Analiza przestrzenna i czasowa aktywnego ERK w linii rozrodczej C. elegans

Ogólnym celem tego eksperymentu jest oznaczenie poziomów aktywnego ERK in vivo w gonadach C.elegans. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie sygnalizacji ERK i komórek rozrodczych, takie jak wpływ leczenia farmakologicznego lub zaburzenia genów na szlak RAS-ERK, a tym samym rozwój komórek rozrodczych. Główną zaletą tej techniki jest to, że wzorzec i siłę sygnału ERK można określić ilościowo in vivo.

Wybierz od 100 do 150 robaków na pożądanym etapie rozwoju i zbierz je w 1,5-mililitrowej probówce mikrowirówkowej zawierającej 100 mikrolitrów buforu M9. Następnie napełnij probówkę mikrowirówki 900 dodatkowymi mikrolitrami buforu M9 i odwiruj ją z prędkością 1000 razy g przez jedną minutę w temperaturze pokojowej. Pod mikroskopem preparacyjnym delikatnie usuń 900 mikrolitrów bufora M9.

Następnie powtórz pranie jeszcze dwa razy, aby usunąć większość przyczepionych bakterii. Następnie, za pomocą końcówki do mikropipet o pojemności 200 mikrolitrów z szerokim otworem, przenieś robaki w 100 mikrolitrach buforu M9 do szklanej czaszy zegarka z płaskim dnem. Następnie dodaj od jednego do trzech mikrolitrów 0,1-molowego lewamizolu do naczynia i delikatnie zamieszaj.

Teraz przymocuj dwie igły o rozmiarze 25 do dwóch strzykawek, aby zrobić jedno narzędzie preparacyjne na każdą rękę. Pod mikroskopem preparacyjnym umieść każdą igłę pod i nad każdym robakiem i wykonaj drobne nacięcie na każdym robaku w pobliżu drugiej opuszki gardłowej, wykonując ruch przypominający nożyce. Pokrój wszystkie zwierzęta co najmniej raz, wszystkie w ciągu pięciu minut, aby lewamizol pozostał skuteczny.

Bardzo ważne jest, aby sekcja zwierząt w naczyniu została zakończona w czasie krótszym niż pięć minut. W przypadku, gdy wyciśnięta gonada nie jest widoczna, po prostu pomiń to zwierzę. Widoczne są tu właściwe wytłoczone gonady.

Po zakończeniu sekcji, pod wyciągiem wyciągowym dodaj dwa mililitry 3% paraformaldehydu bezpośrednio do szklanego naczynia zegarka i przykryj je Parafilmem. Następnie odczekaj dziesięć minut. Następnie, za pomocą dziewięciocalowej szklanej pipety Pasteura, dodaj trzy mililitry PBS-T do szkiełka zegarka i wymieszaj roztwór za pomocą pipety.

Następnie, za pomocą nowej szklanej pipety, pobrać pięć mililitrów płynu zawierającego robaki i przenieść je do świeżej pięciomililitrowej szklanej stożkowej probówki. Następnie odwiruj probówkę przez 30 sekund w wirówce klinicznej o masie 1000 g. Teraz, pod mikroskopem preparacyjnym, usuń i wyrzuć supernatant bez naruszania wypreparowanych tkanek.

Następnie, używając pięciu mililitrowych porcji PBS-T, powtórz etap mycia jeszcze dwa razy i zakończ robakami w małej objętości roztworu. Następnie za pomocą szklanej pipety dodaj dwa mililitry 100% metanolu i delikatnie wymieszaj tkanki, przeciągając je w górę iw dół świeżą pipetą Pasteura. Teraz inkubuj probówkę w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez co najmniej godzinę.

Po zabiegu metanolowym wykonaj trzy płukania PBS-T i zakończ około 500 mikrolitrami PBS-T. Teraz, używając świeżej pipety Pasteura, przenieś tkanki do nowej szklanej rurki o pojemności jednego mililitra i pozwól im osiąść grawitacyjnie. Po pięciu do 10 minutach użyj świeżej pipety i mikroskopu, aby usunąć jak najwięcej płynu z probówki bez naruszania tkanek.

Aby rozpocząć blok, dodaj 100 mikrolitrów 30% normalnej koziej surowicy, która jest buforem blokującym. Następnie przykryj tubkę Parafilmem i pozostaw w temperaturze pokojowej na godzinę. Po godzinie, za pomocą mikroskopu, usuń jak najwięcej płynu za pomocą nowej pipety.

Następnie przygotuj 100 mikrolitrów przeciwciała MAPKYT rozcieńczonego w stosunku jeden na 400 w 30% NGS i dodaj je do tkanek. Następnie zamknij probówkę Parafilmem i inkubuj ją przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia podgrzej probówki do temperatury pokojowej i dodaj 800 mikrolitrów PBS-T.

Następnie pobrać próbkę do świeżej szklanej pipety i delikatnie je uwolnić, aby uzyskać równomierną zawiesinę. Gdy tkanki osiądną na dnie, ostrożnie usuń supernatant i powtórz mycie w sumie trzy razy, zawsze używając świeżej pipety i nigdy nie używając wiru. Przeciwciało drugorzędowe stosuje się tak samo jak przeciwciało pierwszorzędowe, zwraca się jedynie uwagę na utrzymywanie tkanek w ciemności od tego momentu, aż będzie można je zobrazować.

Po inkubacji z przeciwciałem drugorzędowym dodać 800 mikrolitrów rozcieńczonego roztworu DAPI do tkanek po usunięciu ostatniego płukania. Przykryj wylot probówki Parafilmem i inkubuj go w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Później, pod mikroskopem preparacyjnym, usuń jak najwięcej roztworu DAPI za pomocą nowej pipety.

Po usunięciu ostatniej plamy lub umyciu dodaj jedną kroplę roztworu montażowego do rurek. Teraz przygotuj szkiełko montażowe z podkładką agarozową. Dodaj kroplę stopionej 2% agarozy do czystego szkiełka i szybko umieść drugie czyste szkiełko prostopadle do i na wierzchu agarozy.

Na koniec bardzo delikatnie zdejmij górne szkiełko mikroskopu. Teraz przenieś wypreparowane zwierzęta na podkładkę i usuń cały nadmiar płynu z podkładki za pomocą mikroskopu. Na koniec nałóż szkiełko nakrywkowe o wymiarach 24 na 50 milimetrów, nie tworząc pęcherzyków powietrza.

Po nałożeniu szkiełka nakrywkowego nie należy wywierać dodatkowego nacisku. Często prowadzi to do utraty sygnału. Reprezentatywne obrazy dorosłych zwierząt hermafrodytycznych typu dzikiego ujawniły, że dyfosforylowana aktywna forma ERK jest zwykle wizualizowana w regionie środkowym pachytenu, w strefie 1 oraz w najbardziej dojrzałych oocytach w strefie 2.

Zaburzenia w tym wzorcu aktywacji odzwierciedlają zmiany w szlaku sygnałowym. Żeńskie linie rozrodcze nie określają plemników i w związku z tym nie wykazują aktywacji ERK w strefie 2, a jedynie słabą aktywację w strefie 1. Po opanowaniu tej techniki może to zająć co najwyżej dwa dni, przy czym pierwszy dzień zajmuje najwięcej czasu, w ciągu jednej godziny, jeśli jest wykonywany prawidłowo.

Zgodnie z tą procedurą, inne metody, takie jak ryby RNA, mogą być używane do ilościowego określania rzeczy, takich jak poziom transkryptu RNA, a także informacje o obfitości białka. Po jej opracowaniu w 1995 r. technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się rozwojem komórek rozrodczych do oznaczania poziomów obfitości białek in vivo i śledzenia morfologii chromosomów u C. elegans.