Name: Zoptymalizowany protokół analizy glikolizy i oddychania mitochondrialnego w limfocytach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Poznaj zoptymalizowaną metodę analizy glikolizy i oddychania mitochondrialnego w limfocytach myszy przy użyciu testu strumienia pozakomórkowego. Technika umożliwia badanie immunometabolizmu w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują dr Michaelowi N. Sackowi (National Heart, Lung, and Blood Institute) za wsparcie i dyskusję, Pani Ann Kim za optymalizację protokołu izolacji komórek B, dr Josephowi Brzostowskiemu za pomoc w mikroskopii oraz Pani Mirnie Peña za utrzymanie wykorzystywanych zwierząt. Badanie to było wspierane przez Intramural Research Programs National Institutes of Health, National Institute of Allergy and Infectious Diseases oraz National Heart, Lung, and Blood Institute.

<ol><li>Motz, G. T., Coukos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+and+reversing+tumor+immune+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Deciphering and reversing tumor immune suppression.</a> Immunity. 39 (1), 61-73 (2013).</li>
<li>Akkaya, M., Barclay, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+pathogens+drive+the+evolution+of+paired+receptors%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">How do pathogens drive the evolution of paired receptors?</a> Eur J Immunol. 43 (2), 303-313 (2013).</li>
<li>Smith-Garvin, J. E., Koretzky, G. A., Jordan, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">T cell activation.</a> Annu Rev Immunol. 27, 591-619 (2009).</li>
<li>Dinarello, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proinflammatory+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Proinflammatory cytokines.</a> Chest. 118 (2), 503-508 (2000).</li>
<li>Kurosaki, T., Kometani, K., Ise, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Memory B cells.</a> Nat Rev Immunol. 15 (3), 149-159 (2015).</li>
<li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).</li>
<li>Pearce, E. L., Poffenberger, M. C., Chang, C. H., Jones, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fueling+immunity%3A+insights+into+metabolism+and+lymphocyte+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fueling immunity: insights into metabolism and lymphocyte function.</a> Science. 342 (6155), 1242454(2013).</li>
<li>Gerriets, V. A., Rathmell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+pathways+in+T+cell+fate+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Metabolic pathways in T cell fate and function.</a> Trends Immunol. 33 (4), 168-173 (2012).</li>
<li>Doughty, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+receptor-mediated+changes+in+glucose+metabolism+in+B+lymphocytes%3A+role+of+phosphatidylinositol+3-kinase+signaling+in+the+glycolytic+control+of+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Antigen receptor-mediated changes in glucose metabolism in B lymphocytes: role of phosphatidylinositol 3-kinase signaling in the glycolytic control of growth.</a> Blood. 107 (11), 4458-4465 (2006).</li>
<li>Caro-Maldonado, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+reprogramming+is+required+for+antibody+production+that+is+suppressed+in+anergic+but+exaggerated+in+chronically+BAFF-exposed+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Metabolic reprogramming is required for antibody production that is suppressed in anergic but exaggerated in chronically BAFF-exposed B cells.</a> J Immunol. 192 (8), 3626-3636 (2014).</li>
<li>Pelletier, M., Billingham, L. K., Ramaswamy, M., Siegel, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+flux+analysis+to+monitor+glycolytic+rates+and+mitochondrial+oxygen+consumption%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Extracellular flux analysis to monitor glycolytic rates and mitochondrial oxygen consumption.</a> Methods Enzymol. 542, 125-149 (2014).</li>
<li>Mookerjee, S. A., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+and+Analysis+of+Extracellular+Acid+Production+to+Determine+Glycolytic+Rate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate.</a> J Vis Exp. (106), e53464(2015).</li>
<li>Chacko, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+defining+distinct+bioenergetic+profiles+in+platelets%2C+lymphocytes%2C+monocytes%2C+and+neutrophils%2C+and+the+oxidative+burst+from+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Methods for defining distinct bioenergetic profiles in platelets, lymphocytes, monocytes, and neutrophils, and the oxidative burst from human blood.</a> Lab Invest. 93 (6), 690-700 (2013).</li>
<li>Klein, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+different+cell+isolation+techniques+on+lymphocyte+viability+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunoassay+Immunochem%22%5BJournal%5D)">Impact of different cell isolation techniques on lymphocyte viability and function.</a> J Immunoassay Immunochem. 27 (1), 61-76 (2006).</li>
<li>Hsueh, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+Characterization+of+Mouse+Splenic+B+Lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22AfCS+Research+Reports%22%5BJournal%5D)">Purification and Characterization of Mouse Splenic B Lymphocytes.</a> AfCS Research Reports. 1 (1), 1-11 (2012).</li>
<li>Zambrano, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+ex+vivo+expansion+and+differentiation+of+naive+murine+CD43+B+splenocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Prog%22%5BJournal%5D)">Prolonged ex vivo expansion and differentiation of naive murine CD43 B splenocytes.</a> Biotechnol Prog. , (2016).</li>
<li>Costa, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+rare+populations+of+murine+antigen-specific+T+lymphocytes+by+retroviral+transduction+for+potential+application+in+gene+therapy+for+autoimmune+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Targeting rare populations of murine antigen-specific T lymphocytes by retroviral transduction for potential application in gene therapy for autoimmune disease.</a> J Immunol. 164 (7), 3581-3590 (2000).</li>
<li>Franz, B., May, K. F., Dranoff, G., Wucherpfennig, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+characterization+and+isolation+of+rare+memory+B+cells+with+antigen+tetramers%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Ex vivo characterization and isolation of rare memory B cells with antigen tetramers.</a> Blood. 118 (2), 348-357 (2011).</li>
<li>Schneider, D. F., Glenn, C. H., Faunce, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+lymphocyte+subsets+and+their+immunoregulatory+roles+in+burn+injury+and+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Burn+Care+Res%22%5BJournal%5D)">Innate lymphocyte subsets and their immunoregulatory roles in burn injury and sepsis.</a> J Burn Care Res. 28 (3), 365-379 (2007).</li>
<li>Reeves, J. P., Reeves, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+lymphoid+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Removal of lymphoid organs.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 1, Unit 1 9(2001).</li>
<li>Akkaya, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple%2C+Versatile+Antibody-Based+Barcoding+Method+for+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">A Simple, Versatile Antibody-Based Barcoding Method for Flow Cytometry.</a> J Immunol. 197 (5), 2027-2038 (2016).</li>
<li>Traba, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fasting+and+refeeding+differentially+regulate+NLRP3+inflammasome+activation+in+human+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Fasting and refeeding differentially regulate NLRP3 inflammasome activation in human subjects.</a> J. Clin. Invest. 125 (12), 4592-4600 (2015).</li>
<li>Wick, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+the+Primary+Metabolic+Block+Produced+by+2-Deoxyglucose%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Localization of the Primary Metabolic Block Produced by 2-Deoxyglucose.</a> J. Biol. Chem. 224 (2), 963-969 (1957).</li>
<li>Linnett, P. E., Beechey, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+the+ATP+synthetase+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of the ATP synthetase system.</a> Methods Enzymol. 55, 472-518 (1979).</li>
<li>Terada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncouplers+of+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Uncouplers of oxidative phosphorylation.</a> Environmental Health Perspectives. 87, 213-218 (1990).</li>
<li>Mookerjee, S. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+Maximum+Glycolytic+Capacity+Using+Extracellular+Flux+Measurements%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Determining Maximum Glycolytic Capacity Using Extracellular Flux Measurements.</a> PLOS ONE. 11 (3), e0152016(2016).</li>
<li>Lai, L., Alaverdi, N., Maltais, L., Morse, H. C. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+cell+surface+antigens%3A+nomenclature+and+immunophenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mouse cell surface antigens: nomenclature and immunophenotyping.</a> J Immunol. 160 (8), 3861-3868 (1998).</li>
<li>Gerberick, G. F., Cruse, L. W., Miller, C. M., Sikorski, E. E., Ridder, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+modulation+of+T+cell+memory+markers+CD62L+and+CD44+on+murine+draining+lymph+node+cells+following+allergen+and+irritant+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Appl+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Selective modulation of T cell memory markers CD62L and CD44 on murine draining lymph node cells following allergen and irritant treatment.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 146 (1), 1-10 (1997).</li>
<li>Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contributions+of+respiration+and+glycolysis+to+extracellular+acid+production%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta+-+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production.</a> Biochim. Biophys. Acta - Bioenergetics. 1847 (2), 171-181 (2015).</li>
<li>Buck, M. D., O'Sullivan, D., Pearce, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+metabolism+drives+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">T cell metabolism drives immunity.</a> J Exp Med. 212 (9), 1345-1360 (2015).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych. Opłaty za otwarty dostęp do tego artykułu zostały zapewnione przez Agilent Technologies.

Opracowany przez nas protokół pozwolił na skuteczną izolację czystych i żywotnych podzbiorów limfocytów, które następnie wykorzystano w analizie strumienia zewnątrzkomórkowego w różnych stężeniach w celu oceny różnic w wydajności glikolizy i oddychania mitochondrialnego. Protokół ten został opracowany specjalnie dla limfocytów i odnosi się do specjalnych względów związanych z tymi typami komórek, takich jak niska podstawowa aktywność metaboliczna, kruchość, niska częstotliwość i ich niezdolność do przylegania do płytek testowych. Dlatego też, w porównaniu z poprzednio opublikowanymi protokołami11,12, nasza metoda stanowi wygodniejszy i lepiej zoptymalizowany przewodnik dla badaczy pracujących w dziedzinie immunologii. W tym protokole jest kilka krytycznych etapów, w tym uzyskanie czystych i żywotnych populacji komórek, posianie komórek w optymalnym zbiegu i standaryzacja pomiarów strumienia zewnątrzkomórkowego do stężenia białka w każdym dołku.
Początkową liczbę posianych komórek można zarówno uwidocznić za pomocą mikroskopii świetlnej, jak i określić ilościowo za pomocą pomiarów stężenia białka. Liniowa korelacja między liczbą komórek a stężeniem białka potwierdziła, że stężenie białka może być rzeczywiście wykorzystane jako sposób na standaryzację skutków zmian liczby komórek między różnymi dołkami.
Standaryzując wyniki ECAR i OCR do stężeń białek, wykazaliśmy, że pomimo mniejszej konfluencji komórek, w większości testów można użyć zaledwie 2,5 x 105 komórek/studzienkę bez uszczerbku dla jakości danych. Jednak dolna granica komórek, które można wykorzystać, różniła się w zależności od typu komórki i testów. Na przykład, podczas gdy do pomiarów OCR komórek B można było użyć zaledwie 1,25 x 105 komórek, nawet 2,5 x 105 komórek / studzienka nie wystarczyło do oceny wydajności glikolitycznej tego samego typu komórek. Dlatego, o ile liczba komórek nie jest czynnikiem ograniczającym, preferowane jest posiewanie przy ponad 90% zbiegu, co w przybliżeniu odpowiada 5 x 105 limfocytów / studzienkę. Dalsza optymalizacja może być wymagana, gdy wykorzystywane są komórki o różnych rozmiarach, takie jak wcześniej aktywowane i częściowo zróżnicowane limfocyty. Dodatkowo, przy użyciu wcześniej hodowanych limfocytów pierwotnych, mogą wystąpić różnice w żywotności komórek między różnymi warunkami leczenia, co zmniejszyłoby wiarygodność stężenia białka jako miary liczby komórek, ponieważ martwe lub umierające komórki mogą również przyczyniać się do mierzonych poziomów białka. W takich przypadkach pomocne może być sortowanie żywych komórek za pomocą cytometrii przepływowej przed przeprowadzeniem testów strumienia zewnątrzkomórkowego.
W naszych testach z wykorzystaniem świeżo wyizolowanych i wysoce żywotnych populacji limfocytów uzyskaliśmy wiarygodne dane funkcjonalne zarówno dla pomiarów OCR, jak i ECAR. Podczas gdy wszystkie typy komórek zachowywały się podobnie w teście stresu mitochondrialnego, w teście stresu glikolizy zaobserwowano uderzające różnice między typami komórek. Na przykład wydajność glikoliczna naiwnych limfocytów T była niska w porównaniu ze splenocytami lub komórkami B i nie zmieniała się po dodaniu oligomycyny. Obserwacja ta jest zgodna z wcześniej opublikowanymi badaniami7,30, potwierdzającymi ważność naszego protokołu.
Podsumowując, nasza metoda oferuje skuteczny i wygodny sposób testowania aktywności metabolicznej limfocytów za pomocą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego i może być przydatna w szerokim zakresie badań immunologicznych badających zmiany metaboliczne w komórkach odpornościowych po aktywacji, różnicowaniu komórek lub z powodu fenotypów chorobowych, takich jak infekcje, autoimmunizacja i nowotwory hematologiczne.

Odpowiedź immunologiczna przeciwko antygenom to ściśle regulowana równowaga między aktywacją immunologiczną a supresją immunologiczną. Aktywacja immunologiczna napędza szybką proliferację i migrację komórek, a także produkcję cytokin, wydzielanie przeciwciał i zwiększoną fagocytozę w odpowiedzi na stymulant, podczas gdy supresja immunologiczna po prostu hamuje te zdarzenia i dlatego jest ważna w zapobieganiu niepotrzebnym odpowiedziom immunologicznym1-6. Ostatnie badania wykazały, że istnieje bezpośredni związek między stanem aktywacji komórek odpornościowych a aktywnością różnych szlaków metabolicznych7. Komórki odpornościowe mogą przełączać się między stanem spoczynku a stanem aktywowanym, włączając i wyłączając szlaki wytwarzania energii. Ponadto zaobserwowano, że różne typy komórek odpornościowych mogą wykorzystywać różne strategie metaboliczne, aby zaspokoić swoje zwiększone zapotrzebowanie na energię podczas aktywacji. Na przykład, podczas gdy aktywacja limfocytów T kieruje komórki do prawie całkowicie glikolitycznegostanu 8, aktywowane limfocyty B wykorzystują równowagę glikolizy i fosforylacji oksydacyjnej9,10. Badania te wskazują na znaczenie badania wpływu aktywacji komórek odpornościowych na metabolizm komórkowy.
W czasie rzeczywistym, jednoczesne pomiary wskaźnika zużycia tlenu (OCR) i wskaźnika zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR), jako wskaźników fosforylacji oksydacyjnej i glikolizy, to powszechna strategia rozwiązywania stanów szlaków produkcji energii11-13. Aby to osiągnąć, rutynowo stosuje się analizator strumienia zewnątrzkomórkowego, taki jak Seahorse XF 96. Takie urządzenie może szybko porównywać zmiany w OCR i ECAR w różnych typach komórek lub w różnych warunkach stymulacji. Do tej pory za pomocą tych urządzeń badano różne typy komórek, w tym komórki odpornościowe. Jednak zoptymalizowany protokół zaprojektowany specjalnie dla komórek odpornościowych nie jest dostępny.
Komórki odpornościowe, szczególnie limfocyty, różnią się od innych typów komórek na kilka kluczowych sposobów. Limfocyty to delikatne komórki, które nie przeżywają przez długi czas w warunkach ex vivo 14-16. Jest to jeszcze większy problem, gdy są one hodowane w nieoptymalnych pożywkach wzrostowych pozbawionych niezbędnych składników odżywczych, takich jak te używane w analizie strumienia zewnątrzkomórkowego. W przeciwieństwie do makrofagów i wielu linii komórkowych, limfocyty nie przylegają do powierzchni plastikowych; Dlatego tak ważne jest, aby przymocować je do płyty analitycznej bez generowania naprężeń. Wreszcie, niektóre subpopulacje limfocytów mogą być niezwykle rzadkie, a zebranie ich w wymaganych, optymalnych ilościach może być wyzwaniem17-19.
Tutaj oferujemy zoptymalizowany protokół, który został opracowany specjalnie dla limfocytów. Za pomocą splenocytów, limfocytów B i naiwnych limfocytów T CD4 + wyizolowanych ze śledziony i węzłów chłonnych myszy20 pokazujemy charakterystykę ich glikolizy w stanie spoczynku i fosforylacji oksydacyjnej przy różnych gęstościach komórek. Dane znormalizowano w celu uwzględnienia różnic w początkowej liczbie komórek dla każdej studzienki poprzez pomiar stężeń białka lizatu komórkowego w teście końcowym, które były wprost proporcjonalne do liczby komórek. Nasz protokół nie tylko zawiera wytyczne dotyczące szybkiej izolacji żywotnych limfocytów do testów strumienia zewnątrzkomórkowego, ale także pozwala na pracę przy nieoptymalnych stężeniach komórek bez uszczerbku dla jakości danych.

<table><tbody><tr><td>PBS (pH 7,2)</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>20012-050</td><td>Aby zrobić bufor MACS</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3803</td><td>Aby zrobić bufor MACS</td></tr><tr><td>0,5 M EDTA, pH 8</td><td>Jakość Biologiczna</td><td>10128-446</td><td>Aby zrobić bufor MACS</td></tr><tr><td>autoMACS roztwór płuczący</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>Zamiast PBS + EDTA do wytworzenia buforu MS. Używany również w autoMACS Pro Separator.</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>11875-093</td><td>Zawiera czerwień fenolową i L-glutaminę</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>10437-028</td><td>W celu inaktywacji termicznej rozmrozić zamrożoną butelkę bulionową w temperaturze 37 &; C kąpieli wodnej, a następnie dezaktywować w temperaturze 56 & stopni; C przez 30 min. Podwielokrotność surowicy inaktywowanej termicznie do przechowywania (np. , w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml) i zamrażać w temperaturze -20 °; C, dopóki nie będzie potrzebny.&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (ang. Pen)</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>15140-122</td><td>Połącz Pen Strep z L-Glut 1:1 (jeśli robisz 500 ml pożywki, otrzymaj w sumie 12 ml Pen Strep/L-Glut); Utrzymuj podwielokrotności na poziomie -20 &deg; C, aż będzie gotowy do tworzenia multimediów.</td></tr><tr><td>L-Glutamina 200 mM (L-Glut)</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>25030-081</td><td>Składnik RF10 i pożywka do testów warunków skrajnych</td></tr><tr><td>Pirogronian sodu 100 mM</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>11360-070</td><td>Składnik RF10 i pożywka do testów warunków skrajnych</td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>15630-080</td><td>Składnik RF10</td></tr><tr><td>MEM Roztwór aminokwasów endogennych (100x)</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>11140-050</td><td>Składnik RF10</td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol (55 mM)</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>21985-023</td><td>Składnik RF10</td></tr><tr><td>Falcon 70 &mu; m Sitko do komórek</td><td>Falcon-Fischer Scientific</td><td>87712</td><td>Stosowany w izolacji komórek</td></tr><tr><td>Monoject 3 ml Strzykawka, końcówka Luer-Lock</td><td>Covidien</td><td>8881513934</td><td>Stosowany w izolacji komórek</td></tr><tr><td>Falcon 15 ml Stożkowe probówki wirówkowe&nbsp;</td><td>Falcon-Fischer Scientific</td><td>14-959-53A</td><td>Stosowany w izolacji komórek</td></tr><tr><td>Stożkowe probówki wirówkowe Falcon 50 ml&nbsp;</td><td>Falcon-Fischer Scientific</td><td>14-432-22</td><td>Stosowany w izolacji komórek</td></tr><tr><td>ACK Lysing Buffer</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td>Stosowany w izolacji komórek</td></tr><tr><td>CellTrics 30 &mu; m filtr komórkowy, sterylny, pakowany pojedynczo</td><td>Partec CellTrics</td><td>04-004-2326</td><td>Stosowany w izolacji komórek</td></tr><tr><td>B Zestaw do izolacji komórek, mysz</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-862</td><td>Stosowany w izolacji komórek</td></tr><tr><td>Na&iuml; ve CD4+ Zestaw do izolacji komórek T, mysz</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-104-453</td><td>Stosowany w izolacji komórek</td></tr><tr><td>LS Kolumna</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>Stosowany w izolacji komórek</td></tr><tr><td>Separator MidiMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td>Magnes do separacji</td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td>Uchwyt na magnesy</td></tr><tr><td>Roztwór płuczący autoMACS</td><td>130-091-222</td><td>Roztwór płuczący do separatora autoMACS Pro</td>Separator autoMACS Pro Miltenyi Biotec N/A 2-Deoxy-D-glucose (2-DG)Sigma-Aldrich D8375-5G Cell-Tak Corning 354240 Klej do komórek.<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Zwróć uwagę na stężenie, ponieważ każda partia jest inna (opakowanie to 1 mg).</td></tr><tr><td>Oligomycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75351</td><td></td></tr><tr><td>2,4-dinotrofenol (2,4-DNP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D198501</td><td></td></tr><tr><td>Antymycyna A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy Halt</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78429</td><td>Dostarczany jako 100x koktajl, połącz z RIPA, aby uzyskać 1x roztwór do lizy.</td></tr><tr><td>RIPA Buffer</td><td>Boston BioProducts</td><td>BP-115</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Zestaw do oznaczania białek</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23225</td><td>Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 FluxPak</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>101085-004</td><td>Zawiera płytki testowe, wkłady, prowadnice ładowania do przenoszenia związków do wkładu testowego oraz roztwór kalibru.</td></tr><tr><td>Seahorse XF Base Medium Seahorse</td><td>Bioscience</td><td>102353-100</td><td>Służy do przygotowania podłoża do testów warunków skrajnych</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 Zewnątrzkomórkowy analizator strumienia</td><td>Seahorse Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stericup Sterylne filtry próżniowe, 0,22 i mu; m</td><td>EMD Millipore-Fisher Scientific</td><td>SCGPU10RE</td><td>Służy do sterylnego medium filtracyjnego.</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>487031</td><td>rozpuszczony do 0,1 M i użyty do rozcieńczenia Cell-Tak.</td></tr></tbody></table>

zoptymalizowany protokół analizy glikolizy i oddychania mitochondrialnego w limfocytach

An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes

Limfocyty reagują na różne bodźce, aktywując wewnątrzkomórkowe szlaki sygnałowe, co z kolei prowadzi do szybkiej proliferacji, migracji i różnicowania komórek oraz produkcji cytokin. Wszystkie te zdarzenia są ściśle związane ze stanem energetycznym komórki, a zatem badanie ścieżek wytwarzających energię może dostarczyć wskazówek na temat ogólnej funkcjonalności tych komórek. Analizator strumienia zewnątrzkomórkowego jest powszechnie stosowanym urządzeniem do oceny wydajności glikolizy i oddychania mitochondrialnego w wielu typach komórek. System ten został wykorzystany do badania komórek odpornościowych w kilku opublikowanych raportach, jednak brakuje kompleksowego protokołu zoptymalizowanego szczególnie pod kątem limfocytów. Limfocyty to delikatne komórki, które słabo przeżywają w warunkach ex vivo. Często podzbiory limfocytów są rzadkie, a praca z niską liczbą komórek jest nieunikniona. W związku z tym potrzebna jest eksperymentalna strategia, która rozwiąże te trudności. W tym miejscu udostępniamy protokół, który pozwala na szybką izolację żywotnych limfocytów z tkanek limfatycznych oraz analizę ich stanów metabolicznych w analizatorze strumienia zewnątrzkomórkowego. Ponadto przedstawiono wyniki eksperymentów, w których porównano aktywność metaboliczną kilku podtypów limfocytów przy różnych gęstościach komórek. Obserwacje te sugerują, że nasz protokół może być stosowany do osiągania spójnych, dobrze ustandaryzowanych wyników nawet przy niskich stężeniach komórek, a tym samym może mieć szerokie zastosowanie w przyszłych badaniach koncentrujących się na charakterystyce zdarzeń metabolicznych w komórkach odpornościowych.

Komórki eukariotyczne wykorzystują zintegrowaną sieć glikolizy, cyklu kwasów trójkarboksylowych (cyklu TCA) oraz fosforylacji oksydacyjnej, aby zaspokoić większość swoich potrzeb energetycznych i dostarczyć produktów pośrednich niezbędnych do wzrostu i proliferacji komórek. Szlaki te rozpoczynają się od wewnątrzkomórkowego uwięzienia wolnej glukozy w formie glukozo-6-fosforanu, który następnie jest przekształcany w pirogronian. Pirogronian jest albo redukowany do mleczanu, albo transportowany do mitochondriów, gdzie tworzy acetylo-koenzym A (CoA). Acetylo-CoA wchodzi następnie w cykl TCA. Wysokoenergetyczne produkty pośrednie cyklu TCA napędzają ruch elektronów w łańcuchu transportu elektronów (ETC), który z kolei wypompowuje H+ z macierzy mitochondrialnej w celu wytworzenia gradientu H+ przez wewnętrzną błonę mitochondrialną. Tlen działa jako ostateczny akceptor elektronów, a H+ powracają do macierzy mitochondrialnej poprzez kompleks FO/F1, gdzie ich energia potencjalna jest wykorzystywana do generowania ATP (Rysunek 1A).
Zasada działania analizy przepływu zewnątrzkomórkowego opiera się na ingerencji w glikolizę i fosforylację oksydacyjną w określonych punktach oraz ocenie wynikających z tego efektów. W tym celu zastosowano glukozę do pobudzenia glikolizy w komórkach głodzących oraz 2-deoksyglukozę (2-DG), która jest przekształcana przez heksokinazę w 2-deoksyglukozę-6-fosforan, będący konkurencyjnym inhibitorem fosfoglukozisomerazy23, aby zablokować glikolizę. Rotenon (specyficzny inhibitor kompleksu I łańcucha transportu elektronów – ETC), antymycyna A (specyficzny inhibitor kompleksu III ETC), oligomycyna (inhibitor syntazy ATP24) oraz czynnik rozprzęgający 2,4-dinitrofenol (DNP)25 zostały użyte do interwencji w konkretne procesy związane z transportem elektronów, gradientem protonowym i syntezą ATP (Rysunek 1A). Zamiast 2,4-DNP można zastosować cyjanek karbonylu-4-(trifluorometoksy)fenylohydrazonu (FCCP), jednak może to wymagać dalszej optymalizacji. W obu przypadkach przed użyciem należy zawsze przeprowadzić miareczkowanie rozprzęgaczy dla konkretnego typu komórek, aby określić niezbędną optymalną koncentrację.
Test stresu glikolitycznego (Rycina 1B) rozpoczyna się od pomiaru bazowego tempa zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR) w komórkach uprzednio poddanych głodzeniu. Ponieważ komórki te znajdują się na poziomie bazowego minimum i mogą zatem być praktycznie uznane za nieglikolityczne, ECAR zmierzony w tym punkcie określa się jako zakwaszenie nieglikolityczne. Zakwaszenie to prawdopodobnie odpowiada oddechowemu CO2 generowanemu w cyklu TCA, który jest przekształcany w HCO3- i H+. Następnie następuje wstrzyknięcie glukozy w celu aktywacji glikolizy, co objawia się wzrostem zakwaszenia zewnątrzkomórkowego w wyniku tworzenia mleczanu. Wzrost ten reprezentuje normalne tempo glikolizy. Następnie komórki są poddawane działaniu oligomycyny, która blokuje generowanie ATP poprzez fosforylację oksydacyjną. Komórki reagują na ten gwałtowny spadek produkcji ATP poprzez aktywację glikolizy do jej maksymalnego poziomu, co skutkuje wtórnym wzrostem poziomu ECAR (rezerwa glikolityczna). Test kończy się całkowitym zahamowaniem glikolizy przy użyciu analogu glukozy 2-DG, co przywraca ECAR do poziomu nieglikolitycznego. Co ciekawe, zasugerowano, że wbrew zaleceniom producenta, maksymalna glikoliza niekoniecznie jest osiągana po wstrzyknięciu oligomycyny26. W komórkach o wysokiej wydajności glikolitycznej, jeśli nie nastąpi znaczący wzrost zapotrzebowania na ATP, glikoliza może być w pełni w stanie zrekompensować utratę ATP mitochondrialnego bez konieczności jej zwiększania. Tempo glikolizy z oligomycyną może zostać przekroczone poprzez dodanie inhibitorów oddechowych, takich jak rotenon i miksotiazol, co daje kilka korzyści w porównaniu z oligomycyną: 1) zwiększają one zapotrzebowanie na ATP, ponieważ powodują odwrócenie działania syntazy ATP, z hydrolizą ATP w celu pompowania protonów w próbie przywrócenia potencjału błony mitochondrialnej26; 2) zapobiegają oddechowemu zakwaszeniu medium, co może zaburzać wyniki ECAR (patrz poniżej). Inne sposoby zwiększenia zapotrzebowania na ATP obejmują dodanie związków stymulujących hydrolizę ATP przez ATP-azy błony komórkowej26. Wszystko to powinno być starannie rozważone przez badaczy podczas planowania testu stresu glikolitycznego.
Test stresu mitochondrialnego (Rysunek 1C) rozpoczyna się od pomiaru podstawowego tempa zużycia tlenu (OCR) w komórkach nienachodzących. Następnie wstrzykuje się oligomycynę, która hamuje powrót protonów przez kompleks FO/F1, co prowadzi do szybkiej hiperpolaryzacji błony mitochondrialnej. Hiperpolaryzacja zapobiega dalszemu pompowaniu protonów przez kompleksy oddechowe, w wyniku czego tempo oddychania spada. Pozostałe oddychanie określa się mianem przecieku protonowego, który reprezentuje przepływ protonów przez lipidy lub inne kanały. Ten stan hiperpolaryzacji jest szybko odwracany przez dodatek środka odsprzęgającego 2,4-DNP, który działa jako jonofor protonowy. W odpowiedzi komórki próbują odzyskać potencjał błonowy w daremnej próbie, zwiększając tempo transportu elektronów do maksimum, co z kolei zwiększa OCR. Na koniec, po dodaniu dwóch inhibitorów ETC (antymycyny A i rotenonu), oddychanie mitochondrialne całkowicie ustaje, a OCR spada do najniższego poziomu. Na tym etapie zużycie tlenu nie wynika z aktywności mitochondrialnej (zużycie niemitochondrialne). Różnica w OCR wywołana przez te inhibitory jest określana jako maksymalne oddychanie mitochondrialne, które stanowi sumę oddychania podstawowego i wydajności rezerwowej.
Izolacje limfocytów B i T pozwalają na uzyskanie wysoce żywotnych, czystych populacji limfocytów.
Limfocyty B oraz naiwne limfocyty T CD4+ wyizolowano zgodnie z opisem w sekcji 4 protokołu, natomiast splenocyty uzyskano poprzez lizę krwinek czerwonych, zgodnie z opisem w sekcji 3.3.
Czułość specyficznych dla typu komórek analiz metabolicznych zależy od żywotności i czystości wyjściowej populacji komórek. Dlatego, aby zweryfikować żywotność wyizolowanych limfocytów T, splenocytów i limfocytów B myszy oraz czystość limfocytów T i B, niewielkie aliquoty komórek poddano barwieniu do analizy cytometrycznej (Rysunek 2). Na wykresie rozpraszania przedniego względem bocznego (FSC-A vs. SSC-A) wyznaczono bramkę dla limfocytów, a w obrębie tej bramki populację wzdłuż przekątnej na wykresie wysokości rozpraszania przedniego (FSC-H) względem FSC-A określono jako singlety. W populacji singletów żywotność mierzono poprzez bramkowanie komórek wykazujących brak barwienia dla markera żywe/martwe (Rysunek 2A); żywotność limfocytów T wyniosła 97,9%, żywotność splenocytów 92%, a żywotność limfocytów B 94%. Czystość limfocytów B, mierzona na podstawie populacji B20+ CD19+26, wyniosła 9%, natomiast czystość limfocytów T CD4+, mierzona na podstawie populacji CD4- CD4+27, wyniosła 98,3% (Rysunek 2B).
Stężenie białka w lizacie komórkowym może służyć jako bezpośredni wskaźnik liczby wysianych komórek.
Wyizolowane limfocyty i splenocyty wysiano na pokrytą substancją adhezyjną płytkę 96-dołkową w zagęszczeniach 5 x 105 komórek/dołek, 2,5 x 105 komórek/dołek, 1,25 x 105 komórek/dołek oraz 0,625 x 105 komórek/dołek. Stopień zrastania (konfluencja) dla każdego zagęszczenia wysiewu trzech typów komórek została zobrazowana pod mikroskopem świetlnym (Rysunek 3A). Zgodnie z oczekiwaniami, konfluencja korelowała z początkowymi zagęszczeniami wysiewu. Po zakończeniu analizy strumienia zewnątrzkomórkowego (extracellular flux assay) wysiane komórki poddano lizie, a ich stężenie białka wyznaczono za pomocą testu BCA. Dla wszystkich typów komórek wykazano liniową korelację stężeń białka w lizatach z początkowymi zagęszczeniami wysiewu (Rysunek 3B), co potwierdza, że stężenia białka w lizatach mogą służyć jako dokładna miara do normalizacji liczby komórek podczas interpretacji danych ze strumienia zewnątrzkomórkowego. Zagęszczenia wysiewu zastosowane w tym eksperymencie zostały zoptymalizowane dla naiwnych, niepobudzonych limfocytów. W przypadku użycia komórek pobudzonych lub wcześniej hodowanych może być wymagana dalsza optymalizacja.
Testy stresu mitochondrialnego i glikolitycznego są zależne od liczby wysianych komórek.
Wartość OCR była mierzona dla każdego typu komórek i gęstości wysiewu w analizatorze strumienia zewnątrzkomórkowego. Zgodnie z oczekiwaniami, większa liczba komórek przekładała się na wyższy mierzony OCR, a także na gwałtowniejsze odpowiedzi na oligomycynę, 2,4-DNP oraz antymycynę A/rotenon (Rysunek 4A). Standaryzacja pomiarów OCR do stężenia białka w każdej próbce ujawniła, że ogólnie większa liczba komórek prowadzi do dokładniejszych pomiarów OCR. Wysiew w gęstości 5 i 2,5 x 105 komórek/studzienkę dał podobne znormalizowane pomiary OCR w limfocytach T i splenocytach, natomiast 5 i 1,25 x 105 komórek/studzienkę dały podobne znormalizowane pomiary OCR w limfocytach B (Rysunek 4B). Niewielkie różnice w znormalizowanych pomiarach OCR dla limfocytów B mogą być pośrednią wskazówką, że limfocyty B wykazują lepsze parametry przy gęstości 2,5 x 105 komórek/studzienkę w porównaniu do innych gęstości. Według wszystkich parametrów, gęstość 0,625 x 105 komórek/studzienkę dawała suboptymalne wyniki, co dowodzi, że ta gęstość wysiewu jest niewystarczająca. Oddychanie podstawowe, przeciek protonowy, maksymalne oddychanie mitochondrialne, oddychanie pozamitochondrialne oraz produkcja ATP korelowały liniowo z gęstościami wysiewu dla wszystkich typów komórek (Rysunek 4C). Dodatkowo większość oddychania podstawowego jest wykorzystywana do syntezy ATP, co wskazuje niski przeciek protonowy w trzech badanych typach komórek. Chociaż głównym celem eksperymentu stresu mitochondrialnego jest pomiar zmian OCR, rejestrowanie ECAR jest nadal przydatne w celu upewnienia się, że test został przeprowadzony pomyślnie. Podobnie jak w przypadku OCR, dwie wyższe gęstości wysiewu skutkowały wyższym ECAR i gwałtowniejszymi odpowiedziami na oligomycynę, 2,4-DNP oraz antymycynę A/rotenon (Rysunek 4D). Gwałtowne zmiany ECAR po dodaniu 2,4-DNP oraz antymycyny A/rotenonu mogą wynikać ze zmian w oddychaniu oprócz zmian w glikolizie, ponieważ CO2 generowany w cyklu TCA jest przekształcany w HCO3 - i H+. Kwestia ta została niedawno omówiona i istnieje prosta metoda korygowania całkowitego sygnału zakwaszenia zewnątrzkomórkowego przy użyciu danych o zużyciu tlenu, aby uzyskać rzeczywiste tempo glikolizy12,29.
Analiza stresu glikolitycznego była najskuteczniejsza przy najwyższej gęstości wysiewu (Rysunek 5A, B). We wszystkich typach komórek próbki o zagęszczeniu 5 x 105 komórek/dołek wykazały największe zmiany ECAR po dodaniu glukozy, oligomycyny i 2-DG (Rysunek 5B). Dodatkowo normalizacja do stężenia białka wykazała, że dla wszystkich typów komórek próbki o zagęszczeniu 5 x 105 komórek/dołek dawały optymalne wyniki, podczas gdy niższe stężenia – szczególnie 0,625 x 105 komórek/dołek – nie wykazywały wyraźnej wydolności rezerwy glikolitycznej. Zakwaszenie nieglikolityczne, glikoliza i pozorna wydolność glikolityczna korelowały liniowo z gęstością wysiewu dla wszystkich typów komórek (Rysunek 5C). W eksperymencie stresu glikolitycznego wykres OCR pokazuje, że glukoza lekko stymuluje oddychanie mitochondrialne, które następnie jest hamowane przez traktowanie oligomycyną; dodatek 2-DG nie wpłynął na OCR (Rysunek 5D). Wykres OCR może służyć jako dodatkowy wskaźnik prawidłowego przeprowadzenia eksperymentu stresu glikolitycznego. Ponadto wykres OCR może być wykorzystany do korekty wykresu ECAR, jeśli jest to wymagane, tak jak wyjaśniono powyżej w przypadku testu stresu mitochondrialnego12,29.
<img alt="Schemat glikolizy i fosforylacji oksydacyjnej wraz z wykresami analizy metabolicznej ECAR i OCR." src="/files/ftp_upload/54918/54918fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1: Opis analiz przepływu zewnątrzkomórkowego. (A) Ilustracja glikolizy (po lewej) i fosforylacji oksydacyjnej (po prawej) przedstawiająca działanie leków metabolicznych stosowanych w analizach strumienia zewnątrzkomórkowego. (B) Schemat wykresu tempa zakwaszania zewnątrzkomórkowego (ECAR); schemat wykresu tempa zużycia tlenu (OCR) (C). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54918/54918fig1large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat analizy cytometrii przepływowej; limfocyty T, splenocyty, limfocyty B; bramkowanie żywe-martwe; FSC, SSC." src="/files/ftp_upload/54918/54918fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Krokowe bramowanie limfocytów T, limfocytów B oraz splenocytów w celu określenia żywotności i czystości. Wykresy cytometrii przepływowej obrazujące żywotność limfocytów T, splenocytów i limfocytów B (A); oraz czystość limfocytów T i B (B). Wyniki są reprezentatywne dla co najmniej trzech niezależnych eksperymentów. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54918/54918fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskopia gęstości komórkowej limfocytów T, B oraz splenocytów; wykresy poziomu białek; eksperyment; analiza korelacji." src="/files/ftp_upload/54918/54918fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rysunek 3: Stopień zрастаania się komórek koreluje z stężeniem białek w lizacie każdego typu komórek przy różnych gęstościach wysiewu. (A) Mikrofotografie świetlne komórek w studzienkach płytki testowej przy gęstościach wysiewu w zakresie od 5 x 105 komórek/studzienkę do 0,625 x 105 komórek/dołek. Paski skali oznaczają 50 µm. (B) Stężenia białek w lizacie przy różnych gęstościach wysiewu, zmierzone za pomocą testu BCA. Wyniki są reprezentatywne dla co najmniej trzech niezależnych eksperymentów. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54918/54918fig3large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy OCR/ECAR dla limfocytów T, splenocytów i limfocytów B. Analiza poziomu bazowego, przecieku protonów i produkcji ATP." src="/files/ftp_upload/54918/54918fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Analiza stresu mitochondrialnego. Surowe (A) i zestandaryzowane (B) Przedstawiono OCR dla każdego typu komórek i gęstości wysiewu. (C) Dla każdego typu komórek przedstawiono zmiany zależne od liczby komórek w poziomach podstawowego, maksymalnego oddychania mitochondrialnego i niemitochondrialnego, a także zużycia tlenu związanego z przeciekiem protonów lub produkcją ATP. (DPrzedstawiono surowe wartości ECAR uzyskane z testów stresu mitochondrialnego. Każdy punkt danych reprezentuje średnią z 7–8 studzienek wraz z odchyleniem standardowym. Oznaczone strzałkami momenty to iniekcje oligomycyny (O), 2,4-DNP (D) oraz rotenonu/antymycyny A (R/A). Wyniki są reprezentatywne dla co najmniej trzech niezależnych eksperymentów. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54918/54918fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="wykresy glikolizy limfocytów T, splenocytów, limfocytów B; ECAR, OCR względem czasu; analiza wydajności glikolitycznej." src="/files/ftp_upload/54918/54918fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 5"> 
Rysunek 5: Test stresu glikolitycznego. Surowe (A) oraz zestandaryzowane (B) Przedstawiono ECAR dla każdego typu komórek i gęstości wysiewu. (C) Przedstawiono zmiany w ECAR zależne od liczby komórek dla zakwaszenia nieglikolitycznego, glikolizy indukowanej glukozą oraz całkowitej wydajności glikolitycznej. (D) Przedstawiono surowe wartości OCR uzyskane z testów stresu glikolitycznego. Każdy punkt danych reprezentuje średnią z 7–8 studzienek wraz z odchyleniem standardowym. Oznaczone strzałkami zostały momenty podania glukozy (G), oligomycyny (O) oraz 2-deoksyglukozy (2-DG). Wyniki są reprezentatywne dla co najmniej trzech niezależnych eksperymentów. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54918/54918fig5large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>

Badanie metabolizmu staje się coraz bardziej istotne dla badań immunologicznych. W tym artykule przedstawiamy zoptymalizowaną metodę pomiaru glikolizy i oddychania mitochondrialnego w mysich splenocytach oraz limfocytach T i B.

Zoptymalizowany protokół analizy glikolizy i oddychania mitochondrialnego w limfocytach

Lymphocytes respond to a variety of stimuli by activating intracellular signaling pathways, which in turn leads to rapid cellular proliferation, migration ...

Ogólnym celem tej procedury jest dokładny pomiar glikolizy i oddychania mitochondrialnego w limfocytach z wykorzystaniem analizy przepływu zewnątrzkomórkowego. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu immunometabolizmu, takie jak zmiany metaboliczne zachodzące w komórkach odpornościowych podczas aktywacji, różnicowania lub w przebiegu choroby. Główną zaletą tej techniki jest możliwość wydajnej analizy profili metabolicznych ponad 90 próbek jednocześnie w czasie rzeczywistym.Choć metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat metabolizmu limfocytów, można ją zastosować również do innych komórek, w tym komórek nieprzylegających, które wymagają dodania do płytki przy minimalnym zakłóceniu ich funkcjonalności. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ limfocyty są delikatne i wymagają ostrożnego obchodzenia się z nimi w celu zachowania ich funkcjonalności oraz żywotności. W dniu poprzedzającym eksperyment należy podnieść kasetę z czujnikami analizatora przepływu zewnątrzkomórkowego i napełnić każdą studzienkę płytki pomocniczej 200 µL roztworu kalibracyjnego.Następnie opuść kasetę na płytkę, zanurzając czujniki w roztworze kalibracyjnym, i inkubuj kasetę przez noc w inkubatorze w temperaturze 37 °C bez dwutlenku węgla lub azotu. Następnego dnia rano pokryj każde dołeczki płytki do analizy 96-dołkowej 25 µL roztworu adhezyjnego i inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Po zakończeniu inkubacji odessaj substancję adhezyjną i przemyj każdą dołeczkę dwukrotnie 200 µL sterylnej wody.Podczas wysychania płytki na powietrzu umieść sitko do komórek o rozmiarze oczek 70 µm na probówce stożkowej o pojemności 50 mL i przenieś pobrane organy na sitko. Używając tłoka z jałowej strzykawki o pojemności 3 mL, rozgnieć tkankę przez sitko, utrzymując filtr i organy w stanie wilgotnym przez cały proces maceracji poprzez dodawanie buforu MS w razie potrzeby. Następnie przemyj sitko od 5 do 10 mL buforu MS, a następnie odwirowuj otrzymaną zawiesinę komórkową.Resuspendować osad w pięciu mililitrach buforu do lizy erytrocytów ACK. Po pięciu minutach na lodzie przywrócić gęstość za pomocą 10 do 20 mililitrów buforu MS i ponownie odwirować komórki. Po zakończeniu wirowania umieścić sitko komórkowe o oczkach 30 µm nad stożkową probówką o pojemności 15 mililitrów i przygotować sitko, przepłukując je jednym mililitrem buforu MS.Resuspenduj komórki w pięciu mililitrach świeżego buforu MS i przefiltruj zawiesinę komórkową przez sitko, aby usunąć agregaty lizowanych erytrocytów. Dodaj cztery mililitry świeżego buforu MS, aby wypłukać pustą probówkę do lizy, a następnie przepuść płuczkę przez sitko. Policz komórki i odlicz odpowiednią liczbę splenocytów do analizy strumienia zewnątrzkomórkowego (extracellular flux assay).Następnie odwiruj oba zestawy komórek, resuspendując próbkę splenocytów do analizy strumienia zewnątrzkomórkowego w pięciu mililitrach medium RF 10 na lodzie. Resuspenduj komórki do izolacji za pomocą kulek w odpowiednich objętościach koktajlu przeciwciał biotynylowych, mikrokulek antybiotynowych oraz buforu MS na wskazany czas inkubacji w temperaturze od dwóch do ośmiu stopni Celsjusza. Po zakończeniu drugiej inkubacji zbierz komórki poprzez wirowanie i resuspenduj osad w 500 mikrolitrach świeżego buforu MS na każde 1 × 10⁸ komórek.Następnie załaduj odpowiednią kolumnę na magnes separacyjny i przygotuj kolumnę, przepuszczając przez nią 3 mL buforu MS, odrzucając przelew. Umieść sterylną probówkę stożkową o pojemności 15 mL pod kolumną i załaduj na kolumnę całą objętość próbki komórkowej. Następnie przepłucz probówkę z inkubacją komórek 3 mL świeżego buforu MS, zbierając płuczkę do probówki stożkowej.Po zebraniu ostatniej frakcji eluatem należy dopełnić probówkę buforem MS do końcowej objętości 15 mililitrów i odwirować komórki wyizolowane negatywnie. Następnie osad należy resuspender w pięciu mililitrach świeżego medium RF 10 na lodzie. Nie później niż trzy godziny po izolacji należy odwirować wszystkie próbki komórek i resuspender osady w pięciu mililitrach odpowiedniego medium do analizy, a następnie ponownie odwirować.Po drugim wirowaniu resuspenduj osady do odpowiedniego stężenia eksperymentalnego, aby uzyskać końcową objętość 180 µL komórek na studzienkę w świeżym medium do analizy, a następnie nanieś 180 µL komórek do każdej studzienki płytki. Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C przez 25 minut. Następnie odwiruj płytkę, aby zapewnić trwałe przyleganie komórek do dna studzienek, i wprowadź płytkę z powrotem do inkubatora.Po 30 minutach za pomocą mikropipety należy nanieść świeżo przygotowane związki w temperaturze 37 °C do odpowiednich portów wtryskowych kasety sensorycznej analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego, wypełniając porty kontrolne i nieeksperymentalne samym medium. Należy umieścić załadowaną kasetę z powrotem w inkubatorze i skonfigurować program analizy strumienia zewnątrzkomórkowego. Następnie należy załadować kasetę i rozpocząć program, zastępując płytkę kalibracyjną płytką do analizy po zakończeniu kalibracji, zgodnie z komunikatem systemu.Po przeprowadzeniu analizy przepływu zewnątrzkomórkowego należy przystąpić do pomiarów zawartości białka. Ponad 90% wszystkich populacji komórek jest żywotnych, a w przypadku limfocytów zaobserwowano czystość na poziomie od 98 do 99%. Konfluencja każdego typu komórek koreluje z początkową gęstością wysiewu.Stężenia białek w lizacie korelują liniowo z gęstością wysiewu, co potwierdza, że stężenia białek mogą być wykorzystane do dokładnej normalizacji danych dotyczących przepływu zewnątrzkomórkowego. Wyższa liczba komórek koreluje z wyższym zmierzonym tempem zużycia tlenu, a także z silniejszą odpowiedzią na inhibitory mitochondrialne. Wyższe gęstości wysiewu skutkują podobnymi znormalizowanymi pomiarami tempa zużycia tlenu w limfocytach T i splenocytach, natomiast wysiew 5 × 10⁵ oraz 1,25 × 10⁵ komórek na studzienkę prowadzi do podobnych znormalizowanych pomiarów tempa zużycia tlenu w limfocytach B.Parametry oddychania mitochondrialnego wykazują również liniową korelację z gęstością wysiewu komórek. Dodatkowo niski poziom przecieku protonów wskazuje, że większość podstawowego oddychania jest wykorzystywana do syntezy ATP. Wyższa gęstość wysiewu skutkuje wyższymi wskaźnikami zakwaszenia zewnątrzkomórkowego oraz silniejszą odpowiedzią na inhibitory mitochondrialne.Parametry glikolizy korelują liniowo z gęstością wysiewu komórek, przy czym ustalono, że wysoka gęstość wysiewu jest najbardziej optymalna dla pomyślnego przeprowadzenia testu stresu glikolitycznego. Glukoza nieznacznie stymuluje oddychanie mitochondrialne, które jest hamowane przez oligomycynę, podczas gdy 2-DG nie wpływa znacząco na zużycie tlenu. Po opanowaniu techniki proces ten może zostać ukończony w ciągu sześciu do ośmiu godzin, pod warunkiem prawidłowego wykonania.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o utrzymywaniu komórek w lodzie przed analizą strumienia zewnątrzkomórkowego oraz o dokładnym policzeniu i wysianiu komórek. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak pomiar potencjału mitochondrialnego i poboru glukozy, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące stanu metabolicznego komórek. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak izolować limfocyty oraz jak przeprowadzić analizę strumienia zewnątrzkomórkowego.

an-optimized-protocol-to-analyze-glycolysis-mitochondrial-respiration

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Hematopoetyczne komórki progenitorowe (HSPC) przechodzą ze stanu spoczynku do stanu różnicowania dzięki ich plastyczności metabolicznej podczas tworzenia krwi. W tym miejscu przedstawiamy zoptymalizowaną metodę pomiaru oddychania mitochondrialnego i glikolizy HSPC.

Analiza metabolizmu krwiotwórczych komórek macierzystych

W tym artykule opisujemy metodę pomiaru glikolizy i oddychania mitochondrialnego w pierwotnych ludzkich komórkach NK (Natural Killer) wyizolowanych z krwi obwodowej, w spoczynku lub po aktywacji wywołanej przez IL15. Opisany protokół można łatwo rozszerzyć na pierwotne ludzkie komórki NK aktywowane przez inne cytokiny lub rozpuszczalne bodźce.

Analiza metabolizmu ludzkich komórek NK

Adaptacja metaboliczna jest fundamentalna dla limfocytów T, ponieważ decyduje o różnicowaniu, trwałości i cytotoksyczności. W tym artykule przedstawiono zoptymalizowany protokół monitorowania oddychania mitochondrialnego w ludzkich pierwotnych limfocytach T różnicowanych ex vivo cytokinami.

Monitorowanie oddychania mitochondrialnego w ludzkich pierwotnych limfocytach T różnicowanych cytokinami

Opisujemy stopniowe protokoły mierzące oddychanie mitochondrialne mysich i ludzkich neutrofili oraz komórek HL60 za pomocą analizatora metabolicznego przepływu zewnątrzkomórkowego.

Pomiar w czasie rzeczywistym mitochondrialnego profilu bioenergetycznego neutrofili

Bioenergetyka limfocytów T CD8 może być badana za pomocą testu stresu Mito. Metodologia ta może być wykorzystana do badania ostrego i przewlekłego programowania metabolicznego. Protokół ten opisuje podejścia do badania relacji między biologią receptora komórek T a analizą bioenergetyczną.

Pomiar funkcji mitochondrialnej naiwnych i efektorowych limfocytów T CD8

Oddychanie mitochondrialne w całych komórkach drożdży jest cennym wskaźnikiem bioenergetyki komórki. W tym miejscu przedstawiamy protokół ilościowego określenia tego fenotypu mający zastosowanie do różnych gatunków drożdży.

Kwantyfikacja oddychania mitochondrialnego w całych komórkach drożdży

Tutaj szczegółowo opisujemy metody ekstrakcji makrofagów ze szpiku kostnego, śledziony i serca po zawale serca, a następnie oceny przepływu metabolicznego w żywych komórkach.

Analiza przepływu metabolicznego ex vivo w makrofagach śledziony i serca oraz monocytach szpiku kostnego

Protokół ten opisuje opłacalny sposób przeprowadzenia testu stresowego glikolizy w celu ilościowego przeprogramowania metabolizmu w pierwotnym mikrogleju myszy. Po izolacji i stymulacji zapalnej mierzy się tempo zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR) przy użyciu świeżo przygotowanych, pH-skorygowanych odczynników, a następnie następuje normalizacja białek, umożliwiająca dokładną i powtarzalną ocenę zmian glikolitycznych.

Badanie glikolizy w mikrogleju pierwotnym za pomocą testu strumienia zewnętrznego

Testy limfocytotoksyczności komórkowej (CML) mogą być wykorzystywane do badania odpowiedzi autoreaktywnych oraz mechanizmów śmierci komórek in vitro. Jednak dzięki zastosowaniu technik obrazowania konfokalnego żywych komórek z użyciem barwników fluorescencyjnych, typ i kinetyka śmierci komórkowej, a także wykorzystywane szlaki, mogą być badane w znacznie większych szczegółach.

Metody oceny śmierci komórek beta pośredniczonej przez cytotoksyczne limfocyty T

Przedstawiamy nasz zoptymalizowany protokół wysokoprzepustowej nukleofekcji jako wydajny sposób transfekcji pierwotnych ludzkich komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów za pomocą plazmidowego DNA lub siRNA, bez wywoływania dojrzewania komórek. Dostarczamy ponadto dowodów na skuteczne wyciszenie siRNA docelowego genu RIG-I zarówno na poziomie mRNA, jak i białka.

Zoptymalizowany protokół wydajnej transfekcji komórek dendrytycznych bez dojrzewania komórek

Poznaj zoptymalizowaną metodę analizy glikolizy i oddychania mitochondrialnego w limfocytach myszy przy użyciu testu strumienia pozakomórkowego. Technika umożliwia badanie immunometabolizmu w czasie rzeczywistym.

Zoptymalizowany protokół analizy glikolizy i oddychania mitochondrialnego w limfocytach

Przeglądaj więcej filmów