ACT-PRESTO: Biologiczne metody oczyszczania tkanek i znakowania immunologicznego w obrazowaniu objętościowym

Ogólnym celem tej procedury jest uzyskanie oczyszczonej, nienaruszonej tkanki i wizualizacja jej trójwymiarowych informacji molekularnych za pomocą metod znakowania immunologicznego. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurobiologii i biologii rozwoju, takie jak połączenia neuronalne, kategoryzacja molekularna i zmiany strukturalne podczas rozwoju. Główną zaletą tej techniki jest to, że tkanka wyraźnie umożliwia analizę dużych próbek na poziomie subkomórkowym bez konieczności dzielenia ich na sekcje.

Aby rozpocząć tę procedurę, inkubuj utrwalone narządy w roztworze monomeru hydrożelowego A4P0 w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 12 do 24 godzin, delikatnie wstrząsając. Następnie dodaj pięć mililitrów roztworu monomeru hydrożelowego do 10-mililitrowej probówki z okrągłym dnem. Następnie przenieś do niego próbkę mózgu myszy i owiń górną część rurki Parafilmem.

Następnie przez minutę przepuszczaj azot przez ciecz z próbką mózgu w infuzji hydrożelu. Szybko i szczelnie zamknąć probówkę zawierającą próbkę. Przenieś probówkę do łaźni wodnej na dwie godziny.

Następnie sprawdź lepkość hydrożelu, a następnie krótko przemyj spolimeryzowaną próbkę 0,1 X PBS, aby usunąć nadmiar hydrożelu. Na tym etapie przenieś spolimeryzowaną próbkę do pojemnika na tkanki. I umieść pojemnik na chusteczki w komorze ETC.

Następnie napełnić komorę ETC buforem ETC za pomocą pompy perystaltycznej. Ustaw warunki ETC i włącz go. Plasterki mózgu o grubości od jednego do dwóch milimetrów są usuwane w ciągu dwóch godzin.

A cały mózg jest wystarczająco oczyszczony w ciągu pięciu do sześciu godzin. Następnie przenieś próbkę do 50-mililitrowej stożkowej probówki z 45 mililitrami 0,1 X PBS. Przemyć próbkę kilka razy 0,1 X PBS, aż nie będzie widać pęcherzyków, gdy probówka jest krótko potrząsana, aby potwierdzić całkowite usunięcie SDS.

Aby wykonać c-PRESTO, przenieś małą próbkę do 1,5-mililitrowej probówki. Dodać 500 mikrolitrów roztworu rozcieńczającego przeciwciała o współczynniku rozcieńczenia od jednego do 500 dla przeciwciała kolagenu typu czwartego i odwirować probówkę pod ciśnieniem 600 razy g przez dwie godziny. Następnie przepłukać zabarwioną próbkę 0,1 X PBS przez odwirowanie w ilości 600 razy g przez 30 minut.

Następnie dodaj 500 mikrolitrów roztworu rozcieńczającego przeciwciało o współczynniku rozcieńczenia od jednego do 500 dla sprzężonego z Cy3 przeciwciała drugorzędowego Anti Rabbit i odwiruj je 600 razy g przez dwie godziny. Następnie przepłukać zabarwioną próbkę 0,1 X PBS przez odwirowanie w temperaturze 600 razy g przez 30 minut. Aby wykonać s-PRESTO dla większych tkanek, przenieś próbkę do strzykawki połączonej z zaworem trójdrogowym w pozycji zamkniętego zaworu.

Dodaj od pięciu do siedmiu mililitrów roztworu rozcieńczającego przeciwciała o współczynniku rozcieńczenia od jednego do 500 dla przeciwciała kolagenu typu czwartego. Następnie dodaj roztwór przeciwciała do próbki, otwierając zawór. Następnie, w pozycji otwartego zaworu, ustaw tłok strzykawki w pozycji 17 mililitrów, aby zapewnić wystarczająco dużo miejsca na ruch pobierania infuzji.

Następnie zamknij zawór trójdrogowy po zakończeniu ustawiania strzykawki. Umieścić strzykawkę zawierającą próbkę na pompie strzykawkowej. Ustawić warunki pompy strzykawkowej na objętość pobierania infuzji wynoszącą dziesięć mililitrów na minutę i czterominutowy czas przerwy w trybie cyklu ciągłego.

Następnie uruchom pompę strzykawkową na trzy do 24 godzin w temperaturze pokojowej. Następnie otwórz zawór trójdrogowy i zastąp roztwór 0,1 X PBS. Przepłukać zabarwioną próbkę dwukrotnie 0,1 X PBS za każdym razem przez jedną godzinę za pomocą pompy strzykawkowej.

Następnie zastąp PBS roztworem rozcieńczania przeciwciał zawierającym sprzężone przeciwciało drugorzędowe Cy3 Anti Rabbit i uruchom pompę strzykawkową na trzy do 24 godzin. Następnie otwórz zawór trójdrogowy i zastąp roztwór 0,1 X PBS. Przed przystąpieniem do obrazowania należy inkubować wybarwioną próbkę w odpowiedniej ilości roztworu do montażu sześciennego przez godzinę w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając.

Po godzinie zastąp roztwór świeżym roztworem do montażu sześciennego i inkubuj przez dodatkową godzinę. Ponieważ przeciwciała nie mogą przenikać do gęstych tkanek przez dyfuzję, metody immunoznakowania PRESTO są zaprojektowane tak, aby aktywnie infuzjować makrocząsteczki i dostarczać odczynniki do gęstych tkanek. Zastosowanie sił odśrodkowych przy użyciu standardowej wirówki stołowej znacznie ułatwiło dostarczanie przeciwciał.

Zastosowanie przepływu konwekcyjnego za pomocą pompy strzykawkowej również poprawiło penetrację przeciwciał. W przypadku s-PRESTO do dostarczenia przeciwciał użyto pompy strzykawkowej. Narządy myszy, takie jak nerki i wątroba, zostały oznaczone kolagenem typu 4.

W porównaniu z konwencjonalnymi metodami, trzy godziny c lub s-PRESTO znacznie zwiększają głębokość etykietowania. W nerkach i wątrobie głębokość osi Z sięga od 300 do 350 mikrometrów lub głębiej w próbkach PRESTO , podczas gdy próbki kontrolne są znakowane na głębokości zaledwie 40 do 50 mikrometrów. Po opanowaniu, techniki te można wykonać w ciągu jednego dnia dla tkanki, jeśli są wykonywane prawidłowo.

Podejmując tę procedurę, należy pamiętać o wyraźnym zachowaniu czasu utrwalania tkanki Emulsja monomeru hydrożelowego i tkanki elektroforetycznej. Po procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak znakowanie immunologiczne, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak analiza dynamiki komórkowej i identyfikacja gniazda neuronalnego w wielu narządach. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom z dziedziny nauk medycznych do badania diagnostyki chorób.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zatapiać hydrożel i polimeryzować tkanki. Nie zapominaj, że praca z roztworem monomeru hydrożelowego może być bardzo niebezpieczna i zawsze należy zachować ostrożność podczas wykonywania tej procedury.