Skuteczne i specyficzne dla miejsca znakowanie przeciwciał przez cykloaddycję azydowo-alkinową promowaną przez szczep

Ogólnym celem tej procedury jest specyficzne dla danego miejsca wprowadzenie sond chemicznych do fragmentu przeciwciała poprzez genetyczne włączenie aminokwasu zawierającego azydek. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii chemicznej, takie jak modyfikacja, inżynieria i koniugacja białek. Główną zaletą tej techniki jest to, że docelowa sonda lub bulion mogą być wprowadzane do białek lub przeciwciał w określonym miejscu przez proste mieszanie.

Po skonstruowaniu plazmidów dodaj po jednym mikrolitrze każdego do 20 mikrolitrów szczepu E.Coli DH10-beta o stężeniu dwa razy 10 do ośmiu komórek na mikrolitr do 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej. Użyj pipety, aby delikatnie wymieszać roztwór. Następnie umieść 20 mikrolitrów zmieszanego roztworu w czystej kuwecie.

Ustaw maszynę do elektroporacji na 25 mikrofaradów i 2,5 kilowolta. Następnie włóż kuwetę do suwaka komory wstrząsowej. Wsuń suwak do komory, aż kuweta mocno zetknie się z elektrodami komory.

Naciśnij raz przycisk impulsu, aż maszyna do elektroporacji wyda sygnał dźwiękowy. Następnie szybko dodaj jeden mililitr pożywki SOC do kuwety. Następnie przenieś mieszaninę do probówki.

Inkubować z wytrząsaniem w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Po zakończeniu inkubacji rozprowadzić przekształcone komórki E.Coli na lizogennych płytkach agarowych zawierających odpowiednie antybiotyki. Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 12 godzin.

Po zakończeniu inkubacji płytki zaszczepić pojedynczą przekształconą kolonię w pięciu mililitrach pożywki LB zawierającej antybiotyki. Inkubować z wytrząsaniem przez 12 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie przenieś pierwotną hodowlę do 200 mililitrów pożywki LB ze 100 mikrogramami na mililitr ampicyliny i jednym milimolowym AF. Inkubować z wytrząsaniem w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej trzy godziny.

Dodaj dwa mililitry 1,6-molowej arabinozy, gdy kultura osiągnie gęstość optyczną 0,8 przy 550 nanometrach. Następnie inkubować z wytrząsaniem w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 12 godzin. Po zakończeniu inkubacji zebrać komórki przez odwirowanie w ilości 11 000 g przez pięć minut.

Odrzucić supernatant i zamrozić osad w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Gdy będziesz gotowy do lizy komórek, ponownie zawiesić osad w 20 mililitrach buforu do lizy paraplazmatycznej w świeżej probówce wirówkowej. Inkubować mieszaninę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę.

Następnie odwiruj lizat komórkowy w temperaturze 18 000 g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieść supernatant do świeżej probówki i wyrzucić osad. Następnie dodaj 400 mikrolitrów zawiesiny żywicy Ni-NTA.

Za pomocą rotatora delikatnie mieszaj rurkę przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po zakończeniu mieszania zawiesinę wlać do kolumny polipropylenowej. Umyj żywicę trzykrotnie pięcioma mililitrami buforu do mycia.

Eluować przeciwciało docelowe za pomocą 300 mikrolitrów buforu elucyjnego. Następnie określ stężenie zmutowanego białka zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Rozpocząć od dodania 10 mikrolitrów 10 mikromolowego roztworu HerFab-L177AF do buforu fosforanowego zawierającego 10 milimolowy dwuzasadowy fosforan sodu i 100 milimolowy chlorek sodu do świeżej probówki wirówkowej.

Następnie dodaj 20 mikrolitrów 200 mikromolowego roztworu azadibenzocykloktyny Cy 5,5 do wody. Następnie przykryj naczynie reakcyjne folią aluminiową. Pozwól, aby reakcja cykloedycji promowana barwieniem postępowała przez sześć godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po zakończeniu reakcji dodać 30 mikrolitrów próbki i 450 mikrolitrów buforu fosforanowego, aby wypłukać wolny barwnik Cy 5,5 w odśrodkowej kolumnie wirowej z filtrem. Odwirować kolumnę wirową o temperaturze 14 000 g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odrzuć przepływ, a następnie przenieś oczyszczoną próbkę do 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej.

Oczyszczony, oznakowany HerFab należy przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chyba że jest on gotowy do analizy. Zacznij od dodania 13 mikrolitrów oczyszczonego HerFab o stężeniu 7,8 mikromolowym do świeżej probówki. Następnie dodaj pięć mikrolitrów buforu do próbek białka LDS.

Inkubuj mieszaninę w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 10 minut. Po inkubacji podłącz cztery do 12% kasety żelowej Bis-Tris SDS-PAGE do ogniwa elektroforetycznego. Dodaj bufor do biegania.

Następnie załaduj sprzężone próbki białek do wstępnie wybarwionego ekspresu do masy cząsteczkowej. Wykonuj elektroforezę żelową przez 35 minut przy napięciu 200 woltów. Po zakończeniu elektroforezy należy przenieść żel do systemu dokumentacji i analizy żelu.

Zeskanuj w poszukiwaniu Cy 5.5, a następnie zabarwić żel dostępnym w handlu barwnikiem białkowym. W tym badaniu fragment przeciwciała Her-Fab jest swoiście swoisty dla miejsca sprzężonego z Osiąga się to poprzez włączenie aminokwasu zawierającego azydek do fragmentu, a następnie reakcję zmutowanego fragmentu przeciwciała z napiętą cyklooktyną. Analizę SDS-PAGE przeprowadza się dla zmutowanych białek ulegających ekspresji zarówno z aminokwasem zawierającym azydek, jak i bez niego.

Jak widać, pełnowymiarowy fragment przeciwciała został uzyskany tylko w obecności aminokwasu. Przeciwciało zawierające aminokwas jest oceniane pod kątem koniugacji w reakcji z pochodną azadibenzocykloktyny Cy 5,5 sprzężoną z Cy 5,5 i analizowane za pomocą SDS-PAGE. Obrazy fluorescencyjne pokazują koniugację zmutowanego fragmentu przeciwciała z Cy 5,5, podczas gdy w grupie kontrolnej nie zaobserwowano koniugacji.

Po prawidłowej ekspresji i oczyszczeniu białka za pomocą acetylofenyloalaniny, białko można skutecznie znakować za pomocą sondy ze szczepem Ponieważ reakcja znakowania nie wymaga dodatkowego odczynnika, możesz wprowadzić sondę do białka docelowego, po prostu mieszając sondę z białkiem. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, w jaki sposób wprowadzić specyficznie dla miejsca sondę chemiczną do fragmentu przeciwciała poprzez genetyczne włączenie aminokwasu zawierającego azydek.