Name: Protokół wykorzystania biosensorów Förster Resonance Energy Transfer (FRET) do pomiaru sił mechanicznych w jądrowym kompleksie LINC (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Poznaj metodę pomiaru sił mechanicznych w kompleksie LINC za pomocą biosensorów FRET w żywych komórkach NIH 3T3. Technika ta pozwala badać mechanotransdukcję i dynamikę sił jądrowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez Thomas F. and Kate Miller Jeffress Memoria Trust (do DEC) oraz NIH grant R35GM119617 (do DEC). Obrazowanie mikroskopem konfokalnym przeprowadzono w ośrodku VCU Nanomaterials Characterization Core (NCC).

1. Uzyskaj DNA z czujnika Nesprin-2G i inne DNA plazmidu
<ol>
	<li>Uzyskaj Nesprin-2G TS (czujnik napięcia), Nesprin-2G HL (bezgłowy) sterowanie, mTFP1, venus i TSmod ze źródła komercyjnego. Rozmnażaj wszystkie plazmidy DNA i oczyść je za pomocą standardowych szczepów E. coli, takich jak DH5-α, jak opisano wcześniej12,13.</li>
</ol>
2. Komórki transfekcyjne z Nesprin-2G i innym plazmidowym DNA
<ol>
	<li>Hoduj fibroblasty NIH 3T3 do 70-90% konfluencji w 6-dołkowym naczyniu do hodowli komórkowych w standardowym inkubatorze do hodowli komórkowych z regulacją temperatury (37 °C) i CO2 (5%). Jako pożywkę do wzrostu komórek użyj zmodyfikowanej pożywki Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% płodową surowicą cielęcą.</li>
	<li>W kapturze do hodowli komórkowych usunąć pożywkę i przepłukać każdą studzienkę około 1 ml pożywki komórkowej o obniżonej surowicy. Dodać 800 μl pożywki o zredukowanej surowicy do każdego dołka i umieścić 6-dołkową komorę w inkubatorze.</li>
	<li>Odpipetować 700 μl pożywki komórkowej o obniżonej surowicy do probówki o pojemności 1,5 ml z 35 μl roztworu nośnika lipidowego, aby utworzyć "lipomix". Wymieszać pipetując. Oznacz rurkę literą "L".</li>
	<li>Zbierz sześć probówek o pojemności 1,5 ml i oznacz je od 1 do 6. Odpipetować 100 μl pożywki o zredukowanej surowicy do każdej probówki.
	<ol>
		<li>Korzystając z stężenia plazmidowego DNA z kroku 1, odpipetować 2 μg Nesprin 2G-TS do probówek 1 i 2. Pobrać pipetę 2 μg Nesprin-HL do probówek 3 i 4. Odpipetować 1 μg mTFP do probówki 5. Odpipetować 1 μg mVenus do probówki 6. Nie należy ponownie używać końcówek do pipet podczas pipetowania różnych rodzajów DNA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odpipetować 100 μl lipomiksu z probówki "L" do każdej oznaczonej probówki (1-6) i wymieszać przez wielokrotne pipetowanie. Do każdej probówki należy użyć czystej pipety. Inkubować przez 10-20 minut.</li>
	<li>Dodaj 200 μl z każdej oznakowanej probówki do studzienki w komorze 6-dołkowej z 70-90% zlewającymi się komórkami. Oznacz górną część każdej studzienki odpowiednim dodatkiem DNA. Umieść komorę 6-dołkową w inkubatorze na 4-6 godzin.</li>
	<li>Odessać pożywkę i dodać 1-2 ml pożywki o obniżonej zawartości komórek surowicy do spłukania. Odessać pożywkę komórkową o obniżonej surowicy, dodać 2 ml trypsyny do każdej studzienki i umieścić 6-dołkową pożywkę w inkubatorze (5-15 min).</li>
	<li>Podczas gdy komórki odłączają się w inkubatorze, pokryj 6 naczyń ze szklanym dnem warstwą fibronektyny o stężeniu 20 μg/ml rozpuszczonej w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Pozostaw szalki do pokrycia powierzchni w okapie do hodowli komórkowych (około 20 minut).</li>
	<li>Zneutralizuj trypsynę, dodając 2 ml DMEM po odłączeniu komórek.</li>
	<li>Przenieść zawartość każdej studzienki do oznakowanej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i wirować z prędkością 90 x g przez 5 minut w wirówce z wirówką z wirnikiem wahadłowym. Odessać supernatant i ponownie zawiesić każdą osadkę komórkową w 1 000 μl DMEM za pomocą mieszania pipetą.</li>
	<li>Odessać mieszaninę fibronektyny ze szklanych naczyń i odpipetować 1 000 μl każdej zawiesiny komórek na szklane szalki.</li>
	<li>Po tym, jak komórki osiądą na dnie szklanych naczyń (~15 min), dodaj kolejny 1 ml DMEM + 10% FBS + 1% Pen-Strep do każdej studzienki i umieść w inkubatorze komórek. Pozwól ogniwom podłączyć i wysunąć czujnik przez co najmniej 18-24 h. 
	UWAGA: Komórki są transfekowane przy użyciu dostępnych w handlu odczynników do transfekcji kationów lipidowych (patrz Tabela Materiałów). Alternatywnie, stabilne linie komórkowe można wybrać za pomocą plazmidu z genem nadającym oporność na toksynę (plazmidy pcDNA dla Nesprin-TS i -HL są dostępne na stronie internetowej repozytorium DNA (patrz tabela materiałów) zapewniają komórkom wykazującym ekspresję oporności na genetycynę). Ponadto metody infekcji wirusowych (lentiwirus, retrowirus lub adenowirus) mogą być wykorzystane do ekspresji czujnika w komórkach, które są trudne do transfekcji.</li>
	<li>Oprócz Nesprin-TS, należy wykonać transfekcję dodatkowych komórek za pomocą kontroli zerowej siły Nesprin HL, jak opisano w krokach 2.1-2.12; TSmod może być również używany jako sterowanie o zerowej sile i powinien wykazywać podobny FRET do Nesprin-HL.</li>
	<li>Komórki transfekcyjne z mTFP1 i wenus w celu wygenerowania spektralnych odcisków palców (patrz krok 4). 
	UWAGA: mTFP1 i Wenus zazwyczaj ulegają ekspresji na wyższych poziomach niż Nesprin-TS i w związku z tym może być konieczne transfekowanie mniejszych ilości DNA, aby osiągnąć podobne poziomy ekspresji.</li>
</ol>
3. Sprawdź skuteczność transfekcji
<ol>
	<li>Około 18-24 godziny po zakończeniu transfekcji użyj odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego, aby zbadać skuteczność transfekcji, porównując liczbę komórek fluorescencyjnych z całkowitą liczbą komórek w polu widzenia (zwykle 5-30%).
	<ol>
		<li>Użyj mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w częstotliwość wzbudzenia bliską 462 nm (mTFP1) lub 525 nm (Wenus) i filtr emisyjny wyśrodkowany w pobliżu 492 nm (mTFP1) lub 525 nm (Wenus). 
		UWAGA: Alternatywnie, zestawy filtrów GFP będą rejestrować kombinację emisji mTFP1 i Venus i pozwolą na potwierdzenie skuteczności transfekcji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obraz żywych komórek w ciągu 48 godzin po transfekcji.
	<ol>
		<li>Alternatywnie, utrwal komórki w 4% paraformaldehydzie (w PBS z wapniem i magnezem) przez 5 minut, przechowuj w PBS i view po 48 h8. 
		UWAGA: Po upływie 48 godzin jakość i siła sygnału zanika. Utrwalenie komórek zachowuje ich stan, w tym wyrażanie BRET8; jednak komórki powinny być obrazowane tylko w PBS, ponieważ podłoże montażowe może mieć wpływ na FRET14. Stałe komórki można porównywać tylko z innymi stałymi komórkami, ponieważ może nastąpić zmiana wyrażenia. 
		Uwaga: Paraformaldehyd jest toksyczny. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przechwytywanie spektralnych odcisków palców mTFP1 i fluoroforów Wenus w celu rozmieszania widmowego
<ol>
	<li>W kapturze do hodowli komórkowej zastąp pożywkę komórkową pożywką do obrazowania (buforowaną przez HEPES) uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą.</li>
	<li>Umieść viewnaczynia w stoliku mikroskopu konfokalnego o kontrolowanej temperaturze (37 °C).</li>
	<li>Umieść szklaną miskę z komórkami transfekowanymi mTFP1 nad obiektywem olejowym w 60-krotnym powiększeniu z aperturą numeryczną 1.4. 
	UWAGA: Olej jest używany w laserowym mikroskopie skaningowym na obiektywie 60X, aby jak najbardziej przypominał współczynnik załamania światła szklanego podłoża. Olejek umieszcza się na wierzchu soczewki obiektywu i ma bezpośredni kontakt ze szklanym szkiełkiem nakrywkowym.</li>
	<li>Zlokalizuj komórki wykazujące ekspresję mTFP1 ze źródłem wzbudzenia 458 nm i filtrem pasmowoprzepustowym emisji wyśrodkowanym na 500 nm.</li>
	<li>Mając komórkę fluorescencyjną w polu widzenia, wybierz tryb detekcji spektralnej ("Tryb Lambda" w używanym tutaj oprogramowaniu) i uchwyć obraz spektralny (Rysunek 3-1); uwzględnij wszystkie częstotliwości powyżej 458 nm w krokach co 10 nm (Rysunek 3-3). Wybierz jasny obszar fluorescencyjny (ROI) w komórce (promień 20 pikseli). 
	UWAGA: Kształt widmowy ROI wyrażającego mTFP1 powinien pozostać względnie stały w całej komórce. Jeśli kształt znacznie się różni, ponownie dostosuj ustawienia lasera i wzmocnienia, aby poprawić stosunek sygnału do szumu.</li>
	<li>Dodaj średnią ROI fluorescencyjną, znormalizowaną intensywność do bazy danych spektralnej, klikając "zapisz widma w bazie danych".</li>
	<li>Zoptymalizuj moc i wzmocnienie lasera tak, aby uzyskać dobry stosunek sygnału do szumu. Ustawienia będą się różnić w zależności od sprzętu. Używając niefluorescencyjnych, nietransfekowanych komórek jako odniesienia tła, zwiększaj wzmocnienie i moc, aż komórki będą jasne, ale nie poza zakresem dynamicznym detektora (punkt nasycenia). Komórki tła nie powinny mieć wykrywalnej fluorescencji po uśrednieniu.</li>
	<li>Powtórz ten proces dla komórek transfekowanych przez Wenus z następującymi wyjątkami:
	<ol>
		<li>Upewnij się, że częstotliwość wzbudzenia wynosi 515 nm i że filtr pasmowoprzepustowy jest wyśrodkowany w pobliżu 530 nm podczas lokalizowania komórek wykazujących ekspresję Wenus.</li>
		<li>W "trybie widmowym" użyj częstotliwości wzbudzenia 515 nm zamiast 458 nm.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Przechwytywanie niezmieszanych obrazów
<ol>
	<li>Przełącz tryb przechwytywania na "Unmixtr Spectral Unmixing".</li>
	<li>Dodaj widmowe odciski palców Wenus i mTFP1 do kanałów rozmieszania (Ryc. 3, Strzałka-2).</li>
	<li>Ustaw laser wzbudzający z powrotem na źródło argonu o długości fali 458 nm.</li>
	<li>Umieść Nesprin-TS viewnaczynie nad obiektywem olejowym 60X.</li>
	<li>Po ustawieniu ostrości na ogniwie fluorescencyjnym o wystarczająco jasnym wyrazie, dostosuj wzmocnienie i moc lasera, aby zoptymalizować stosunek sygnału do szumu. 
	UWAGA: Ponieważ wydajność FRET Nesprin-TS jest bliska 20%, niezmieszany obraz Wenus powinien być znacznie ciemniejszy niż niezmieszany obraz mTFP1. Po iteracyjnym ustaleniu akceptowalnego ustawienia mocy i wzmocnienia, parametry te muszą pozostać stałe dla wszystkich zarejestrowanych obrazów.</li>
	<li>Uchwyć co najmniej 15-20 obrazów komórek Nesprin-TS o stosunkowo podobnej jasności i unikaj nadmiernego nasycenia pikseli (wszystkie nasycone piksele są usuwane podczas przetwarzania obrazu).</li>
	<li>Powtórz proces przechwytywania obrazu za pomocą komórek Nesprin-HL przy identycznych parametrach obrazowania.</li>
</ol>
6. Przetwarzanie obrazu i analiza proporcji obrazu
<ol>
	<li>Korzystając z oprogramowania ImageJ (FIJI) o otwartym kodzie źródłowym (http://fiji.sc/), otwórz obrazy w formacie natywnym za pomocą BioFormats Reader.</li>
	<li>Wstępnie przedrukuj obrazy i oblicz proporcje obrazów przy użyciu wcześniej ustalonych protokołów15.</li>
</ol>

<ol><li>Conway, D. E., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-dependent+cellular+mechanotransduction+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Flow-dependent cellular mechanotransduction in atherosclerosis.</a> J Cell Sci. 126, Pt 22 5101-5109 (2013).</li>
<li>Arsenovic, P. T., Ramachandran, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nesprin-2G%2C+a+Component+of+the+Nuclear+LINC+Complex%2C+Is+Subject+to+Myosin-Dependent+Tension%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension.</a> Biophys J. 110 (1), 34-43 (2016).</li>
<li>Grashoff, C., Hoffman, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+mechanical+tension+across+vinculin+reveals+regulation+of+focal+adhesion+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics.</a> Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).</li>
<li>Austen, K., Ringer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+rigidity+sensing+by+talin+isoform-specific+mechanical+linkages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">Extracellular rigidity sensing by talin isoform-specific mechanical linkages.</a> Nat Cell Bio. 17 (12), 1597-1606 (2015).</li>
<li>Meng, F., Sachs, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+dynamic+cytoplasmic+forces+with+a+compliance-matched+FRET+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Visualizing dynamic cytoplasmic forces with a compliance-matched FRET sensor.</a> J Cell Sci. 124, Pt 2 261-269 (2011).</li>
<li>Borghi, N., Sorokina, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-cadherin+is+under+constitutive+actomyosin-generated+tension+that+is+increased+at+cell-cell+contacts+upon+externally+applied+stretch%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">E-cadherin is under constitutive actomyosin-generated tension that is increased at cell-cell contacts upon externally applied stretch.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (31), 12568-12573 (2012).</li>
<li>Cai, D., Chen, S. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+Feedback+through+E-Cadherin+Promotes+Direction+Sensing+during+Collective+Cell+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanical Feedback through E-Cadherin Promotes Direction Sensing during Collective Cell Migration.</a> Cell. 157 (5), 1146-1159 (2014).</li>
<li>Conway, D. E., Breckenridge, M. T., Hinde, E., Gratton, E., Chen, C. S., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+Shear+Stress+on+Endothelial+Cells+Modulates+Mechanical+Tension+across+VE-Cadherin+and+PECAM-1%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Bio+CB%22%5BJournal%5D)">Fluid Shear Stress on Endothelial Cells Modulates Mechanical Tension across VE-Cadherin and PECAM-1.</a> Curr Bio CB. 23 (11), 1024-1030 (2013).</li>
<li>Brenner, M. D., Zhou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spider+Silk+Peptide+Is+a+Compact%2C+Linear+Nanospring+Ideal+for+Intracellular+Tension+Sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Spider Silk Peptide Is a Compact, Linear Nanospring Ideal for Intracellular Tension Sensing.</a> Nano Lett. 16 (3), 2096-2102 (2016).</li>
<li>Rothenberg, K. E., Neibart, S. S., LaCroix, A. S., Hoffman, B. D. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/282499670_Controlling_Cell_Geometry_Affects_the_Spatial_Distribution_of_Load_Across_Vinculin">Controlling Cell Geometry Affects the Spatial Distribution of Load Across Vinculin.</a> Cell Mol Bioeng. 8 (3), 364-382 (2015).</li>
<li>Ostlund, C., Folker, E. S., Choi, J. C., Gomes, E. R., Gundersen, G. G., Worman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+and+molecular+interactions+of+linker+of+nucleoskeleton+and+cytoskeleton+%28LINC%29+complex+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Dynamics and molecular interactions of linker of nucleoskeleton and cytoskeleton (LINC) complex proteins.</a> J Cell Sci. 122, Pt 22 4099-4108 (2009).</li>
<li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> J Vis Exp. (6), e253(2007).</li>
<li>Zhang, S., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purifying+plasmid+DNA+from+bacterial+colonies+using+the+QIAGEN+Miniprep+Kit%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit.</a> J Vis Exp. (6), e247(2007).</li>
<li>Rodighiero, S., Bazzini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation%2C+mounting+and+sealing+with+nail+polish+of+cell+specimens+lead+to+incorrect+FRET+measurements+using+acceptor+photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Physiol.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Fixation, mounting and sealing with nail polish of cell specimens lead to incorrect FRET measurements using acceptor photobleaching.</a> Cell. Physiol. Biochem. 21 (5-6), 489-498 (2008).</li>
<li>Kardash, E., Bandemer, J., Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+protein+activity+in+live+embryos+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging protein activity in live embryos using fluorescence resonance energy transfer biosensors.</a> Nat Protoc. 6 (12), 1835-1846 (2011).</li>
<li>Vaziri, A., Mofrad, M. R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+and+deformation+of+the+nucleus+in+micropipette+aspiration+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Mechanics and deformation of the nucleus in micropipette aspiration experiment.</a> J Biomech. 40 (9), 2053-2062 (2007).</li>
<li>Wang, N., Naruse, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+behavior+in+living+cells+consistent+with+the+tensegrity+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Mechanical behavior in living cells consistent with the tensegrity model.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (14), 7765-7770 (2001).</li>
<li>Nagayama, K., Yahiro, Y., Matsumoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+fibers+stabilize+the+position+of+intranuclear+DNA+through+mechanical+connection+with+the+nucleus+in+vascular+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Stress fibers stabilize the position of intranuclear DNA through mechanical connection with the nucleus in vascular smooth muscle cells.</a> FEBS letters. 585 (24), 3992-3997 (2011).</li>
<li>Luxton, G. W. G., Gomes, E. R., Folker, E. S., Vintinner, E., Gundersen, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+arrays+of+nuclear+envelope+proteins+harness+retrograde+actin+flow+for+nuclear+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Linear arrays of nuclear envelope proteins harness retrograde actin flow for nuclear movement.</a> Science. 329 (5994), New York, N.Y. 956-959 (2010).</li>
<li>Chen, Y., Mauldin, J. P., Day, R. N., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+spectral+FRET+imaging+microscopy+for+monitoring+nuclear+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Characterization of spectral FRET imaging microscopy for monitoring nuclear protein interactions.</a> J Microsc. 228, Pt 2 139-152 (2007).</li>
<li>Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Berginski, M. E., Urs, A. N., Hoffman, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction%2C+imaging%2C+and+analysis+of+FRET-based+tension+sensors+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Construction, imaging, and analysis of FRET-based tension sensors in living cells.</a> Methods Cell Biol. , (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Powyżej przedstawiono metodę i demonstrację obrazowania napięcia mechanicznego w żywych komórkach Nesprin-2G, białka w jądrowym kompleksie LINC. Przed tymi pracami stosowano różne techniki, takie jak aspiracja mikropipet, cytometria magnetyczna i mikroskopowa ablacja laserowa, w celu naprężenia jądra komórkowego i pomiaru właściwości jego materiału sypkiego 16,17,18. Jednak do czasu naszych ostatnich prac żadne badan...

Wrażliwe na siłę, genetycznie kodowane czujniki FRET pojawiły się ostatnio jako ważne narzędzie do pomiaru sił rozciągających w żywych komórkach, dostarczając wglądu w to, jak siły mechaniczne są przykładane do białek1,2,3,4. Dzięki tym narzędziom naukowcy mogą nieinwazyjnie obrazować siły wewnątrzkomórkowe w żywych komórkach za pomocą konwencjonalnych mikroskopów fluorescencyjnych. Czujniki te składają się z pary FRET (białka fluorescencyjne donora i akceptora, najczęściej niebieskiego donora i żółtego akceptora) oddzielonych elastycznym peptydem3. W przeciwieństwie do znakowania C- lub N-końcowego, czujnik ten jest umieszczany w wewnętrznym miejscu białka w celu zmierzenia siły mechanicznej przenoszonej przez białko, zachowując się jak tensometr molekularny. Zwiększone napięcie mechaniczne w poprzek czujnika powoduje zwiększenie odległości między parą FRET, co skutkuje zmniejszeniem FRET3. W rezultacie FRET jest odwrotnie proporcjonalny do siły rozciągającej.
Te fluorescencyjne czujniki zostały opracowane dla ogniskowych białek adhezyjnych (vinculin3 i talin4), białek cytoszkieletu (α-aktynina5) i białek połączenia komórka-komórka (E-Cadherin6,7, VE-Cadherin8, oraz PECAM8). Najczęściej używany i dobrze scharakteryzowany elastyczny łącznik w tych biosensorach jest znany jako TSmod i składa się z powtarzalnej sekwencji 40 aminokwasów (GPGGA)8, która pochodzi z białka wiciowca z pajęczej nici. Wykazano, że TSmod zachowuje się jak liniowa elastyczna nanosprężyna, z reakcją FRET na 1 do 5 pN siły rozciągającej3. Różne długości wici mogą być używane do zmiany zakresu dynamiki TSmod FRET-force sensitivity9. Oprócz wiciowatych, spektryna repeats5 i peptyd główki villin (znany jako HP35)4 zostały użyte jako elastyczne peptydy między parami FRET-ów w biosensorach o podobnej sile4. Wreszcie, niedawny raport wykazał, że TSmod może być również używany do wykrywania sił ściskających10.
Niedawno opracowaliśmy czujnik siły dla łącznika białka kompleksu nukleo-cytoszkieletu (LINC) Nesprin-2G, używając TSmod wstawionego do wcześniej opracowanego skróconego białka Nesprin-2G, znanego jako mini-Nesprin2G (Rysunek 2C), który zachowuje się podobnie do endogennego Nesprin-2G11. Kompleks LINC zawiera wiele białek, które prowadzą z zewnątrz do wnętrza jądra, łącząc cytoszkielet cytoplazmatyczny z blaszką jądrową. Nesprin-2G jest białkiem strukturalnym wiążącym się zarówno z cytoszkieletem aktynowym w cytoplazmie, jak i z białkami SUN w przestrzeni okołojądrowej. Korzystając z naszego biosensora, byliśmy w stanie wykazać, że Nesprin-2G podlega zależnemu od aktomiozyny napięciu w fibroblastach NIH3T32. Był to pierwszy raz, kiedy siła została bezpośrednio zmierzona w białku w jądrowym kompleksie LINC i prawdopodobnie stanie się ważnym narzędziem do zrozumienia roli siły w jądrze w mechanobiologii.
Poniższy protokół zawiera szczegółową metodologię korzystania z czujnika siły Nesprin-2G, w tym ekspresję czujnika napięcia Nesprin (Nesprin-TS) w komórkach ssaków, a także akwizycję i analizę obrazów FRET komórek wyrażających Nesprin-TS. Za pomocą odwróconego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w detektor spektralny przedstawiono opis sposobu pomiaru uczulonej emisji FRET za pomocą rozmieszania spektralnego i ratiometrycznego obrazowania FRET. Wyjściowe obrazy ratiometryczne mogą być używane do dokonywania względnych porównań sił ilościowych. Chociaż protokół ten koncentruje się na ekspresji Nesprin-TS w fibroblastach, łatwo przystosowuje się do innych komórek ssaków, w tym zarówno linii komórkowych, jak i komórek pierwotnych. Co więcej, protokół ten, w odniesieniu do akwizycji obrazu i analizy FRET, można łatwo dostosować do innych bioczujników siły opartych na FRET, które zostały opracowane dla innych białek.

<table><tbody><tr><td>Nesprin-TS DNA</td><td>Addgene</td><td>68127</td><td>Pobieranie z https://www.addgene.org/68127/</td></tr> <tr><td>Nesprin-HL DNA</td><td>Addgene</td><td>68128</td><td>Pobieranie z https://www.addgene.org/68128/</td></tr> <tr><td>mTFP1 DNA</td><td>Addgene</td><td>54613</td><td>Pobieranie z https://www.addgene.org/54613/</td></tr> <tr><td>mVenus DNA</td><td>Addgene</td><td>27793</td><td>Pobieranie z https://www.addgene.org/27793/</td></tr><tr><td>TSmod DNA</td><td>Addgene</td><td>26021</td><td>Pobieranie z https://www.addgene.org/26021/</td></tr> <tr><td>Competent Cells</td><td>Bioline</td><td>BIO-85026</td><td></td></tr><tr><td>Płynne podłoże LB</td><td>ThermoFisher</td><td>10855001</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10855001</td></tr><tr><td>Stałe płytki do hodowli bakterii LB</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5667</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l5667?lang=en&region=US</td></tr> Spektrofotometr <tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Biorad</td><td>273 BR 07335</td><td></td></tr><tr><td>Kuweta kwarcowa</td> SmartSpec Plus <td>Kuweta</td><td>Biorad</td><td>1702504</td> do</tr><tr><td>zestawu do izolacji DNA</td> SmartSpec Plus <td>Macherey-Nagel</td><td>740412.5</td><td>NucleoBond Xtra Midi Plus</td></tr><tr><td>6-dołkowe naczynie do hodowli komórkowych</td><td>Falcon-Corning</td><td>353046</td><td>Multiwell 6-dołkowe naczynie do hodowli polistrenowych</td></tr><tr><td>Zmodyfikowane podłoże Dulbecco, pożywka komórkowa (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>DMEM(1x)</td></tr><tr><td>Bovine Serum</td><td>Life Technologies</td><td>16170-078</td><td></td></tr><tr><td>zredukowana pożywka komórkowa w surowicy</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>Zredukowana pożywka w surowicy, "optymem"</td></tr><tr><td>Lipid Carrier Solution</td><td>invitrogen</td><td>11668-019</td><td>Odczynnik lipidowy, "Lipofectamina 2000"</td></tr><tr><td>1,5 ml sterylna plastikowa probówka</td><td>Denville</td><td>c2170</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>0,25% Trypsyna-EDTA (1x)</td></tr> <tr><td>szklana płytka do oglądania</td> mikroskopu <td>In Vitro Scientific</td><td>D35-20-1.5-N</td><td>35 mm Naczynie z 20 mm Studnia dolna #1,5 szklana</td></tr><tr><td>Fibronektyna</td><td>ThermoFisher</td><td>33016015</td><td>fibronektyna białko ludzkie, sól</td></tr><tr><td>fizjologiczna buforowana fosforanem w osoczu (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco</td></tr><tr><td>15 ml sterylna probówka wirówkowa</td><td>Greiner bio-one</td><td>188261</td><td></td></tr><tr><td>wirówka z wirnikiem wahadłowym&nbsp;</td><td>Thermo electron</td><td>Centra CL2</td><td>Rotor wahadłowy termo elektron 236</td></tr> kaptur <tr><td>bezpieczeństwa biologicznego do hodowli komórkowych</td><td>Forma Scientific</td><td>1284</td><td></td></tr><tr><td>klimatyzowany inkubator do hodowli komórkowych</td><td>ThermoFisher</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>odwrócony szerokokątny mikroskop fluorescencyjny LED</td><td>Technologie życiowe</td><td>EVOS FL</td><td></td></tr><tr><td>Clear HEPES buforowane nośniki</td><td>obrazowe Sondy molekularne</td><td></td><td></td>A14291DJ</tr><tr><td>Technologie życia</td><td>płodu bydlęcego</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalne konfokalne z kontrolowaną temperaturą i odwróconymi źródłami lasera o długości fali 458 i 515 nm&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>&nbsp; LSM 710-w/spektralny detektor</td><td></td>META</tr><tr><td>Outgrowth Media</td><td>Newengland Biolabs</td><td>B9020s</td><td></td></tr><tr><td>NIH 3T3 Fibroblasty</td><td>ATCC</td><td>CRL-1658</td><td></td></tr></tbody></table>

protokół wykorzystania biosensorów förster resonance energy transfer (fret) do pomiaru sił mechanicznych w jądrowym kompleksie linc

A Protocol for Using F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

Przypuszcza się, że kompleks LINC jest krytyczną strukturą, która pośredniczy w przenoszeniu sił mechanicznych z cytoszkieletu do jądra. Nesprin-2G jest kluczowym składnikiem kompleksu LINC, który łączy cytoszkielet aktynowy z białkami błonowymi (białkami domeny SUN) w przestrzeni okołojądrowej. Te białka błonowe łączą się z laminami wewnątrz jądra. Niedawno sonda Förster Resonance Energy Transfer (FRET) została sklonowana do mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (czujnik napięcia)) i wykorzystana do pomiaru napięcia w Nesprin-2G w żywych fibroblastach NIH3T3. W artykule opisano proces wykorzystania Nesprin-TS do pomiaru sił kompleksu LINC w fibroblastach NIH3T3. W celu wyodrębnienia informacji FRET z Nesprin-TS przedstawiono również zarys spektralnego miksowania surowych obrazów spektralnych z akceptorowymi i donorowymi kanałami fluorescencyjnymi. Za pomocą oprogramowania typu open source (ImageJ) obrazy są wstępnie przetwarzane i przekształcane w obrazy ratiometryczne. Na koniec przedstawiono dane FRET dotyczące Nesprin-TS wraz ze strategiami porównywania danych z różnych grup eksperymentalnych.

Zgodnie z powyższym protokołem, plazmidowe DNA pobrano z repozytorium DNA i wprowadzono do komórek E. coli. Wyselekcjonowano komórki E. coli wykazujące ekspresję DNA sensora z płytek z pożywką LB/Ampicyliną, a następnie namnożono je w płynnej pożywce LB. Po amplifikacji wektorów plazmidy DNA oczyszczono w buforze TRIS-EDTA przy użyciu standardowego, dostępnego komercyjnie zestawu do izolacji DNA. Za pomocą spektrofotometru określono ilość oczyszczonego DNA, sprowadzając ...

Ostatnio opracowano wiele biosensorów siły opartych na FRET, które umożliwiają specyficzne dla białek rozwiązywanie siły wewnątrzkomórkowej. W tym protokole pokazujemy, w jaki sposób jeden z tych czujników, zaprojektowany dla łącznika białka kompleksu nukleoszkielet-cytoszkielet (LINC) Nesprin-2G, może być wykorzystany do pomiaru sił aktomiozyny w jądrowym kompleksie LINC.

Protokół wykorzystania biosensorów Förster Resonance Energy Transfer (FRET) do pomiaru sił mechanicznych w jądrowym kompleksie LINC

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. ...

Ogólnym celem tej procedury jest określenie sił działających na łącznik cytoszkieletu nukleoszkieletu lub kompleksu LINC za pomocą mikroskopii FRET w żywych komórkach za pomocą bioczujnika zaprojektowanego dla białka kompleksu LINC, nesprin-2G. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie mechanotransdukcji, takie jak siły działające na białka w jądrze żywych komórek oraz jak siły te zmieniają się w różnych warunkach. Główną zaletą tej techniki jest jej zdolność do pomiaru bardzo małych poziomów siły działającej na białka i żywe komórki.Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały problemy z robieniem zdjęć. Optymalizacja mocy i wzmocnienia lasera mikroskopu w celu uzyskania dobrego sygnału między wszystkimi grupami eksperymentalnymi jest trudna. Na początek hoduj komórki blastyczne z włókna NIH 3T3 do zbiegu od 70% do 90% w sześciodołkowym naczyniu do hodowli komórkowych w standardowym inkubatorze do hodowli komórkowych z regulacją temperatury i CO2.W kapturze do hodowli komórkowych usunąć pożywkę i przepłukać każdą studzienkę około 1 mililitrem zredukowanej pożywki komórkowej surowicy. Dodać 800 mikrolitrów zredukow

a-protocol-for-using-frster-resonance-energy-transfer-fret-force

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W niniejszym artykule opisujemy zastosowanie pęset magnetycznych do badania wpływu siły na proteolizę enzymatyczną na poziomie pojedynczej cząsteczki w sposób wysoce równoległy.

Multipleksowe pomiary proteolizy pojedynczych cząsteczek siłowych przy użyciu pęset magnetycznych

Celulosomy to kompleksy wieloenzymatyczne przeznaczone do trawienia celulozy. SMFS oparty na AFM wykorzystano do zbadania właściwości mechanicznych i konfiguracji fałdowania zespołów białkowych związanych z celulozonami. Przedstawiamy kompletny przepływ pracy do immobilizacji białek, pozyskiwania i analizy danych w celu zbadania interakcji poszczególnych kompleksów receptor-ligand zaangażowanych w składanie celulasomów.

Badanie układów receptor-ligand celulosomu za pomocą spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek opartej na AFM

Przedstawiono opis kalibracji zintegrowanych czujników biologicznych (FIBS) Förster Resonance Energy Transfer do profilowania metabolicznego in situ. FIBS może być używany do pomiaru wewnątrzkomórkowych poziomów metabolitów w sposób nieinwazyjny, pomagając w rozwoju modeli metabolicznych i wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych warunków bioprocesowych.

Nieinwazyjne profilowanie metaboliczne z wykorzystaniem FIBS

Opisujemy technikę jednoczesnego pomiaru kinetyki wiązania pojedynczego receptora-liganda o regulowanej sile oraz obrazowania w czasie rzeczywistym sygnalizacji wapniowej w pojedynczym limfocycie T.

Sonda siły biomembrany fluorescencyjnej: jednoczesna kwantyfikacja kinetyki receptor-ligand i sygnalizacji wewnątrzkomórkowej indukowanej wiązaniem na pojedynczej komórce

W tym protokole opisujemy metodę mikropipet, która bezpośrednio przykłada kontrolowaną siłę do jądra w żywej komórce. Test ten pozwala na zbadanie właściwości mechanicznych jądra w żywej, przylegającej komórce.

Sonda siły bezpośredniej do pomiaru integracji mechanicznej między jądrem a cytoszkieletem

Tutaj prezentujemy protokół jednoczesnego użycia czujników napięcia opartych na transferze energii rezonansu Förstera do pomiaru obciążenia białkami i odzyskiwania fluorescencji po fotowybielaniu w celu pomiaru dynamiki białek, umożliwiając pomiar dynamiki białek wrażliwych na siłę w żywych komórkach.

Pomiar dynamiki białek wrażliwych na siłę w żywych komórkach przy użyciu kombinacji technik fluorescencyjnych

Prezentowany tutaj jest obszerny protokół do przeprowadzania ultraszybkich eksperymentów z zaciskiem siły na procesyjnych silnikach miozyny-5, który można łatwo rozszerzyć do badania innych klas silników procesowych. Protokół wyszczególnia wszystkie niezbędne kroki, od ustawienia aparatury doświadczalnej po przygotowanie próbki, gromadzenie danych i analizę.

Analiza właściwości mechanoenzymatycznych miozyn procesowych za pomocą ultraszybkiej spektroskopii siłowo-zaciskowej

Badanie szczegółowo opisuje metodologię mapowania FRET, w tym wybór miejsc etykietowania, wybór barwników, akwizycję i analizę danych. Metodologia ta jest skuteczna w określaniu miejsc wiązania, zmian konformacyjnych i ruchów dynamicznych w układach białkowych i jest najbardziej użyteczna, jeśli jest wykonywana w połączeniu z istniejącymi informacjami strukturalnymi 3D.

Mapowanie transferu energii rezonansu Förster: nowa metodologia wyjaśniająca globalne cechy strukturalne

Zespołowa spektroskopia sił (EFS) to solidna technika mechanicznego rozkładania i wykrywania w czasie rzeczywistym zestawu struktur biomolekularnych w polach biofizycznych i biosensorycznych.

Spektroskopia sił zespołowych za pomocą sił ścinających

Biosensory współpracują ze złożonymi środowiskami biologicznymi i przeprowadzają ukierunkowaną detekcję, łącząc wysokoczułe czujniki z wysoce specyficznymi sondami przytwierdzonymi do czujnika poprzez modyfikację powierzchni. W niniejszym materiale demonstrujemy funkcjonalizację powierzchni krzemionkowych czujników optycznych biotyną przy użyciu czynników sprzęgających na bazie silanów w celu stworzenia pomostu między czujnikiem a środowiskiem biologicznym.

Przyłączanie sond biologicznych do krzemionkowych biosensorów optycznych z użyciem silanowych środków sprzęgających

Poznaj metodę pomiaru sił mechanicznych w kompleksie LINC za pomocą biosensorów FRET w żywych komórkach NIH 3T3. Technika ta pozwala badać mechanotransdukcję i dynamikę sił jądrowych.

Protokół wykorzystania biosensorów Förster Resonance Energy Transfer (FRET) do pomiaru sił mechanicznych w jądrowym kompleksie LINC (Wideo) | JoVE Journal

Protokół wykorzystania biosensorów Förster Resonance Energy Transfer (FRET) do pomiaru sił mechanicznych w jądrowym kompleksie LINC

Przeglądaj więcej filmów