Name: Skuteczne i specyficzne dla miejsca znakowanie przeciwciał przez cykloaddycję azydowo-alkinową promowaną przez szczep (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Poznaj metodę specyficznego dla miejsca znakowania przeciwciał poprzez genetyczne wprowadzanie aminokwasu zawierającego azyd i cykloaddycję SPAAC. Technika umożliwia precyzyjną modyfikację białek w chemii biologicznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Budowa plazmidu
<ol>
	<li>Skonstruuj plazmid ekspresyjny (pBAD-HerFab-L177TAG), który wyrażałby docelowy gen przeciwciała (pBAD-HerFab-WT) za pomocą znacznika His6 i zastąp kodon dla Leucyny-177 kodonem bursztynowym (TAG) 27, używając konwencjonalnej techniki mutagenezy ukierunkowanej na miejsce. 
	Zobacz tabelę materiałów.</li>
	<li>Skonstruuj inny plazmid ekspresyjny (pEVOL-AFRS) zawierający geny dla wyewoluowanej pary tRNATyr i syntetazy aminoacylo-tRNA (aaRS). Użyj specjalnie zaprojektowanego wektora plazmidowego, pEVOL, do efektywnej inkorporacji UAA. Szczegółowe informacje o plazmidach i protokoły klonowania są opisane w poprzednim raporcie. 28</li>
	<li>Uzyskaj wysokiej jakości plazmidowe DNA przy użyciu dostępnych na rynku zestawów do przygotowania plazmidu. Stosunek 260/280 wynoszący ~1,8 jest optymalny dla oczyszczonego DNA. W razie potrzeby wykonaj elektroforezę w żelu agarozowym 1%, aby sprawdzić czystość DNA.</li>
</ol>
2. Przygotowanie kultury
<ol>
	<li>Elektroporacja
	<ol>
		<li>Dodaj każdy 1 μl DNA pEVOL-AFRS28 i pBAD-HerFab-L177TAG do 20 μl szczepu Escherichia coli DH10β. Delikatnie wymieszać za pomocą pipety. Plazmidy mogą być przekształcane razem lub w niezależnych reakcjach.</li>
		<li>W przypadku kuwet 0.1 cm ustaw ustawienia elektroporacji na 25 μF i 2.5 kV.</li>
		<li>Włóż kuwetę do suwaka komory wstrząsowej. Wsuń suwak do komory, aż kuweta mocno zetknie się z elektrodami komory.</li>
		<li>Wykonaj impuls raz, naciskając przycisk impulsu, aż maszyna do elektroporacji wyda sygnał dźwiękowy.</li>
		<li>Dodaj 1 ml super optymalnego bulionu z pożywką do tłumienia katabolitu (SOC) zawierającą 2% (w/v) tryptonu, 0,5% (w/v) ekstraktu drożdżowego, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2 i 20 mM glukozy do kuwety szybko i przenieś mieszaninę do probówki. Inkubować komórki przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem.</li>
		<li>Rozprzestrzenić transformowane komórki E. coli na płytkach agarowych z bulionu lizogennego (LB) zawierających odpowiednie antybiotyki (35 μg/ml chloramfenikolu i 100 μg/ml ampicyliny do wyboru odpowiednio pEVOL-AFRS i pBAD-HerFab-L177TAG). Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 12 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie kultury
	<ol>
		<li>Zaszczepić pojedynczą przekształconą kolonię w pożywce o pojemności 5 ml LB zawierającej antybiotyki. Inkubować przez 12 godzin w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Ekspresja i oczyszczanie HerFab-L177AF
<ol>
	<li>Ekspresja HerFab-L177AF
	<ol>
		<li>Przenieść kulturę pierwotną (5 ml) do pożywki o pojemności 200 ml zawierającej ampicylinę (100 μg/ml) i AF (1 mM), a następnie inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem. 
		UWAGA: 100 mM roztwór podstawowy AF (10 ml) przygotowano przez rozpuszczenie 206 mg AF w 100 mM kwasu solnego (10 ml, objętość końcowa).</li>
		<li>Dodać 2 ml 1,6 M arabinozy (16 mM stężenie końcowe), gdy kultura osiągnie fazę logarytmiczną (OD550 = 0,8, OD = gęstość optyczna). Inkubować przez 12 godzin w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem.</li>
		<li>Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 11 000 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i zamrozić osad w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Liza komórek
	<ol>
		<li>Zawiesić osady komórkowe w 20 ml buforze do lizy peryplazmatycznej zawierającym 30 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 20% sacharozy i 0,2 mg/ml lizozymu i inkubować mieszaninę przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Odwirować lizat komórkowy przy sile 18 000 x g w temperaturze 4 °C przez 15 minut. Przenieść supernatant do świeżej probówki i wyrzucić osad.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Chromatografia powinowactwa Ni-NTA
	<ol>
		<li>Dodać zawiesinę żywicy Ni-NTA do każdej probówki wirówkowej (400 μl żywicy na 200 ml kultury) i delikatnie mieszać w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę.</li>
		<li>Wlać zawiesinę do kolumny polipropylenowej i przemyć żywicę trzykrotnie 5 ml buforu płuczącego zawierającego 50 mM NaH2PO4 (pH 8,0), 20 mM imidazolu i 300 mM NaCl.</li>
		<li>Eluować przeciwciało docelowe za pomocą 300 μl buforu elucyjnego zawierającego 50 mM NaH2PO4 (pH 8,0), 250 mM imidazolu i 300 mM NaCl.</li>
		<li>Oznaczyć stężenie zmutowanego białka za pomocą testu białkowego Bradforda29 lub mierząc absorbancję przy 280 nm. Oblicz współczynnik ekstynkcji (75,866 M-1 cm-1) dla HerFab-L177AF przy 280 nm za pomocą kalkulatora współczynnika ekstynkcji białka, używając współczynnika ekstynkcji (2,471 M-1 cm-1) dla AF. 
		UWAGA: Sekwencję aminokwasową HerFab można znaleźć na stronie NCBI (GI:783282791 i GI:783282792).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Koniugacja oczyszczonego HerFab-L177AF z sondami alkinowymi przy użyciu cykloaddycji azydowo-alkinowej promowanej szczepem (SPAAC)
<ol>
	<li>Dodać 20 μl Cy5,5-Azadibenzocyklooktynyny(Cy5,5-ADIBO) w H2O (200 μM stężenie końcowe) do roztworu 10 μL HerFab-L177AF (10 μM stężenie końcowe) w buforze fosforanowym zawierającym 10 mM Na2HPO4 (pH 7,0) i 100 mM NaCl. 
	UWAGA: Jako alternatywy dostępne są również pochodne difluorowanej cyklooktyny (DIFO) i bicyklo[6.1.0]nonyny (BCN) do tego samego zastosowania.</li>
	<li>Pozostawić reakcję cykloaddycji wspomaganą przez szczep na 6 godzin w temperaturze 37 °C. W przypadku użycia sondy światłoczułej (np. Cy5,5) należy przykryć naczynie reakcyjne folią aluminiową.</li>
	<li>Oczyść oznakowany HerFab zgodnie z krokiem 5.</li>
</ol>
5. Oczyszczanie oznakowanego HerFab
<ol>
	<li>Dodać 500 μl próbki do kolumny wirowej z filtrem odśrodkowym.</li>
	<li>Odwirować kolumnę wirową o sile 14 000 x g w temperaturze 4 °C przez 15 minut.</li>
	<li>Odrzucić przepływową i przenieść oczyszczoną próbkę z kolumny wirowej do probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Alternatywą dla kroku 5.1-5.3 jest przeprowadzenie oczyszczania przez dializę w stosunku do tego samego buforu.</li>
	<li>Oczyszczony, oznakowany HerFab należy przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
6. Analiza SDS-PAGE oznaczonego HerFab
<ol>
	<li>Dodać 5 μl buforu próbki białka LDS zawierającego 106 mM Tris·HCl, 141 mM zasady Tris (pH 8,5), 2% LDS, 10% glicerolu, 0,51 mM EDTA, 0,22 mM SERVA Blue G250 i 0,175 mM czerwieni fenolowej do 13 μl oczyszczonego znakowanego HerFab (7,8 μM lub 0,38 mg/ml) w obecności (+) lub braku (−) 2 μl ditiotreitolu (DTT, 100 mM stężenie końcowe). Inkubować mieszaninę w temperaturze 95 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Podłącz kasetę z żelem 4-12% Bis-Tris SDS-PAGE do ogniwa elektroforezy i dodaj bufor do pracy. Załaduj sprzężone próbki białek i wstępnie wybarwiony marker masy cząsteczkowej. Wykonać elektroforezę żelową przez 35 minut przy napięciu 200 V. 
	Uwaga: Utrzymuj komórkę elektroforezy w ciemności przez cały okres, aby zminimalizować fotowybielanie fluoroforu.</li>
	<li>Po elektroforezie przenieś żel do skanera fluorescencyjnego żelu i skanuj w poszukiwaniu emisji fluorescencji na odpowiedniej długości fali. W przypadku Cy5.5 użyj trybu Cy5 w oprogramowaniu skanera.</li>
	<li>Zabarwić żel dostępną w handlu plamą białkową.</li>
</ol>

<ol><li>Wang, L., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+genetic+code%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Expanding the genetic code.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 44 (1), 34-66 (2004).</li>
<li>Wu, X., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+at+the+interface+of+chemistry+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Synthesis at the interface of chemistry and biology.</a> J. Am. Chem. Soc. 131 (35), 12497-12515 (2009).</li>
<li>Liu, C. C., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adding+new+chemistries+to+the+genetic+code%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Adding new chemistries to the genetic code.</a> Annu. Rev. Biochem. 79, 413-444 (2010).</li>
<li>Wang, L., Zhang, Z., Brock, A., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addition+of+the+keto+functional+groupto+the+genetic+code+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Addition of the keto functional groupto the genetic code of Escherichia coli.</a> proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (1), 56-61 (2003).</li>
<li>Chin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addition+of+p-azido-L-phenylalanine+to+the+genetic+code+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Addition of p-azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli.</a> J. Am. Chem. Soc. 124 (31), 9026-9027 (2002).</li>
<li>Deiters, A., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+incorporation+of+an+alkyne+into+proteins+in+Esshcerichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Med.+Chem.+Lett%22%5BJournal%5D)">In vivo incorporation of an alkyne into proteins in Esshcerichia coli.</a> Bioorg. Med. Chem. Lett. 15 (5), 1521-1524 (2005).</li>
<li>Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+copper-free+click+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded copper-free click chemistry.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 50 (17), 3878-3881 (2011).</li>
<li>Seitchik, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+tetrazine+amino+acid+directs+rapid+site-specific+in+vivo+bioorthogonal+ligation+with+transcyclooctenes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with transcyclooctenes.</a> J. Am. Chem. Soc. 134 (6), 2898-2901 (2014).</li>
<li>Lee, Y. -J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+acrylamide+fuctionality%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded acrylamide fuctionality.</a> ACS Chem. Biol. 8 (8), 1664-1670 (2013).</li>
<li>Lang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+norbornene+directs+site-specific+cellular+protein+labelling+via+a+rapid+bioorthogonal+raction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded norbornene directs site-specific cellular protein labelling via a rapid bioorthogonal raction.</a> Nat Chem. 4 (4), 298-304 (2012).</li>
<li>Lang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+encoding+of+bicyclononynes+and+trans-cyclooctenes+for+site-specific+protein+labeling+in+vitro+and+in+live+mammalian+cells+via+rapid+fluorogenic+Diels-Alder+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Genetic encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions.</a> J. Am. Chem. Soc. 134 (25), 10317-10320 (2012).</li>
<li>Jewett, J. C., Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Cu-free+click+chemistry+with+readily+synthesized+biarylazacyclooctynones%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Rapid Cu-free click chemistry with readily synthesized biarylazacyclooctynones.</a> J. Am. Chem. Soc. 132 (11), 3688-3690 (2010).</li>
<li>Debets, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Azadibenzocyclooctynes+for+fast+and+efficient+enzyme+PEGylation+via+copper-free+%283+%2B+2%29+cycloaddition%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Azadibenzocyclooctynes for fast and efficient enzyme PEGylation via copper-free (3 + 2) cycloaddition.</a> Chem. Commun. 46 (1), 97-99 (2010).</li>
<li>Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+mechanism+to+mouse%3A+a+tale+of+two+bioorthogonal+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">From mechanism to mouse: a tale of two bioorthogonal reactions.</a> Acc. Chem. Res. 44 (9), 666-676 (2011).</li>
<li>Debets, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioconjugation+with+strained+alkenes+and+alkynes%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">Bioconjugation with strained alkenes and alkynes.</a> Acc. Chem. Res. 44 (9), 805-815 (2011).</li>
<li>Mbua, N. E., Guo, J., Wolfert, M. A., Steet, R., Boons, G. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-promoted+alkyne%E2%88%92azide+cycloadditions+%28SPAAC%29+reveal+new+features+of+glycoconjugate+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Strain-promoted alkyne−azide cycloadditions (SPAAC) reveal new features of glycoconjugate biosynthesis.</a> ChemBioChem. 12 (12), 1912-1921 (2011).</li>
<li>Kuzmin, A., Poloukhtine, A., Wolfert, M. A., Popik, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+functionalization+using+catalyst-free+azide-alkyne+cycloaddition%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug.+Chem%22%5BJournal%5D)">Surface functionalization using catalyst-free azide-alkyne cycloaddition.</a> Bioconjug. Chem. 21 (11), 2076-2085 (2011).</li>
<li>Yao, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorophore+targeting+to+cellular+proteins+via+enzymemediated+azide+ligation+and+strain-promoted+cycloaddition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Fluorophore targeting to cellular proteins via enzymemediated azide ligation and strain-promoted cycloaddition.</a> J. Am. Chem. Soc. 134 (8), 3720-3728 (2012).</li>
<li>Hao, Z., Hong, S., Chen, X., Chen, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introducing+bioorthogonal+functionalities+into+proteins+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">Introducing bioorthogonal functionalities into proteins in living cells.</a> Acc. Chem. Res. 44 (9), 742-751 (2011).</li>
<li>Reddington, S. C., Tippmann, E. M., Jones, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Residue+choice+defines+efficiency+and+influence+of+bioorthogonal+protein+modification+via+genetically+encoded+strain+promoted+Click+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Residue choice defines efficiency and influence of bioorthogonal protein modification via genetically encoded strain promoted Click chemistry.</a> Chem. Commun. 48 (9), 8419-8421 (2012).</li>
<li>Chari, R. V. J., Miller, M. L., Widdison, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-drug+conjugates%3A+an+emerging+concept+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Antibody-drug conjugates: an emerging concept in cancer therapy.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 53 (15), 3751-4005 (2014).</li>
<li>Tsao, M., Tian, F., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+staudinger+modification+of+proteins+containing+p-Azidophenylalanine%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Selective staudinger modification of proteins containing p-Azidophenylalanine.</a> ChemBioChem. 6 (12), 2147-2149 (2005).</li>
<li>Brustad, E. M., Lemke, E. A., Schultz, P. G., Deniz, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+and+efficient+method+for+the+site-specific+dual-labeling+of+proteins+for+single+molecule+fluorescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A general and efficient method for the site-specific dual-labeling of proteins for single molecule fluorescence resonance energy transfer.</a> J. Am. Chem. Soc. 130 (52), 17664-17665 (2008).</li>
<li>Milles, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+strategies+for+single-molecule+protein+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Click strategies for single-molecule protein fluorescence.</a> J. Am. Chem. Soc. 134 (11), 5187-5195 (2012).</li>
<li>Jang, S., Sachin, K., Lee, hJ., Kim, D. W., Lee, hS. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+simple+method+for+protein+conjugation+by+copper-free+click+reaction+and+its+application+to+antibody-free+Western+blot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug.+Chem%22%5BJournal%5D)">Development of a simple method for protein conjugation by copper-free click reaction and its application to antibody-free Western blot analysis.</a> Bioconjug. Chem. 23 (11), 2256-2261 (2012).</li>
<li>Kazane, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+antibody+multimers+through+peptide+nucleic+acid+conjugation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Self-assembled antibody multimers through peptide nucleic acid conjugation.</a> J. Am. Chem. Soc. 135 (1), 340-346 (2012).</li>
<li>Ko, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+site-specific+antibody+labeling+by+strain-promoted+azide-alkyne+cycloaddition%5BTitle%5D)+AND+%22Bull.+Korean+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Efficient and site-specific antibody labeling by strain-promoted azide-alkyne cycloaddition.</a> Bull. Korean Chem. Soc. 36 (9), 2352-2354 (2015).</li>
<li>Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enhanced+system+for+unnatural+amino+acid+mutagenesis+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli.</a> J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374 (2010).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Cho, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+extracellular+region+of+HER2+alone+and+in+complex+with+the+Herceptin+Fab%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the extracellular region of HER2 alone and in complex with the Herceptin Fab.</a> Nature. 421 (6924), 756-760 (2003).</li>
<li>Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+chemistry+%3A+Diverse+chemical+function+from+a+few+good+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Click chemistry : Diverse chemical function from a few good reactions.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 40 (11), 2004-2021 (2001).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Genetyczne włączenie nienaturalnych aminokwasów do białek ma kilka zalet w porównaniu z innymi metodami stosowanymi do modyfikacji białek. 1-3 Jedną z ważnych zalet jest jego ogólne zastosowanie do każdego rodzaju białka. W zasadzie nie ma ograniczeń w wyborze białka docelowego i miejsca docelowego białka. Jednak zastąpienie reszty o znaczeniu strukturalnym lub funkcjonalnym przez powierzchnię użytka jamonowego może spowodować zmianę struktury i funkcji białka docelowego. Ogólnie rzecz biorąc, pozostałości, k...

Od czasu zgłoszenia genetycznego włączenia p-metoksyfenyloalaniny do Escherichia coli,1 ponad 100 nienaturalnych aminokwasów (UAA) zostało z powodzeniem włączonych do różnych białek. 1-3 Wśród tych użytków rolnych aminokwasy zawierające bioortogonalne grupy funkcyjne zostały szeroko przebadane i stanowią największy odsetek. Bioortogonalne grupy funkcyjne stosowane w UAA obejmują keton, 4 azydek, 5 alkin, 6 cyklooktyn, 7 tetrazynę, α, β-nienasycony amid, 9 norbonen, 10 transcyklookten11 i bicyklo[6.1.0]-nonyn. 11 Chociaż każda grupa funkcyjna ma swoje zalety i wady, aminokwasy zawierające azydek są najszerzej stosowane do koniugacji białek. p-Azidophenylalanina (AF), jeden z aminokwasów zawierających azydo, jest łatwo dostępna, a jej skuteczność inkorporacji jest doskonała. Zmutowane białka zawierające ten aminokwas mogą reagować z alkinami przez cykloaddycję katalizowaną miedzią lub z cyklooktynami przez SPAAC. 12-20 Dni
Ostatnio biofarmaceutyki cieszą się dużym zainteresowaniem w przemyśle farmaceutycznym. Koniugat przeciwciało-lek (ADC) to klasa przeciwciał terapeutycznych, które są korzystne ze względu na ich zdolność do terapii celowanej w leczeniu nowotworów u ludzi21 i innych chorób. Ponad 50 ADC jest obecnie w fazie badań klinicznych, a liczba ta szybko rośnie. Przy opracowywaniu ADC należy wziąć pod uwagę wiele czynników, aby zmaksymalizować skuteczność i zminimalizować skutki uboczne. Wśród tych czynników kluczowe znaczenie ma skuteczna i specyficzna dla miejsca reakcja koniugacji w celu utworzenia wiązania kowalencyjnego między przeciwciałem a lekiem. Pożądaną skuteczność i swoistość w reakcji koniugacji można osiągnąć poprzez koniugację z bioortogonalną grupą funkcyjną w nienaturalnym aminokwasie, który jest specyficznie włączony do przeciwciała. 22-26 Tutaj przedstawiamy protokół specyficznego dla miejsca włączenia AF do fragmentu przeciwciała i koniugacji zmutowanego fragmentu przeciwciała za pomocą sondy biochemicznej.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><silny>1. Budowa plazmidu</td></tr><tr><td>plasmid pBAD_HerFab_L177TAG</td><td></td><td></td><td>Opcjonalnie zawierają bursztynowy kodon stop (TAG) w żądanej pozycji. Ko, W. et al. Skuteczne i specyficzne dla miejsca znakowanie przeciwciał przez promowaną szczepem cykloaddycję azydowo-alkinową. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015)</td></tr><tr><td>plazmid pEvol-AFRS</td><td></td><td></td><td>Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A. i Schultz, P. G. Ulepszony system do nienaturalnej mutagenezy aminokwasów w E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010)</td></tr><tr><td>DH10B</td><td>Invitrogen</td><td>C6400-03</td><td>Expression Host</td></tr><tr><td>Plasmid Mini-prep kit</td><td>Nucleogen</td><td>5112</td><td>200/pack</td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Intron biotechnology</td><td>32034</td><td>500&nbsp; g</td></tr><tr><td>Bromek etydyny</td><td>Alfa Aesar</td><td>L07482</td><td>1 g</td></tr><tr><td>LB Bulion</td><td>BD Difco</td><td>244620</td><td>500&nbsp; g</td></tr><tr><td colspan="4"><silny>2. Przygotowanie hodowli</td></tr><tr><td colspan="4">2.1 Elektroporacja</td></tr><tr><td>Micro pulser</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2100</td><td></td></tr><tr><td>Kuweta mikropulsatorowa</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2089</td><td>0.1&nbsp; cm odstęp między elektrodami, opakowanie 50</td></tr><tr><td>Ampicylina Sód</td><td>Wako</td><td>018-10372</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Chloramfenikol</td><td>Alfa Aesar</td><td>B20841</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Agar</td><td>SAMCHUN</td><td>214230</td><td>500 g</td></tr><tr><td>SOC medium</td><td>Sigma</td><td>S1797</td><td>100 mL</td></tr><tr><td colspan="4">3. Ekspresja i oczyszczanie HerFab-L177AF</td></tr><tr><td colspan="4">3.1 Ekspresja Herfab-L177AF<</td></tr>em<tr><td>>p-azido-L-fenyloalanina (AF)</td><td>Bachem</td><td>F-3075.0001</td><td>1 g</td></tr><tr><td>L(+)-Arabinoza, 99%</td><td>Acros</td><td>104981000</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Kwas solny, 35~37%</td><td>SAMCHUN</td><td>H0256</td><td>500 mL</td></tr><tr><td colspan="4">3.2 Liza komórek</td></tr><tr><td>Tris(hydroksymetylo)aminometan, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>T1351</td><td>500 g</td></tr><tr><td>dwuwodna sól disodowa EDTA, 99,5%</td><td>SAMCHUN</td><td>E0064</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>sacharoza</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Siyaku</td><td>126-0671</td><td>1 g</td></tr><tr><td colspan="4">3.3 Chromatografia powinowactwa Ni-NTA</td></tr><tr><td>Żywica Ni-NTA</td><td>QIAGEN</td><td>30210</td><td>25 ml</td></tr><tr><td>Kolumna polipropylenowa</td><td>QIAGEN</td><td>34924</td><td>50/opakowanie, pojemność 1 ml</td></tr><tr><td>Imidazol, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>I0578</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy, 98%</td><td>SAMCHUN</td><td>S0919</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Chlorek sodu, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>S2907</td><td>1 kg</td></tr><tr><td colspan="4"><silny>4. Koniugacja oczyszczonego HerFab-L177AF z sondami alkinowymi przy użyciu cykloaddycji azydowo-alkinowej (SPAAC) promowanej szczepem</td></tr><tr><td>Cy5.5-ADIBO&nbsp;</td><td>FutureChem</td><td>FC-6119</td><td>1 mg</td></tr><tr><td colspan="4"><silny>5. Oczyszczanie znakowanych filtrów odśrodkowych HerFab</td></tr><tr><td>Amicon Ultra 0,5 mL</td><td>MILLIPORE</td><td>UFC500396</td><td>96/opakowanie, 500 &#956; L pojemność</td></tr><tr><td colspan="4"><silny>6. SDS-PAGE Analiza znakowanego HerFab i fluorescencyjnego skanowania żelowego</td></tr><tr><td>1,4-Dithio-DL-treitol, naziemna telewizja cyfrowa, 99,5%</td><td>Sigma</td><td>10708984001</td><td>10 g</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Sample Buffer, 4x</td><td>Thermofisher</td><td>NP0007</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>MES bufor do biegania</td><td>Thermofisher</td><td>NP0002</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Nupage Novex 4-12% żele SDS PAGE</td><td>Thermofisher</td><td>NO0321</td><td>12-dołkowy</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td><td>Wako</td><td>031-17922</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Typhoon 9210 kamera o zmiennym trybie pracy</td><td>Amersham Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

skuteczne i specyficzne dla miejsca znakowanie przeciwciał przez cykloaddycję azydowo-alkinową promowaną przez szczep

Efficient and Site-specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition

Obecnie dostępnych jest wiele narzędzi chemicznych do wprowadzania sond chemicznych do białek w celu zbadania ich struktury i funkcji. Przydatną metodą jest koniugacja białek poprzez genetyczne wprowadzenie nienaturalnego aminokwasu zawierającego bioortogonalną grupę funkcyjną. W niniejszym raporcie opisano szczegółowy protokół koniugacji przeciwciał specyficznych dla danego miejsca. Protokół zawiera szczegóły eksperymentalne dotyczące genetycznego włączenia aminokwasu zawierającego azydek oraz reakcji koniugacji przez cyklodykcję azydkowo-alkinową promowaną szczepem (SPAAC). Ta reakcja wspomagana przez szczep przebiega poprzez proste mieszanie reagujących cząsteczek o fizjologicznym pH i temperaturze i nie wymaga dodatkowych odczynników, takich jak jony miedzi(I) i ligandy chelatujące miedź. Dlatego metoda ta byłaby przydatna do ogólnej koniugacji białek i opracowywania koniugatów przeciwciał z lekami (ADC).

W niniejszym badaniu fragment przeciwciała został sprzężony specyficznie w danej pozycji z fluorophorem poprzez wprowadzenie aminokwasu zawierającego grupę azydową do fragmentu i przeprowadzenie reakcji zmutowanego fragmentu przeciwciała z naprężonym cyklooktynem (Rysunek 1). Jako docelowy fragment przeciwciała, w który włączono AF jako aminokwas zawierający grupę azydową, wybrano HerFab. W celu wyboru reszty w HerFab do zastąpienia przez AF, przeanalizowano krystaliczną ...

Tutaj prezentujemy protokół specyficznego dla danego miejsca wprowadzania sond chemicznych do fragmentu przeciwciała poprzez genetyczne włączenie aminokwasu zawierającego azydek, a następnie sprzężenie azydu z sondą chemiczną za pomocą promowanej przez szczep cykloaddycji azydkowo-alkinowej (SPAAC).

Skuteczne i specyficzne dla miejsca znakowanie przeciwciał przez cykloaddycję azydowo-alkinową promowaną przez szczep

There are currently many chemical tools available to introduce chemical probes into proteins to study their structure and function. A useful method is ...

Ogólnym celem tej procedury jest specyficzne dla danego miejsca wprowadzenie sond chemicznych do fragmentu przeciwciała poprzez genetyczne włączenie aminokwasu zawierającego azydek. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii chemicznej, takie jak modyfikacja, inżynieria i koniugacja białek. Główną zaletą tej techniki jest to, że docelowa sonda lub bulion mogą być wprowadzane do białek lub przeciwciał w określonym miejscu przez proste mieszanie.Po skonstruowaniu plazmidów dodaj po jednym mikrolitrze każdego do 20 mikrolitrów szczepu E.Coli DH10-beta o stężeniu dwa razy 10 do ośmiu komórek na mikrolitr do 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej. Użyj pipety, aby delikatnie wymieszać roztwór. Następnie umieść 20 mikrolitrów zmieszanego roztworu w czystej kuwecie.Ustaw maszynę do elektroporacji na 25 mikrofaradów i 2,5 kilowolta. Następnie włóż kuwetę do suwaka komory wstrząsowej. Wsuń suwak do komory, aż kuweta mocno zetknie się z elektrodami komory.Naciśnij raz przycisk impulsu, aż maszyna do elektroporacji wyda sygnał dźwiękowy. Następnie szybko dodaj jeden mililitr pożywki SOC do kuwety. Następnie przenieś mieszaninę do probówki.Inkubować z wytrząsanie

efficient-site-specific-antibody-labeling-strain-promoted-azide

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Cząsteczki adenowirusów są modyfikowane tak, aby zawierały albo nienaturalny analog aminokwasu azydohomoalaninę, albo azydocukier O-GlcNAz. Grupa azydowa każdego z nich jest chemoselektywnie łączona za pomocą reakcji chemii „click” w celu modyfikacji powierzchni wirusa.

Chemoselektywna modyfikacja powierzchni wirusów za pomocą bioortogonalnej chemii klik

Kodujemy genetycznie nienaturalny aminokwas, p-azydo-L-fenyloalaninę w różnych docelowych miejscach w GPCR i pokazujemy wszechstronność grupy azydologicznej w różnych zastosowaniach. Obejmują one ukierunkowaną technologię fotosieciowania w celu identyfikacji reszt w kieszeni wiążącej ligand GPCR oraz specyficzną dla miejsca bioortogonalną modyfikację GPCR za pomocą znacznika peptydowo-epitopowego lub sondy fluorescencyjnej.

Genetycznie kodowane sondy molekularne do badania receptorów sprzężonych z białkiem G

DNA i białka są specjalnie znakowane sekwencyjnie grupami reporterowymi o powinowactwie lub fluorescencyjnym za pomocą metylotransferaz DNA lub białek oraz analogów syntetycznych kofaktorów. W zależności od specyficzności kofaktora enzymów, do jedno- lub dwuetapowego znakowania stosuje się azyrydynę lub podwójnie aktywowane analogi kofaktorów.

Specyficzne sekwencyjnie znakowanie kwasów nukleinowych i białek za pomocą metylotransferaz i analogów kofaktorów

Fotostabilne barwniki cyjaninowe są dołączane do oligonukleotydów w celu monitorowania hybrydyzacji poprzez transfer energii.

Synteza sond hybrydyzacyjnych DNA zmieniających długość fali przy użyciu fotostabilnych barwników cyjaninowych

Opisujemy tutaj metodę identyfikacji białek wiążących małe cząsteczki za pomocą znakowania fotopowinowactwa. Zaletą tej techniki jest to, że wiązanie i znakowanie kowalencyjne białek docelowych zachodzi w żywym środowisku komórkowym, co eliminuje ryzyko zakłócenia natywnej struktury białka i warunków wiązania podczas lizy komórki.

Identyfikacja białek wiążących małe cząsteczki w natywnym środowisku komórkowym za pomocą znakowania fotopowinowactwa żywych komórek

Opisano szczegółową procedurę syntezy azydku znakowanego 125I oraz znakowania radioaktywnego nanocząstek złota o wielkości 13 nm sprzężonych z grupą dibenzocyklooktynu (DBCO) przy użyciu reakcji kliknięcia bez miedzi.

Zoptymalizowany protokół skutecznego znakowania radioaktywnego nanocząstek złota przy użyciu azydkowej grupy protetycznej znakowanej 125I

Przedstawiono łatwy test fluorescencyjny w celu oceny skuteczności par syntetazy amino-acyl-tRNA/tRNA zawierających niekanoniczne aminokwasy (ncAA) do białek ulegających ekspresji w komórkach ssaków. Opisano zastosowanie ncAA do badania receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR), w tym fotosieciowanie miejsc wiązania i bioortogonalne znakowanie GPCR na żywych komórkach.

Optymalizacja genetycznego włączenia sond chemicznych do GPCR w celu mapowania fotosieciowania i chemii bioortogonalnej w żywych komórkach ssaków

Włączenie pochodnej cyklopropenu lizyny do przeciwciał pozwala na specyficzne dla miejsca, szybkie i efektywne połączenie cząsteczek zawierających tetrazynę w celu wytworzenia koniugatów przeciwciało-lek.

Kodowanie genetyczne niekanonicznego aminokwasu do wytwarzania koniugatów przeciwciało-lek w drodze szybkiej reakcji bioortogonalnej

W tym protokole opiszemy syntezę PODS, odczynnika na bazie fenyoksadiazolylu metylosulfonu do selektywnego przyłączania ładunków do tioli biomolekuł, szczególnie przeciwciał. Ponadto opiszemy syntezę i charakterystykę dwufunkcyjnego chelatora nośnego POD oraz jego koniugację z modelowym przeciwciałem.

Synteza i biokoniugacja odczynników tiolowo-reaktywnych do tworzenia immunokoniugatów modyfikowanych selektywnie

Fluorescencyjnie oznaczone antybiotyki są potężnymi narzędziami, które mogą być używane do badania wielu aspektów oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe. W artykule opisano przygotowanie antybiotyków znakowanych fluorescencyjnie i ich zastosowanie do badania antybiotykooporności bakterii. Sondy mogą być wykorzystywane do badania mechanizmów oporności bakterii (np. wypływu) za pomocą spektrofotometrii, cytometrii przepływowej i mikroskopii.

Wizualizacja oporności bakterii za pomocą fluorescencyjnych sond antybiotykowych

Poznaj metodę specyficznego dla miejsca znakowania przeciwciał poprzez genetyczne wprowadzanie aminokwasu zawierającego azyd i cykloaddycję SPAAC. Technika umożliwia precyzyjną modyfikację białek w chemii biologicznej.

Skuteczne i specyficzne dla miejsca znakowanie przeciwciał przez cykloaddycję azydowo-alkinową promowaną przez szczep

Przeglądaj więcej filmów