Protokół wykorzystania biosensorów Förster Resonance Energy Transfer (FRET) do pomiaru sił mechanicznych w jądrowym kompleksie LINC

Ogólnym celem tej procedury jest określenie sił działających na łącznik cytoszkieletu nukleoszkieletu lub kompleksu LINC za pomocą mikroskopii FRET w żywych komórkach za pomocą bioczujnika zaprojektowanego dla białka kompleksu LINC, nesprin-2G. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie mechanotransdukcji, takie jak siły działające na białka w jądrze żywych komórek oraz jak siły te zmieniają się w różnych warunkach. Główną zaletą tej techniki jest jej zdolność do pomiaru bardzo małych poziomów siły działającej na białka i żywe komórki.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały problemy z robieniem zdjęć. Optymalizacja mocy i wzmocnienia lasera mikroskopu w celu uzyskania dobrego sygnału między wszystkimi grupami eksperymentalnymi jest trudna. Na początek hoduj komórki blastyczne z włókna NIH 3T3 do zbiegu od 70% do 90% w sześciodołkowym naczyniu do hodowli komórkowych w standardowym inkubatorze do hodowli komórkowych z regulacją temperatury i CO2.

W kapturze do hodowli komórkowych usunąć pożywkę i przepłukać każdą studzienkę około 1 mililitrem zredukowanej pożywki komórkowej surowicy. Dodać 800 mikrolitrów zredukowanej pożywki z komórek surowicy do każdej studzienki i umieścić sześciodołkową komorę w inkubatorze. Następnie odpipetować 700 mikrolitrów zredukowanej pożywki z komórek surowicy do 1,5-mililitrowej probówki oznaczonej L z 35 mikrolitrami roztworu nośnika lipidowego, aby utworzyć mieszaninę lipo.

Wymieszać zawiesinę przez pipetowanie. Następnie odpipetuj 100 mikrolitrów zredukowanej pożywki z komórek surowicy do każdej z sześciu 1,5-mililitrowych probówek oznaczonych od pierwszej do sześciu. Pipetować DNA osocza do czujnika napięcia nesprin, bezgłowej kontroli siły zerowej nesprin, mTFP1 i wenus do probówek od pierwszej do szóstej, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Nie należy ponownie używać końcówek do pipet podczas pipetowania różnych typów DNA. Następnie odpipetować 100 mikrolitrów lipo z rurki L do każdej oznakowanej probówki i wymieszać przez wielokrotne pipetowanie, używając czystej pipety do każdej probówki. Inkubować zawiesinę przez 10 do 20 minut.

Następnie dodaj 200 mikrolitrów z każdej oznakowanej probówki do studzienki przygotowanej sześciodołkowej komory zawierającej komórki. Oznacz górną część każdej studzienki odpowiednim dodatkiem DNA. Następnie umieść sześciodołkową komorę w inkubatorze na cztery do sześciu godzin.

Po inkubacji odessać pożywkę i dodać od jednego do dwóch mililitrów zredukowanej pożywki z komórek surowicy do wypłukania. Odessać zredukowaną pożywkę z komórek surowicy i dodać dwa mililitry trypsyny do każdej studzienki przed umieszczeniem sześciodołkowej pożywki w inkubatorze na pięć do 15 minut. Podczas gdy komórki odłączają się w inkubatorze, pokryj sześć naczyń ze szklanym dnem warstwą fibronektyny o stężeniu 20 mikrogramów na mililitr rozpuszczonej w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami.

Pozwól szalkom pokryć powierzchnię w kapturze do hodowli komórkowych. Zneutralizuj trypsynę, dodając dwa mililitry DMEM po odłączeniu komórek. Następnie przenieś zawartość każdej studzienki do oznakowanej 15-mililitrowej probówki wirówkowej i wiruj z prędkością 90 razy g przez pięć minut w wirówce z wirówką z wirnikiem wahadłowym.

Odessać supernatant i ponownie zawiesić każdą osadkę komórkową w 1 000 mikrolitrach DMEM za pomocą pipety. Odessać mieszaninę fibronektyny ze szklanych naczyń i odpipetować 1 000 mikrolitrów każdej zawiesiny komórkowej na szalki. Po tym, jak komórki osiądą na dnie szklanych naczyń, dodaj kolejny mililitr pożywki do każdej studzienki.

Pozwól komórkom podłączyć i odciągnąć czujnik w inkubatorze komórek przez co najmniej 18 do 24 godzin. Aby sprawdzić skuteczność transfekcji, użyj mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w częstotliwość wzbudzenia bliską 462 nanometrów dla mTFP1 lub 525 nanometrów dla Wenus. Użyj filtra emisyjnego wyśrodkowanego w pobliżu 492 nanometrów dla mTFP1 lub 525 nanometrów dla Wenus.

Około 18 do 24 godzin po zakończeniu transfekcji użyj odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego, aby zbadać skuteczność transfekcji, porównując liczbę komórek fluorescencyjnych z całkowitą liczbą komórek w polu widzenia. Jeśli żywe komórki nie mogą być zobrazowane w ciągu 48 godzin po transfekcji, utrwal komórki w 4% paraformaldehydzie na pięć minut. Pozwól komórkom na ekspresję czujnika przez 24 do 48 godzin przed utrwaleniem.

Zapisz komórki w PBS i wyświetl po 48 godzinach. W kapturze do hodowli komórkowej zastąp pożywkę komórkową pożywką do obrazowania uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą. Umieść viewnaczynia w mikroskopie konfokalnym stage z kontrolowaną temperaturą.

Umieść szklaną czaszę z komórkami transfekowanymi mTFP1 nad obiektywem olejowym pod 60-krotnym powiększeniem z aperturą numeryczną 1,4. Zlokalizuj komórki wykazujące ekspresję mTFP1 w trybie fluorescencyjnym szerokiego pola. Gdy komórka fluorescencyjna znajduje się w polu view, wybierz tryb detekcji spektralnej i uchwyć obraz spektralny.

Uwzględnij wszystkie częstotliwości powyżej 458 nanometrów z przyrostem 10 nanometrów. Wybierz jasny obszar fluorescencyjny w komórce. Dodaj średnią zwrotu z inwestycji we fluorescencji jako znormalizowaną intensywność do bazy danych spektralnej, klikając Zapisz widma w bazie danych.

Zoptymalizuj moc i wzmocnienie lasera tak, aby uzyskać dobry stosunek sygnału do szumu. Ustawienia będą się różnić w zależności od sprzętu. Powtórz proces dla komórek wykazujących ekspresję Wenus i pozostań w trybie widmowym.

Użyj częstotliwości wzbudzenia 488 nanometrów zamiast 458 nanometrów. Dostosuj ustawienia mocy zgodnie z potrzebami, ale nie zmieniaj częstotliwości emisji. Wybierz jasny fluorescencyjny zwrot z inwestycji o promieniu około 20 pikseli.

Dodaj średnią ROI fluorescencji jako znormalizowaną intensywność do bazy danych spektralnej, klikając Zapisz widma w bazie danych. Aby uchwycić niezmiksowane obrazy, najpierw przełącz tryb przechwytywania na rozmieszanie spektralne. Dodaj spektralne odciski palców Wenus i mTFP1 do kanałów rozmieszania.

Ustaw laser wzbudzający z powrotem na źródło argonu o długości 458 nanometrów. Umieść czujnik naprężenia nesprin viewnaczynie nad obiektywem olejowym 60X. Po ustawieniu ostrości na ogniwie fluorescencyjnym o wystarczająco jasnym wyrazie, dostosuj wzmocnienie i moc lasera, aby zoptymalizować stosunek sygnału do szumu.

Zrób co najmniej 15 do 20 zdjęć komórek czujnika napięcia nesprin o stosunkowo podobnej jasności i unikaj nadmiernego nasycenia pikseli. Powtórz proces przechwytywania obrazu za pomocą komórek bezgłowych nesprin przy użyciu identycznych parametrów obrazowania. Reprezentatywny obraz fibroblastów 3T3 transfekowanych w 10-krotnym powiększeniu za pomocą czujnika napięcia nesprin przy użyciu nośnika za pośrednictwem lipidów jest pokazany tutaj.

Zazwyczaj tylko ułamek komórek jest transfekowany w danym polu widzenia. Pokazana tutaj jest reprezentatywna para dwóch jąder 3T3 eksprymujących nesprin-TS w niezmieszanych spektralnie kanałach wenus i mTFP. Scalony kolorowy obraz dwóch kanałów jest pokazany w skrajnym prawym panelu.

Oto reprezentatywna próbka zamaskowanych jąder nesprin-TS ze stabilnych komórek MDCK o ekspresji na podłożach wzorzystych i niewzorzystych. Obrazy proporcji są definiowane jako stosunek kanału wenus podzielony przez kanał mTFP i mogą być używane do dokonywania względnych porównań sił ilościowych. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w około osiem godzin, jeśli jest wykonywana prawidłowo.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o dokładnym oznakowaniu probówek DNA podczas transfekcji i utrzymaniu stałych parametrów obrazowania podczas wykonywania obrazów spektralnych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak transfekować komórki za pomocą czujnika napięcia nesprin i przechwytywać obrazy o rozdzielczości spektralnej do komputerowego indeksu FRET, który koreluje z siłą działającą na czujnik napięcia. Chociaż w tym przypadku czujnik FRET jest używany do nesprin, można go również zastosować do innych białek w komórce, w których pożądana jest siła pomiarowa.