkowej. Tutaj pokazujemy, jak skutecznie preparować, barwić i obrazować dpERK w obrębie gonady C. elegans. Metoda ta może być dostosowana do lokalizacji przestrzennej dowolnego białka sygnałowego lub strukturalnego w gonadzie C. elegans, pod warunkiem, że dostępne jest przeciwciało zgodne z immunofluorescencją.

W dorosłych zwierzętach hermafrodytycznych typu WT dpERK jest zazwyczaj widoczny w regionie środkowego pachytenu, Strefie 1 oraz w najbardziej dojrzałych oocytach od -1 do -4 lub -5 (Strefa 2). Zaburzenia w tym wzorcu aktywacji odzwierciedlają zmiany w szlaku sygnalizacyjnym. Żeńskie linie zarodkowe nie różnicują się w plemniki, w związku z czym nie wykazują aktywacji ERK w Strefie 2, a w Strefie 1 występuje jedynie słaba aktywacja. Przedstawiono je na Rysunku 5.
<img alt="Schemat gonady C. elegans pokazujący oocyty, pachiten i embriony do badań nad biologią rozwoju." src="/files/ftp_upload/54901/54901fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Morfologia linii zarodkowej C. elegans. Obraz z kontrastowego mikroskopu interferencyjnego (DIC) dorosłego hermafrodyty z jednym ramieniem gonady w kształcie litery U obrysowanym białą linią. Dorosła gonada hermafrodyty zawiera komórki mitotyczne na dystalnym końcu. Komórki mitotyczne wchodzą w mejozę i przechodzą przez profazę meiotyczną (pachiten), rozwijając się w dojrzałe oocyty w proksymalnej części gonady. Strefa 1 i Strefa 2 wyznaczają stereotypową lokalizację dpERK w dorosłej gonadzie hermafrodyty. Skala: 20 µm. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54901/54901fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskop sekcyjny, strzykawka wstrzykująca, nicień, konfiguracja eksperymentu, mikroskopia, badania biologiczne." src="/files/ftp_upload/54901/54901fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Prezentacja pozycji igieł podczas sekcji. Po lewej: zdjęcie procesu sekcji. Po prawej: pozycje igieł w odniesieniu do nicienia. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54901/54901fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Proces przygotowania preparatu z agarem i taśmą; ustawienie laboratoryjne do obserwacji mikroskopowych." src="/files/ftp_upload/54901/54901fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Demonstracja przygotowania preparatu z agarozy. (A) Przyklej taśmę wzdłuż dwóch czystych szkiełek przedmiotowych. Umieść świeże, czyste szkiełko przedmiotowe pomiędzy tymi dwoma szkiełkami z taśmą, jak pokazano na rysunku. Trzy szkiełka znajdują się obok siebie wzdłużnie. (B) Dodaj roztopioną agarozę na środkowe szkiełko. (C) Umieść świeże szkiełko przedmiotowe prostopadle i na wierzchu środkowego szkiełka, na którym znajduje się kropla agarozy. (D) Pozostaw agarozę do stężenia. (E) Usuń górne szkiełko, pozostawiając zestaloną podkładkę z agarozy. Użyj dolnego szkiełka z podkładką z agarozy do montowania wypreparowanych i barwionych linii zarodkowych. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54901/54901fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obraz mikroskopowy, próbki barwione DAPI i dpERK, analiza lokalizacji białek, struktura komórkowa." src="/files/ftp_upload/54901/54901fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Obrazowanie preparatów w formie montażu. Montaż linii zarodkowej typu dzikiego z kanałem DAPI (góra) i dpERK (dół). Obrazy wykonane przy powiększeniu 63X z nakładającymi się granicami; białe ramki dla paneli A i B oraz zielone ramki dla paneli B i C. Obrazy DAPI i dpERK dla każdego panelu wykonano jednocześnie w dwóch różnych kanałach. Złożony obraz przedstawiono na Rysunku 5A. Pasek skali: 20 μm. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54901/54901fig4large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Postęp mejozy; dpERK, barwienie DNA w komórkach zarodkowych; mikroskopia fluorescencyjna, badanie mutacji fog-2." src="/files/ftp_upload/54901/54901fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Dynamiczna czasowo-przestrzenna aktywacja ERK. (A-C) Linie zarodkowe dorosłych (24 godziny po etapie połowy L4 rozwoju) hermafrodytów WT (N2) barwione na DNA (B, DAPI, biały) oraz dpERK (C, czerwony). Podświetlono sygnał dpERK w Strefie 1 (region pachitenowy) oraz w Strefie 2 (dojrzałe oocyty). (D-F) fog-2(oz40) linie zarodkowe samic (8 h po etapie połowy L4 rozwoju) barwione na DNA (E, DAPI) oraz dpERK (F). Młode linie zarodkowe samic wykazują słabe dpERK w Strefie 1 oraz w pojedynczym oocycie w sposób niezależny od plemników. Strefa 2 jest zależna od plemników, a zatem nie występuje w linii zarodkowej samic. Pasek skali: 20 μm. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54901/54901fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Prezentujemy metodę obrazowania immunofluorescencyjnego opartą na przestrzennej i czasowej lokalizacji aktywnego ERK w wypreparowanej gonadzie C. elegans. Opisany tutaj protokół może być dostosowany do wizualizacji dowolnego białka sygnalizacyjnego lub strukturalnego w gonadzie C. elegans, pod warunkiem, że dostępny jest odpowiedni odczynnik przeciwciała.

Analiza przestrzenna i czasowa aktywnego ERK w linii rozrodczej C. elegans

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest oznaczenie poziomu aktywnego ERK in vivo w gonadach C.elegans. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu sygnalizacji ERK i biologii komórek linii zarodkowej, takie jak wpływ leczenia farmakologicznego lub zaburzeń genetycznych na szlak RAS-ERK, a tym samym na rozwój komórek linii zarodkowej. Główną zaletą tej techniki jest możliwość ilościowego określenia wzorca i natężenia sygnału ERK in vivo.Wybierz od 100 do 150 nicieni na pożądanym etapie rozwoju i zbierz je do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml zawierającej 100 µL buforu M9. Następnie dopełnij probówkę do mikrocentryfugi kolejnymi 900 µL buforu M9 i wiruj przy 1000 ×g przez jedną minutę w temperaturze pokojowej. Pod mikroskopem stereoskopowym ostrożnie usuń 900 µL buforu M9.Następnie powtórz płukanie jeszcze dwa razy, aby usunąć większość przytwierdzonych bakterii. Potem, używając końcówki do mikropipety o pojemności 200 µL z szerokim otworem, przenieś nicienie w 100 µL buforu M9 do szklanej szalki zegarkowej o płaskim dnie. Następnie dodaj do szalki od jednego do trzech µL 0,1 M lewamisolu i delikatnie zamieszaj ruchem okrężnym.Następnie do dwóch strzykawek przymocuj igły o rozmiarze 25 G, aby stworzyć narzędzia do sekcji dla każdej ręki. Pod mikroskopem sekcyjnym ustaw każdą igłę pod i nad każdym nicieniem i wykonaj precyzyjne cięcie na każdym zwierzęciu w pobliżu drugiej opuszki gardzielowej, stosując ruch przypominający pracę nożyczek. Wszystkie zwierzęta należy naciąć co najmniej raz w ciągu pięciu minut, aby lewamisolol zachował swoją skuteczność.Bardzo ważne jest, aby sekcja zwierząt w szalce została zakończona w czasie krótszym niż pięć minut. W przypadku, gdy wydzielona gonada nie jest widoczna, należy pominąć dane zwierzę. Prawidłowo wydzielone gonady są widoczne tutaj.Po zakończeniu sekcji, pod wyciągiem dodać dwa mililitry 3% paraformaldehydu bezpośrednio do szklanego zlewka i przykryć go Parafilmem. Następnie odczekać dziesięć minut. Potem, używając dziewięciocalowej szklanej pipety Pasteura, dodać trzy mililitry PBS-T do zlewka i wymieszać roztwór za pomocą pipety.Następnie, używając nowej pipety szklanej, pobierz pięć mililitrów cieczy zawierającej nicienie i przelej je do nowej szklanej probówki stożkowej o pojemności pięciu mililitrów. Następnie wiruj probówkę przez 30 sekund w wirówce klinicznej przy 1000 g. Teraz, pod mikroskopem stereoskopowym, usuń i wylej nadsącz, uważając, aby nie naruszyć wypreparowanych tkanek.Następnie, używając aliquotów PBS-T o objętości pięciu mililitrów, powtórz etap płukania jeszcze dwa razy, pozostawiając nicienie w niewielkiej objętości roztworu. Następnie, za pomocą pipety szklanej, dodaj dwa mililitry 100% metanolu i delikatnie wymieszaj tkanki, pobierając je i wypuszczając świeżą pipetą Pasteura. Teraz inkubuj probówkę w temperaturze -20 °C przez co najmniej jedną godzinę.Po traktowaniu metanolem przeprowadź trzy przemycia w roztworze PBS-T i zakończ proces, pozostawiając około 500 µL PBS-T. Następnie, używając nowej pipety Pasteura, przenieś tkanki do nowej szklanej probówki o pojemności 1 ml i pozwól im opaść pod wpływem grawitacji. Po 5 do 10 minutach, używając nowej pipety oraz pod kontrolą mikroskopu, usuń z probówki jak największą ilość płynu piorącego, tak aby nie naruszyć tkanek.Aby rozpocząć blokowanie, dodaj 100 µL 30% normal goat serum, który służy jako bufor blokujący. Następnie przykryj probówkę folią Parafilm i pozostaw w temperaturze pokojowej na godzinę. Po godzinie, korzystając z mikroskopu, usuń jak największą ilość cieczy za pomocą nowej pipety.Następnie przygotuj 100 µL przeciwciała MAPKYT w rozcieńczeniu 1:400 w 30% NGS i dodaj je do tkanek. Następnie zamknij probówkę Parafilmem i inkubuj ją przez noc w temperaturze 4 °C. Następnego dnia ogrzej probówki do temperatury pokojowej i dodaj 800 µL PBS-T.Następnie pobierz próbkę do nowej szklanej pipety i delikatnie ją zwolnij, aby uzyskać jednorodną zawiesinę. Po opadnięciu tkanek na dno ostrożnie usuń nadsącz i powtórz proces płukania łącznie trzy razy, za każdym razem używając nowej pipety i nie stosując wirówki typu vortex. Przeciwciało wtórne nakłada się w ten sam sposób co pierwotne, z tą różnicą, że od tego momentu aż do momentu obrazowania należy dbać o to, aby tkanki znajdowały się w ciemności.Po inkubacji z przeciwciałami wtórnymi, po usunięciu ostatniego przemycia, dodaj do tkanek 800 µL rozcieńczonego roztworu DAPI. Zamknij otwór probówki Parafilmem i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Następnie, pod mikroskopem stereologicznym, usuń za pomocą nowej pipety jak największą ilość roztworu DAPI.Po usunięciu ostatniego barwnika lub przemyciu, dodaj do probówek jedną kroplę medium montażowego. Następnie przygotuj szkiełko do montażu z podkładką z agarozy. Na czyste szkiełko przedmiotowe nanieś kroplę roztopionej 2% agarozy i szybko połóż drugie czyste szkiełko prostopadle na agarozy.Na koniec bardzo ostrożnie zdejmij górne szkiełko przedmiotowe. Następnie przenieś wypreparowane zwierzęta na podkładkę i usuń z niej nadmiar płynu przy użyciu mikroskopu. Na koniec nałóż szkiełko nakrywkę o wymiarach 24 by 50 milimetrów, dbając o to, aby nie powstały pęcherzyki powietrza.Po nałożeniu szkiełka nakrywkowe nie należy wywierać żadnego dodatkowego nacisku. Często prowadzi to do utraty sygnału. Reprezentatywne obrazy dorosłych hermafrodyt dzikiego typu wykazały, że difosforylowana aktywna forma ERK jest zazwyczaj widoczna w regionie środkowego pachytenu, w strefie 1 oraz w najbardziej dojrzałych oocytach w strefie 2.Zaburzenia w tym wzorcu aktywacji odzwierciedlają zmiany w szlaku sygnalizacyjnym. Linie zarodkowe żeńskie nie różnicują się w plemniki, w związku z czym nie wykazują aktywacji ERK w strefie 2, natomiast w strefie 1 wykazują jedynie słabą aktywację. Po opanowaniu techniki tej procedura zajmuje maksymalnie dwa dni, przy czym pierwszy dzień jest najbardziej czasochłonny i trwa jedną godzinę, jeśli jest wykonywana prawidłowo.Po zastosowaniu tej procedury można wykorzystać inne metody, takie jak RNA fish, do ilościowego określania parametrów, takich jak poziom transkrypcji RNA, jako uzupełnienie informacji o obfitości białek. Po opracowaniu tej techniki w 1995 roku, otworzyła ona przed badaczami zajmującymi się rozwojem komórek linii zarodkowej możliwość oceny poziomów obfitości białek in vivo oraz śledzenia morfologii chromosomów u C.elegans.

spatial-and-temporal-analysis-of-active-erk-in-the-c-elegans-germline

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Przeprowadzono analizę mikromacierzy w celu określenia profili ekspresji genów u C. elegans, a w celu walidacji i kwantyfikacji danych z mikromacierzy zastosowano reakcję PCR w czasie rzeczywistym.

Wyznaczanie profili ekspresji genetycznej w C. elegans z wykorzystaniem mikromacierzy i PCR w czasie rzeczywistym

Ten film opisuje metodę preparowania gonad od dorosłych hermafrodytów C. elegans, w wyniku czego powstają tkanki odpowiednie do barwienia immunologicznego i obrazowania fluorescencyjnego.

C. elegans (C. elegans) Wytłaczanie gonad: technika szybkiej sekcji

Tutaj pokazano, jak śledzić i określać ilościowo procesy rozwojowe u C. elegans. Przedstawione metody oparte są na narzędziach open-source, które można łatwo wdrożyć. Pokazano, jak rekonstruować modele 3D w kształcie komórki, jak ręcznie śledzić struktury subkomórkowe i jak analizować korowy przepływ skurczowy.

Śledzenie i ilościowe określanie procesów rozwojowych u C. elegans przy użyciu narzędzi open source

Zegar segmentacyjny napędza oscylacyjną ekspresję genów w mezodermie presomitycznej (PSM). Dynamiczna aktywność Notch jest kluczem do tego procesu. Wykorzystujemy obrazowanie i analizy obliczeniowe, aby wyodrębnić dynamikę czasową z danych wyrażeń przestrzennych, aby wykazać, że ekspresja liganda Delta i receptora Notch oscyluje w PSM kręgowców.

Porządkowanie czasowe danych wyrażeń dynamicznych na podstawie szczegółowych map wyrażeń przestrzennych

Prezentujemy zautomatyzowaną metodę trójwymiarowej rekonstrukcji linii zarodkowej Caenorhabditis elegans. Nasza metoda określa liczbę i położenie każdego jądra w linii zarodkowej oraz analizuje rozmieszczenie białek linii zarodkowej i strukturę cytoszkieletu.

Analiza obliczeniowa linii zarodkowej Caenorhabditis elegans w celu zbadania rozmieszczenia jąder, białek i cytoszkieletu

Opisano metodę opartą na obrazowaniu, która może być użyta do identyfikacji fazy S i analizy dynamiki cyklu komórkowego w hermafrodytycznej linii zarodkowej C. elegans przy użyciu analogu tymidyny EdU. Ta metoda nie wymaga transgenów i jest kompatybilna z barwieniem immunofluorescencyjnym.

Analiza cyklu komórkowego w linii zarodkowej C. elegans z analogiem tymidyny EdU

Ta praca opisuje protokół o średniej przepustowości, który umożliwia jednoczesne obrazowanie 3D poklatkowe embriogenezy u zarodków 80-100 C. elegans w ciągu jednej nocy. Dodatkowo dołączone są narzędzia do przetwarzania i wizualizacji obrazu, które usprawniają analizę danych. Połączenie tych metod z niestandardowymi szczepami reporterowymi umożliwia szczegółowe monitorowanie embriogenezy.

Metoda obrazowania półwysokoprzepustowego i zestaw narzędzi do wizualizacji danych do analizy rozwoju embrionalnego C. elegans

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania i montażu zarodków Caenorhabditis elegans, rejestrowania rozwoju pod mikroskopem 4D i śledzenia linii komórkowej.

Mikroskopia 4D: odkrywanie rozwoju embrionalnego Caenorhabditis elegans za pomocą mikroskopii Nomarskiego

Ten protokół opisuje interferencję RNA i test ChIP w celu zbadania epigenetycznego dziedziczenia indukowanego przez RNAi wyciszania i związanych z nim modyfikacji chromatyny u C. elegans.

Analiza międzypokoleniowego dziedziczenia epigenetycznego u C. elegans przy użyciu fluorescencyjnego reportera i immunoprecypitacji chromatyny (ChIP)

RASopatie to wielosystemowe zespoły genetyczne wywołane hiperaktywacją szlaku RAS-MAPUK. Potencjalnie patogenne warianty oczekujące na walidację pojawiają się nieustannie, podczas gdy słabe dowody przedkliniczne ograniczają terapię. Tutaj opisujemy nasz protokół in vivo polegający na testowaniu i krzyżowej weryfikacji poziomów aktywacji ERK związanych z RASopatią oraz jego modulacji farmakologicznej podczas embrigenezy za pomocą obrazowania FRET na żywo u danio danio młodego typu Teen-reporter.

Efektywny protokół oceny modulacji aktywności ERK w wczesnych modelach zespołu Noonana u danio danio za pomocą mikroskopii na żywo FRET i immunofluorescencji

Przepływ pracy z mikroiniekcją CRISPR/Cas9 do endogennego fluorescencyjnego oznaczania w linii komórkowej Caenorhabditis elegans w celu uzyskania homozygotycznych linii knock-in do analizy lokalizacji białka in vivo lokalizacji białka.

Endogenouszne fluorescencyjne oznaczanie genów specyficznych dla komórek germinalnych za pośrednictwem CRISPR/Cas9 u Caenorhabditis elegans

Poznaj metodę immunofluorescencji do lokalizacji aktywnego ERK w gonadach C. elegans. Technika umożliwia ilościową analizę wzorców sygnału ERK in vivo oraz badanie wpływu leków i perturbacji genowych na rozwój komórek płciowych.

Analiza przestrzenna i czasowa aktywnego ERK w linii rozrodczej C. elegans

Przeglądaj więcej filmów