Name: Macierze 2D i 3D do badania liniowego powstawania i aktywności inwadosomów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: Poznaj metodę przygotowania macierzy 2D i 3D do badania liniowych inwadosomów oraz degradacji macierzy pozakomórkowej. Protokół umożliwia analizę inwazyjności komórek nowotworowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

J.D.M. był wspierany przez stypendium doktoranckie z INSERM/Région Aquitaine, a teraz jest wspierany przez stypendium podoktoranckie ARC i Tisch Cancer Institute w Mount Sinai School of Medicine. E.H. jest wspierany przez doktorat z Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche. Z.E. jest wspierany przez stypendium podoktorskie z Agence Nationale de la Recherche (ANR). C.M. jest wspierany przez Tisch Cancer Instytut w Mount Sinai School of Medicine i J.J.B.C. są wspierane przez K22CA196750 grantowe NIH/NCI, TCI Young Scientist Cancer Research Award JJR Fund oraz Tisch Cancer Institute w Mount Sinai School of Medicine. Prace te zostały wsparte grantem z ANR-13-JJC-JSV1-0005. F.S. jest wspierany przez "Ligue nationale contre le cancer". V.M. i F.S. są wspierane przez fundusze z "Equipe Labellisée Ligue Nationale contre le Cancer 2016" oraz Institut National du Cancer, INCA_8036 i PLBio2012.

UWAGA: Przed utrwaleniem wszystkie etapy są wykonywane w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza.
1. Macierz 2D
UWAGA: Macierze 2D są wykorzystywane do określenia procentowego udziału komórek tworzących invadosomy oraz powierzchni degradacji macierzy przypadającej na jedną komórkę.
<img alt="Schemat przygotowania hodowli komórkowej; proces powlekania szkiełek żelatyną; metoda krok po kroku." src="/files/ftp_upload/54911/54911fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Protokół. Podsumowanie protokołu wykorzystanego do przygotowania macierzy żelatynowych i kolagenowych typu I. Możliwe jest przygotowanie wyłącznie macierzy żelatynowej lub mieszanej macierzy żelatynowo-kolagenowej typu I. <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54911/54911fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<ol>
	<li>Macierz żelatynowa 
	UWAGA: Fluorescencyjne macierze żelatynowe są wykorzystywane do ilościowego określania degradacji macierzy, natomiast żelatyna niefluorescencyjna służy do promowania adhezji włókien kolagenu I. Fluorescencyjne macierze żelatynowe są również stosowane w badaniach nad podosomami i invadopodiami (patrz Rycina 1).
	<ol>
		<li>Pod sterylną kopułą z laminarnym przepływem powietrza umieść kawałek parafilmu (20 cm x 15 cm) na obszarze roboczym i zdezynfekuj go 70% etanolem.</li>
		<li>Nanieś krople żelatyny o stężeniu 1 mg/mL w ilości 20 µL każda w linii, w odstępach około 1 cm; organizację kropli przedstawiono na Rycynie 1.</li>
		<li>Przykryj każdą 20 µL kroplę żelatyny autoklawowaną szklaną lamelką (średnica 12 mm).</li>
		<li>Inkubuj przez 20 min w temperaturze pokojowej. Jeśli żelatyna jest fluorescencyjna, chroń ją przed światłem.</li>
		<li>Nanieś krople 0,5% glutaraldehydu w 1x soli fosforanowej buforze (PBS) w ilości 40 µL każda w linii, tak aby każda znajdowała się około 1 cm poniżej linii lamelkek z kroku 1.1.3. 
		OSTRZEŻENIE: Glutaraldehyd jest toksycznym czynnikiem utrwalającym. Należy używać rękawiczek i nie wdychać oparów.</li>
		<li>Za pomocą pęsety z końcówkami z kamieni szlachetnych przenieś każdą lamelkę pokrytą żelatyną do kropli glutaraldehydu. 
		UWAGA: To normalne, że na parafilmie pozostanie niewielka kropla żelatyny. Nie należy jej używać w kolejnych eksperymentach.</li>
		<li>Inkubuj przez 40 min w temperaturze pokojowej. W przypadku lamelkek fluorescencyjnych chroń je przed światłem.</li>
		<li>Użyj 24-dołkowej płytki do hodowli komórkowej i wypełnij każdy dołek 500 µL sterylnego 1x PBS. Umieść lamelki stroną z żelatyną do góry w każdym dołku.</li>
		<li>Przemyj dwukrotnie w 1x PBS przez 5 min za każdym razem. 
		UWAGA: Na tym etapie lamelki mogą być wykorzystane do eksperymentów lub przechowywane w 1x PBS w temperaturze 4 °C. Lamelki niefluorescencyjne można przechowywać przez tydzień, a fluorescencyjne przez 48 h.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Macierz włóknistego kolagenu typu I 
	UWAGA: Macierz włóknistego kolagenu typu I jest stosowana do badania tworzenia się liniowych invadosomów oraz związanej z nimi degradacji macierzy. Kombinacja fluorescencyjnego kolagenu I i niefluorescencyjnych lamelkek żelatynowych służy do kolokalizacji markerów invadosomów z włóknami kolagenu (np. F-aktyna w kanale dalekiej czerwieni, kolagen I w kanale czerwonym, Tks5 w kanale zielonym i barwnik Hoechst do barwienia jąder). Z kolei kombinacja niefluorescencyjnego kolagenu I z niefluorescencyjnymi lamelkami żelatynowymi służy do maksymalizacji liczby barwionych markerów invadosomów (np. F-aktyna w kanale dalekiej czerwieni, kortaktyna w kanale czerwonym, Tks5 w kanale zielonym i barwnik Hoechst do barwienia jąder). Wreszcie, kombinacja niefluorescencyjnego kolagenu I z fluorescencyjnymi lamelkami żelatynowymi służy do ilościowego określania degradacji związanej z żelatyną (np. F-aktyna w kanale dalekiej czerwieni, Tks5 w kanale czerwonym, w kanale zielonym i barwnik Hoechst do barwienia jąder) (patrz Rycina 1). Barwnik Hoechst służy do barwienia jąder, a także do kontroli zanieczyszczenia mycoplasmami, jako uzupełnienie regularnie przeprowadzanych testów PCR dla stosowanych linii komórkowych.
	<ol>
		<li>Fluorescencyjny kolagen I
		<ol>
			<li>Użyj komercyjnego kolagenu I ekstrahowanego z ścięgna ogona szczura w 0,02 N kwasie octowym. Pobierz ilość kolagenu I niezbędną do przygotowania 500 µL roztworu na lamelkę przy końcowym stężeniu kolagenu I wynoszącym 0,4 mg/mL.</li>
			<li>Dodaj 5-karboksy-x-rodaminy ester succinimidylowy w końcowym stężeniu 10 µg/mL, obliczonym dla końcowej objętości roztworu kolagenu I (n x 500 µL).</li>
			<li>Wymieszaj roztwór, pipetując w górę i w dół, i inkubuj przez 5 min w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.</li>
			<li>Rozcieńcz do końcowej objętości za pomocą 1X soli fosforanowej buforu Dulbecco (DPBS) zawierającego wapń i magnez i użyj bezpośrednio.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Lamelka z włóknistym kolagenem I
		<ol>
			<li>Użyj niefluorescencyjnych lub fluorescencyjnych lamelkek żelatynowych przygotowanych wcześniej w kroku 1.1.</li>
			<li>Przygotuj roztwór fluorescencyjnego lub niefluorescencyjnego kolagenu I o końcowym stężeniu 0,4 mg/mL w 1X DPBS zawierającym wapń i magnez.</li>
			<li>Dodaj 500 µL roztworu fluorescencyjnego lub niefluorescencyjnego kolagenu I na każdą lamelkę w 24-dołkowej płytce do hodowli komórkowej.</li>
			<li>Inkubuj przez 4 h w 37 °C w celu polimeryzacji kolagenu I.</li>
			<li>Po inkubacji usuń nadmiar kolagenu I, przechylając płytkę i odsysając płyn z boku dołka (nie bezpośrednio z lamelki), aby uniknąć uszkodzenia macierzy. 
			UWAGA: Tą macierzy nie można przechowywać. Wysiej komórki natychmiast po usunięciu nadmiaru kolagenu I.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Wysiew komórek, czas hodowli i fiksacja
<ol>
	<li>W zależności od rodzaju komórek, przygotować komórki w odpowiedniej pożywce hodowlanej i dodać komórki tak, aby objętość końcowa wynosiła 500 µL na dołek.</li>
	<li>Aby scharakteryzować zdolność linii komórkowej do tworzenia liniowych invadosomów oraz do degradacji macierzy, wysiać komórki na macierz kolagenu I na 4 h, 12 h i 24 h w celu określenia kinetyki tworzenia liniowych invadosomów i związanej z tym aktywności degradacyjnej. 
	UWAGA: Tabela 1 zawiera przykłady linii komórkowych testowanych w laboratorium.
	<table border="1">
		<tbody >
			<tr >
				<td >Linia komórkowa</td >
				<td >Liczba komórek na szkiełku przedmiotowym</td >
				<td >Czas kontaktu z macierzą dla ilościowego oznaczenia liniowych invadosomów</td >
				<td >Czas kontaktu z macierzą dla ilościowego oznaczenia aktywności degradacyjnej liniowych invadosomów</td >
			</tr >
			<tr >
				<td >MDA MB 231</td >
				<td >40,000</td >
				<td >4 h</td >
				<td >12 h</td >
			</tr >
			<tr >
				<td >HUH7</td >
				<td >40,000</td >
				<td >12 h</td >
				<td >24 h </td >
			</tr >
			<tr >
				<td >HEP 3B</td >
				<td >40,000</td >
				<td >12 h</td >
				<td >24 h </td >
			</tr >
			<tr >
				<td >SNU 398</td >
				<td >40,000</td >
				<td >12 h</td >
				<td >24 h </td >
			</tr >
			<tr >
				<td >NIH 3T3 src</td >
				<td >30,000</td >
				<td >4 h</td >
				<td >12 h</td >
			</tr >
			<tr >
				<td >A431</td >
				<td >50,000</td >
				<td >6 h</td >
				<td >24 h </td >
			</tr >
			<tr >
				<td >A549</td >
				<td >40,000</td >
				<td >12 h</td >
				<td >24 h </td >
			</tr >
			<tr >
				<td >RAW</td >
				<td >40,000</td >
				<td >12 h</td >
				<td >12 h</td >
			</tr >
			<tr >
				<td >PAE</td >
				<td >40,000</td >
				<td >12 h</td >
				<td >12 h</td >
			</tr >
		</tbody >
	</table>
	Tabela 1: Referencyjny czas wysiewania i inkubacji komórek. Tabela ta przedstawia niewyczerpującą listę linii komórkowych wykorzystywanych do badania liniowych invadosomów. Określa ona liczbę komórek do wysiania na macierz, czas niezbędny do zaobserwowania liniowych invadosomów oraz czas niezbędny do zaobserwowania związanej z nimi degradacji macierzy. Liniowe invadosomy mają krótki czas życia. Aby móc zaobserwować liniowe invadosomy w maksymalnej liczbie komórek, muszą one pozostawać w kontakcie z macierzą kolagenu I przez krótki czas. Z drugiej strony, aby móc zwizualizować opisaną degradację żelatyny, komórki muszą pozostawać w kontakcie z macierzą kolagenu I przez dłuższy czas niż wymienione powyżej.</li>
	<li>Po usunięciu pożywki hodowlanej zafiksować szkiełka przedmiotowe przez 10 min w 500 µL 4% paraformaldehydu w 1X PBS.</li>
	<li>Przepłukać dwukrotnie 1x PBS.</li>
	<li>Przechowywać w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem.</li>
</ol>
3. Immunofluorescencja
<ol>
	<li>Przeprowadź permeabilizację komórek przez 10 min, używając świeżo przygotowanego roztworu 0,2% Triton X-100 w 1x PBS. Nie używać tego roztworu ponownie.</li>
	<li>Przemyj szkiełka podstawowe dwukrotnie w 1x PBS.</li>
	<li>Połóż kawałek parafilmu (20 cm x 15 cm) na blacie.</li>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciało pierwotne w 4% albuminie surowiczej bydlęcej (BSA) w 1x PBS, zgodnie z opisem w Tabela materiałów.</li>
	<li>Aliquota 50 µL krople roztworu przeciwciała pierwszego w linii, w odstępach około 1 cm każda.</li>
	<li>Umieść każde szkiełko nakrywkowe na kropli.</li>
	<li>Inkubować przez 40 min w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.</li>
	<li>Po okresie inkubacji przemyć dwukrotnie 1x PBS.</li>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciało wtórne, falloidynę oraz barwnik Hoechst w 4% BSA w 1x PBS.</li>
	<li>Aliquota 50 µL krople mieszaniny, z których każda znajduje się w odległości około 1 cm poniżej pierwszej linii szkiełek nakrywkowych, zgodnie z wcześniejszą procedurą.</li>
	<li>Połóż każde szkiełko nakrywkowe na kropli.</li>
	<li>Inkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.</li>
	<li>Po inkubacji przemyć dwukrotnie 1x PBS.</li>
	<li>Przemyć raz wodą destylowaną w celu usunięcia soli.</li>
	<li>Przymocuj szkiełka nakrywkowe do szkiełka przedmiotowego, używając polimeryzującego medium montażowego.</li>
	<li>Pozostaw szkiełka nakrywki do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez noc, chroniąc je przed światłem, przed przystąpieniem do mikroskopii.</li>
</ol>
4. Ilościowe oznaczenia
<img alt="Analiza komórkowa; kwantyfikacja invadosomów; schemat przetwarzania obrazu; podsumowanie wyników danych." src="/files/ftp_upload/54911/54911fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Liniowa kwantyfikacja invadosomów. Makro wymaga obrazów konfokalnych barwienia F-aktyny i Tks5 (format: 1 024 x 1 024). (A) Najpierw otwórz obraz F-aktyny i utwórz maskę. (B) Następnie otwórz obraz Tks5 i ustaw próg (threshold). Uruchom makro. (C) Analizowane wyniki zostaną wyświetlone w dwóch tabelach. Liczba liniowych invadosomów na komórkę oraz inne informacje, takie jak procentowy obszar zajmowany przez liniowe invadosomy w komórce, znajdą się w tabeli podsumowującej (Summary). Rozmiar każdego liniowego invadosomu zostanie zapisany w tabeli wyników (Results). <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54911/54911fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<ol>
	<li>Procent komórek tworzących liniowe invadosomy
	<ol>
		<li>Policz komórki tworzące liniowe invadosomy, około 100 komórek na szkiełko cover-slip (wykorzystaj triplikaty techniczne). Przeanalizuj co najmniej 300 komórek na n, przy n = 3.</li>
		<li>Oblicz procent komórek tworzących liniowe invadosomes, wyciągając średnią z trzech niezależnych eksperymentów, co daje łącznie 900 przeanalizowanych komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozmiar i liczba liniowych invadosomów na komórkę 
	UWAGA: Użyj mikroskopu konfokalnego do wykonania sekwencyjnych obrazów barwień F-aktyny i Tks5. Makro jest dostosowane do formatu obrazu 1,024 x 1,024.
	<ol>
		<li>Użyj programu ImageJ wraz z makrem uzupełniającym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Degradacja na komórkę
	<ol>
		<li>Użyj trzech szkiełek cover-slip na każdą warunek.</li>
		<li>Wykonaj 30 obrazów na szkiełko, obrazując fluorescencyjną żelatynę oraz jądra barwione Hoechst.</li>
		<li>Użyj oprogramowania ImageJ zgodnie z opisem w pracy Martin KH et al.9.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Test inwazji w 3D kolagenie
<img alt="Schemat testu inwazyjności z komorą Boydena przedstawiający kolagen, migrację komórek nowotworowych oraz etapy utrwalania." src="/files/ftp_upload/54911/54911fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Schemat testu inwazyjności. Podsumowanie protokołu testu inwazyjności. Kolagen I jest sieciowany barwnikiem z estrem sukcynimidylowym i polimeryzowany przez 1 h w 37 °C. Komórki nanosi się w medium bezsurowiczym na wierzch zatyczki z kolagenu I. Wkład nanosi się do medium z 10% FBS. Zatyczki z kolagenu I są utrwalane 1 h po wysianiu komórek w grupie kontrolnej i 3 dni po wysianiu komórek w warunkach eksperymentalnych w celu określenia zdolności inwazyjnych komórek. <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54911/54911fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<ol>
	<li>Przygotowanie wtyczki z kolagenu I
	<ol>
		<li>W pierwszym eksperymencie ustal przebieg czasowy obejmujący 4 h, 12 h, 24 h, 48 h i 72 h, aby określić kinetykę inwazji w głąb żelu w zależności od typu komórek. Dla każdego eksperymentu dodaj punkt czasowy 1 h jako punkt odniesienia, w którym nie zachodzi inwazja.</li>
		<li>Przygotuj roztwór kolagenu I w lodzie pod sterylnym dygestorium z laminarnym przepływem powietrza. Przygotuj 500 µL roztworu na 3 wkładki do komór Boydena.</li>
		<li>Odmiar 1 mg komercyjnego kolagenu I z ogona szczura, aby przygotować roztwór o stężeniu końcowym 2 mg/mL kolagenu I.</li>
		<li>Dodaj ester sukcynimidylowy 5-karboksy-x-rodaminy do stężenia końcowego 1 µg/mL, obliczonego dla końcowej objętości roztworu kolagenu I (w tym przypadku 500 µL).</li>
		<li>Wymieszaj dokładnie i inkubuj przez 5 min w lodzie pod sterylnym dygestorium z laminarnym przepływem powietrza, chroniąc przed światłem.</li>
		<li>Dodaj 50 µL lodowatego, filtrowanego 10X PBS oraz 6,25 µL lodowatego 1 M wodorotlenku sodu (NaOH).</li>
		<li>Dodaj sterylną wodę zgodnie ze wzorem 443,75 - x µL kolagenu I.</li>
		<li>Dodaj 100 µL roztworu do każdej wkładki do komóry Boydena.</li>
		<li>Inkubuj przez 1 h w temperaturze 37 °C, aby umożliwić polimeryzację.</li>
		<li>Do nowych dołków dodaj pożywkę do hodowli komórkowych wzbogaconą płodową surowicą bydlęcą (FBS); umieść wkładki w tych dołkach.</li>
		<li>Wysiej 30 000 komórek na wierzch wtyczki z kolagenu I w pożywce bez FBS.</li>
		<li>Po hodowaniu komórek w 37 °C, utrwal wtyczkę z kolagenu I przez 30 min w 4% paraformaldehydzie w 1x PBS.</li>
		<li>Przeprowadź immunofluorescencję zgodnie z krokiem 3, z wyjątkiem następujących etapów: permeabilizację wykonaj za pomocą 0,2% Triton X-100 w 1x PBS przez 30 min, a nie 10 min; inkubację z roztworami przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych przeprowadź przez 1,5 h dla każdego z nich, zamiast odpowiednio 40 min i 30 min. Wybarw F-aktynę lub jądra komórkowe, aby zlokalizować komórki.</li>
		<li>Po immunofluorescencji użyj skalpela, aby wyciąć obszar wokół membrany wkładki i ostrożnie przenieś wtyczkę z kolagenu I do szalki z szklanym dnem. Upewnij się, że góra wtyczki z kolagenu I styka się ze szkłem. Pozostaw membranę wkładki przymocowaną do spodu wtyczki z kolagenu I, aby zachować jej integralność. 
		UWAGA: Wtyczka z kolagenu I pozostaje nienaruszona w szalce z szklanym dnem. Odległość między szklanym dnem a plastikiem otaczającym szkło odpowiada grubości wtyczki.</li>
		<li>Nałóż szkiełko nakrywkowe na wtyczkę z kolagenu I i zamocuj polimeryzującym medium montującym, aby zapobiec wysychaniu wtyczki.</li>
		<li>Użyj odwróconego mikroskopu konfokalnego do obrazowania wtyczki z kolagenu I; góra wtyczki styka się ze szklanym dnem szalki.
		<ol>
			<li>Wykonaj serię obrazów z-stack od góry do dołu wtyczki z kolagenu I, aby zwizualizować inwazję komórek. Określ grubość z-stack, badając, jak głęboko komórki wnikają w pole obrazowania. Akwizycję przeprowadź przy użyciu obiektywu olejowego 40X w formacie 512 x 512 z rozmiarem kroku z wynoszącym 0,25 μm. 
			UWAGA: Dla odniesienia, średni z-stack dla komórek MDA-MB-231 3 dni po wysianiu wynosi 30 µm.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Ramaswamy, S., Ross, K. N., Lander, E. S., Golub, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+signature+of+metastasis+in+primary+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">A molecular signature of metastasis in primary solid tumors.</a> Nat. Genet. 33, 49-54 (2003).</li>
<li>Gilkes, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+prolyl+hydroxylases+are+essential+for+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Collagen prolyl hydroxylases are essential for breast cancer metastasis.</a> Cancer Res. 73, 3285-3296 (2013).</li>
<li>Linder, S., Wiesner, C., Himmel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degrading+Devices%3A+Invadosomes+in+Proteolytic+Cell+Invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Degrading Devices: Invadosomes in Proteolytic Cell Invasion.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 27, 185-211 (2011).</li>
<li>Murphy, D. A., Courtneidge, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%27ins%27+and+%27outs%27+of+podosomes+and+invadopodia%3A+characteristics%2C+formation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The 'ins' and 'outs' of podosomes and invadopodia: characteristics, formation and function.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 12, 413-426 (2011).</li>
<li>Di Martino, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdc42+and+Tks5%3A+a+minimal+and+universal+molecular+signature+for+functional+invadosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adh.+Migr%22%5BJournal%5D)">Cdc42 and Tks5: a minimal and universal molecular signature for functional invadosomes.</a> Cell Adh. Migr. 8, 280-292 (2014).</li>
<li>Poincloux, R., Lizarraga, F., Chavrier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+invasion+by+tumour+cells%3A+a+focus+on+MT1-MMP+trafficking+to+invadopodia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Matrix invasion by tumour cells: a focus on MT1-MMP trafficking to invadopodia.</a> J. Cell Sci. 122, 3015-3024 (2009).</li>
<li>Juin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+type+I+collagen+organization+induces+the+formation+of+a+novel+class+of+linear+invadosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Physiological type I collagen organization induces the formation of a novel class of linear invadosomes.</a> Mol. Biol. Cell. 23, 297-309 (2012).</li>
<li>Juin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discoidin+domain+receptor+1+controls+linear+invadosome+formation+via+a+Cdc42-Tuba+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Discoidin domain receptor 1 controls linear invadosome formation via a Cdc42-Tuba pathway.</a> J. Cell Biol. 207, 517-533 (2014).</li>
<li>Martin, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+measurement+of+invadopodia-mediated+extracellular+matrix+proteolysis+in+single+and+multicellular+contexts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantitative measurement of invadopodia-mediated extracellular matrix proteolysis in single and multicellular contexts.</a> J. Vis. Exp. , e4119(2012).</li>
<li>Diaz, B. <a target="_blank" href="http://www.bio-protocol.org/e997">Invadopodia detection and gelatin degradation assay.</a> Bio-protocol. 3, 1-8 (2013).</li>
<li>Artym, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dense+fibrillar+collagen+is+a+potent+inducer+of+invadopodia+via+a+specific+signaling+network%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dense fibrillar collagen is a potent inducer of invadopodia via a specific signaling network.</a> J. Cell Biol. 208, 331-350 (2015).</li>
<li>Schachtner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megakaryocytes+assemble+podosomes+that+degrade+matrix+and+protrude+through+basement+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Megakaryocytes assemble podosomes that degrade matrix and protrude through basement membrane.</a> Blood. 121, 2542-2552 (2013).</li>
<li>Schoumacher, M., Glentis, A., Gurchenkov, V. V., Vignjevic, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement+membrane+invasion+assays%3A+native+basement+membrane+and+chemoinvasion+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Basement membrane invasion assays: native basement membrane and chemoinvasion assay.</a> Methods Mol. Biol. 1046, 133-144 (2013).</li>
<li>Wolf, K., Muller, R., Borgmann, S., Brocker, E. B., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amoeboid+shape+change+and+contact+guidance%3A+T-lymphocyte+crawling+through+fibrillar+collagen+is+independent+of+matrix+remodeling+by+MMPs+and+other+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Amoeboid shape change and contact guidance: T-lymphocyte crawling through fibrillar collagen is independent of matrix remodeling by MMPs and other proteases.</a> Blood. 102, 3262-3269 (2003).</li>
<li>Geraldo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+cancer+cells+have+distinct+adhesions+in+3D+collagen+matrices+and+in+vivo%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Do cancer cells have distinct adhesions in 3D collagen matrices and in vivo?</a> Eur. J. Cell Biol. 91, 930-937 (2012).</li>
<li>Monteiro, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomal+WASH+and+exocyst+complexes+control+exocytosis+of+MT1-MMP+at+invadopodia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Endosomal WASH and exocyst complexes control exocytosis of MT1-MMP at invadopodia.</a> J. Cell Biol. 203, 1063-1079 (2013).</li>
<li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen-based+cell+migration+models+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 20, 931-941 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Klasycznie inwadosomy są badane in vitro bez względu na mikrośrodowisko i matrycę, na której są platerowane komórki. Obecnie stosuje się kilka rodzajów matryc, w tym żelatynę, fibronektynę, witronektynę lub kolagen fibrylarny o dużej gęstości (HDFC)7,11; Jednak często nie są one reprezentatywne dla mikrośrodowiska, w którym znajdują się komórki, i nie są fizjologicznie istotne. W tym przypadku zastosowano nowy rodzaj matrycy, który polega na powiązaniu ż...

Przebudowa macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) zachodzi podczas procesów fizjologicznych i patologicznych, takich jak angiogeneza i inwazja komórek nowotworowych. W warunkach fizjologicznych wiele typów komórek, głównie z linii krwiotwórczej, jest zdolnych do degradacji elementów ECM. Na przykład makrofagi są w stanie przekraczać bariery anatomiczne, aby dotrzeć do tkanek, a osteoklasty degradują macierz kostną, aby zapewnić homeostazę wapnia. Mówiąc bardziej globalnie, wszystkie matryce w organizmie odnawiają się, aby zachować swoje właściwości fizyczne i chemiczne. W tkankach nowotworowych skład mikrośrodowiska guza ulega zmianie. Na przykład w raku piersi i płuc kolagen typu I ulega nadekspresji i gromadzi się wokół guza. Co więcej, ta kumulacja wiąże się ze zwiększonym ryzykiem wystąpienia przerzutów1,2. Przerzuty nowotworowe są zależne od zdolności komórek rakowych do degradacji ECM i inwazji sąsiednich tkanek.
Inwazyjna aktywność komórek jest przypisywana wyspecjalizowanym strukturom bogatym w aktynę, znanym jako inwadosomy. Termin ten obejmuje podosomy i inwadopodia, które są obecne odpowiednio w komórkach normalnych i rakowych (np. Makrofagach, komórkach śródbłonka i komórkach rakowych, takich jak linia komórkowa raka piersi MDA-MB-231). In vitro inwadosomy mogą organizować się w różne kształty: kropki, agregaty lub rozety3. Klasycznie inwadosomy składają się z rdzenia F-aktyny zawierającego kilka białek, takich jak białko rusztowania Tks5 i kortaktyna, otoczone cząsteczkami płytki adhezyjnej, takimi jak integryny i winkulina4. Niedawno wykazano, że Tks5 i RhoGTPase Cdc42 mogą być używane jako minimalna sygnatura molekularna dla funkcjonalnych inwadosomów5. Struktury te są zdolne do degradacji ECM poprzez rekrutację i aktywację specyficznych białek metaloproteazy, takich jak MT1-MMP i MMP-26. W poprzednim badaniu informowaliśmy, że interakcja między włókienkami kolagenu typu I a receptorem domeny dyskoidyny 1 (DDR1), specyficznym receptorem włókien kolagenowych typu I, prowadzi do powstania nowej klasy inwadosomów, zwanych inwadosomami liniowymi. Liniowe inwadosomy powstają wzdłuż włókien kolagenu typu I7. Struktury te są zdolne do degradacji włókien kolagenu typu I poprzez rekrutację i aktywację MT1-MMP/MMP2. Co więcej, ich tworzenie jest zależne od Tks5 i Cdc425. In vitro wykazaliśmy istnienie liniowych inwadosomów i udział DDR1 w ich tworzeniu i aktywności8 przy użyciu różnych strategii składających się z kombinacji różnych elementów matrycy, w tym: i) fluorescencyjnych szkiełek nakrywkowych pokrytych żelatyną, ii) fluorescencyjnych szkiełek nakrywkowych pokrytych fibrylami kolagenowymi typu I oraz iii) czopów kolagenowych 3D typu I. Dzięki zastosowaniu różnych matryc byliśmy w stanie zbadać i scharakteryzować liniowe powstawanie inwadosomów oraz ich aktywność degradacyjną7,8.
Na koniec, aby lepiej zrozumieć biologię komórek inwazyjnych, zastosowano kombinację komponentów ECM w systemach hodowli 2D i 3D, naśladując złożoność składu mikrośrodowiska guza. Poniżej znajdują się protokoły powlekania szkiełek nakrywkowych żelatyną/kolagenem typu I w systemach hodowli 2D i 3D.

<table><tbody><tr><td>Roztwór żelatyny</td><td>Sigma</td><td>G1393</td><td>Zapas 20 mg/ml stosowany w stężeniu 1 mg/ml</td></tr><tr><td>Żelatyna ze skóry świni Koniugat Oregon green 488</td><td>Sonda molekularna technologie życia</td><td>G13186</td><td>5 mg rozcieńczony w 1 mg / ml w sterylnej wodzie</td></tr><tr><td>Okulary nakrywkowe do mikroskopu</td><td>Marlenfeld GmbH & Co</td><td>111520</td><td>&Oslash; 12mm No.1</td></tr><tr><td>2,5% Aldehyd glutarowy w 0,1 M bufor kakodylanu sodu pH 7,4</td><td>Mikroskopia elektronowa</td><td>15960</td><td>Rozcieńczyć 0,5% w sterylnej wodzie</td></tr><tr><td>1x PBS pH 7,4</td><td>Gibco by life technologies</td><td>10010-015</td><td>Użyj tego PBS na wszystkich etapach przed utrwaleniem</td></tr><tr><td>Kolagen I Ogon szczura</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>5 karboksyl X rhodamin siccinimidyl ester</td><td>Technologie życiowe</td><td>C-6125</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 1x + wapń + magnez</td><td>Gibco firmy life technologies</td><td>14040-091</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór paraformaldehydu 16%</td><td>Mikroskopia elektronowa</td><td>15710</td><td>Rozcieńczyć 4% w 1X PBS</td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>10x bufor PBS pH 7,4</td><td>Ambion</td><td>AM9625</td><td>Rozcieńczyć w stężeniu 1X w wodzie Stosować stopniowo po utrwaleniu</td></tr><tr><td>Przeciwciało</td> <td>Tks5Santa Cruz</td><td>sc-30122</td><td>Markery inwadosomu Rozcieńczenie: 1/100</td></tr><tr><td>Przeciwciało Cortactin 4F11</td><td>Millipore</td><td>5180</td><td>Markery inwadosomu Rozcieńczenie: 1/100</td></tr><tr><td>Przeciwciało DDR1</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>5583</td><td>Liniowy receptor inwadosomu</td></tr><tr><td>Rozcieńczenie: 1/100</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin FluoProbes</td><td>Interchim</td><td>FT-AZ0330</td><td>Fibrylarny marker aktynowy Rozcieńczenie :1/200</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Sigma</td><td>33258</td><td>Marker jądra Rozcieńczenie: 1/200</td></tr><tr><td>Przeciwciała drugorzędowe FluoProbes</td><td>Interchim</td><td>FP-488 FP-547H lub FP-647H</td><td></td></tr><tr><td>Albumina z surowicy bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td>Rozcieńczyć w 4% w 1X PBS</td></tr><tr><td>Fluoromount G podłoże montażowe</td><td>Interchim</td><td>FP 483331</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie ImageJ</td><td>Domena</td><td></td> <td>publicznahttp://www.macbiophotonics.ca/imagej/</td></tr> <tr><td>Wkładka do hodowli komórkowych</td><td>Corning</td><td>353097</td><td>8.0 i mikro; m wielkość porów / 24 dołki</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu (NaOH)</td> <td>Sigma</td><td>221465</td><td></td></tr></tbody></table>

macierze 2d i 3d do badania liniowego powstawania i aktywności inwadosomów

2D and 3D Matrices to Study Linear Invadosome Formation and Activity

Przyleganie, migracja i inwazja komórek są zaangażowane w wiele procesów fizjologicznych i patologicznych. Na przykład podczas tworzenia przerzutów komórki nowotworowe muszą przekraczać bariery anatomiczne, aby zaatakować i migrować przez otaczającą tkankę, aby dotrzeć do naczyń krwionośnych lub limfatycznych. Wymaga to interakcji między komórkami a macierzą zewnątrzkomórkową (ECM). Na poziomie komórkowym wiele komórek, w tym większość komórek nowotworowych, jest w stanie tworzyć inwadosomy, które są strukturami opartymi na F-aktynie zdolnymi do degradacji ECM. Inwadosomy to wystające struktury aktynowe, które rekrutują i aktywują metaloproteinazy macierzy (MMP). Skład molekularny, gęstość, organizacja i sztywność ECM mają kluczowe znaczenie w regulacji tworzenia i aktywacji inwadosomu. In vitro test żelatyny jest standardowym testem stosowanym do obserwacji i ilościowego określenia aktywności degradacji inwadosomu. Jednak żelatyna, która jest denaturowanym kolagenem I, nie jest fizjologicznym elementem matrycy. Opracowano nowatorski test z wykorzystaniem włókien kolagenu typu I, który wykorzystano do wykazania, że ta fizjologiczna matryca jest silnym induktorem inwadosomów. Inwadosomy, które tworzą się wzdłuż włókien kolagenowych, są znane jako inwadosomy liniowe ze względu na ich liniową organizację na włóknach. Co więcej, analiza molekularna liniowych inwadosomów wykazała, że receptor domeny dyskoidyny 1 (DDR1) jest receptorem zaangażowanym w ich powstawanie. Dane te wyraźnie pokazują, jak ważne jest stosowanie fizjologicznie istotnej matrycy w celu zrozumienia złożonych interakcji między komórkami a ECM.

Wykorzystując kombinację dwóch rodzajów matryc, żelatyny i kolagenu typu I (Rysunki 1 i 4), wyróżniliśmy nowy typ invadosomów, znany jako invadosomy liniowe. Znakowanie tych matryc umożliwia obserwację formowania się liniowych invadosomów wzdłuż włókien kolagenu I oraz ich zdolności do degradacji (Rysunek 5). Liczbę struktur inwazyjnych można następnie określić ilościowo za pomocą makra opisanego wcześniej (krok 4.2), a aktywność degradac...

Ten protokół opisuje, jak przygotować mieszaną matrycę 2D, składającą się z żelatyny i kolagenu I, oraz wtyczkę 3D kolagenu I do badania liniowych inwadosomów. Protokoły te pozwalają na badanie liniowego tworzenia inwadosomu, aktywności degradacji macierzy oraz zdolności inwazji komórek pierwotnych i linii komórek rakowych.

Macierze 2D i 3D do badania liniowego powstawania i aktywności inwadosomów

Cell adhesion, migration, and invasion are involved in many physiological and pathological processes. For example, during metastasis formation, tumor ...

Nasza grupa zajmuje się interakcją między komórką a macierzą zewnątrzkomórkową. Komórki mogą produkować, ale także mogą degradować element macierzy zewnątrzkomórkowej. Degradacja macierzy może wystąpić podczas procesów fizjologicznych, ale także patologicznych, takich jak neurodegenza i inwazja guza komórkowego.Na poziomie komórkowym możemy zauważyć obecność struktury opartej na aktynie, która bierze udział w degradacji macierzy. Struktury te nazywane są inwadosomami. Inwadosom, to ogólny termin obejmujący podosomy w normalnych komórkach i inwadopodia w komórkach rakowych.Degradacja tego inwadosomu może być samoorganizująca się w różne kształty, kropki, agregaty i rozety. Aktywność tego inwazosomu jest napędzana przez metaloproteinazy, takie jak MMP2 i MT1-MMP. Nie jest to długotrwałe, że para, MMP2, MT1-MMP jest aktywowana przez włókienka kolagenu typu 1.Do zbadania aktywności inwadosomów wykorzystano klasyczny test zymograficzny in-situ. Aby jednak zbadać rolę i wpływ włókien kolagenu typu 1 na inwadosomy, postanowiliśmy stworzyć nowy test. W tym celu stworzyliśmy mieszaną matrycę złożoną z żelatyny i włókien kolagenu typu 1.W tym filmie w pierwszej części Eloide Henriet pokaże Ci, w jaki sposób generujemy tego rodzaju matrycę. W drugiej części Zakaria Ezzoukhry pokaże Ci, w jaki sposób jesteśmy w stanie zmierzyć wpływ włókien kolagenu typu 1 na morfologię, tworzenie i aktywację inwadosomów. A w ostatniej części Julie Di Marino pokaże Ci, jak dostosowujemy test inwazji kolagenu 3D.Pokażę Ci, jak przygotować matrycę mieszaną złożoną z żelatyny i włókienek kolagenu typu 1. Zrobię dwa rodzaje matrycy mieszanej. Jeden do wykonania testu symografii in-situ z żelatyną fluoresceinową i kolagenem niefluoresceinowym typu 1.I drugi, który pozwala nam uwidocznić włókna kolagenowe za pomocą żelatyny niefluoresceinowej i znakowanych włókien kolagenowych. Aby przygotować matrycę żelatynową, podnieś 20 mikrolitrowych kropelek żelatyny na kawałku parafilmu. Przykryj każdą kroplę autoklawizowanym szkiełkiem nakrywkowym.Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut i chronić przed światłem. Do utrwalania żelatyny podwielokrotność 40 mikrolitrów kropelek 0,5% aldehydu glutarowego w PBS. Za pomocą kleszczyków przenieś szkiełka nakrywkowe pokryte żelatyną na każdą kroplę aldehydu glutarowego.Inkubować w temperaturze pokojowej przez 40 minut i chronić przed światłem. Weź wielodołkową płytkę do hodowli komórkowej i napełnij każdą studzienkę 500 mikrolitrami sterylnego 1X PBS. Pod koniec okresu inkubacji umieścić każde szkiełko nakrywkowe żelatynową stroną do góry w każdym dołku.Umyj szkiełka nakrywkowe dwa razy w 1X PBS przez pięć minut każde. Na tym etapie szkiełka nakrywkowe mogą być używane do eksperymentów lub przechowywane do późniejszego wykorzystania. Pipetę 0,4 mg na ml kolagenu jeden do probówki.Dodać barwnik fluorescencyjny do końcowego stężenia 10 mikrogramów na ml. Wymieszać roztwór w probówce i inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Rozcieńczyć do końcowej objętości 1x DPBS i dodać 500 mikrolitrów roztworu na wierzch szkiełek nakrywkowych pokrytych żelatyną na płytce wielodołkowej.Inkubować przez cztery godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu polimeryzacji kolagenu. Po inkubacji usuń nadmiar kolagenu. Dodaj komórki do końcowej objętości 500 mikrolitrów i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przed utrwaleniem.Ten rodzaj matryc może być modyfikowany innymi elementami matrycy, takimi jak fibronektyna, witronektyna lub kolagen typu IV. Ze swojej strony pokażę Ci, jak przeprowadzić immunofluorescencję za pomocą Tks5, markera inwadosomów, oraz jak określić ilościowo liniowe inwadosomy na szkiełkach nakrywkowych pokrytych kolagenem typu 1. Możemy przedstawić wyniki według liczby komórek obecnych w liniowych inwadosomach, ale także możemy przedstawić liczbę struktur w każdej komórce.Utrwal szkiełka nakrywkowe przez 10 minut w 500 mikrolitrach 4% paraformaldehydu w PBS. Przemyć dwukrotnie 1x PBS i przepuścić komórki 0,2%Triton X-100 w 1x PBS przez 10 minut. Podwielokrotność 50 mikrolitrów roztworu przeciwciała pierwszorzędowego w 4% BSA w 1x PBS na kawałku parafilmu.Umieść każde szkiełko nakrywkowe na kropli. Inkubować przez 40 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Przemyć szkiełka nakrywkowe dwukrotnie 1x PBS i inkubować szkiełka nakrywkowe w przeciwciałie wtórnym, koloidynie i barwniku Hoechst przez 30 minut, chroniąc przed światłem.Po inkubacji przemyć dwukrotnie 1x PBS, a następnie wodą destylowaną w celu usunięcia soli. Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełku podstawowym z polimeryzującym medium montażowym. Pozostaw szkiełko do wyschnięcia na noc w temperaturze pokojowej przed obrazowaniem.W celu analizy obrazu uzyskaj obraz aktyny i Tks5 sekwencyjnie za pomocą mikroskopu konfokalnego. Aby określić ilościowo rozmiar i liczbę liniowych inwadosomów na komórkę, użyj oprogramowania ImageJ i dostarczonego makra. Najpierw uruchom makro w ImageJ i otwórz obraz aktyny.Następnie otwórz obraz Tks5. Ustaw próg i zastosuj makro. Przeanalizowane wyniki pojawią się w dwóch tabelach.Liczba inwadosomów liniowych na komórkę i inne informacje, takie jak procentowy obszar używany przez inwadosomy liniowe w komórce, będą znajdować się w tabeli podsumowania. Rozmiar każdego liniowego inwadosomu będzie znajdował się w tabeli wyników. Po kwantyfikacji obrazów możemy przedstawić wyniki, pokazując liczbę struktur w komórce.Tak więc z mojej strony adaptujemy metodę do wykazania obecności liniowych inwadosomów w 3D. Zdaliśmy sobie sprawę, że żel składa się tylko z włókienek kolagenu i ten test służy do oceny inwazji komórek w kontekście kolagenu. Przygotować roztwór kolagenu typu 1 na lodzie o końcowym stężeniu dwóch mg na ml.Dodaj barwnik fluorescencyjny w końcowym stężeniu jednego mikrograma na mililitr. Wymieszać roztwór i inkubować na lodzie przez pięć minut, chroniąc przed światłem. Następnie dodaj 50 mikrolitrów lodowatego 10x PBS.Następnie dodaj 6,25 mikrolitra lodowatego jednomolowego wodorotlenku sodu. Dodaj sterylną wodę, aby uzyskać odpowiednie stężenie i wymieszaj roztwór. Umieść wkładki komory Boydena w wielodołkowym naczyniu do hodowli komórkowych.Dodaj 100 mikrolitrów kolagenu po jednym roztworze do każdej wkładki. Aby spolimeryzować żel kolagenowy, inkubuj naczynie przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dodaj pożywkę do hodowli komórkowych wzbogaconą surowicą do każdej studzienki i umieść wkładki w pożywce.Wysiewaj 30 000 komórek w pożywce bez surowicy na wierzchu żelu kolagenowego. Aby naprawić komórki, dodaj 4% roztwór paraformaldehydu do pustej studzienki. Wyjmij pożywkę komórkową z wkładu, nie dotykając żelu kolagenowego.Umieść wkładkę w studzienkach z 4% roztworem paraformaldehydu i dodaj dodatkowy 4% roztwór paraformaldehydu na wierzch żelu kolagenowego. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Po utrwaleniu usunąć 4% roztwór paraformaldehydu i przemyć 1x PBS.Po umyciu żel kolagenowy powinien stać się przezroczysty. Teraz wkładki są gotowe do immunofluorescencji. Najpierw opróżnij wkładki.Następnie umieść wkładki w nowych dołkach płytki wielodołkowej. Aby przepuszczalność komórek, dodaj roztwór 0,2% Triton X-100 w 1X PBS na wierzch żelu kolagenowego przez 30 minut. Opróżnij wkładki.Umyj 1X PBS i dodaj pierwszorzędowy roztwór przeciwciał na wierzch żelu kolagenowego przez godzinę chronioną przed światłem. Usuń roztwór przeciwciała pierwotnego, przemyj 1X PBS i inkubuj żel kolagenowy z roztworem przeciwciała wtórnego przez 1,5 godziny, chroniąc przed światłem. Przemyć roztwór przeciwciał drugorzędowych 1X PBS.Aby przygotować żel kolagenowy do montażu, należy przeciąć membranę wkładu za pomocą skalpela. Umieść żel kolagenowy przymocowany do membrany w naczyniu ze szklanym dnem. Ważne jest, aby górna część żelu stykała się z dnem naczynia.Dodaj nośnik montażowy i szkiełko nakrywkowe na wierzchu do obserwacji mikroskopowej. Dzięki temu testowi wykazaliśmy kluczową rolę receptora DDR1 w inwazji komórek w żelu kolagenowym. Test ten może być również stosowany do oceny wpływu leków na inwazję komórek.W naszym innym badaniu wykazaliśmy, że samo dodanie nowego elementu macierzy zewnątrzkomórkowej w jej fizjologicznym potwierdzeniu, w tym przypadku włókien kolagenu typu 1, może modyfikować morfologię, skład molekularny i aktywność inwadosomów. Używając różnych testów opisanych w tym filmie, wykazaliśmy istnienie nowych struktur, nowej organizacji inwadosomu, którą nazwaliśmy inwadosomami liniowymi. Generując złożone i bardziej fizjologiczne matryce, umożliwiamy identyfikację nowych szlaków związanych z dodawaniem, migracją i inwazją komórek.

2d-and-3d-matrices-to-study-linear-invadosome-formation-and-activity

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Modele inwazji komórek nowotworowych do trójwymiarowej macierzy zewnątrzkomórkowej lepiej odzwierciedlają sytuację in vivo niż dwuwymiarowe testy motylości. Dzięki zastosowaniu testów inwazji do macierzy w połączeniu z obrazowaniem konfokalnym komórek znakowanych fluorescencyjnie można uzyskać szczegółowe informacje na temat trybów inwazji oraz odrębnego wkładu komórek prowadzących i podążających.

Modelowanie i obrazowanie trójwymiarowej zbiorowej inwazji komórek

Procesy komórkowe, takie jak migracja komórek, były tradycyjnie badane na dwuwymiarowych, sztywnych powierzchniach plastikowych. Niniejszy raport opisuje technikę bezpośredniej wizualizacji lokalizacji białek oraz analizy dynamiki białek w komórkach migrujących w bardziej fizjologicznie istotnej macierzy trójwymiarowej.

Obrazowanie żywych komórek migrujących, wykazujących ekspresję białek z fluorescencyjnym znacznikiem, w macierzy trójwymiarowej

Opisujemy prototypową metodę przygotowania szkiełek podstawowych pokrytych fluorescencyjną żelatyną w celu wizualizacji degradacji macierzy pośrednio przez invadopodia. Przedstawiono techniki obliczeniowe z wykorzystaniem dostępnego oprogramowania do kwantyfikacji poziomu proteolizy macierzy przez pojedyncze komórki w obrębie mieszanej populacji oraz przez grupy wielokomórkowe obejmujące całe pola widzenia mikroskopu.

Ilościowy pomiar proteolizy macierzy zewnątrzkomórkowej zależnej od invadopodiów w kontekście jednokomórkowym i wielokomórkowym

Ten artykuł przedstawia metodę fluorescencyjnego znakowania kolagenu, która może być dalej wykorzystywana zarówno do obrazowania na żywo, jak i do obrazowania na żywo kultur komórkowych 3D. Zapewniamy również zoptymalizowany protokół wizualizacji endogennych białek cytoszkieletu komórek hodowanych w środowiskach 3D.

Odkrywanie organizacji cytoszkieletu inwazyjnych komórek nowotworowych w 3D

Ten protokół skutecznie bada podział komórek ssaków w matrycach kolagenowych 3D poprzez integrację synchronizacji podziału komórek, monitorowanie zdarzeń podziału w matrycach 3D za pomocą techniki obrazowania żywych komórek, czasowo-rozdzielczą konfokalną mikroskopię refleksyjną i ilościową analizę obrazowania.

Podział komórek ssaków w matrycach 3D za pomocą ilościowej konfokalnej mikroskopii refleksyjnej

Ten protokół opisuje odwrócony test inwazji pionowej, który może być użyty do ilościowego określenia zdolności migracji i inwazji komórek w trójwymiarowym otoczeniu, przy jednoczesnym zachowaniu mikrośrodowiska komórki. Ten test jest odpowiedni dla rzadkich i/lub wrażliwych komórek.

Ruch w górę: prosty i elastyczny protokół trójwymiarowego testu inwazyjnego in vitro

Obecny protokół opisuje zintegrowaną metodę badania migracji i inwazji komórek rakowych na jednej platformie w czasie rzeczywistym, zapewniając łatwą do odtworzenia i efektywną czasowo opcję badania mobilności i morfologii komórek.

Prosty przepływ pracy migracji/inwazji przy użyciu zautomatyzowanego imagera Live Cell

Mikrośrodowisko guza jest istotną częścią wzrostu i inwazji raka. Aby naśladować postęp raka, potrzebna jest biologicznie istotna ludzka matryca. Protokół ten wprowadza ulepszenie trójwymiarowego testu inwazji sferoidalnej in vitro poprzez zastosowanie ludzkiej matrycy opartej na mięśniaku gładkokomórkowym. Protokół wprowadza również komputerową analizę inwazji komórek.

W pełni ludzka matryca oparta na guzie w trójwymiarowym teście inwazji sferoidów

Inwazja jest głównym zjawiskiem biologicznym w rozwoju i postępie raka. Na proces ten mają wpływ komórki nienowotworowe i składniki mikrośrodowiska guza. Celem pracy jest opisanie alternatywnej metody analizy inwazji komórek nowotworowych in vitro z wykorzystaniem kultur trójwymiarowych (3D).

Alternatywna strategia analizy inwazji komórek in vitro w kulturach 3D

Zaprojektowano cykliczny bioreaktor ciśnieniowy, który umożliwia poddawanie tkanki zastawek serca fizjologicznym oraz patologicznym warunkom ciśnieniowym. Program LabVIEW pozwala użytkownikom na kontrolowanie wartości, amplitudy oraz częstotliwości ciśnienia. Urządzenie to może być wykorzystywane do badania mechanobiologii tkanki zastawek serca lub izolowanych komórek.

Projekt cyklicznego bioreaktora ciśnieniowego do badań ex vivo zastawek tętniczych serca

Poznaj metodę przygotowania macierzy 2D i 3D do badania liniowych inwadosomów oraz degradacji macierzy pozakomórkowej. Protokół umożliwia analizę inwazyjności komórek nowotworowych.

Macierze 2D i 3D do badania liniowego powstawania i aktywności inwadosomów

Przeglądaj więcej filmów