Name: Indukcja różnicowania chondrogennego komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej przez grawitację odśrodkową (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Poznaj metodę indukcji różnicowania chondrogennego komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej przy użyciu grawitacji odśrodkowej. Technika ta umożliwia uzyskanie fenotypu chondrogennego bez stosowania cytokin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez grant Koreańskiego Projektu Badawczo-Rozwojowego Technologii Zdrowia przez Koreański Instytut Rozwoju Przemysłu Zdrowia (KHIDI), finansowany przez Ministerstwo Zdrowia i Opieki Społecznej, Republika Korei (numer grantu: HI14C2116) oraz przez Fundusz Badawczy Szpitala Najświętszej Maryi Panny w Seulu, Katolicki Uniwersytet Korei.

Ten protokół badania został zatwierdzony przez instytucjonalną komisję rewizyjną Katolickiego Uniwersytetu Korei (KC16EAME0162) i przeprowadzony zgodnie z wytycznymi NIH. Wszystkie tkanki zostały pobrane za pisemną świadomą zgodą.
1. Odśrodkowe ładowanie grawitacyjne i hodowla granulek
<ol>
	<li>Hodowla komórkowa i zbiór
	<ol>
		<li>Hodowla ASC (P2-P3; patrz wykaz materiałów) w zmodyfikowanym Dulbecco's Eagle's Medium-low glucose (DMEM-LG) uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną/streptomycyną (P/S) w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze zawierającym 5% CO2 .</li>
		<li>Gdy komórki osiągną 80% konfluencji, wyrzuć pożywkę i umyj komórki 5 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).</li>
		<li>Dodać 1 ml PBS zawierającego 1 mM EDTA i inkubować przez 2 minuty w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze zawierającym 5% CO2 .</li>
		<li>Delikatnie postukać w płytkę hodowlaną, dodać 4 ml świeżej pożywki, przenieść komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować komórki przy 250 × g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odśrodkowe obciążenie grawitacyjne
	<ol>
		<li>Po odwirowaniu (krok 1.1.4) usunąć supernatant bez naruszania osadu i ponownie zawiesić osad w 10 ml DMEM-LG z 10% FBS. Policz komórki za pomocą hemocytometru.</li>
		<li>W celu załadowania CG przenieś 2,5 × 105 komórek do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwiruj przy 2 400 × g przez 15 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kultura granulek
	<ol>
		<li>Natychmiast po odwirowaniu odessać supernatant i dodać 500 μl zdefiniowanej pożywki do różnicowania chondrogennego (CDM, DMEM o wysokiej zawartości glukozy uzupełniony 1% FBS, 1% ITS+Premix, 100 nM deksametazon, 1x MEM roztwór aminokwasów endogennych, 50 μg/ml L-proliny i 1% penicyliny/streptomycyny). Dodawać 50 μg/ml świeżo przygotowanego 2-fosforanu kwasu L-askorbinowego przy każdej zmianie podłoża. Jako kontrolę pozytywną indukować różnicowanie chondrogenne w nieodwirowanych komórkach poprzez dodanie CDM zawierającego 10 ng / ml TGF-β1.</li>
		<li>Umieścić luźno zakorkowane probówki zawierające granulki w pozycji stojącej i inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze zawierającym 5% CO2 .</li>
		<li>Zmieniaj podłoże co drugi dzień przez 3 tygodnie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hodowla mikromas
	<ol>
		<li>Natychmiast po odwirowaniu (etap 1.2.2; 2 400 × g przez 15 minut) odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 μl CDM.</li>
		<li>Aby utworzyć mikromasę, umieść zawieszone komórki w środku dołka 24-dołkowej płytki.</li>
		<li>Po 2 godzinach ostrożnie dodać 1 ml CDM do dołka, pipetując do ścianki płytki, aby uniknąć uszkodzenia mikromasy. Jako kontrolę pozytywną należy przeprowadzić hodowlę mikromasową z nieodwirowanymi komórkami, dodając CDM zawierający 10 ng / ml TGF-β1.</li>
		<li>Inkubować mikromasę w temperaturze 37 °C w nawilżanym inkubatorze zawierającym 5% CO2 .</li>
		<li>Zmieniaj podłoże co drugi dzień przez 3 tygodnie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Reakcja łańcuchowa odwrotnej transkryptazy-polimerazy (RT-PCR) w celu wykrycia regulacji w górę transkrypcji markerów różnicowania chondrogennego
<ol>
	<li>W dniu 14 użyj pipety, aby przenieść kulisy sferoidalne do nowej probówki o pojemności 1,5 ml i umyj je w 1x PBS.</li>
	<li>Ekstrahować całkowite RNA z osadów za pomocą metody ekstrakcji tiocyjanianianem guanidyny-fenolem-chloroformem9.</li>
	<li>Zsyntetyzować cDNA z 2 μg całkowitego RNA za pomocą odwrotnej transkryptazy zgodnie z protokołem producenta (inkubować w temperaturze 42 °C przez 1 godzinę, a następnie inaktywować enzym w temperaturze 70 °C przez 5 minut).</li>
	<li>Wykonaj PCR ze starterami specyficznymi dla markerów różnicowania chondrogennego10.</li>
</ol>
3. Barwienie w celu wykrycia nadekspresji białek markera różnicowania chondrogennego
<ol>
	<li>Granulki komórkowe zatapiające parafinę
	<ol>
		<li>W 21 dniu użyj pipety, aby zebrać granulki sferoidów i umyć je 1x PBS.</li>
		<li>Utrwalić sferoidalne granulki przez zanurzenie w 4% paraformaldehydzie przez 24 godziny 
		Uwaga: Paraformaldehyd jest wysoce toksyczny. Unikać kontaktu z oczami, skórą lub błonami śluzowymi. Zminimalizuj narażenie i unikaj inhalacji podczas przygotowywania. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.</li>
		<li>Wyrzuć utrwalacz i spłucz osady komórkowe wodą dejonizowaną (DW).</li>
		<li>Umieść jedną warstwę gazy na kasecie i przenieś utrwalone granulki za pomocą pipety. Przykryj granulkę, składając gazę i zamknij pokrywę kasety.</li>
		<li>Odwodnić granulki.
		<ol>
			<li>Zanurz granulki w 70% etanolu (EtOH) na 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Zanurz granulki w 80% EtOH na 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Zanurz granulki w 95% EtOH na 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Zanurz granulki w 100% EtOH na 5 minut w temperaturze pokojowej. Powtórz dwukrotnie.</li>
			<li>Zanurz granulki w 100% ksylenie na 15 minut w temperaturze pokojowej. Powtórz dwukrotnie.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Osadzać granulki o stałych komórkach w parafinie w temperaturze 56 °C w formie; granulki mogą być zatopione w parafinie za pomocą specjalistycznych zautomatyzowanych systemów przetwarzania tkanek.</li>
		<li>Wyciąć odcinki o grubości 5 μm z osadzonego w parafinie granulatu komórkowego za pomocą mikrotomu obrotowego.</li>
		<li>Zanurzyć sekcje w 50% EtOH, a następnie przenieść je do łaźni wodnej o temperaturze 50 °C za pomocą szkiełka.</li>
		<li>Umieść ruchome sekcje na slajdach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Safranina O i barwienie błękitem Alcian
	<ol>
		<li>Uwodnić sekcje parafiny.
		<ol>
			<li>Zanurz szkiełka w ksylenie na 15 minut. Powtórz dwukrotnie.</li>
			<li>Zanurz szkiełka w 100% EtOH na 5 minut. Powtórz dwukrotnie.</li>
			<li>Zanurz szkiełka w 90% EtOH na 5 minut.</li>
			<li>Zanurz szkiełka w 80% EtOH na 5 minut.</li>
			<li>Zanurz szkiełka w 70% EtOH na 5 minut, a następnie umyj je w 1x PBS.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Uwodnione skrawki należy barwić 1% roztworem Safraniny O i 3% błękitem Alcian przez 30 minut.</li>
		<li>Wyrzuć roztwór barwiący i spłucz sekcje DW.</li>
		<li>Wybarwić skrawki roztworem Hematoksyliny/Eozyny (przeciwbarwienie) przez 1 min.</li>
		<li>Wyrzuć roztwór barwiący i spłucz sekcje DW.</li>
		<li>Umieść kroplę podłoża montażowego na szkiełku nakrywkowym po usunięciu resztek wody. Ostrożnie umieść szkiełko (komórką do dołu) na szkiełku nakrywkowym zawierającym nośnik montażowy.</li>
		<li>Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na 2-3 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Rejestruj obrazy za pomocą mikroskopu jasnego pola (automatyczny mikroskop pionowy, 50X i 200X).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test immunofluorescencyjny
	<ol>
		<li>Ponownie nawodnić sekcje zgodnie z opisem w sekcji 3.2.1.</li>
		<li>Zanurz szkiełka w buforze cytrynianu sodu (10 mM cytrynian sodu, 0,05% Tween 20, pH 6,0), a następnie utrzymuj je w temperaturze poniżej wrzenia przez 10 minut za pomocą kuchenki mikrofalowej.</li>
		<li>Schłodzić szkiełka przez 20 minut w temperaturze pokojowej, a następnie umyć je wodą z kranu.</li>
		<li>Inkubuj szkiełka w 3% H2O2 (w 1x PBS) przez 15 minut, a następnie myj je wodą z kranu przez 15 minut11.</li>
		<li>Zablokować szkiełka buforem blokującym (10% normalnej surowicy koziej w PBS) na 1 godzinę.</li>
		<li>Odessać roztwór blokujący, a następnie nałożyć na szkiełka przeciwciało pierwszorzędowe rozcieńczone 5% normalną surowicą kozią.</li>
		<li>Inkubować szkiełka przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Umyj szkiełka trzy razy w 1x PBS przez 5 minut każda.</li>
		<li>Inkubować szkiełka w przeciwciałie drugorzędowym sprzężonym z fluorochromem rozcieńczonym 5% normalną surowicą kozią przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
		<li>Umyj szkiełka trzy razy w 1x PBS przez 5 minut każdy w ciemności.</li>
		<li>Inkubować szkiełka z DAPI (1 μg/ml) przez 10 minut, a następnie myć je dwa razy w 1x PBS przez 5 minut każde.</li>
		<li>Umieść kroplę podłoża montażowego na szkiełku nakrywkowym po usunięciu resztek wody. Ostrożnie umieść suwak (komórką do dołu) na nośniku montażowym.</li>
		<li>Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na 2-3 godziny w ciemności przy RT.</li>
		<li>Wizualizacja preparatów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (Rhod: 594 nm, DAPI: 340 nm; powiększenie 60X i 200X)12.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Awad, H. A., Halvorsen, Y. D., Gimble, J. M., Guilak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+transforming+growth+factor+beta1+and+dexamethasone+on+the+growth+and+chondrogenic+differentiation+of+adipose-derived+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Effects of transforming growth factor beta1 and dexamethasone on the growth and chondrogenic differentiation of adipose-derived stromal cells.</a> Tissue Eng. 9 (6), 1301-1312 (2003).</li>
<li>Erickson, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrogenic+potential+of+adipose+tissue-derived+stromal+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Chondrogenic potential of adipose tissue-derived stromal cells in vitro and in vivo.</a> Biochem Biophys Res Commun. 290 (2), 763-769 (2002).</li>
<li>Sah, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthetic+response+of+cartilage+explants+to+dynamic+compression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Biosynthetic response of cartilage explants to dynamic compression.</a> J Orthop Res. 7 (5), 619-636 (1989).</li>
<li>Sakao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+chondrogenic+phenotype+in+synovium-derived+progenitor+cells+by+intermittent+hydrostatic+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Induction of chondrogenic phenotype in synovium-derived progenitor cells by intermittent hydrostatic pressure.</a> Osteoarthritis Cartilage. 16 (7), 805-814 (2008).</li>
<li>Li, Z., Yao, S. J., Alini, M., Stoddart, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrogenesis+of+human+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+in+fibrin-polyurethane+composites+is+modulated+by+frequency+and+amplitude+of+dynamic+compression+and+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Chondrogenesis of human bone marrow mesenchymal stem cells in fibrin-polyurethane composites is modulated by frequency and amplitude of dynamic compression and shear stress.</a> Tissue Eng Part A. 16 (2), 575-584 (2010).</li>
<li>Alves da Silva, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrogenic+differentiation+of+human+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+in+chitosan-based+scaffolds+using+a+flow-perfusion+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Chondrogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells in chitosan-based scaffolds using a flow-perfusion bioreactor.</a> J Tissue Eng Regen Med. 5 (9), 722-732 (2011).</li>
<li>Maeda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+microstructure+and+gene+expression+of+articular+chondrocytes+cultured+in+a+tube+under+mechanical+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Changes in microstructure and gene expression of articular chondrocytes cultured in a tube under mechanical stress.</a> Osteoarthritis Cartilage. 13 (2), 154-161 (2005).</li>
<li>Yang, J., Hooper, W. C., Phillips, D. J., Tondella, M. L., Talkington, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrifugation+of+human+lung+epithelial+carcinoma+a549+cells+up-regulates+interleukin-1beta+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Centrifugation of human lung epithelial carcinoma a549 cells up-regulates interleukin-1beta gene expression.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 9 (5), 1142-1143 (2002).</li>
<li>Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+RNA+using+TRIzol+%28TRI+reagent%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Purification of RNA using TRIzol (TRI reagent).</a> Cold Spring Harb Protoc. (6), (2010).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> J Vis Exp. (63), e3998(2012).</li>
<li>Jang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UVB+induces+HIF-1alpha-dependent+TSLP+expression+via+the+JNK+and+ERK+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">UVB induces HIF-1alpha-dependent TSLP expression via the JNK and ERK pathways.</a> J Invest Dermatol. 133 (11), 2601-2608 (2013).</li>
<li>Wu, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunodetection+of+human+telomerase+reverse-transcriptase+%28hTERT%29+re-appraised%3A+nucleolin+and+telomerase+cross+paths%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Immunodetection of human telomerase reverse-transcriptase (hTERT) re-appraised: nucleolin and telomerase cross paths.</a> J Cell Sci. 119, Pt 13 2797-2806 (2006).</li>
<li>Bobick, B. E., Chen, F. H., Le, A. M., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+chondrogenic+phenotype+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Res+C+Embryo+Today%22%5BJournal%5D)">Regulation of the chondrogenic phenotype in culture.</a> Birth Defects Res C Embryo Today. 87 (4), 351-371 (2009).</li>
<li>Akiyama, H., Chaboissier, M. C., Martin, J. F., Schedl, A., de Crombrugghe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+Sox9+has+essential+roles+in+successive+steps+of+the+chondrocyte+differentiation+pathway+and+is+required+for+expression+of+Sox5+and+Sox6%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The transcription factor Sox9 has essential roles in successive steps of the chondrocyte differentiation pathway and is required for expression of Sox5 and Sox6.</a> Genes Dev. 16 (21), 2813-2828 (2002).</li>
<li>Lefebvre, V., Huang, W., Harley, V. R., Goodfellow, P. N., de Crombrugghe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX9+is+a+potent+activator+of+the+chondrocyte-specific+enhancer+of+the+pro+alpha1%28II%29+collagen+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">SOX9 is a potent activator of the chondrocyte-specific enhancer of the pro alpha1(II) collagen gene.</a> Mol Cell Biol. 17 (4), 2336-2346 (1997).</li>
<li>Jang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+adipose+tissue-derived+stromal+vascular+fraction+for+clinical+application+to+cartilage+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol+Anim%22%5BJournal%5D)">Characterization of adipose tissue-derived stromal vascular fraction for clinical application to cartilage regeneration.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 51 (2), 142-150 (2015).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+regeneration+of+articular+cartilage+and+subchondral+bone+in+vivo+using+MSCs+induced+by+a+spatially+controlled+gene+delivery+system+in+bilayered+integrated+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Simultaneous regeneration of articular cartilage and subchondral bone in vivo using MSCs induced by a spatially controlled gene delivery system in bilayered integrated scaffolds.</a> Biomaterials. 32 (21), 4793-4805 (2011).</li>
<li>Janzen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-cell+ageing+modified+by+the+cyclin-dependent+kinase+inhibitor+p16INK4a%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stem-cell ageing modified by the cyclin-dependent kinase inhibitor p16INK4a.</a> Nature. 443 (7110), 421-426 (2006).</li>
<li>Muraglia, A., Cancedda, R., Quarto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+mesenchymal+progenitors+from+human+bone+marrow+differentiate+in+vitro+according+to+a+hierarchical+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Clonal mesenchymal progenitors from human bone marrow differentiate in vitro according to a hierarchical model.</a> J Cell Sci. 113, Pt 7 1161-1166 (2000).</li>
</ol>

Oświadczamy, że nie mamy żadnych konfliktów interesów związanych z tą pracą.

Stan macierzysty komórek jest bardzo ważny dla nadekspresji SOX9 indukowanej przez CG. W naszym badaniu ekspresja SOX9 może być indukowana przez CG w ASC we wczesnym pasażowaniu (2-3), ale nie w ASC w późniejszym pasażowaniu. Doniesiono, że podczas hodowli komórki ASC zawierają komórki CD34 + do 3 pasaży16. ASC mają tendencję do utraty ekspresji CD34 podczas pasażu komórek, co skutkuje niską odpowiedzią na CG.
Dzięki odśrodkowej sile grawitacji ciśnienie hydrostatyczne ...

Ubytki w chrząstce stawowej nie goją się naturalnie. W związku z tym przeszczep komórek macierzystych został zaproponowany jako obiecujące podejście do naprawy uszkodzonej chrząstki. Metoda ta wymaga jednak zarówno pozyskania wystarczającej liczby komórek macierzystych, jak i indukcji tych komórek do ulegania różnicowaniu chondrogennemu. Szpik kostny (BM) jest szeroko stosowany jako źródło komórek macierzystych, ale izolacja komórek z BM ma dwie główne wady: inwazyjność i niewystarczającą wydajność. Ze względu na łatwość pozyskiwania, tkanka tłuszczowa jest preferowanym źródłem komórek macierzystych. Wcześniejsze badania wykazały możliwość wyizolowania komórek macierzystych z tkanki tłuszczowej i indukowania różnicowania chondrogennego w tych komórkach za pomocą cytokin, takich jak TGF-β11,2. Te metody są skuteczne, ale drogie.
Jako tańsza alternatywa dla cytokin, naprężenia mechaniczne mogą być wykorzystane do wywołania różnicowania chondrogennego. Obciążenie mechaniczne odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu zdrowia chrząstki stawowej3 i może indukować chondrogenne fenotypy w różnych komórkach. Na przykład ciśnienie hydrostatyczne indukuje chondrogenne fenotypy w komórkach progenitorowych pochodzących z błony maziowej za pośrednictwem szlaku kinazy MAP/JNK 4, a kompresja mechaniczna indukuje chondrogenezę w ludzkich mezenchymalnych komórkach macierzystych (MSC) poprzez regulację w górę genów chondrocytarnych5. Ponadto naprężenie ścinające przyczynia się do ekspresji macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) związanej z chondrogenezą w ludzkich MSCs6. Grawitacja odśrodkowa (CG), łatwe do zastosowania i kontrolowane naprężenie mechaniczne generowane przez wirowanie, może indukować różnicową ekspresję genów w komórkach7. Na przykład w komórkach raka nabłonka płuc ekspresja interleukiny (IL)-1b jest regulowana w górę przez wirowanie8. Dlatego, jako eksperymentalnie indukowane naprężenie mechaniczne, CG może być stosowany do indukowania ekspresji genów chondrocytarnych w komórkach macierzystych. Nie jest jednak jasne, czy CG może indukować chondrogenne różnicowanie komórek macierzystych.
W tym badaniu odkryliśmy, że CG indukuje regulację w górę SOX9, głównego regulatora chondrogenezy, u ludzkich ASC, co skutkuje nadekspresją genów chondrocytarnych. Ponadto porównaliśmy wpływ CG na chondrogenezę z TGF-β1, czynnikiem wzrostu najczęściej stosowanym do indukowania chondrogenezy in vitro w komórkach macierzystych.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Plasticware</td></tr><tr><td>100 mm Naczynie</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Naczynie</td><td>TPP</td><td>93060</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Rurka rogówkowa</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Rurka rogówkowa</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Jednorazowa pipeta</td><td>Falcon</td><td>7551</td><td></td></tr><tr><td>5 ml</td><td>Falcon</td><td>7543</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">ASC Materiały do hodowli</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Technologie życia o niskiej glikemii</td><td></td><td>11885-084</td><td>podłoże bazowe</td></tr><tr><td>dla wzrostu Penicilina Streptomycyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4333</td><td>1%</td></tr> <tr><td>Technologie życia</td> w <td>surowicy bydlęcej dla płodu</td><td>16000-044</td><td>10%</td></tr><tr><td>PBS/1 mM EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>12604-039</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Chondrogenic Differentiation Media Materials</td></tr><tr><td>DMEM High glucose</td><td>Life Technologies</td><td>11995</td><td>pożywka bazowa do różnicowania chondrogenowego</td></tr><tr><td>MEM Roztwór aminokwasów endogennych (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2915</td><td>100 nM</td></tr><tr><td>Penicilina Streptomycyna</td><td>Life Technologies</td><td>P4333</td><td>1%</td></tr> <tr><td>Płodowa surowica bydlęca Life</td><td>Technologies</td><td>16000-044</td><td>1%</td></tr> <tr><td>Askorbinian-2-fosforan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8960</td><td>50 i #956; g/ml</td></tr><tr><td>L-prolina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5607</td><td>50 &#956; g/mL</td></tr><tr><td>JEGO</td><td>BD</td><td></td> 354352 <td>1%</td></tr> <tr><td>Ludzkie TGF i beta; 1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td>10 ng/mL</td></tr><tr><td colspan="4">Materials</td></tr><tr><td>18 mm Szkło osłonowe</td><td>Superior</td><td>HSU-0111580</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldyhyde</td><td>Tech & Innowacja</td><td>BPP-9004</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>BIOSESANG</td><td>T1027</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Wektor Lab</td><td>SP-5050</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało antykolagenowe II</td><td>abcam&nbsp;</td><td>ab34712</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało drugorzędowe anty-królicze IgG (H + L), sprzężona sonda</td><td>molekularna</td> Alexa Fluor 594 <td>A-11037</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Sonda molekularna</td><td>DAPI</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Prolong złoty odczynnik zapobiegający blaknięciu</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Szkło ślizgowe, powlekane</td><td>Hyun Il Lab-Mate</td><td>HMA-S9914</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma Aldrich</td><td>366919</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol izoprypylowy</td><td>Milipor</td><td>109634</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Duksan</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do syntezy pierwszej nici cDNA RevertAid</td><td>Thermo Scientfic</td><td>K1622</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza DNA Taq</td><td>iNtRON BIOTECH</td><td>25021</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 10x TBE Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>15581-044</td><td></td></tr><tr><td>gwiazda ładowania</td><td>Dyne Bio</td><td>A750</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>1 kb (+) Marker drabinkowy DNA</td><td>Enzynomics</td><td>DM003</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej (ASC)</td><td>Katolickie komórki</td><td></td><td></td> MASTER</tr></tbody></table>

indukcja różnicowania chondrogennego komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej przez grawitację odśrodkową

Chondrogenic Differentiation Induction of Adipose-derived Stem Cells by Centrifugal Gravity

Uszkodzona chrząstka nie może się naturalnie zagoić. Obecnie najbardziej zaawansowaną terapią ubytków w chrząstce jest przeszczepianie chondrocytów różnicowanych z komórek macierzystych za pomocą cytokin. Niestety, różnicowanie chondrogenne wywołane cytokinami jest kosztowne, czasochłonne i wiąże się z wysokim ryzykiem zanieczyszczenia podczas różnicowania in vitro. Jednak bodźce biomechaniczne służą również jako kluczowe czynniki regulacyjne dla chondrogenezy. Na przykład stres mechaniczny może indukować chondrogenne różnicowanie komórek macierzystych, co sugeruje potencjalne podejście terapeutyczne do naprawy uszkodzonej chrząstki. W tym badaniu wykazaliśmy, że grawitacja odśrodkowa (CG, 2,400 × g), naprężenie mechaniczne łatwe do zastosowania przez wirowanie, indukowała regulację w górę regionu determinującego płeć Y (SRY)-box 9 (SOX9) w komórkach macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ASC), powodując ekspresję fenotypów chondrogennych. Odwirowane ASC wyrażały wyższe poziomy chondrogennych markerów różnicowania, takich jak agrekan (ACAN), kolagen typu 2 alfa 1 (COL2A1) i kolagen typu 1 (COL1), ale niższe poziomy kolagenu typu 10 (COL10), markera przerostowych chondrocytów. Ponadto w odwirowanych ASC zaobserwowano tworzenie się agregatów chondrogennych, co jest warunkiem wstępnym chondrogenezy.

Grawitacja odśrodkowa indukuje nadekspresję markerów różnicowania chondrogennego w komórkach macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej.
Aby określić stopień siły grawitacji odśrodkowej odpowiedni do indukcji różnicowania chondrogennego, ASC stymulowano różnymi wartościami CG (0, 30, 600, 1 20 i 2 40 ×g) przez 15 min. Po stymulacji ASC ponownie wysiano na płytki hodowlane i hodowano przez 24 h. Jak pokazano na Rysun...

Stres mechaniczny może indukować chondrogenne różnicowanie komórek macierzystych, dostarczając potencjalnego podejścia terapeutycznego do naprawy uszkodzonej chrząstki. Przedstawiamy protokół indukowania chondrogennego różnicowania komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ASC) za pomocą grawitacji odśrodkowej (CG). Indukowana przez CG regulacja w górę SOX9 powoduje rozwój fenotypów chondrogennych.

Indukcja różnicowania chondrogennego komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej przez grawitację odśrodkową

Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes ...

Ogólnym celem tej procedury jest wywołanie chondrogennego różnicowania ASC w celu wadliwej naprawy chrząstki. Metoda ta ma na celu wywołanie prechondrogennego różnicowania ASC za pomocą odśrodkowej siły grawitacji. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat chondrogennego różnicowania ASC, może być również zastosowana do innych systemów, takich jak różnicowanie osteogenne i fibrogenne.Główną zaletą tej techniki jest to, że różnicowanie chondrogenne można łatwo indukować z komórek macierzystych bez leczenia jakichkolwiek cytokin. Procedurę zademonstrują Yeri Alice Rim i Yoojun Nam z mojego laboratorium. Zacznij od zebrania 80% zlewających się komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej ze 100-mililitrowej płytki hodowlanej, odrzucając pożywkę i myjąc pięcioma mililitrami PBS.Następnie dodaj jeden mililitr PBS zawierający jeden milimolowy EDTA i inkubuj przez dwie minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnym inkubatorze zawierającym 5% dwutlenku węgla. Po dwóch minutach delikatnie postukaj w płytkę hodowlaną, a następnie dodaj cztery mililitry świeżej pożywki i przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Odwirować komórki 250 razy g przez dwie minuty w temperaturze pokojowej.Po odwirowaniu usunąć supernatant bez naruszania osadu. Następnie ponownie zawiesić granulat w 10 mililitrach podłoża. Policz komórki za pomocą hemocytometru.W przypadku odśrodkowego obciążenia grawitacyjnego przenieś 2,5 razy dziesięć do piątych komórek do nowej 15-mililitrowej stożkowej probówki i odwiruj przy 2400 razy g przez 15 minut. Po odwirowaniu przystąp do hodowli granulek lub mikromasy. Natychmiast po odwirowaniu odessać supernatant i przy 500 mikrolitrach chondrogennej pożywki różnicującej lub CDM oraz 50 mikrogramów na mililitr świeżo przygotowanego 2-fosforanu kwasu L-askorbinowego do osadu.Kontrola pozytywna, indukuje różnicowanie chondrogenne i zbiera swoje komórki, dodając CDM zawierające 10 nanogramów na mililitr TGF-beta-1. Luźno zakryj probówki i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nawilżanym inkubatorze zawierającym 5% dwutlenku węgla przez trzy tygodnie. Natychmiast po odwirowaniu z obciążeniem grawitacyjnym odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 mikrolitrach CDM.Aby utworzyć mikromasę, należy pipetować ponownie zawieszone komórki do środka dołka na płytce 24-dołkowej, a następnie umieścić płytkę w inkubatorze. Po dwóch godzinach ostrożnie dodaj 500 mikrolitrów CDM do studzienki, pipetując do ścianki płytki, aby uniknąć zakłócenia mikromasy. Jako kontrolę pozytywną należy przeprowadzić hodowlę mikromasową z nieodwirowanymi komórkami, dodając CDM zawierającą 10 nanogramów na mililitr TGF-beta-1.Inkubuj mikromasę przez trzy tygodnie. W 21 dniu po utworzeniu mikromasy użyj pipety, aby zebrać granulki sferoidów, a następnie przemyj 1X PBS. Utrwal sferoidalne granulki przez zanurzenie w 4% paraformaldehydzie na 24 godziny.Następnego dnia wyrzuć utrwalacz i spłucz granulki komórek wodą dejonizowaną. Umieścić jedną warstwę gazy na kasecie z tkankami i przenieść utrwalone kulki sferoidalne za pomocą pipety. Przykryj granulkę, składając gazę i zamknij pokrywę kasety.Następnie odwodnić sferoidalne granulki, zanurzając je w 70% etanolu na pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie kontynuuj serię stężeń etanolu przez pięć minut każde. Następnie zanurz granulki w 100% ksylenie na 15 minut.Zanurz sferoidalne granulki w parafinie w temperaturze 56 stopni Celsjusza w celu zatopienia. Następnie wytnij pięć odcinków o grubości mikronów z osadzonych w parafinie granulek komórkowych za pomocą mikrotomu obrotowego. Zanurz sekcje w 50% etanolu, a następnie przenieś je do łaźni wodnej o temperaturze 50 stopni Celsjusza.Zamontuj pływające sekcje na szkiełkach, a następnie przejdź do safraniny o i błękitu alcian w celu barwienia immunofluorescencyjnego. Aby określić odpowiednią odśrodkową siłę grawitacji, ASC wirowano przy grawitacji odśrodkowej wynoszącej zero, 300, 600, 1, 200 i 2, 400 razy g przez piętnaście minut. Ekspresję mRNA SOX9 oceniano po 24 godzinach od stymulacji CG.CG wynoszący 2, 400 razy g znacząco indukował ekspresję mRNA SOX9. Aby ocenić ekspresję genów związanych z chondrogenezą, całkowity RNA wyekstrahowano z niestymulowanych ASC, ASC, które zostały odwirowane lub potraktowane TGF-beta-onem. Jak widać tutaj, stymulacja CG indukuje ekspresję kolagenu typu 2 i aggrekanu.nadekspresja kolagenu typu 2 u ASC leczonych CG została potwierdzona przez immunofluorescencję przy użyciu przeciwciała przeciwko kolagenowi typu 2 w sprzężonym przeciwciałie drugorzędowym Alexa Fluor 594. Aby określić wpływ CG na nadekspresję ECM związaną z chondrogenezą, ASC traktowano TGF-beta-onem jako kontrolą pozytywną. Kontrolą ujemną była hodowla osadów niepoddanych obciążeniu CG lub traktowaniu TGF-beta-onu.Nadekspresję ECM związaną z chondrogenezą oceniano w sferoidalnych osadach składających się z odwirowanych ASC poprzez zastosowanie barwienia safraniną o i błękitem alcjanowym. Glikozaminoglikan, główny składnik chrząstki stawowej, był barwiony na niebiesko przez błękit alcian lub na pomarańczowo przez safraninę o. Po 14 dniach hodowli mikromasowej kondensację chondrocytów oceniano na podstawie wielkości agregatów.Wielkość każdego agregatu, generowanego przez CG, wynosiła około 0,5 milimetra. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w 30 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, w jaki sposób indukować chondogenne różnicowanie komórek macierzystych za pomocą odśrodkowej siły grawitacji.

chondrogenic-differentiation-induction-adipose-derived-stem-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Ten protokół opisuje izolację komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej świni (pADSC) z podskórnych tkanek tłuszczowych z badaniem multipotencji. Multipotencjalne pADSC są wykorzystywane do wyznaczania procesów różnicowania adipocytów i badania transdyferencjacji do wielu linii komórkowych mezenchymy mezodermalnej lub dalszych linii ektodermy i endodermy do badań regeneracyjnych.

Izolacja i różnicowanie komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej z podskórnych tkanek tłuszczowych świń

Tutaj prezentujemy protokół do sekcji próbki ludzkiej pępowiny (UC) i łożyska płodu na błonę śluzową pępowiny (CL), galaretkę Whartona (WJ), połączenie pępowina-łożysko (CPJ) i łożysko płodu (FP) w celu izolacji i charakterystyki mezenchymalnych komórek zrębu (MSC) przy użyciu techniki hodowli eksplantatów.

Izolacja i charakterystyka mezenchymalnych komórek zrębu z ludzkiej pępowiny i łożyska płodu

Przedstawiamy protokół generowania linii chondrogennej z ludzkiej krwi obwodowej (PB) za pomocą indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) przy użyciu metody bez integracji, która obejmuje tworzenie ciała zarodkowego (EB), ekspansję komórek fibroblastycznych i indukcję chondrogeneczną.

Różnicowanie chondrocytów od pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z krwi obwodowej pochodzących od człowieka

Tutaj proponujemy protokół chondrogenicznego różnicowania od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z krwi pępowinowej.

Tworzenie chondrogennych osadów z pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z krwi pępowinowej

Opisano metodę uzyskiwania nierównych nanowzorów na bazie dendrymerów, które pozwalają na nanoskalową kontrolę lokalnej gęstości powierzchni kwasu arginina-glicyna-asparaginowa (RGD) i zastosowano ją do badania adhezji komórek i różnicowania chondrogennego.

Nierówne nanowzorce na bazie dendrymerów do lokalnej kontroli adhezji powierzchni: metoda kierowania różnicowaniem chondrogennym

Celem tego protokołu jest przetestowanie zdolności komórek progenitorowych pochodzących z ludzkiej okołonaczyniowej tkanki tłuszczowej do różnicowania się w wiele linii komórkowych. Różnicowanie porównano z mezenchymalnymi komórkami macierzystymi pochodzącymi z ludzkiego szpiku kostnego, o których wiadomo, że różnicują się w linie adipocytów, osteocytów i chondrocytów.

Zdolność różnicowania ludzkich okołonaczyniowych komórek progenitorowych tkanki tłuszczowej ludzkiej aorty

Przedstawiamy protokół izolacji, hodowli i indukcji adipogennej komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej pochodzącej z grzebienia nerwowego (NCADSC) z okołoaortalnej tkanki tłuszczowej Wnt-1 Cre+/-; Myszy Rosa26RFP/+. NCADSC mogą być łatwo dostępnym źródłem ADSC do modelowania adipogenezy lub lipogenezy in vitro.

Izolacja, hodowla i indukcja adipogenna grzebienia nerwowego Oryginalne komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej okołoorciowej

Ten protokół opisuje metodologię izolowania i identyfikacji mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (MSC) od szczurów Sprague Dawley.

Izolacja i identyfikacja mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej szczurów Sprague Dawley

Tkanka tłuszczowa jest doskonałym źródłem mezenchymalnych komórek macierzystych. Tutaj przedstawiamy krok po kroku ekstrakcję, hodowlę i charakterystykę komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ADSC) z tkanki tłuszczowej najądrza szwajcarskich myszy.

Izolacja, ekspansja in vitro i charakterystyka mezenchymalnych komórek macierzystych z tkanki tłuszczowej najądrza myszy

To badanie opisuje metodę wytwarzania sferoid chondrocytarnych poprzez agregację komórek w sferoidy w warunkach niskiej adhezji przy użyciu grawitacji, a następnie hodowlę powstałych sferoid w mini-bioreaktorach.

Generowanie sferoid z różnych chondrocytów przy użyciu warunków niskiej przyczepności w warunkach grawitacyjnych i domowych mini-bioreaktorów

Poznaj metodę indukcji różnicowania chondrogennego komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej przy użyciu grawitacji odśrodkowej. Technika ta umożliwia uzyskanie fenotypu chondrogennego bez stosowania cytokin.

Indukcja różnicowania chondrogennego komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej przez grawitację odśrodkową

Przeglądaj więcej filmów