Prosty sposób na zmierzenie zmian w zachowaniu związanym z poszukiwaniem nagrody za pomocą Drosophila melanogaster

Ogólnym celem tej procedury jest zmierzenie samodzielnego podawania etanolu u muszek owocowych jako wskaźnika zastępczego dla zmian w stanach nagrody. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w neurobiologii, takie jak to, w jaki sposób doświadczenie jest kodowane w mózgu i prowadzi do modyfikacji zachowania. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest stosunkowo prosta i nie wymaga skomplikowanej konfiguracji.

Protokół składa się z dwóch odrębnych części. Pierwszym z nich jest wystawianie muszek na doświadczenia nagradzające i nienagradzające, a drugim jest oznaczanie dobrowolnego spożywania etanolu jako miary motywacji do uzyskania nagrody w postaci narkotyku. Obie części protokołu mogą być używane niezależnie.

Wywołanie modulacji doświadczenia jako początkowy krok do dalszych testów lub jako niezależny test żywieniowy dwuwyboru. Procedurę zademonstrują Shir Zer, studentka studiów magisterskich, i Julia Ryvkin, doktorantka, obie z mojego laboratorium. Aby rozpocząć budowę podajnika kapilarnego, najpierw weź standardową fiolkę muchową z małymi otworami z boku fiolki.

Za pomocą żyletki przeciąć korek fiolki na pół, w poprzek. Zaznacz cztery punkty na powierzchni korka, tworząc kwadratowy kształt, aby ustawić uchwyty kapilarne. Za pomocą igły o rozmiarze 18 wykonaj cztery otwory przez zatyczkę w miejscu znaków.

I poszerz otwory za pomocą mikropipety. Za pomocą żyletki przetnij cztery mikropipety tak, aby mocno trzymały pięć mikrolitrowych szklanych kapilarek. Włóż je do otworów w przygotowanej zatyczce.

Zaznacz położenie na korku dwóch kapilarn, które będą zawierały etanol. Następnie ułóż szklane fiolki na stojakach do mikrowirówek. Rozpuść pokarm dla much, a następnie wlej dwa mililitry do każdej z fiolek.

Poczekaj, aż pokarm stwardnieje, a następnie przykryj fiolki folią. Zacznij od pobrania samców much, które były trzymane oddzielnie w mniejszych fiolkach w odosobnieniu. Przypisz je losowo do dwóch grup.

Ci, którzy przejdą satysfakcjonujące, w przeciwieństwie do nienagradzających doświadczeń godowych. Zaczynając od grupy nienagradzającej, dodaj do każdej fiolki wcześniej pokrytą samicę. Przechodząc do grupy nagród, dodaj dziewiczą samicę do każdej fiolki.

Obserwuj spotkania godowe, aby upewnić się, że samce wchodzące w interakcję z dziewiczymi samicami pomyślnie łączą się w pary w ciągu pierwszej godziny. I że samce wchodzące w interakcje z wcześniej pokrytymi samicami nie łączą się w pary. Niezbędna jest uważna obserwacja, aby upewnić się, że pokryta kohorta rzeczywiście przechodzi krycie, a odrzucona kohorta nie udaje się połączyć w pary.

Po jednej godzinie usuń z eksperymentu wszystkie samce z odrzuconej kohorty, którym udało się połączyć w pary, oraz samce z kohorty pokrytej, które nie zakończyły się kopulacją do końca pierwszej sesji treningowej. Zakończ sesję kondycjonowania, odsysając wcześniej pokryte samice ze stanu nienagradzającego, zatrzymując te osobniki do późniejszych prób. Na koniec usuń i odrzuć samice z pokrytej grupy samców.

Pozwól muchom odpocząć przez godzinę, a następnie powtórz godzinny test kondycjonowania jeszcze dwa razy z godzinnym odpoczynkiem pomiędzy nimi. Te sesje treningowe należy powtarzać ponownie każdego dnia przez kolejne trzy dni. Po ostatniej sesji kondycjonowania w czwartym dniu, odessaj pojedyncze samce i umieść je w grupach od sześciu do ośmiu w fiolkach z karmnikiem kapilarnym, trzymając muchy razem w tej samej grupie nagrody.

Użyj miękkiej wtyczki, aby utrzymać samce na miejscu podczas przenoszenia. Po włożeniu wszystkich much wymień miękką zatyczkę na zatyczkę podajnika kapilarnego. Zwilż korki, delikatnie dodając pięć mililitrów wody do górnej części każdej korka, unikając rozlania do fiolki.

Przygotuj etanol i wodne roztwory żywnościowe, a następnie umieść pięć mikrolitrowych kropli na pasku folii laboratoryjnej. Pozwól, aby roztwór wypełnił kapilarę, aż osiągnie znak pięciu mikrolitrów. A następnie delikatnie postukaj nimi w pasek, aby umieścić roztwór dokładnie w zaznaczonej linii.

Uszczelnij końce naczyń włosowatych, zanurzając je w małych kropelkach oleju mineralnego. Na koniec włóż dwie kapilary zawierające etanol i niezawierające etanolu do adapterów we wtyczce. Odsłonięte boki powinny wystawać jeden milimetr lub mniej z powierzchni wtyczki.

Utrzymywanie otworu na kapilary w pobliżu mokrego korka zmniejsza parowanie i umożliwia łatwy dostęp do pokarmu, ponieważ muchy zwykle siedzą na korkach i schodzą na odsłoniętą kapilę, aby się pożywić. Dodatkowo należy przygotować jedną imitację fiolki bez much, która posłuży jako kontrola do oceny naturalnego parowania. Na koniec zapisać względne położenie cieczy w każdej z naczyń włosowatych w fiolkach w stosunku do czarnej linii w milimetrach.

Umieścić fiolki w inkubatorze doświadczalnym na 24 godziny. Zmierzyć i zapisać poziomy cieczy w każdej usuniętej kapilarze w odniesieniu do czarnej linii. Po zakończeniu eksperymentu wymieniaj kapilarnę o ustalonej porze każdego dnia.

Ponownie zwilżyć korki dwoma mililitrami wody, a następnie umieścić fiolki z powrotem w inkubatorze. Samce muszek owocowych dzikiego typu Canton S zebrane po eklozji i dojrzewające do czwartego dnia życia, były badane w ciągu czterech dni pod kątem ich wrodzonej preferencji do spożywania alkoholu. Analiza ilości spożywanych roztworów etanolowych i niezawierających etanolu pokazuje, że muchy wykazywały znaczną preferencję dla źródła pożywienia zawierającego 15% etanolu.

Eksperyment CAFE powtórzono z samcami pokrytymi i odrzuconymi. Obie grupy były wcześniej trzymane pojedynczo i wystawione na kontakt z samicami, które akceptowały lub odrzucały krycie. Po wprowadzeniu w grupach do fiolek CAFE, odrzucona grupa spożywała więcej z kapilar etanolowych.

Sugerowało to, że postrzegany brak nagrody prowadził do wzrostu zachowań związanych z poszukiwaniem nagrody. I odwrotnie, udane krycie zwiększa wewnętrzny poziom nagrody, co z kolei obniża zużycie etanolu. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby utrzymać dobrze nawilżone środowisko przez cały eksperyment, z dodatkowym naciskiem na część konsumpcyjną, codzienne podlewanie korków i utrzymywanie końców kapilar w bliskiej odległości od mokrych zatyczek.