Zoptymalizowany protokół analizy glikolizy i oddychania mitochondrialnego w limfocytach

Ogólnym celem tej procedury jest dokładny pomiar glikolizy i oddychania mitochondrialnego w limfocytach z wykorzystaniem analizy przepływu zewnątrzkomórkowego. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu immunometabolizmu, takie jak zmiany metaboliczne zachodzące w komórkach odpornościowych podczas aktywacji, różnicowania lub w przebiegu choroby. Główną zaletą tej techniki jest możliwość wydajnej analizy profili metabolicznych ponad 90 próbek jednocześnie w czasie rzeczywistym.

Choć metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat metabolizmu limfocytów, można ją zastosować również do innych komórek, w tym komórek nieprzylegających, które wymagają dodania do płytki przy minimalnym zakłóceniu ich funkcjonalności. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ limfocyty są delikatne i wymagają ostrożnego obchodzenia się z nimi w celu zachowania ich funkcjonalności oraz żywotności. W dniu poprzedzającym eksperyment należy podnieść kasetę z czujnikami analizatora przepływu zewnątrzkomórkowego i napełnić każdą studzienkę płytki pomocniczej 200 µL roztworu kalibracyjnego.

Następnie opuść kasetę na płytkę, zanurzając czujniki w roztworze kalibracyjnym, i inkubuj kasetę przez noc w inkubatorze w temperaturze 37 °C bez dwutlenku węgla lub azotu. Następnego dnia rano pokryj każde dołeczki płytki do analizy 96-dołkowej 25 µL roztworu adhezyjnego i inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Po zakończeniu inkubacji odessaj substancję adhezyjną i przemyj każdą dołeczkę dwukrotnie 200 µL sterylnej wody.

Podczas wysychania płytki na powietrzu umieść sitko do komórek o rozmiarze oczek 70 µm na probówce stożkowej o pojemności 50 mL i przenieś pobrane organy na sitko. Używając tłoka z jałowej strzykawki o pojemności 3 mL, rozgnieć tkankę przez sitko, utrzymując filtr i organy w stanie wilgotnym przez cały proces maceracji poprzez dodawanie buforu MS w razie potrzeby. Następnie przemyj sitko od 5 do 10 mL buforu MS, a następnie odwirowuj otrzymaną zawiesinę komórkową.

Resuspendować osad w pięciu mililitrach buforu do lizy erytrocytów ACK. Po pięciu minutach na lodzie przywrócić gęstość za pomocą 10 do 20 mililitrów buforu MS i ponownie odwirować komórki. Po zakończeniu wirowania umieścić sitko komórkowe o oczkach 30 µm nad stożkową probówką o pojemności 15 mililitrów i przygotować sitko, przepłukując je jednym mililitrem buforu MS.

Resuspenduj komórki w pięciu mililitrach świeżego buforu MS i przefiltruj zawiesinę komórkową przez sitko, aby usunąć agregaty lizowanych erytrocytów. Dodaj cztery mililitry świeżego buforu MS, aby wypłukać pustą probówkę do lizy, a następnie przepuść płuczkę przez sitko. Policz komórki i odlicz odpowiednią liczbę splenocytów do analizy strumienia zewnątrzkomórkowego (extracellular flux assay).

Następnie odwiruj oba zestawy komórek, resuspendując próbkę splenocytów do analizy strumienia zewnątrzkomórkowego w pięciu mililitrach medium RF 10 na lodzie. Resuspenduj komórki do izolacji za pomocą kulek w odpowiednich objętościach koktajlu przeciwciał biotynylowych, mikrokulek antybiotynowych oraz buforu MS na wskazany czas inkubacji w temperaturze od dwóch do ośmiu stopni Celsjusza. Po zakończeniu drugiej inkubacji zbierz komórki poprzez wirowanie i resuspenduj osad w 500 mikrolitrach świeżego buforu MS na każde 1 × 10⁸ komórek.

Następnie załaduj odpowiednią kolumnę na magnes separacyjny i przygotuj kolumnę, przepuszczając przez nią 3 mL buforu MS, odrzucając przelew. Umieść sterylną probówkę stożkową o pojemności 15 mL pod kolumną i załaduj na kolumnę całą objętość próbki komórkowej. Następnie przepłucz probówkę z inkubacją komórek 3 mL świeżego buforu MS, zbierając płuczkę do probówki stożkowej.

Po zebraniu ostatniej frakcji eluatem należy dopełnić probówkę buforem MS do końcowej objętości 15 mililitrów i odwirować komórki wyizolowane negatywnie. Następnie osad należy resuspender w pięciu mililitrach świeżego medium RF 10 na lodzie. Nie później niż trzy godziny po izolacji należy odwirować wszystkie próbki komórek i resuspender osady w pięciu mililitrach odpowiedniego medium do analizy, a następnie ponownie odwirować.

Po drugim wirowaniu resuspenduj osady do odpowiedniego stężenia eksperymentalnego, aby uzyskać końcową objętość 180 µL komórek na studzienkę w świeżym medium do analizy, a następnie nanieś 180 µL komórek do każdej studzienki płytki. Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C przez 25 minut. Następnie odwiruj płytkę, aby zapewnić trwałe przyleganie komórek do dna studzienek, i wprowadź płytkę z powrotem do inkubatora.

Po 30 minutach za pomocą mikropipety należy nanieść świeżo przygotowane związki w temperaturze 37 °C do odpowiednich portów wtryskowych kasety sensorycznej analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego, wypełniając porty kontrolne i nieeksperymentalne samym medium. Należy umieścić załadowaną kasetę z powrotem w inkubatorze i skonfigurować program analizy strumienia zewnątrzkomórkowego. Następnie należy załadować kasetę i rozpocząć program, zastępując płytkę kalibracyjną płytką do analizy po zakończeniu kalibracji, zgodnie z komunikatem systemu.

Po przeprowadzeniu analizy przepływu zewnątrzkomórkowego należy przystąpić do pomiarów zawartości białka. Ponad 90% wszystkich populacji komórek jest żywotnych, a w przypadku limfocytów zaobserwowano czystość na poziomie od 98 do 99%. Konfluencja każdego typu komórek koreluje z początkową gęstością wysiewu.

Stężenia białek w lizacie korelują liniowo z gęstością wysiewu, co potwierdza, że stężenia białek mogą być wykorzystane do dokładnej normalizacji danych dotyczących przepływu zewnątrzkomórkowego. Wyższa liczba komórek koreluje z wyższym zmierzonym tempem zużycia tlenu, a także z silniejszą odpowiedzią na inhibitory mitochondrialne. Wyższe gęstości wysiewu skutkują podobnymi znormalizowanymi pomiarami tempa zużycia tlenu w limfocytach T i splenocytach, natomiast wysiew 5 × 10⁵ oraz 1,25 × 10⁵ komórek na studzienkę prowadzi do podobnych znormalizowanych pomiarów tempa zużycia tlenu w limfocytach B.

Parametry oddychania mitochondrialnego wykazują również liniową korelację z gęstością wysiewu komórek. Dodatkowo niski poziom przecieku protonów wskazuje, że większość podstawowego oddychania jest wykorzystywana do syntezy ATP. Wyższa gęstość wysiewu skutkuje wyższymi wskaźnikami zakwaszenia zewnątrzkomórkowego oraz silniejszą odpowiedzią na inhibitory mitochondrialne.

Parametry glikolizy korelują liniowo z gęstością wysiewu komórek, przy czym ustalono, że wysoka gęstość wysiewu jest najbardziej optymalna dla pomyślnego przeprowadzenia testu stresu glikolitycznego. Glukoza nieznacznie stymuluje oddychanie mitochondrialne, które jest hamowane przez oligomycynę, podczas gdy 2-DG nie wpływa znacząco na zużycie tlenu. Po opanowaniu techniki proces ten może zostać ukończony w ciągu sześciu do ośmiu godzin, pod warunkiem prawidłowego wykonania.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o utrzymywaniu komórek w lodzie przed analizą strumienia zewnątrzkomórkowego oraz o dokładnym policzeniu i wysianiu komórek. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak pomiar potencjału mitochondrialnego i poboru glukozy, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące stanu metabolicznego komórek. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak izolować limfocyty oraz jak przeprowadzić analizę strumienia zewnątrzkomórkowego.