Name: ACT-PRESTO: Biologiczne metody oczyszczania tkanek i znakowania immunologicznego w obrazowaniu objętościowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Poznaj metodę ACT-PRESTO do oczyszczania tkanek i immunoznakowania w obrazowaniu objętościowym. Technika ta umożliwia analizę podkomórkową dużych próbek bez konieczności ich sekcjonowania.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

To badanie było wspierane przez Program Badań nad Mózgiem za pośrednictwem Narodowej Fundacji Badawczej (NRF) finansowany przez koreańskie Ministerstwo Nauki, ICT, and Future Planning (NRF-2015M3C7A1028790).

Eksperymenty na zwierzętach muszą być zgodne ze wszystkimi odpowiednimi regulacjami rządowymi i instytucjonalnymi.
1. Przygotowanie odczynników
<ol>
	<li>Dla roztworu monomeru hydrożelowego (A4P0): Dodać 20 g akrylamidu do 450 ml 0,1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) i dostosować objętość do 500 ml za pomocą 0,1x PBS. 
	UWAGA: Monomery akrylamidu są toksyczne. Wszystkie zabiegi należy wykonywać pod wyciągiem przy użyciu środków ochrony osobistej, w tym osłony twarzy, fartucha laboratoryjnego, rękawic i butów z zakrytymi palcami.
	<ol>
		<li>Bezpośrednio przed użyciem dodać 100 mg dichlorowodorku 2,2'-Azobis[2-(2-imidazolin-2-ylo)propanu] do 40 ml roztworu monomeru hydrożelowego (A4P0) w stożkowej probówce o pojemności 50 ml pod wyciągiem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Do elektroforetycznego buforu oczyszczającego tkanki (ETC): Dodać 40 g dodecylosiarczanu sodu (SDS) i 12,37 g kwasu borowego do 800 ml dejonizowanegoH2O(dH2O). Doprowadzić pH do 8,5 za pomocą NaOH i dostosować objętość do 1 L z dodatkowym dH2O. 
	UWAGA: SDS jest szkodliwą substancją chemiczną; Dlatego obchodź się z nim ostrożnie.</li>
	<li>Dla roztworu CUBIC-mount: Dodać 250 g sacharozy, 125 g mocznika i 125 g N,N,N',N'--tetrakis(2-hydroksypropylo)etylenodiaminy do 150 ml dH2O i doprowadzić objętość do 500 ml za pomocądH 2O.</li>
</ol>
2. Przygotowanie i utrwalenie próbki
<ol>
	<li>Eutanazja myszy.
	<ol>
		<li>Przygotować alfakson (1 mg/kg mc.) i ksylazynę (0,5 mg/kg mc.) w tej samej strzykawce.</li>
		<li>Wstrzyknąć dootrzewnowo mieszaninę alfaksonu i ksylazyny i odczekać 3 minuty, aby mysz straciła przytomność.</li>
		<li>Poczekaj, aż znieczulona mysz przestanie reagować na bolesne bodźce, takie jak szczypanie ogona, zanim przejdziesz dalej. 
		ostrożność: Postępuj zgodnie z odpowiednimi wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi obchodzenia się ze zwierzętami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Perfuzja przezsercowa myszy ze 100 ml 0,9% roztworu NaCl (pH 7,4-7,5) zawierającego heparynę (100 U/ml) w celu wykrwawienia, a następnie 100 ml 4% paraformaldehydu (PFA) w 1x PBS (pH 7,4)14, 
	ostrożność: Roztwór PFA jest toksyczny. Przygotowanie roztworu PFA i wszelkie późniejsze obchodzenie się z nim musi odbywać się pod wyciągiem i przy użyciu środków ochrony indywidualnej.</li>
	<li>Odetnij głowę myszy, otwórz skórę i rozbij czaszkę między oczami za pomocą małych nożyczek.</li>
	<li>Usuń kawałki czaszki za pomocą małych, zakrzywionych kleszczy.</li>
	<li>Wyjmij mózg lub wybrane narządy.</li>
	<li>Inkubować mózg i narządy w 4% roztworze PFA po utrwaleniu w temperaturze 4 °C przez noc. 
	nuta: W celu oczyszczenia tkanki w określonym obszarze, należy wyciąć określony obszar lub przyciąć tkankę po utrwaleniu tkanki. 
	ostrożność: Roztwór PFA jest toksyczny. Perfuzja przezsercowa i wszystkie późniejsze czynności związane z myszami muszą być przeprowadzane pod wyciągiem i przy użyciu środków ochrony indywidualnej.</li>
</ol>
3. Infuzja i polimeryzacja monomeru hydrożelu
<ol>
	<li>Inkubować utrwalone narządy w roztworze monomeru hydrożelowego A4P0 w temperaturze 4 °C przez 12-24 godziny, delikatnie wstrząsając.</li>
	<li>Polimeryzacja tkanek z monomerem hydrożelowym.
	<ol>
		<li>Przenieść próbkę do probówki okrągłodennej o pojemności 10 ml z 5 ml roztworu monomeru hydrożelowego. Owiń górną część rurki z okrągłym dnem Parafilmem.</li>
		<li>Usuń tlen z probówki okrągłodennej zawierającej nasyconą hydrożelem próbkę całego mózgu myszy, bulgocząc azotem przez ciecz przez 1 minutę. Szybko i szczelnie zamknij probówkę zawierającą próbkę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieść probówkę do łaźni wodnej (37 °C) na 2 godziny.</li>
	<li>Przemyć krótko spolimeryzowaną próbkę 0,1x PBS, aby usunąć nadmiar hydrożelu. 
	ostrożność: Monomery hydrożelowe są toksyczne. Aby uniknąć kontaktu skóry z monomerem hydrożelowym, wszystkie zabiegi należy wykonywać pod wyciągiem i przy użyciu środków ochrony osobistej, w tym osłony twarzy, fartucha laboratoryjnego i rękawiczek. 
	nuta: Spolimeryzowane tkanki mogą być przechowywane w 0,1 PBS zawierającym azydek sodu przez ponad 2 tygodnie w temperaturze 4 °C. 
	ostrożność: Azydek sodu jest silnie i ostro toksyczny. Wszystkie zabiegi należy wykonywać pod wyciągiem i przy użyciu środków ochrony osobistej, w tym osłony twarzy, fartucha laboratoryjnego i rękawiczek.</li>
</ol>
4. Elektroforetyczne oczyszczanie tkanek (ETC)
<ol>
	<li>Przenieś spolimeryzowaną próbkę do pojemnika na tkanki i umieść pojemnik na tkanki w komorze ETC.</li>
	<li>Napełnij komorę ETC buforem ETC za pomocą pompy perystatycznej.</li>
	<li>Ustaw warunki ETC i uruchom ETC. Użyj następujących ustawień.
	<ol>
		<li>W przypadku ustawień ETC dla całych narządów należy użyć następujących ustawień: (1.5 amp), temperatura (37 °C), czas pracy (6.0 h), prędkość pompy (30 obr./min).</li>
		<li>W przypadku ustawień ETC dla wycinków mózgu myszy o grubości od 1 do 2 mm użyj następujących ustawień: prąd (1.5 A), temperatura (37 °C), czas pracy (2.0 h), prędkość pompy (30 obr./min).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieś oczyszczoną próbkę do stożkowej probówki o pojemności 50 ml z 45 ml 0,1 PBS. Przemyć oczyszczoną próbkę kilkakrotnie 0,1x PBS, aż po krótkim potrząśnięciu probówką nie będą widoczne pęcherzyki (w celu potwierdzenia całkowitego usunięcia SDS).</li>
</ol>
5. Znakowanie immunologiczne tkanek przetwarzanych metodą ACT
<ol>
	<li>Dla całego mózgu myszy: Inkubować próbkę w objętości 3 ml roztworu przeciwciała zawierającego 1x PBS, 6% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 0,1% Triton X-100 i 0,01% azydku sodu (roztwór rozcieńczający przeciwciała) ze współczynnikiem rozcieńczenia 1/500 dla przeciwciała przeciwko hydroksylazie tyrozynowej (TH) przez 4 dni w temperaturze 37 °C z łagodnym wstrząsaniem. Roztwór przeciwciał należy wymienić pod koniec 2. dnia.
	<ol>
		<li>Umyj próbkę w stożkowej probówce o pojemności 50 ml z 45 ml 0,1 PBS przez 3 - 5 godzin i zmieniaj bufor co godzinę.</li>
		<li>Inkubować próbkę w objętości 3 ml roztworu rozcieńczającego przeciwciała o współczynniku rozcieńczenia 1/500 dla przeciwciała drugorzędowego przeciwko królikowi 488 osła przez 4 dni w temperaturze 37 °C, lekko wstrząsając. Rozcieńczone roztwory przeciwciał należy wymienić w 2 dniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku pokrojonej tkanki mózgowej o grubości od 1 do 2 mm: Próbkę inkubować przez noc lub przez okres do 1 dnia w objętości 0,5 do 1 ml roztworu rozcieńczającego przeciwciała o współczynniku rozcieńczenia 1/500 dla przeciwciała kolagenu typu IV w temperaturze 37 °C z łagodnym wstrząsaniem.
	<ol>
		<li>Próbkę należy przemyć w stożkowej probówce o pojemności 15 ml o objętości 12 ml 0,1 PBS przez 1-2 godziny. Zmieniaj bufor co godzinę.</li>
		<li>Inkubować próbkę w objętości 0,5 do 1 ml roztworu rozcieńczającego przeciwciała o współczynniku rozcieńczenia 1/500 dla drugorzędowego przeciwciała anty-królika sprzężonego z Cy3 przez noc lub przez okres do 1 dnia w temperaturze 37 °C z łagodnym wstrząsaniem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przemywać próbkę w 0,1x PBS przez 3 - 5 godzin; bufor należy zmieniać co godzinę.</li>
	<li>Przed przystąpieniem do obrazowania należy inkubować próbkę w odpowiedniej ilości roztworu CUBIC-mount przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając. Zastąp świeżym roztworem do montażu CUBIC i inkubuj przez dodatkowe 1 h. 
	UWAGA: 76 typów przeciwciał działało dobrze w tkance myszy przetwarzanej przez ACT, w tym 31 przeciwciał monoklonalnych14. Wstępnie znakowaną tkankę można połączyć z immunoznakowaniem dwóch kolejnych fluorochromów w tkance przetworzonej przez ACT.</li>
</ol>
6. Znakowanie immunologiczne gęstych tkanek (PRESTO)
<ol>
	<li>c-PRESTO 
	UWAGA: c-PRESTO nadaje się do małych próbek, takich jak całe jądro, cała nerka lub małe odcinki większych narządów.
	<ol>
		<li>Przenieść próbkę do probówki o pojemności 1,5 ml, dodać 500 μl roztworu rozcieńczającego przeciwciała o współczynniku rozcieńczenia 1/500 dla przeciwciała kolagenu typu IV i odwirować probówkę o masie 600 × g przez 2 godziny.</li>
		<li>Przepłukać zabarwioną próbkę 0,1 x PBS przez odwirowanie przy 600 × g przez 30 minut.</li>
		<li>Dodać 500 μl roztworu rozcieńczającego przeciwciała o współczynniku rozcieńczenia 1/500 dla sprzężonego z Cy3 drugorzędowego przeciwciała anty-królika i odwirować przy 600 × g przez 2 godziny.</li>
		<li>Przepłukać zabarwioną próbkę 0,1 x PBS przez odwirowanie przy 600 × g przez 30 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>s-PRESTO 
	UWAGA: s-PRESTO nadaje się do większych tkanek.
	<ol>
		<li>Przygotuj strzykawkę (objętość 30 ml) i podłącz ją do zaworu 3-drogowego (Rysunek 1A). Przyklej zawór za pomocą pistoletu do klejenia w warunkach wysokiego ciśnienia (Rysunek 1B).</li>
		<li>Przenieść próbkę do strzykawki z zaworem 3-drogowym w pozycji zamkniętego zaworu.</li>
		<li>Dodać 5 - 7 ml roztworu rozcieńczającego przeciwciała o współczynniku rozcieńczenia 1/500 dla przeciwciała kolagenu typu IV. Uwolnić roztwór przeciwciała do próbki, otwierając zawór.</li>
		<li>Ustawić tłok strzykawki w pozycji 17 ml, aby zapewnić wystarczającą ilość miejsca na ruch infuzji/odstawienia. Można to zrobić w pozycji otwartego zaworu. Zamknąć zawór 3-drogowy po zakończeniu ustawiania strzykawki.</li>
		<li>Umieścić strzykawkę zawierającą próbkę na pompie strzykawkowej. Ustawić warunki pompy strzykawkowej na objętość infuzji/odstawienia 10 ml/min i 4-minutową przerwę w trybie cyklu ciągłego (Rysunek 1C). 
		nuta: Pompa zaparza do momentu osiągnięcia docelowej objętości (10 ml), a następnie po krótkiej przerwie (4 min) zmienia się kierunek przepływu.</li>
		<li>Uruchom pompę strzykawkową na 3 - 24 godziny w temperaturze pokojowej (Rysunek 1F).</li>
		<li>Otwórz zawór 3-drogowy i zastąp roztwór 0,1x PBS.</li>
		<li>Przebarwioną próbkę przemyć dwukrotnie 0,1 x PBS przez 1 godzinę za każdym razem za pomocą pompy strzykawkowej.</li>
		<li>Zamień roztworem do rozcieńczania przeciwciał zawierającym sprzężone z Cy3 drugorzędowe przeciwciało anty-królicze (współczynnik rozcieńczenia 1/500) i uruchom pompę strzykawkową na 3 - 24 godziny.</li>
		<li>Otwórz zawór 3-drogowy i zastąp roztwór 0,1x PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przed przystąpieniem do obrazowania należy inkubować wybarwioną próbkę w odpowiedniej ilości roztworu do montażu sześciennego przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając. Zastąp świeżym roztworem do montażu CUBIC i inkubuj przez dodatkowe 1 godzinę.</li>
</ol>
7. Obrazowanie
<ol>
	<li>Umieść oznakowaną tkankę w naczyniu konfokalnym i dodawaj roztwór CUBIC-mount, aż tkanka zostanie pokryta. Umieść szkiełko nakrywkowe na chusteczce. Użyj mikroskopu konfokalnego, aby zobrazować tkankę14 pod obiektywem 10X.</li>
</ol>

<ol><li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Array+tomography%3A+a+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55, 25-36 (2007).</li>
<li>Dodt, H. -U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultramicroscopy%3A+three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nat Methods. 4, 331-336 (2007).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22NATURE%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> NATURE. 497, 332-337 (2013).</li>
<li>Ke, M. -T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SeeDB%3A+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).</li>
<li>Ert&#252;rk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale%3A+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li>
<li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iDISCO%3A+a+simple%2C+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159, 896-910 (2014).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157, 726-739 (2014).</li>
<li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159, 911-924 (2014).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158, 945-958 (2014).</li>
<li>Kim, S. -Y., Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+microscopy+mapping+of+connections+in+the+intact+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cogn+Sci%22%5BJournal%5D)">Light microscopy mapping of connections in the intact brain.</a> Trends Cogn Sci. 17, 596-599 (2013).</li>
<li>Yushchenko, D. A., Schultz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+for+optical+anatomy%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Edit%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing for optical anatomy.</a> Angew Chem Int Edit. 52, 10949-10951 (2013).</li>
<li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nat Protoc. 9, 1682-1697 (2014).</li>
<li>Lee, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ACT-PRESTO%3A+Rapid+and+consistent+tissue+clearing+and+labeling+method+for+3-dimensional+%283D%29+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging.</a> Sci Rep. 6, 18631(2016).</li>
<li>Murray, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+Proteomic+Imaging+for+High-Dimensional+Profiling+of+Intact+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Scalable Proteomic Imaging for High-Dimensional Profiling of Intact Systems.</a> Cell. 163, 1500-1514 (2015).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Słabe utrwalenie lub zanurzenie hydrożelu w tkankach może spowodować utratę białek i zniekształcenie tkanki podczas procesu oczyszczania tkanek. Cały mózg dorosłej myszy należy inkubować w 4% paraformaldehydzie przez noc, a następnie zanurzyć w minimalnej objętości 20 ml roztworu monomeru hydrożelowego na 12 - 18 godzin, delikatnie wstrząsając. W przypadku dużych tkanek, w tym tkanek ludzkich, takich jak wycinki mózgu i rdzeń kręgowy, wymagany jest wydłużony czas namaczania w roztworze monomeru hydrożelowego. Protokół ACT można łatwo zastosować do oczyszczania utrwalonych tkanek, ponieważ etapy utrwalania tkanek i infuzji polimeru są oddzielone. Po oczyszczeniu tkanek tkanki ludzkie były dobrze wybarwione kilkoma przeciwciałami. Należy pamiętać, że technika oczyszczania ACT nie jest kompatybilna z utrwalaczami alkoholowymi, takimi jak etanol i metanol.
Etap polimeryzacji tkankowo-hydrożelowej ma również kluczowe znaczenie dla wytworzenia dobrej jakości tkanki po procesie oczyszczania. Ponieważ tlen hamuje polimeryzację akrylamidu, należy go usunąć poprzez odgazowanie roztworu zawierającego tkankę w systemie infuzji azotu gazowego. Alternatywnie odtlenianie można przeprowadzić za pomocą komory próżniowej z blokiem grzewczym przez 23 godziny.
Szybkość usuwania zależy od wielu czynników, w tym wielkości narządu, zawartości lipidów lub białek włóknistych ECM, stanu utrwalenia itp. Większość tkanek dorosłych myszy może zostać usunięta przez ETC w ciągu nocy. Istnieje jednak ryzyko niepotrzebnego nadmiernego oczyszczania i obrzęku tkanek; W związku z tym różnice w czasie rozliczeń mają istotne znaczenie. Warunki oczyszczania tkanek powinny być określone empirycznie. Co ważne, zawartość ECM może wpływać na wygląd oczyszczonej tkanki. Kolor tkanek pozostaje biały lub nieprzezroczysty, nawet po ACT w buforze ETC, ponieważ ACT nie usuwa gęstych włókien białkowych. Jednak, gdy narządy te zostały zanurzone w roztworze pasującym RI, stały się przezroczyste.
Szybkość obrzęku tkanek wydaje się być zależna od zawartości ECM w tkankach, a narządy miękkie, takie jak mózg, wykazują większy współczynnik obrzęku niż gęste narządy. Ponieważ zwiększony obrzęk tkanek pomoże w procedurze oczyszczania tkanek, ACT w większości przypadków rutynowo wykorzystuje destylowany bufor na bazie wody. W niektórych przypadkach, gdy obrzęk tkanek lub przejściowa deformacja nie jest pożądana, na przykład w zarodkach, do obrazowania w wysokiej rozdzielczości można zastosować bufor zawierający 0,1x PBS. Należy również zauważyć, że wyższe stężenia soli w buforze mogą powodować kurczenie się tkanek.
Metoda ACT może wyjaśnić całe narządy, a nawet całe ciało myszy14. Jednak obrazowanie tkanek głębokich przezroczystych wymaga specjalnych mikroskopów i obiektywów. Tak więc tkanka mózgowa o grubości od 1 do 2 mm jest najbardziej skuteczna w obrazowaniu za pomocą konwencjonalnego mikroskopu konfokalnego. W naszych rękach usuwanie znakowanych przeciwciał z tkanek przetworzonych przez ACT jest zależne od przeciwciał i nie zaleca się wykonywania różnych rund znakowania przeciwciałami. Kilka przeciwciał, takich jak TH i GFAP, działało szczególnie dobrze w przypadku znakowania immunologicznego całego mózgu14. Z drugiej strony, niektóre przeciwciała, takie jak Tuj1 lub Map2, często znakowały tylko powierzchnię tkanek. Można to poprawić za pomocą innych metod, takich jak SWITCH15. Innym potencjalnym ograniczeniem jest to, że może być trudno zachować drobne struktury białkowe w tkance przetwarzanej przez ACT ze względu na pęcznienie i kurczenie się tkanki na etapie oczyszczania tkanki.
Technika PRESTO ma zastosowanie w szerokiej gamie technik znakowania tkanek. Na przykład w metodach przezroczystych tkankowo wykorzystujących wstępnie znakowaną tkankę, takich jak SeeDB4 i iDISCO7, znakowanie immunologiczne gęstej tkanki wymaga okresów inkubacji dłuższych niż kilka dni do tygodni. Jednak PRESTO może skrócić czas inkubacji do kilku godzin, umożliwiając zakończenie całego procesu w ciągu jednego dnia z gęstą tkanką o grubości 1 mm. PRESTO może zwiększyć skuteczność głębokiego znakowania grubych, gęstych tkanek, a nawet nieoczyszczonych grubych tkanek. Ponieważ PRESTO wykorzystuje wirówkę stołową lub pompę strzykawkową i nie wymaga żadnego specjalnego sprzętu, stosunkowo łatwo jest wdrożyć tę technikę w rutynowych procedurach laboratoryjnych.

Jednym z wyzwań w neuronauce jest wizualizacja okablowania obwodów neuronalnych i pojedynczych komórek w nienaruszonej tkance mózgowej. Do niedawna wykazanie w ten sposób połączeń między neuronami wymagało 1) seryjnego cięcia tkanek; 2) znakowanie molekularne określonych celów, takich jak aksony lub białka; oraz 3) wizualizacja poprzez rekonstrukcję 3D całego mózgu poprzez rejestrację obliczeniową lub wyrównanie obrazów seryjnych 2D1. Kroki te są pracochłonne, wymagają dużo czasu i mogą spowodować utratę informacji podczas sekcji i etykietowania, co sprawia, że mapowanie sieci neuronowych jest niezwykle trudne. Opracowano jednak wiele metod, które pozwalają na wizualizację nienaruszonej tkanki bez wycinania. Tkanki biologiczne mogą stać się optycznie przezroczyste za pomocą technik oczyszczania tkanek2-10. Jedną z głównych metod jest zmniejszenie różnic współczynnika załamania światła między nienaruszoną tkanką a roztworem zanurzeniowym w celu zmniejszenia rozpraszania światła w nienaruszonej tkance, a tym samym nadania tkance przezroczystości i umożliwienia obserwacji głębokich struktur. Niektóre rodzaje roztworów zanurzeniowych mają właściwości hydrofobowe, które powodują szybkie wygaszanie fluorescencyjne podczas procedury odwadniania. W związku z tym metody te nie są kompatybilne z obrazowaniem fluorescencyjnym w długim okresie czasu11,12. Zamiast odczynników hydrofobowych, inne metody wykorzystują odczynniki hydrofilowe do oczyszczania tkanek, takie jak SeeDB4 i Scale6, które utrzymują informację strukturalną i fluorescencję tkanki biologicznej4,6,8. Jednak makrocząsteczki, w tym przeciwciała, nie mogą dotrzeć do rdzenia nienaruszonej tkanki przez samą dyfuzję. W związku z tym wstępne znakowanie cząsteczek docelowych w głębokich obszarach gęsto upakowanych tkanek jest technicznie trudne.
W niedawno opracowanej metodzie oczyszczania tkanek, CLARITY3, tkanka biologiczna zatopiona w hydrożelu jest tworzona z akrylamidu, a lipidy są usuwane przez elektroforezę pod roztworem zawierającym dodecylosiarczan sodu (SDS). Próbkę zanurza się następnie w roztworze o dopasowanym wskaźniku odbicia w celu zmniejszenia rozpraszania światła3. System usuwania lipidów został później zmodyfikowany w zaawansowanych CLARITY13 i PACT (technika pasywnej klarowności)10. Po polimeryzacji łańcuchy akrylamidu sieciują się z białkami, tworząc tkankę hydrożelową. Składniki lipidowe nie mogą sieciować się z akrylamidem; w ten sposób lipidy mogą być eliminowane przez elektroforezę w buforze zawierającym SDS. Poprzez aktywną eliminację lipidów tkanka mózgowa znacznie zwiększa swoją przezroczystość9. Metody te nie rozwiązują jednak problemu niemożności głębokiego znakowania poprzez swobodną dyfuzję. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, potrzebne są techniki aktywnego transportu odczynników do najgłębszych części grubych tkanek.
Chociaż PRZEJRZYSTOŚĆ umożliwia oczyszczanie tkanek i wizualizację głębokich tkanek, nie jest to łatwa ani szybka procedura. Oczyszczenie całego mózgu myszy może zająć kilka tygodni7,14. Szybkie oczyszczanie tkanek jest niezbędne do zastosowania takich metod w podstawowych lub klinicznych warunkach laboratoryjnych do badań z zakresu nauk przyrodniczych lub diagnostyki objętościowej. Obecny protokół zapewnia uproszczony proces biologicznego usuwania tkanek i późniejszego wykrywania białek poprzez barwienie immunologiczne wspomagane ciśnieniem. Nadaje się do obrazowania objętościowego o wysokiej rozdzielczości dużych plików i systemów przetwarzania danych 3D w połączeniu z metodami obrazowania.

<table><tbody><tr><td>4% Paraformaldehyd</td><td>Lugen SCI&nbsp;</td><td>Mocowanie próbki LGB-1175-4B</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Akrylamid</td><td>Affymetrix</td><td>75820</td><td>Roztwór monomeru hydrożelowego&nbsp;</td></tr><tr><td>Dichlorowodorek 2,2'-Azobis[2-(2-imidazolin-2-ylo)propanu]</td><td>Wako Pure Chemical Industries&nbsp; &nbsp;</td><td>VA-044</td><td>Roztwór monomeru hydrożelowego&nbsp;</td></tr><tr><td>Kwas borowy</td><td>Bufor Affymetrix</td><td>76324</td><td>ETC</td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS)</td><td>Bufor</td> <td>Affymetrix</td><td>18220</td> ETC</tr><tr><td>Granulki wodorotlenku sodu</td><td>Bufor chemiczny Junsei</td><td>1310-73-2</td><td>ETC</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2323A</td><td>Znakowanie immunologiczne</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Znakowanie immunologiczne</td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td>Znakowanie immunologiczne</td></tr><tr><td>Hydroksylaza tyrozyny (TH)</td><td>Millipore</td><td>AB152</td><td>Przeciwciało/znakowanie immunologiczne</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Cy3 Osioł anty-króliczy IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-165-152</td><td>Przeciwciało wtórne / znakowanie immunologiczne</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Osioł anty-króliczy IgG (H+L)</td><td>Life Technologies - Molekularne Sondy</td><td>A21206</td><td>Przeciwciało wtórne / immunoznakowanie</td></tr><tr><td>Naczynie konfokalne</td><td>SPL lifesciences</td><td>101350</td><td>Obrazowanie</td></tr><tr><td>mikroskopu konfokalnego</td><td>Leica</td><td>SP8</td><td>Obrazowanie</td></tr><tr><td>sacharozy</td><td>Junsei chemiczne</td><td>31365-0301</td><td>Roztwór do montażu w kostce&nbsp;</td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Affymetrix</td><td>23036</td><td>Roztwór do montażu w kostce&nbsp;</td></tr><tr><td>N,N,N',N' -tetrakis(2-hydroksypropylo)etylenodiamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>122262</td><td>roztwór do montażu na CUBIC&nbsp;</td></tr><tr><td>Izba ECT</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C10101</td><td>System ETC</td></tr><tr><td>Sterownik komory ECT</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>System C10201</td><td></td></tr><tr><td>ETC Sonda temperatury</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C12101</td><td>System ETC</td></tr><tr><td>Pompa perystatyczna</td><td>Baoding dłuższa pompa precyzyjna Co., Ltd</td><td></td><td>YZ1515X System ETC</td></tr><tr><td>Zbiornik buforowy</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C10401</td><td>System ETC</td></tr><tr><td>Pojemnik na tkanki&nbsp;</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>System C12001</td><td>ETC</td></tr><tr><td>Uchwyt na 1 pojemnik na chusteczki</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>System C12002</td><td></td></tr><tr><td>ETC Uchwyt na plasterki mózgu myszy</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>System C12004</td><td></td></tr><tr><td>ETC Uchwyt na cały mózg szczura</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>System C12007</td><td></td></tr><tr><td>ETC Przewody pompy perystaltycznej</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C12104</td><td>System ETC</td></tr><tr><td>Wirówka stołowa</td><td>Hanil science industrial Co., Ltd</td><td>MICRO 12</td><td>c-PRESTO</td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa</td><td>Baoding dłuższa pompa precyzyjna Co., Ltd</td><td>LSP02-1B</td><td>s-PRESTO</td></tr><tr><td>Strzykawka (30 mL)</td> <td>Korea vaccine Co., Ltd.</td><td>KV-S30</td><td>s-PRESTO</td></tr><tr><td>3-drogowy kran</td><td>Hyupsung medical Co., Ltd.</td><td>HS-T-01N</td><td>s-PRESTO</td></tr></tbody></table>

act-presto: biologiczne metody oczyszczania tkanek i znakowania immunologicznego w obrazowaniu objętościowym

ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging

Identyfikacja i eksploracja szczegółowej organizacji organów lub całego ciała na poziomie komórkowym to fundamentalne wyzwania w biologii. Metody przejściowe wymagają znacznej ilości czasu i wysiłku w celu uzyskania obrazu 3D, w tym przekroju nienaruszonej tkanki, znakowania immunologicznego i obrazowania tkanki ciętej seryjnie, co powoduje utratę informacji na każdym etapie procesu. W niedawno opracowanych podejściach do obrazowania w wysokiej rozdzielczości w nienaruszonej tkance, charakterystyka molekularna została ograniczona do znakowania białek. Jednak obecnie dostępne protokoły oczyszczania narządów wymagają znacznie długiego czasu procesu, co utrudnia wdrożenie technik oczyszczania tkanek w laboratorium. Niedawno opracowaliśmy szybki i wysoce powtarzalny protokół o nazwie ACT-PRESTO (active clarity technique-p ressure related efefficient, and stable transphere makromolekuł do wszystkichrodzajów molekuł), który pozwala na usunięcie tkanek w ciągu kilku godzin. Co więcej, ACT-PRESTO umożliwia szybkie znakowanie immunologiczne konwencjonalnymi metodami i przyspiesza przenikanie przeciwciał do głębokiej warstwy gęsto uformowanych, grubych próbek poprzez zastosowanie ciśnienia lub przepływu konwekcyjnego. Opisujemy, jak przygotować tkanki, jak usunąć lipidy za pomocą elektroforezy oraz jak wybarwić immunologicznie za pomocą podawania wspomaganego ciśnieniem. Szybkość i spójność protokołu przyspieszy wykonywanie badań histologicznych 3D i diagnoz opartych na objętości.

Przezrocznienie tkanek metodą ACT
Ważnym czynnikiem wpływającym na przejaśnianie tkanki jest jej utrwalenie. Utrwalanie w PFA oraz infuzja akrylamidu stanowią oddzielne etapy w niniejszym protokole. Po etapie polimeryzacji hydrożelu tkankowego wolny roztwór A4P0 nie ulega polimeryzacji, mimo że hydrożele nasycone tkanką są sieciowane z endogennymi makromolekułami. W związku z tym poza tkankami nie powinien powstać żel (Ryc. 2A). Procedura ACT skutkuje słabszym sieciowaniem białek i akrylamidu w porównaniu do protokołu CLARITY. W konsekwencji próbka tkanka-hydrożel jest bardziej porowata. Cecha ta umożliwia szybką ekstrakcję lipidów oraz dyfuzję makromolekuł. Przekroje mózgu myszy o grubości od 1 do 2 mm zostały wystarczająco przejaśnione w ciągu 1–2 h (Ryc. 2B), a 5–6 h ETC było wystarczające do przejaśnienia całych mózgów myszy (Ryc. 2C). Przejaśnianie tkanki za pośrednictwem hydrożelu wywołało ekspansję tkanki po etapie ETC, jednak tkanka powróciła do pierwotnego rozmiaru w roztworze dopasowującym współczynnik załamania światła. Próbka tkanka-hydrożel utworzona w procedurze ACT jest wysoce porowata, dzięki czemu małe związki i makromolekuły mogły efektywnie penetrować i łatwo dyfundować (Ryc. 3). Po 2-godzinnej inkubacji 1-mm plastrów mózgu z przeciwciałami przeciwko tyrozynowej hydroksylazie (TH) i kolagenowi typu IV, kolejna 2-godzinna inkubacja z przeciwciałem wtórnym była wystarczająca do oznakowania neuronów dopaminergicznych na głębokości 500 µm (Ryc. 3).
Immunoznakowanie tkanek metodą PRESTO
Organy o gęstej budowie charakteryzują się zazwyczaj wysokim stężeniem włókien ECM, co wpływa na przenikanie przeciwciał do tkanek. W związku z tym, po 12 h inkubacji przeciwciała przenikały na głębokość zaledwie 20-30 µm w tkankach gęstych, takich jak tkanka nerek. Aby pokonać to ograniczenie, opracowaliśmy metody aktywnego przenikania makrocząsteczek umożliwiające dostarczanie odczynników do głębokich warstw tkanek, a mianowicie metodę PRESTO (pressure related efficient and stable transfer of macromolecules into the organs) (Rycina 4). W porównaniu do statycznej inkubacji tkanki nerek poddanej procesowi ACT z roztworami przeciwciał, zastosowanie sił odśrodkowych (600 x g) przy użyciu wirówki laboratoryjnej (centryfugalny PRESTO, c-PRESTO) znacznie poprawiło dostarczanie przeciwciał do głębokich tkanek (Rycina 5). Po zastosowaniu procedury c-PRESTO do tkanek gęstych, 3 h inkubacji wystarczyły do oznakowania struktur znajdujących się na głębokości 250-300 µm. Aby zminimalizować zniekształcenia tkanki bez powodowania jej znacznych uszkodzeń, zaprojektowaliśmy również urządzenie zapewniające przepływ konwekcyjny z wykorzystaniem pompy strzykawkowej (strzykawkowy PRESTO, s-PRESTO). Proces ten w podobny sposób poprawił przenikanie przeciwciał w porównaniu do dyfuzji pasywnej (Rycina 5).
<img alt="System pompy strzykawkowej do precyzyjnej kontroli przepływu cieczy w chromatografii; obejmuje konfigurację i wyświetlacz obsługi." src="/files/ftp_upload/54904/54904fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Przygotowanie aparatury s-PRESTO. A. Strzykawka (30 mL) i kurek trójdrożny. B. Kurek trójdrożny połączony i przyklejony do strzykawki. C. Strzykawka zawierająca próbkę i roztwór przeciwciał oraz strzykawka umieszczona w pompie strzykawkowej. D. Pompa strzykawkowa i konfiguracja warunków pracy. E. Pompa wprowadza roztwór zawierający odczynniki znakujące do preparatu. Po osiągnięciu wyznaczonej objętości kierunek pompowania ulega zmianie, a roztwór jest wycofywany po określonym czasie. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Proces polimeryzacji; probówki i próbki podczas utrudniania optycznego; schemat postępu eksperymentu." src="/files/ftp_upload/54904/54904fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Przejrzyszczanie tkanek metodą ACT w mózgu myszy. A. Po polimeryzacji wolne roztwory A4P0 nie ulegają polimeryzacji; hydrożele nasycone tkanką żelują poprzez sieciowanie z endogennymi makrocząsteczkami. B. Przezryszczano plastry mózgu o grubości 1–2 mm przez 1–2 h, a następnie rejestrowano stopień ekspansji i odzyskanie rozmiaru w roztworze dopasowującym współczynnik załamania światła (RI). C. Grubość całego mózgu myszy wynosi około 0,8 cm, a 5–6 h ETC było wystarczające do całkowitego przejrzyszczenia mózgu. Po 3 h ETC stwierdzono znaczną ilość nieprzejrzyszczonej tkanki. Jednak po 6 h ETC nastąpiło przejrzyszczenie całego mózgu. Kolor tkanek po ACT w buforze ETC jest biały lub nieprzezroczysty. Po dopasowaniu RI tkanki stają się przezroczyste. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat mózgu myszy; Kolagen IV (czerwony), Tyrozynohydroksylaza (zielony); analiza mikroskopowa." src="/files/ftp_upload/54904/54904fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Immunoznakowanie w tkance mózgu myszy utrwalonej metodą ACT. Obrazy przekrojów mózgu myszy o grubości 1 mm, przetworzonych metodą ACT, przedstawiające korę mózgową myszy barwioną przeciwciałem przeciwko kolagenowi typu IV oraz część śródmózgowia barwioną przeciwciałem przeciwko tyrozynohydroksylazie (TH). Pasek skali, 100 µm. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat porównania dyfuzji PRESTO; c-PRESTO odśrodkowa, s-PRESTO konwekcyjna; przepływ przeciwciał." src="/files/ftp_upload/54904/54904fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Metody immunoznakowania PRESTO. Przeciwciała nie mogą przenikać do gęstych tkanek drogą dyfuzji. Metody immunoznakowania PRESTO zostały zaprojektowane w celu aktywnego wprowadzania makrocząsteczek i dostarczania odczynników do gęstych tkanek. Zastosowanie sił odśrodkowych przy użyciu standardowej wirówki stołowej (odśrodkowe PRESTO, c-PRESTO) znacznie ułatwiło dostarczanie przeciwciał. Zastosowanie przepływu konwekcyjnego za pomocą pompy strzykawkowej (strzykawkowe PRESTO, s-PRESTO) poprawiło penetrację przeciwciał. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Porównanie mikroskopowe nerki i wątroby; dyfuzja swobodna vs. metoda PRESTO; wyniki obrazowania tkanek." src="/files/ftp_upload/54904/54904fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Immunoznakowanie PRESTO gęstej tkanki oczyszczonej metodą ACT. W przypadku c-PRESTO tkanki wirowano przy 600 ×g przez 3 h przy użyciu standardowej wirówki stołowej w celu przyspieszenia penetracji przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych. W przypadku s-PRESTO do podania przeciwciał wykorzystano pompę strzykawkową. Organy myszy, takie jak nerki i wątroba, znakowano przeciwciałami przeciwko kolagenowi typu IV. W porównaniu z metodami konwencjonalnymi, 3 h c- lub s-PRESTO wyraźnie zwiększa głębokość znakowania. W nerkach i wątrobie głębokość w osi Z w próbkach PRESTO (po prawej) osiąga 300 - 350 µm lub więcej, podczas gdy próbki kontrolne są znakowane tylko do głębokości 40 - 50 µm (po lewej). Obraz zrekonstruowany w 3D uzyskano za pomocą mikroskopu konfokalnego. Pasek skali, 100 µm. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

ACT-PRESTO (technika aktywnej przejrzystości - efektywny i stabilny transfer makrocząsteczek do organów związany z ciśnieniem) umożliwia szybkie, skuteczne, ale niedrogie oczyszczanie tkanek i szybką penetrację przeciwciał do oczyszczonych tkanek poprzez pasywną dyfuzję lub dostarczanie wspomagane ciśnieniem. Za pomocą tej metody można oczyścić szeroki zakres tkanek, znakować immunologicznie wieloma przeciwciałami i obrazować objętość.

ACT-PRESTO: Biologiczne metody oczyszczania tkanek i znakowania immunologicznego w obrazowaniu objętościowym

The identification and exploration of the detailed organization of organs or of the whole body at the cellular level are fundamental challenges in ...

Ogólnym celem tej procedury jest uzyskanie oczyszczonej, nienaruszonej tkanki i wizualizacja jej trójwymiarowych informacji molekularnych za pomocą metod znakowania immunologicznego. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurobiologii i biologii rozwoju, takie jak połączenia neuronalne, kategoryzacja molekularna i zmiany strukturalne podczas rozwoju. Główną zaletą tej techniki jest to, że tkanka wyraźnie umożliwia analizę dużych próbek na poziomie subkomórkowym bez konieczności dzielenia ich na sekcje.Aby rozpocząć tę procedurę, inkubuj utrwalone narządy w roztworze monomeru hydrożelowego A4P0 w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 12 do 24 godzin, delikatnie wstrząsając. Następnie dodaj pięć mililitrów roztworu monomeru hydrożelowego do 10-mililitrowej probówki z okrągłym dnem. Następnie przenieś do niego próbkę mózgu myszy i owiń górną część rurki Parafilmem.Następnie przez minutę przepuszczaj azot przez ciecz z próbką mózgu w infuzji hydrożelu. Szybko i szczelnie zamknąć probówkę zawierającą próbkę. Przenieś probówkę do łaźni wodnej na dwie godziny.Następnie sprawdź lepkość hydrożelu, a następnie krótko przemyj spolimeryzowaną próbkę 0,1 X PBS, aby usunąć nadmiar hydrożelu. Na tym etapie przenieś spolimeryzowaną próbkę do pojemnika na tkanki. I umieść pojemnik na chusteczki w komorze ETC.Następnie napełnić komorę ETC buforem ETC za pomocą pompy perystaltycznej. Ustaw warunki ETC i włącz go. Plasterki mózgu o grubości od jednego do dwóch milimetrów są usuwane w ciągu dwóch godzin.A cały mózg jest wystarczająco oczyszczony w ciągu pięciu do sześciu godzin. Następnie przenieś próbkę do 50-mililitrowej stożkowej probówki z 45 mililitrami 0,1 X PBS. Przemyć próbkę kilka razy 0,1 X PBS, aż nie będzie widać pęcherzyków, gdy probówka jest krótko potrząsana, aby potwierdzić całkowite usunięcie SDS.Aby wykonać c-PRESTO, przenieś małą próbkę do 1,5-mililitrowej probówki. Dodać 500 mikrolitrów roztworu rozcieńczającego przeciwciała o współczynniku rozcieńczenia od jednego do 500 dla przeciwciała kolagenu typu czwartego i odwirować probówkę pod ciśnieniem 600 razy g przez dwie godziny. Następnie przepłukać zabarwioną próbkę 0,1 X PBS przez odwirowanie w ilości 600 razy g przez 30 minut.Następnie dodaj 500 mikrolitrów roztworu rozcieńczającego przeciwciało o współczynniku rozcieńczenia od jednego do 500 dla sprzężonego z Cy3 przeciwciała drugorzędowego Anti Rabbit i odwiruj je 600 razy g przez dwie godziny. Następnie przepłukać zabarwioną próbkę 0,1 X PBS przez odwirowanie w temperaturze 600 razy g przez 30 minut. Aby wykonać s-PRESTO dla większych tkanek, przenieś próbkę do strzykawki połączonej z zaworem trójdrogowym w pozycji zamkniętego zaworu.Dodaj od pięciu do siedmiu mililitrów roztworu rozcieńczającego przeciwciała o współczynniku rozcieńczenia od jednego do 500 dla przeciwciała kolagenu typu czwartego. Następnie dodaj roztwór przeciwciała do próbki, otwierając zawór. Następnie, w pozycji otwartego zaworu, ustaw tłok strzykawki w pozycji 17 mililitrów, aby zapewnić wystarczająco dużo miejsca na ruch pobierania infuzji.Następnie zamknij zawór trójdrogowy po zakończeniu ustawiania strzykawki. Umieścić strzykawkę zawierającą próbkę na pompie strzykawkowej. Ustawić warunki pompy strzykawkowej na objętość pobierania infuzji wynoszącą dziesięć mililitrów na minutę i czterominutowy czas przerwy w trybie cyklu ciągłego.Następnie uruchom pompę strzykawkową na trzy do 24 godzin w temperaturze pokojowej. Następnie otwórz zawór trójdrogowy i zastąp roztwór 0,1 X PBS. Przepłukać zabarwioną próbkę dwukrotnie 0,1 X PBS za każdym razem przez jedną godzinę za pomocą pompy strzykawkowej.Następnie zastąp PBS roztworem rozcieńczania przeciwciał zawierającym sprzężone przeciwciało drugorzędowe Cy3 Anti Rabbit i uruchom pompę strzykawkową na trzy do 24 godzin. Następnie otwórz zawór trójdrogowy i zastąp roztwór 0,1 X PBS. Przed przystąpieniem do obrazowania należy inkubować wybarwioną próbkę w odpowiedniej ilości roztworu do montażu sześciennego przez godzinę w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając.Po godzinie zastąp roztwór świeżym roztworem do montażu sześciennego i inkubuj przez dodatkową godzinę. Ponieważ przeciwciała nie mogą przenikać do gęstych tkanek przez dyfuzję, metody immunoznakowania PRESTO są zaprojektowane tak, aby aktywnie infuzjować makrocząsteczki i dostarczać odczynniki do gęstych tkanek. Zastosowanie sił odśrodkowych przy użyciu standardowej wirówki stołowej znacznie ułatwiło dostarczanie przeciwciał.Zastosowanie przepływu konwekcyjnego za pomocą pompy strzykawkowej również poprawiło penetrację przeciwciał. W przypadku s-PRESTO do dostarczenia przeciwciał użyto pompy strzykawkowej. Narządy myszy, takie jak nerki i wątroba, zostały oznaczone kolagenem typu 4.W porównaniu z konwencjonalnymi metodami, trzy godziny c lub s-PRESTO znacznie zwiększają głębokość etykietowania. W nerkach i wątrobie głębokość osi Z sięga od 300 do 350 mikrometrów lub głębiej w próbkach PRESTO , podczas gdy próbki kontrolne są znakowane na głębokości zaledwie 40 do 50 mikrometrów. Po opanowaniu, techniki te można wykonać w ciągu jednego dnia dla tkanki, jeśli są wykonywane prawidłowo.Podejmując tę procedurę, należy pamiętać o wyraźnym zachowaniu czasu utrwalania tkanki Emulsja monomeru hydrożelowego i tkanki elektroforetycznej. Po procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak znakowanie immunologiczne, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak analiza dynamiki komórkowej i identyfikacja gniazda neuronalnego w wielu narządach. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom z dziedziny nauk medycznych do badania diagnostyki chorób.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zatapiać hydrożel i polimeryzować tkanki. Nie zapominaj, że praca z roztworem monomeru hydrożelowego może być bardzo niebezpieczna i zawsze należy zachować ostrożność podczas wykonywania tej procedury.

act-presto-biological-tissue-clearing-immunolabeling-methods-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszej pracy opisujemy szybką i prostą metodę obrazowania fluorescencyjnie znakowanych komórek w półgrubych skrawkach mózgu. Poprzez utrwalenie, pocięcie i optyczne klarowanie tkanki mózgowej opisujemy, w jaki sposób standardowe obrazowanie epifluorescencyjne lub konfokalne może być wykorzystane do wizualizacji poszczególnych komórek i sieci neuronalnych w obrębie nienaruszonej tkanki nerwowej.

Szybka metoda obrazowania fluorescencyjnego o wysokiej rozdzielczości w półgrubych przekrojach mózgu

Aby uzyskać obrazy o wysokiej rozdzielczości fluorescencyjnie znakowanych komórek w dużych tkankach, najlepiej byłoby, gdyby próbki biologiczne były obrazowane bez dzielenia na sekcje. 3DISCO to prosta procedura oczyszczania tkanek oparta na sekwencyjnej inkubacji z rozpuszczalnikami organicznymi. Po oczyszczeniu narządy stają się przezroczyste, co pozwala na kompleksowe skanowanie laserowe próbki.

Obrazowanie oczyściło nienaruszone systemy biologiczne na poziomie komórkowym za pomocą 3DISCO

Obrazowanie ex vivo całego narządu to szybka metoda określania względnych stężeń związków znakowanych fluorescencyjnie w obrębie i pomiędzy tkankami lub grupami leczenia. I odwrotnie, ilościowa histologia fluorescencji, choć bardziej pracochłonna, pozwala na ilościowe określenie bezwzględnych poziomów tkanek znakowanych cząsteczek.

Zastosowanie obrazowania ex vivo całego narządu i ilościowej histologii tkanek w celu określenia biodystrybucji cząsteczek znakowanych fluorescencyjnie

Tutaj opisujemy podejście do mikroskopii świetlnej w celu wizualizacji nacieku leukocytów CD45+ w mysim modelu aseptycznego, piorunującego zapalenia mięśnia sercowego, które jest indukowane przez leczenie myszami CD11c.DTR toksyną dyfterytową dotchawiczą.

Ilościowa wizualizacja nacieku leukocytów w mysim modelu piorunującego zapalenia mięśnia sercowego za pomocą mikroskopii świetlnej

To badanie przedstawia protokół odwracalnego oczyszczania tkanek, barwienia immunologicznego, renderowania 3D i analizy sieci naczyniowych w próbkach ludzkich kosmków łożyskowych rzędu 1 - 2 mm3.

Trójwymiarowe renderowanie i analiza znakowanych immunologicznie, oczyszczonych ludzkich sieci naczyniowych kosmków łożyskowych

Połączenie znakowania przeciwciałami, optycznego oczyszczania i zaawansowanej mikroskopii świetlnej pozwala na trójwymiarową analizę całych struktur lub organów. Opisano tutaj prostą metodę łączenia znakowania immunologicznego grubych plasterków nerki, oczyszczania optycznego za pomocą cynamonianu etylu oraz obrazowania konfokalnego, które umożliwia wizualizację i kwantyfikację trójwymiarowych struktur nerkowych.

Optyczne oczyszczanie i obrazowanie znakowanej immunologicznie tkanki nerki

Opisujemy metodę szybkiego barwienia do wykonywania obrazowania wielospektralnego na zamrożonych tkankach.

Szybka metoda wielospektralnego obrazowania fluorescencyjnego zamrożonych skrawków tkanek

Protokół dostarcza szczegółową metodę obrazowania neuronów w wycinku mózgu za pomocą metody oczyszczania tkanki, ScaleSF. Protokół obejmuje przygotowanie tkanki mózgowej, klarowanie tkanek, postępowanie z oczyszczonymi wycinkami oraz konfokalne obrazowanie struktur neuronalnych za pomocą laserowej mikroskopii skaningowej od poziomu mezoskopowego do mikroskopowego.

Metoda oczyszczania tkanek do obrazowania neuronów ze skal mezoskopowych do mikroskopowych

Obecny protokół zapewnia krok po kroku procedurę szybkiego i jednoczesnego oczyszczania optycznego, wieloetapowego znakowania i wolumetrycznej rekonstrukcji 3D dziesiątek pośmiertnych odcinków ludzkiego mózgu poprzez połączenie (SWITCH - H2O2 - Pozyskiwanie antygenu R- 2,2'-tiodieetanol [TDE]) KRÓTKA technika transformacji tkankowej z obrazowaniem mikroskopii fluorescencyjnej za pomocą arkusza świetlnego w rutynowym protokole wysokoprzepustowym.

Optyczne oczyszczanie i znakowanie w mikroskopii fluorescencyjnej arkuszy świetlnych w wielkoskalowym obrazowaniu ludzkiego mózgu

Ten protokół wprowadza szybką metodę ilościowego trójwymiarowego obrazowania naczyń krwionośnych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z użyciem arkusza świetlnego. Skuteczność metody wykazano przy użyciu systemu tętnic łukowatych gardła w modelu zarodka pisklęcia, z siłami hemodynamicznymi określonymi ilościowo za pomocą obliczeniowej dynamiki płynów.

Szybkie obrazowanie naczyń krwionośnych małych zwierząt w całej rozdzielczości do badań ilościowych

Poznaj metodę ACT-PRESTO do oczyszczania tkanek i immunoznakowania w obrazowaniu objętościowym. Technika ta umożliwia analizę podkomórkową dużych próbek bez konieczności ich sekcjonowania.

ACT-PRESTO: Biologiczne metody oczyszczania tkanek i znakowania immunologicznego w obrazowaniu objętościowym

Przeglądaj więcej filmów