Indukcja różnicowania chondrogennego komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej przez grawitację odśrodkową

Ogólnym celem tej procedury jest wywołanie chondrogennego różnicowania ASC w celu wadliwej naprawy chrząstki. Metoda ta ma na celu wywołanie prechondrogennego różnicowania ASC za pomocą odśrodkowej siły grawitacji. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat chondrogennego różnicowania ASC, może być również zastosowana do innych systemów, takich jak różnicowanie osteogenne i fibrogenne.

Główną zaletą tej techniki jest to, że różnicowanie chondrogenne można łatwo indukować z komórek macierzystych bez leczenia jakichkolwiek cytokin. Procedurę zademonstrują Yeri Alice Rim i Yoojun Nam z mojego laboratorium. Zacznij od zebrania 80% zlewających się komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej ze 100-mililitrowej płytki hodowlanej, odrzucając pożywkę i myjąc pięcioma mililitrami PBS.

Następnie dodaj jeden mililitr PBS zawierający jeden milimolowy EDTA i inkubuj przez dwie minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnym inkubatorze zawierającym 5% dwutlenku węgla. Po dwóch minutach delikatnie postukaj w płytkę hodowlaną, a następnie dodaj cztery mililitry świeżej pożywki i przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Odwirować komórki 250 razy g przez dwie minuty w temperaturze pokojowej.

Po odwirowaniu usunąć supernatant bez naruszania osadu. Następnie ponownie zawiesić granulat w 10 mililitrach podłoża. Policz komórki za pomocą hemocytometru.

W przypadku odśrodkowego obciążenia grawitacyjnego przenieś 2,5 razy dziesięć do piątych komórek do nowej 15-mililitrowej stożkowej probówki i odwiruj przy 2400 razy g przez 15 minut. Po odwirowaniu przystąp do hodowli granulek lub mikromasy. Natychmiast po odwirowaniu odessać supernatant i przy 500 mikrolitrach chondrogennej pożywki różnicującej lub CDM oraz 50 mikrogramów na mililitr świeżo przygotowanego 2-fosforanu kwasu L-askorbinowego do osadu.

Kontrola pozytywna, indukuje różnicowanie chondrogenne i zbiera swoje komórki, dodając CDM zawierające 10 nanogramów na mililitr TGF-beta-1. Luźno zakryj probówki i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nawilżanym inkubatorze zawierającym 5% dwutlenku węgla przez trzy tygodnie. Natychmiast po odwirowaniu z obciążeniem grawitacyjnym odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 mikrolitrach CDM.

Aby utworzyć mikromasę, należy pipetować ponownie zawieszone komórki do środka dołka na płytce 24-dołkowej, a następnie umieścić płytkę w inkubatorze. Po dwóch godzinach ostrożnie dodaj 500 mikrolitrów CDM do studzienki, pipetując do ścianki płytki, aby uniknąć zakłócenia mikromasy. Jako kontrolę pozytywną należy przeprowadzić hodowlę mikromasową z nieodwirowanymi komórkami, dodając CDM zawierającą 10 nanogramów na mililitr TGF-beta-1.

Inkubuj mikromasę przez trzy tygodnie. W 21 dniu po utworzeniu mikromasy użyj pipety, aby zebrać granulki sferoidów, a następnie przemyj 1X PBS. Utrwal sferoidalne granulki przez zanurzenie w 4% paraformaldehydzie na 24 godziny.

Następnego dnia wyrzuć utrwalacz i spłucz granulki komórek wodą dejonizowaną. Umieścić jedną warstwę gazy na kasecie z tkankami i przenieść utrwalone kulki sferoidalne za pomocą pipety. Przykryj granulkę, składając gazę i zamknij pokrywę kasety.

Następnie odwodnić sferoidalne granulki, zanurzając je w 70% etanolu na pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie kontynuuj serię stężeń etanolu przez pięć minut każde. Następnie zanurz granulki w 100% ksylenie na 15 minut.

Zanurz sferoidalne granulki w parafinie w temperaturze 56 stopni Celsjusza w celu zatopienia. Następnie wytnij pięć odcinków o grubości mikronów z osadzonych w parafinie granulek komórkowych za pomocą mikrotomu obrotowego. Zanurz sekcje w 50% etanolu, a następnie przenieś je do łaźni wodnej o temperaturze 50 stopni Celsjusza.

Zamontuj pływające sekcje na szkiełkach, a następnie przejdź do safraniny o i błękitu alcian w celu barwienia immunofluorescencyjnego. Aby określić odpowiednią odśrodkową siłę grawitacji, ASC wirowano przy grawitacji odśrodkowej wynoszącej zero, 300, 600, 1, 200 i 2, 400 razy g przez piętnaście minut. Ekspresję mRNA SOX9 oceniano po 24 godzinach od stymulacji CG.

CG wynoszący 2, 400 razy g znacząco indukował ekspresję mRNA SOX9. Aby ocenić ekspresję genów związanych z chondrogenezą, całkowity RNA wyekstrahowano z niestymulowanych ASC, ASC, które zostały odwirowane lub potraktowane TGF-beta-onem. Jak widać tutaj, stymulacja CG indukuje ekspresję kolagenu typu 2 i aggrekanu.

nadekspresja kolagenu typu 2 u ASC leczonych CG została potwierdzona przez immunofluorescencję przy użyciu przeciwciała przeciwko kolagenowi typu 2 w sprzężonym przeciwciałie drugorzędowym Alexa Fluor 594. Aby określić wpływ CG na nadekspresję ECM związaną z chondrogenezą, ASC traktowano TGF-beta-onem jako kontrolą pozytywną. Kontrolą ujemną była hodowla osadów niepoddanych obciążeniu CG lub traktowaniu TGF-beta-onu.

Nadekspresję ECM związaną z chondrogenezą oceniano w sferoidalnych osadach składających się z odwirowanych ASC poprzez zastosowanie barwienia safraniną o i błękitem alcjanowym. Glikozaminoglikan, główny składnik chrząstki stawowej, był barwiony na niebiesko przez błękit alcian lub na pomarańczowo przez safraninę o. Po 14 dniach hodowli mikromasowej kondensację chondrocytów oceniano na podstawie wielkości agregatów.

Wielkość każdego agregatu, generowanego przez CG, wynosiła około 0,5 milimetra. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w 30 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, w jaki sposób indukować chondogenne różnicowanie komórek macierzystych za pomocą odśrodkowej siły grawitacji.