Macierze 2D i 3D do badania liniowego powstawania i aktywności inwadosomów

Nasza grupa zajmuje się interakcją między komórką a macierzą zewnątrzkomórkową. Komórki mogą produkować, ale także mogą degradować element macierzy zewnątrzkomórkowej. Degradacja macierzy może wystąpić podczas procesów fizjologicznych, ale także patologicznych, takich jak neurodegenza i inwazja guza komórkowego.

Na poziomie komórkowym możemy zauważyć obecność struktury opartej na aktynie, która bierze udział w degradacji macierzy. Struktury te nazywane są inwadosomami. Inwadosom, to ogólny termin obejmujący podosomy w normalnych komórkach i inwadopodia w komórkach rakowych.

Degradacja tego inwadosomu może być samoorganizująca się w różne kształty, kropki, agregaty i rozety. Aktywność tego inwazosomu jest napędzana przez metaloproteinazy, takie jak MMP2 i MT1-MMP. Nie jest to długotrwałe, że para, MMP2, MT1-MMP jest aktywowana przez włókienka kolagenu typu 1.

Do zbadania aktywności inwadosomów wykorzystano klasyczny test zymograficzny in-situ. Aby jednak zbadać rolę i wpływ włókien kolagenu typu 1 na inwadosomy, postanowiliśmy stworzyć nowy test. W tym celu stworzyliśmy mieszaną matrycę złożoną z żelatyny i włókien kolagenu typu 1.

W tym filmie w pierwszej części Eloide Henriet pokaże Ci, w jaki sposób generujemy tego rodzaju matrycę. W drugiej części Zakaria Ezzoukhry pokaże Ci, w jaki sposób jesteśmy w stanie zmierzyć wpływ włókien kolagenu typu 1 na morfologię, tworzenie i aktywację inwadosomów. A w ostatniej części Julie Di Marino pokaże Ci, jak dostosowujemy test inwazji kolagenu 3D.

Pokażę Ci, jak przygotować matrycę mieszaną złożoną z żelatyny i włókienek kolagenu typu 1. Zrobię dwa rodzaje matrycy mieszanej. Jeden do wykonania testu symografii in-situ z żelatyną fluoresceinową i kolagenem niefluoresceinowym typu 1.

I drugi, który pozwala nam uwidocznić włókna kolagenowe za pomocą żelatyny niefluoresceinowej i znakowanych włókien kolagenowych. Aby przygotować matrycę żelatynową, podnieś 20 mikrolitrowych kropelek żelatyny na kawałku parafilmu. Przykryj każdą kroplę autoklawizowanym szkiełkiem nakrywkowym.

Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut i chronić przed światłem. Do utrwalania żelatyny podwielokrotność 40 mikrolitrów kropelek 0,5% aldehydu glutarowego w PBS. Za pomocą kleszczyków przenieś szkiełka nakrywkowe pokryte żelatyną na każdą kroplę aldehydu glutarowego.

Inkubować w temperaturze pokojowej przez 40 minut i chronić przed światłem. Weź wielodołkową płytkę do hodowli komórkowej i napełnij każdą studzienkę 500 mikrolitrami sterylnego 1X PBS. Pod koniec okresu inkubacji umieścić każde szkiełko nakrywkowe żelatynową stroną do góry w każdym dołku.

Umyj szkiełka nakrywkowe dwa razy w 1X PBS przez pięć minut każde. Na tym etapie szkiełka nakrywkowe mogą być używane do eksperymentów lub przechowywane do późniejszego wykorzystania. Pipetę 0,4 mg na ml kolagenu jeden do probówki.

Dodać barwnik fluorescencyjny do końcowego stężenia 10 mikrogramów na ml. Wymieszać roztwór w probówce i inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Rozcieńczyć do końcowej objętości 1x DPBS i dodać 500 mikrolitrów roztworu na wierzch szkiełek nakrywkowych pokrytych żelatyną na płytce wielodołkowej.

Inkubować przez cztery godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu polimeryzacji kolagenu. Po inkubacji usuń nadmiar kolagenu. Dodaj komórki do końcowej objętości 500 mikrolitrów i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przed utrwaleniem.

Ten rodzaj matryc może być modyfikowany innymi elementami matrycy, takimi jak fibronektyna, witronektyna lub kolagen typu IV. Ze swojej strony pokażę Ci, jak przeprowadzić immunofluorescencję za pomocą Tks5, markera inwadosomów, oraz jak określić ilościowo liniowe inwadosomy na szkiełkach nakrywkowych pokrytych kolagenem typu 1. Możemy przedstawić wyniki według liczby komórek obecnych w liniowych inwadosomach, ale także możemy przedstawić liczbę struktur w każdej komórce.

Utrwal szkiełka nakrywkowe przez 10 minut w 500 mikrolitrach 4% paraformaldehydu w PBS. Przemyć dwukrotnie 1x PBS i przepuścić komórki 0,2%Triton X-100 w 1x PBS przez 10 minut. Podwielokrotność 50 mikrolitrów roztworu przeciwciała pierwszorzędowego w 4% BSA w 1x PBS na kawałku parafilmu.

Umieść każde szkiełko nakrywkowe na kropli. Inkubować przez 40 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Przemyć szkiełka nakrywkowe dwukrotnie 1x PBS i inkubować szkiełka nakrywkowe w przeciwciałie wtórnym, koloidynie i barwniku Hoechst przez 30 minut, chroniąc przed światłem.

Po inkubacji przemyć dwukrotnie 1x PBS, a następnie wodą destylowaną w celu usunięcia soli. Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełku podstawowym z polimeryzującym medium montażowym. Pozostaw szkiełko do wyschnięcia na noc w temperaturze pokojowej przed obrazowaniem.

W celu analizy obrazu uzyskaj obraz aktyny i Tks5 sekwencyjnie za pomocą mikroskopu konfokalnego. Aby określić ilościowo rozmiar i liczbę liniowych inwadosomów na komórkę, użyj oprogramowania ImageJ i dostarczonego makra. Najpierw uruchom makro w ImageJ i otwórz obraz aktyny.

Następnie otwórz obraz Tks5. Ustaw próg i zastosuj makro. Przeanalizowane wyniki pojawią się w dwóch tabelach.

Liczba inwadosomów liniowych na komórkę i inne informacje, takie jak procentowy obszar używany przez inwadosomy liniowe w komórce, będą znajdować się w tabeli podsumowania. Rozmiar każdego liniowego inwadosomu będzie znajdował się w tabeli wyników. Po kwantyfikacji obrazów możemy przedstawić wyniki, pokazując liczbę struktur w komórce.

Tak więc z mojej strony adaptujemy metodę do wykazania obecności liniowych inwadosomów w 3D. Zdaliśmy sobie sprawę, że żel składa się tylko z włókienek kolagenu i ten test służy do oceny inwazji komórek w kontekście kolagenu. Przygotować roztwór kolagenu typu 1 na lodzie o końcowym stężeniu dwóch mg na ml.

Dodaj barwnik fluorescencyjny w końcowym stężeniu jednego mikrograma na mililitr. Wymieszać roztwór i inkubować na lodzie przez pięć minut, chroniąc przed światłem. Następnie dodaj 50 mikrolitrów lodowatego 10x PBS.

Następnie dodaj 6,25 mikrolitra lodowatego jednomolowego wodorotlenku sodu. Dodaj sterylną wodę, aby uzyskać odpowiednie stężenie i wymieszaj roztwór. Umieść wkładki komory Boydena w wielodołkowym naczyniu do hodowli komórkowych.

Dodaj 100 mikrolitrów kolagenu po jednym roztworze do każdej wkładki. Aby spolimeryzować żel kolagenowy, inkubuj naczynie przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dodaj pożywkę do hodowli komórkowych wzbogaconą surowicą do każdej studzienki i umieść wkładki w pożywce.

Wysiewaj 30 000 komórek w pożywce bez surowicy na wierzchu żelu kolagenowego. Aby naprawić komórki, dodaj 4% roztwór paraformaldehydu do pustej studzienki. Wyjmij pożywkę komórkową z wkładu, nie dotykając żelu kolagenowego.

Umieść wkładkę w studzienkach z 4% roztworem paraformaldehydu i dodaj dodatkowy 4% roztwór paraformaldehydu na wierzch żelu kolagenowego. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Po utrwaleniu usunąć 4% roztwór paraformaldehydu i przemyć 1x PBS.

Po umyciu żel kolagenowy powinien stać się przezroczysty. Teraz wkładki są gotowe do immunofluorescencji. Najpierw opróżnij wkładki.

Następnie umieść wkładki w nowych dołkach płytki wielodołkowej. Aby przepuszczalność komórek, dodaj roztwór 0,2% Triton X-100 w 1X PBS na wierzch żelu kolagenowego przez 30 minut. Opróżnij wkładki.

Umyj 1X PBS i dodaj pierwszorzędowy roztwór przeciwciał na wierzch żelu kolagenowego przez godzinę chronioną przed światłem. Usuń roztwór przeciwciała pierwotnego, przemyj 1X PBS i inkubuj żel kolagenowy z roztworem przeciwciała wtórnego przez 1,5 godziny, chroniąc przed światłem. Przemyć roztwór przeciwciał drugorzędowych 1X PBS.

Aby przygotować żel kolagenowy do montażu, należy przeciąć membranę wkładu za pomocą skalpela. Umieść żel kolagenowy przymocowany do membrany w naczyniu ze szklanym dnem. Ważne jest, aby górna część żelu stykała się z dnem naczynia.

Dodaj nośnik montażowy i szkiełko nakrywkowe na wierzchu do obserwacji mikroskopowej. Dzięki temu testowi wykazaliśmy kluczową rolę receptora DDR1 w inwazji komórek w żelu kolagenowym. Test ten może być również stosowany do oceny wpływu leków na inwazję komórek.

W naszym innym badaniu wykazaliśmy, że samo dodanie nowego elementu macierzy zewnątrzkomórkowej w jej fizjologicznym potwierdzeniu, w tym przypadku włókien kolagenu typu 1, może modyfikować morfologię, skład molekularny i aktywność inwadosomów. Używając różnych testów opisanych w tym filmie, wykazaliśmy istnienie nowych struktur, nowej organizacji inwadosomu, którą nazwaliśmy inwadosomami liniowymi. Generując złożone i bardziej fizjologiczne matryce, umożliwiamy identyfikację nowych szlaków związanych z dodawaniem, migracją i inwazją komórek.