Name: Analiza metagenomiczna kiszonki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Poznaj metagenomiczną analizę kiszonki przy użyciu sekwencjonowania shotgun i bioinformatyki. Protokół obejmuje ekstrakcję DNA, przygotowanie biblioteki oraz klasyfikację taksonomiczną bakterii w celu wykrycia oznak psucia paszy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Andrew Birdowi za próbki kiszonki oraz Audrey Farbos z Exeter Sequencing Service za pomoc w przygotowaniu bibliotek sekwencjonowania DNA. Exeter Sequencing Service i podstawowe urządzenia obliczeniowe na Uniwersytecie w Exeter. Nagroda Rady ds. Badań Medycznych ds. Infrastruktury Klinicznej (MR/M008924/1). Wellcome Trust Institutional Strategic Support Fund (WT097835MF), Wellcome Trust Multi User Equipment Award (WT101650MA) oraz BBSRC LOLA award (BB/K003240/1).

1. Lokalizacja strony
<ol>
	<li>Próbkę kiszonki należy pobrać z odpowiedniego miejsca, takiego jak gospodarstwo rolne. Tutaj farma znajdowała się w Ballydulea, Co. Cork, Irlandia (51°51'58.4"N 8°16'48.7"W).</li>
</ol>
2. Ekstrakcja DNA
UWAGA: Ekstrakcja DNA została przeprowadzona przy użyciu komercyjnego zestawu zgodnie z instrukcjami producenta. Kontrola ujemna, która nie zawierała próbki, była stosowana w całej metodzie przygotowania biblioteki.
<ol>
	<li>Dodać 100 - 400 mg próbki do 978 μl buforu fosforanu sodu i 122 μl buforu do lizy gleby w dostarczonych probówkach do lizy</li>.
	<li>Homogenizować próbki, umieszczając probówki do lizy w homogenizatorze na 40 s z prędkością 6,0 m/s.</li>
	<li>Odwirować lizaty przy 14 000 x g przez 15 minut i przenieść supernatant do czystej probówki mikrowirówkowej zawierającej 250 μl roztworu osadu białkowego (PPS). Wymieszaj roztwór, odwracając 10 razy i odwiruj przy 14 000 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Dodać supernatant do 1 ml matrycy wiążącej DNA w czystej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Wymieszaj roztwór, ciągle odwracając probówkę przez 3 minuty. Pozostawić mieszaninę do osiadania na 3 minuty, a następnie wyrzucić 500 μl supernatantu. Wymieszać pozostały supernatant.</li>
	<li>Przenieść 600 μl zawiesiny do filtra wirowego i odwirować przy 14 000 x g przez 1 min. Odrzucić filtrat i powtórzyć proces z pozostałą zawiesiną.</li>
	<li>Dodać 500 μl buforu do matrycy wiążącej DNA w filtrze wirowym, wymieszać pipetując, a następnie odwirować przy 14 000 x g przez 1 min.</li>
	<li>Wyrzuć filtrat i ponownie odwiruj filtr wirowy przy 14 000 x g przez 2 minuty, aby upewnić się, że cały bufor płuczący został usunięty. Suszyć filtr wirowy w temperaturze 23 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Podgrzej wstępnie (70 °C) wodę wolną od DNaz (DES) i ponownie zawiesić matrycę wiążącą DNA w 100 μl DES w filtrze wirowym. Przenieś filtr wirowy do czystej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i wiruj przy 14 000 x g przez 1 minutę w celu wymycia DNA. Oczyszczone DNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu przeprowadzenia dalszej analizy.</li>
</ol>
3. Oczyszczanie DNA za pomocą koralików oczyszczających DNA
UWAGA: Przed przygotowaniem biblioteki metagenomicznej, wyekstrahowane DNA zostało oczyszczone za pomocą kulek oczyszczających, aby zapewnić uzyskanie czystej próbki DNA.
<ol>
	<li>Inkubować kulki w temperaturze 23 °C przez 30 minut przed użyciem. Dodać 2 objętości kulek do próbki DNA i inkubować roztwór w temperaturze 23 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Umieścić próbki na magnesie separacyjnym na 5 minut, a następnie wyrzucić supernatant. Umyj kulki dwukrotnie 200 μl świeżego 80% etanolu (EtOH). Suszyć koraliki na powietrzu przez 10 minut.</li>
	<li>Wyjąć próbki z magnesu rozdzielającego i dodać 50 μl buforu elucyjnego (EB), wymieszać pipetując.</li>
	<li>Inkubować zawiesinę w temperaturze 23 °C przez 5 minut, po czym umieścić próbki z powrotem na magnesie rozdzielającym na 3 minuty.</li>
	<li>Przenieś supernatant, który zawiera DNA, do czystej probówki. Wyrzuć koraliki.</li>
	<li>Określić ilościowo oczyszczone DNA zgodnie z sekcją czwartą.</li>
</ol>
4. Kwantyfikacja oczyszczonego DNA
UWAGA: Oczyszczone DNA zostało oznaczone ilościowo za pomocą fluorometru i dwuniciowego (dsDNA) zestawu do oznaczania wysokiej czułości (HS) zgodnie z instrukcjami producenta.
<ol>
	<li>Przygotować roztwór roboczy, stosując stosunek buforu do odczynnika 199:1.</li>
	<li>Dodać 10 μl każdego wzorca DNA do 190 μl roztworu roboczego.</li>
	<li>Dodać 10 μl oczyszczonego DNA do 190 μl roztworu roboczego. Ostateczna objętość powinna wynosić 200 μl. Próbki wzorcowe i DNA inkubować w temperaturze 23 °C przez 2 minuty.</li>
	<li>Analizuj wzorce przed próbkami DNA na fluorometrze, korzystając z instrukcji wyświetlanych na ekranie.</li>
</ol>
5. Przygotowanie biblioteki sekwencjonowania strzelby
UWAGA: Biblioteka sekwencjonowania strzelb została przygotowana przy użyciu komercyjnego zestawu do przygotowania biblioteki zgodnie z instrukcjami producenta.
<ol>
	<li>Rozcieńczyć próbki DNA do 0,2 ng/μl za pomocą EB. Każdą próbkę, która jest już poniżej tego stężenia, tj. kontroli ujemnej, pozostawia się w obecnym stężeniu.</li>
	<li>Zmieszać 5 μl oczyszczonego DNA z 10 μl buforu i 5 μl mieszanki enzymatycznej. Próbki inkubować w temperaturze 55 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Dodać 5 μl buforu neutralizującego i inkubować roztwór w temperaturze 23 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Dodać po 5 μl każdego ze wskaźników sekwencjonowania specyficznych dla próbki i 15 μl głównej mieszanki PCR.</li>
	<li>W termocyklerze inkubować próbki w temperaturze 72 °C przez 3 minuty, w temperaturze 95 °C przez 30 s, następnie w 12 cyklach w temperaturze 95 °C przez 10 s, w temperaturze 55 °C przez 30 s i w temperaturze 72 °C przez 30 s. Próbki należy inkubować w temperaturze 72 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Oczyścić przygotowane DNA, stosując oczyszczanie kulkowe jak poprzednio, ale z końcową elucją, wyciskając 30 μl EB.</li>
</ol>
6. Kontrola ilości i jakości biblioteki
UWAGA: Ilość i jakość przygotowanych bibliotek została oceniona za pomocą komercyjnego zestawu i oprzyrządowania.
<ol>
	<li>Inkubować składniki zestawu w temperaturze 23 °C przez 30 minut przed użyciem.</li>
	<li>Dodaj 2 μl DNA do 2 μl buforu i wiruj przez 1 minutę przy 2,000 obr./min.</li>
	<li>Zakręć próbkę, aby upewnić się, że znajduje się na dnie probówki.</li>
	<li>Włóż probówki z próbkami, taśmę analityczną i końcówki do urządzenia i wykonaj analizę zgodnie z zaleceniami oprogramowania.</li>
</ol>
7. Sekwencjonowanie DNA
<ol>
	<li>Przenieś przygotowane i oznaczone ilościowo próbki bibliotek sekwencjonowania DNA do usługi sekwencjonowania i sekwencjonuj przy użyciu sekwencjonowania sparowanych końców 300 pz 45.</li>
</ol>
8. Analiza surowych danych sekwencyjnych
UWAGA: Polecenia dla każdego programu korzystającego z systemu operacyjnego Linux są pokazane poniżej kroku protokołu. Potok używany do analizy danych sekwencyjnych pokazano na rysunku 1. Programy muszą zostać zainstalowane przez użytkownika przed analizą. Proces ten powinien być wykonywany indywidualnie dla każdej próbki.
<ol>
	<li>Analizuj i wizualizuj dane sekwencji DNA za pomocą FastQC 46, wpisując w wierszu poleceń /path-to-file/fastqc, a następnie w przód i w tył surowe odczyty raw_read1.fastq raw_read2.fastq.</li>
	<li>Określ folder wyjściowy, wpisując -o output_fastqc i format pliku surowych plików odczytanych przez -f fastq.</li>
	<li>Wyświetl plik wyjściowy (Rysunek 2). 
	ścieżka do-pliku/fastqc raw_read1.fastq raw_read2.fastq -o output_directory -f fastq.</li>
</ol>
9. Kontrola jakości, przycinanie i filtrowanie danych sekwencji
<ol>
	<li>Uruchom program do przycinania, Trimmomatic 28, wpisując w wierszu poleceń java -jar /ścieżka-do-pliku/ trimmomatic-0.35.jar.</li>
	<li>Określ, że pliki są sparowanymi plikami końcowymi, wpisując "PE". Określ, że 16 jednostek centralnych (CPU) powinno być używanych przez program, wpisując -threads 16.</li>
	<li>Wymień dwa pliki do sprawdzenia w ramach kontroli jakości, wpisując nazwy nieprzetworzonych odczytów do przodu i do tyłu. Prefiks plików wyjściowych jest określany przez wpisanie -baseout silage.</li>
	<li>Zdefiniuj opcje programu, wpisując ILLUMINACLIP:NexteraPE-PE.fa:2:30:10 LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:20 CROP:200 HEADCROP:15 MINLEN:36.</li>
	<li>Po zakończeniu przeanalizuj przycięte sekwencje za pomocą FastQC, tak jak poprzednio, i porównaj dane wyjściowe z surowymi danymi sekwencji, aby upewnić się, że przycinanie zostało przeprowadzone pomyślnie. 
	UWAGA: Narzędzie programowe Trimmomatic przycina odczyty dalej, usuwając wiodące bazy niskiej jakości lub N (poniżej jakości 3), usuwając końcowe bazy niskiej jakości lub N zasad (poniżej jakości 3) i skanując każdy odczyt za pomocą przesuwanego okna o szerokości 4 baz. Parametry zostały ustawione na cięcie, gdy średnia jakość na bazę spadnie poniżej 20, a następnie na spadek wszelkich odczytów poniżej 36 zasad. Na koniec 15 baz zostało przyciętych z nagłówka każdego odczytu, a odczyty zostały przycięte, aby zachować 200 baz od początku odczytu. Ten ostatni krok został wykonany w celu przezwyciężenia niektórych problemów z jakością podczas sekwencjonowania długich (> 200 bp) odczytów. Można je dostosować do konkretnych próbek 28, 
	java -jar /ścieżka-do-pliku/trimmomatic-0.35.jar PE -threads 16 raw_read1.fastq raw_read2.fastq -baseout kiszonka ILLUMINACLIP:NexteraPE-PE.fa:2:30:10 PROWADZENIE:3 KOŃCOWE:3 PRZYCINANIEOKNO:4:20 PRZYCINANIE:200 PRZYCINANIE:15 MINLEN:36</li>
</ol>
10. Montaż metagenomu
<ol>
	<li>Scal niesparowane, przycięte odczyty, wpisując cat, a następnie niesparowane odczyty; silage_read1_unpaired.fastq silage_read2_unpaired.fastq. Zapisz pliki w nowym pliku, wpisując > silage_merged_unpaired.fastq 
	kot silage_read1_unpaired.fastq silage_read2_unpaired.fastq > silage_merged_unpaired.fastq</li>
	<li>Aby de novo złożyć zsekwencjonowane DNA, użyj SPAdes (St. Petersburg genome assembler) 30, wpisując /path-to-file/spades.py. Określ, że 16 procesorów ma być używanych, wpisując -t 16 i że parametr metagenomiczny powinien być zastosowany, wpisując --meta.</li>
	<li>Zidentyfikuj przycięte odczyty do przodu za pomocą -1 silage_read1_paired.fastq, a odwrotne odczyty za pomocą -2 silage_read2_paired.fastq. Scalone, niesparowane odczyty są określone przez -s silage_merged_unpaired.fastq.</li>
	<li>Zdefiniuj folder wyjściowy, wpisując -o silage_spades. 
	ścieżka-do-pliku/spades.py -t 16 --meta -1 silage_read1_paired.fastq -2 silage_read2_paired.fastq -s silage_merged_unpaired.fastq -o silage_spades</li>
</ol>
11. Nakładanie się odczytu na sparowanym końcu
<ol>
	<li>Scal pary odczytów sekwencji DNA za pomocą FLASH (Fast Length Adjustment of Short Reads) 29, wpisując w wierszu poleceń /path-to-file/flash. Określ, że powinno być używanych 16 procesorów, używając -t 16, a prefiks wyjściowy, wpisując -o kiszonka.</li>
	<li>Zidentyfikuj przycięte odczyty, wpisując silage_trimmed_R1.fastq silage_trimmed_R2.fastq 
	ścieżka do-pliku/flash -t 16 -o FLASHed silage_read1_paired.fastq silage_read2_paired.fastq</li>
</ol>
12. Klasyfikacja taksonomiczna
<ol>
	<li>Wpisz /path-to-file/kraken i określ bazę danych, wpisując --db /path-to-file/standard.</li>
	<li>Zdefiniuj, że należy użyć 16 procesorów CPU, wpisując --threads 16 i zidentyfikuj folder wyjściowy przy użyciu polecenia --output FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.txt. Wpisz nazwę pliku wejściowego; FLASHed_silage.extendedFrags.fastq 
	ścieżka do-pliku/kraken --db standard --thread 16 --output FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.txt FLASHed_silage.extendedFrags.fastq 
	UWAGA: Klasyfikacja złożonych rusztowań sekwencji DNA przy użyciu Kraken 7 została zakończona na podstawie najnowszej, standardowej bazy danych Kraken, która zawierała wszystkie dostępne sekwencje genomu prokariotów.</li>
	<li>Przenieś kolumny 2 i 3 z pliku wyjściowego do nowego pliku, wpisując cut -f2,3 FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.txt > FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.int</li>
	<li>Otwórz plik wyjściowy w web browser. 
	cut -f2,3 FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.txt > FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.int</li>
	<li>Zaimportuj nowy plik do Krona 12, wpisując ktImportTaxonomy. Określ plik wejściowy, wpisując FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.int. Zidentyfikuj plik wyjściowy, wpisując -o FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.out.html. 
	ścieżka-do-pliku/ktImportTaxonomy FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.int -o FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.out.html</li>
</ol>
13. Adnotacja funkcjonalna
<ol>
	<li>Wejdź na stronę MG-RAST 47, http://metagenomics.anl.gov/. W razie potrzeby zarejestruj się jako nowy użytkownik. Po zalogowaniu kliknij przycisk "Prześlij". Prześlij zmontowane rusztowania z kroku 10.</li>
	<li>Po przesłaniu plików kliknij "Prześlij" i postępuj zgodnie z instrukcjami, czekając na zakończenie analizy.</li>
	<li>Po zakończeniu analizy wyświetl link wysłany e-mailem od MG-RAST lub alternatywnie kliknij "Postęp". Dostępna jest lista zrealizowanych zadań. Kliknij odpowiedni identyfikator zadania, a następnie link do "strony pobierania".</li>
	<li>Na stronie pobierania, pod nagłówkiem "Grupowanie białek 90%", kliknij przycisk białka, aby pobrać przewidywany plik białka, 550.cluster.aa90.faa.</li>
	<li>Aby sklasyfikować białka jako przypuszczalnie należące do określonej klasy enzymów CAZy, porównaj pobrane białka z bazą danych CAZy 48. Pobierz bazę danych Carbohydrate-Active enZYmes (CAZy) z plików to: AA.zip, CE.zip, GH.zip, GT.zip i PL.zip. Pliki te reprezentują odpowiednio następujące klasy enzymów: działania pomocnicze (AA), esterazy węglowodanowe (CE), hydrolazy glikozydowe (GH), transferazy glikozylowe (GT) i liazy polisacharydowe (PL).</li>
	<li>Rozpakuj pliki bazy danych i dodaj adnotacje do białek, określając podobieństwo białek do białek z bazy danych CAZy za pomocą algorytmu USEARCH UBLAST 49. Aby użyć pętli bash (dla i w *.txt) do iteracji po 5 plikach bazy danych .txt, wpisz "for i w *.txt; zrób".</li>
	<li>Uruchom USEARCH, wpisując /path-to-file/usearch8 z parametrem -ublast, aby użyć algorytmu ublast. Następnie wpisz nazwę pliku sekwencji białka pobranego z MG-RAST, "mgmXXXXXX.3.550.cluster.aa90.faa".</li>
	<li>Aby wskazać plik bazy danych, który ma być używany, wpisz "-db $i" i aby określić próg wartości E na poziomie 1e-5, wpisz "-evalue 1e-5".</li>
	<li>Aby zakończyć wyszukiwanie po odkryciu sekwencji docelowej i tym samym sklasyfikowaniu tej sekwencji białka jako należącej do docelowej klasy enzymów, np. GH, należy wpisać "-masaccepts 1".</li>
	<li>Aby zdefiniować, że należy użyć 16 procesorów, wpisz "-threads 16", a aby określić format pliku wyjściowego jako tekst rozdzielany tabulatorami, wpisz "-blast6out". Aby zidentyfikować plik wyjściowy, wpisz "$i.ublast". Aby zakończyć pętlę bash, wpisz "; Gotowe" 
	dla i w *.txt; 
	do /ścieżka-do-pliku/usearch8 -ublast .. /mgmXXXXXX.3.550.cluster.aa90.faa -db $i -evalue 1e-5 -maxaccepts 1 -threads 16 -blast6out $i.ublast; 
	gotowy</li>
</ol>
14. Wizualizacja adnotacji CAZy
<ol>
	<li>Aby zwizualizować dane wyjściowe z adnotacji CAZy jako diagram Venna, wygeneruj listy identyfikatorów białek dla każdej klasy enzymów przy użyciu pętli bash. Wpisz "for i w *.ublast; zrób".</li>
	<li>Aby przenieść kolumnę 1 z pliku wyjściowego do nowego pliku, wpisz "cat $i | cut -f 1 >$i.list".</li>
	<li>Zakończ pętlę i wpisz "; gotowe".</li>
	<li>Otwórz pliki .list w edytorze tekstu. Wejdź na stronę , wybierz liczbę zestawów jako 5 i wklej zawartość każdego pliku z listą w osobnym polu. Pobierz wynikowy diagram jako plik . SVG plik. 
	for i w *.ublast; 
	czy kot $i | cut -f 1 >$i.list; 
	gotowy</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Chociaż analiza in silico może dać doskonały wgląd w społeczności drobnoustrojów, które są obecne w próbkach środowiskowych, niezwykle ważne jest, aby wykazane klasyfikacje taksonomiczne były przeprowadzane w połączeniu z odpowiednimi kontrolami i aby osiągnięto odpowiednią głębokość sekwencjonowania, aby uchwycić całą obecną populację 51.
W przypadku każdej analizy obliczeniowej istnieje wiele dróg do osiągnięcia podobnego celu. Metody, które zastosowaliśmy w tym badaniu, są przykładami odpowiednich i prostych metod, które zostały połączone w celu uzyskania szeregu analiz mikrobiomu kiszonki. Do analizy danych metagenomicznych dostępnych jest różnorodnych i stale rosnących narzędzi i technik bioinformatycznych, na przykład Phylosift 8 i MetaPhlAn2 52, które powinny zostać ocenione przed badaniem pod kątem ich znaczenia dla próbki i wymaganej analizy 53. Metody analizy metagenomicznej są ograniczone przez bazy danych dostępne do klasyfikacji, głębokości sekwencjonowania i jakości sekwencjonowania.
Zademonstrowane tutaj przetwarzanie bioinformatyczne zostało przeprowadzone na lokalnej maszynie o dużej mocy; Dostępne są jednak również systemy oparte na chmurze. Te usługi oparte na chmurze pozwalają na wynajem niezbędnej mocy obliczeniowej bez konieczności kosztownej inwestycji w odpowiednią, wydajną lokalną stację roboczą. Potencjalnym zastosowaniem tej metody byłaby ocena kiszonki przed jej zastosowaniem w rolnictwie, aby upewnić się, że nie ma w niej potencjalnie szkodliwych bakterii, zapobiegając w ten sposób ich przedostawaniu się do łańcucha pokarmowego.

Metagenomika to bezpośrednia analiza DNA oczyszczonego ze zbiorowisk biologicznych znalezionych w próbkach środowiskowych 1 i pierwotnie była używana do wykrywania nienadających się do hodowli bakterii znalezionych w osadach 2. Metagenomika jest szeroko stosowana w wielu zastosowaniach, takich jak identyfikacja ludzkiego mikrobiomu 3, klasyfikacja populacji drobnoustrojów w oceanie 4 , a nawet do analizy społeczności bakteryjnych, które rozwijają się w ekspresach do kawy 5 . Wprowadzenie technologii sekwencjonowania nowej generacji zaowocowało większą przepustowością i wydajnością sekwencjonowania. W związku z tym sekwencjonowanie DNA stało się bardziej ekonomiczne 6, a głębokość sekwencjonowania, które można wykonać, znacznie wzrosła, dzięki czemu metagenomika stała się potężnym narzędziem analitycznym.
Ulepszenia "Front-end" w praktycznym, molekularnym aspekcie sekwencjonowania metagenomicznego przyczyniły się do rozwoju narzędzi bioinformatycznych in silico dostępnych dla klasyfikacji taksonomicznej 7-9, adnotacji funkcjonalnej 10,11 i wizualnej reprezentacji 12,13 danych sekwencji DNA. Rosnąca liczba dostępnych, zsekwencjonowanych genomów prokariotycznych i eukariotycznych 14 pozwala na dalszą dokładność klasyfikacji społeczności drobnoustrojów, która jest niezmiennie przeprowadzana w odniesieniu do "zaplecza" referencyjnej bazy danych sekwencjonowanych genomów 15. Do analizy metagenomicznej można przyjąć dwa główne podejścia.
Bardziej konwencjonalną metodą jest analiza regionu kodującego gen 16S rRNA genomu bakteryjnego. 16S rRNA jest wysoce konserwatywne między gatunkami prokariotów, ale wykazuje dziewięć hiperzmiennych regionów (V1 - V9), które można wykorzystać do identyfikacji gatunku 16. Wprowadzenie dłuższego sekwencjonowania (≤ sparowanym końcem 300 pz) pozwoliło na analizę sekwencji DNA obejmujących dwa hiperzmienne regiony, w szczególności region V3 - V4 17. Postępy w innych technologiach sekwencjonowania, takich jak Oxford Nanopore 18 i PacBIO 19, pozwalają na sekwencjonowanie całego genu 16S rRNA w sposób ciągły.
Podczas gdy biblioteki oparte na 16S rDNA zapewniają ukierunkowane podejście do identyfikacji gatunków i umożliwiają wykrywanie DNA o niskiej liczbie kopii, które naturalnie występuje w oczyszczonych próbkach, biblioteki sekwencjonowania typu shotgun pozwalają na wykrywanie gatunków, które mogą zawierać regiony DNA, które albo nie są amplifikowalne przez użyte sekwencje starterów markerów 16S rRNA, albo dlatego, że różnice między sekwencją matrycy a sekwencją startera wzmacniającego są zbyt duże 20,21. Ponadto, chociaż polimerazy DNA charakteryzują się wysoką wiernością replikacji DNA, podczas amplifikacji PCR mogą jednak wystąpić błędy zasadowe, które mogą skutkować nieprawidłową klasyfikacją gatunków pochodzących 22. Mogą również wystąpić odchylenia w amplifikacji sekwencji matryc PCR; sekwencje DNA o wysokiej zawartości GC mogą być niedostatecznie reprezentowane w końcowej puli amplikonów 23, a podobnie nienaturalne modyfikacje zasad, takie jak glikol tyminowy, mogą zatrzymać polimerazy DNA, powodując niepowodzenia w amplifikacji sekwencji DNA 24. W przeciwieństwie do tego, biblioteka DNA do sekwencjonowania typu shotgun to biblioteka DNA, która została przygotowana przy użyciu całego oczyszczonego DNA, które zostało wyekstrahowane z próbki, a następnie rozdrobnione na krótsze długości łańcucha DNA przed przygotowaniem do sekwencjonowania. Klasyfikacja taksonomiczna sekwencji DNA generowanych przez sekwencjonowanie typu shotgun jest dokładniejsza w porównaniu z sekwencjonowaniem amplikonów 16S rRNA 25, chociaż koszt finansowy wymagany do osiągnięcia wiarygodnej głębokości sekwencjonowania jest większy niż w przypadku sekwencjonowania amplikonowego 26. Główną zaletą metagenomiki sekwencjonowania typu shotgun jest to, że zsekwencjonowane regiony różnych genomów w próbce są dostępne do poszukiwania genów po ich taksonomicznej klasyfikacji 27.
Dane sekwencji metagenomicznej są analizowane przez coraz szerszy zakres narzędzi bioinformatycznych. Narzędzia te są w stanie wykonywać szeroką gamę zastosowań, na przykład analizę kontroli jakości surowych danych sekwencji 28, nakładanie się sparowanych odczytów końcowych 29, montaż de novo odczytów sekwencji do kontigów i rusztowań 30,31, klasyfikację taksonomiczną i wizualizację odczytów sekwencji i zmontowanych sekwencji 7,12,32,33 oraz funkcjonalną adnotację złożonych sekwencji 34,35.
Kiszonka, produkowana przez rolników na całym świecie z fermentowanych zbóż, takich jak kukurydza (Zea mays), jest głównie używana jako pasza dla bydła. Kiszonka jest traktowana bakterią Lactobacillus sp. w celu wspomagania fermentacji 36, ale do tej pory wiedza na temat innych populacji drobnoustrojów występujących w kiszonce jest ograniczona. Proces fermentacji może prowadzić do rozpowszechnienia się niepożądanych i potencjalnie szkodliwych mikroorganizmów w kiszonce 37. Oprócz drożdży i pleśni bakterie szczególnie przystosowują się do środowiska beztlenowego podczas fermentacji kiszonki i częściej są związane z chorobami zwierząt gospodarskich niż z degradacją kiszonki 38. Bakterie kwasu masłowego mogą zostać przypadkowo dodane z resztek glebowych podczas napełniania silosów na kiszonkę i są w stanie przekształcić kwas mlekowy, produkt fermentacji beztlenowej, w kwas masłowy, zwiększając w ten sposób pH kiszonki 39. Ten wzrost pH może prowadzić do gwałtownego wzrostu liczby bakterii powodujących psucie się, które normalnie nie byłyby w stanie utrzymać wzrostu w optymalnych warunkach fermentacji kiszonki 38. Clostridium spp., Listeria spp. i Bacillus spp. są szczególnie niepokojące, zwłaszcza w kiszonce na paszę dla bydła mlecznego, ponieważ zarodniki bakterii, które przetrwały w przewodzie pokarmowym 40 , mogą dostać się do łańcucha pokarmowego, prowadzić do psucia się żywności, a w rzadkich przypadkach do śmierci zwierząt i ludzi 37,39,41-44. Ponadto, chociaż trudno jest oszacować dokładny wpływ ekonomiczny leczenia weterynaryjnego i strat zwierząt gospodarskich spowodowanych psuciem się kiszonki, wystąpienie ogniska choroby może być szkodliwe dla gospodarstwa.
Przypuszcza się, że za pomocą podejścia metagenomicznego możemy sklasyfikować populacje mikroorganizmów, które są obecne w próbkach kiszonki, a ponadto zidentyfikować społeczności mikrobiologiczne związane z psuciem się kiszonki, które z kolei potencjalnie miałyby szkodliwy wpływ na zwierzęta gospodarskie, umożliwiając podjęcie działań zaradczych zanim kiszonka zostanie wykorzystana jako źródło pożywienia.

<table><tbody><tr><td>Zestaw FastDNA SPIN do gleby</td><td>MP Bio 116560200</td><td></td><td>Ekstrakcja DNA</td></tr><tr><td>DNA FastPrep</td><td>MP Bio</td><td>116004500</td><td>Ekstrakcja DNA</td></tr><tr><td>Koraliki Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>Bufor elucyjny</td> do oczyszczania DNA <td>Qiagen</td><td>19806</td><td>Oczyszczanie DNA</td></tr><tr><td>Qubit Fluorometr</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q33216</td><td>DNA Kwantyfikacja</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Zestaw testowy</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32854</td><td>Kwantyfikacja DNA</td></tr><tr><td>Zestaw do przygotowania biblioteki DNA Nextera XT</td><td>Przygotowanie biblioteki</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1024</td></tr><tr><td>Zestaw indeksów Nextera XT</td><td>Przygotowanie biblioteki Illumina</td><td>FC-131-1001</td><td>Przygotowanie biblioteki</td></tr><tr><td>TapeStation 2200</td><td>Agilent</td><td>G2964AA</td><td>Kwantyfikacja DNA</td></tr><tr><td>HS D100 ScreenTape</td><td>Agilent</td><td>5067-5584</td><td>Kwantyfikacja DNA</td></tr><tr><td>HS D100 Odczynniki ScreenTape</td><td>Agilent</td><td>5067-5585</td><td>Końcówki do kwantyfikacji DNA</td></tr><tr><td>TapeStation</td><td>Agilent</td><td>5067-5153</td><td>Kwantyfikacja DNA</td></tr><tr><td>TapeStation</td><td>Agilent</td><td>401428 i 401425</td><td>Sekwencjonowanie DNA</td></tr><tr><td>HiSeq 2500</td><td>Illumina</td><td></td><td>- dostarczane przez usługa sekwencjonowania</td></tr><tr><td>Stacja robocza do analizy dużej mocy</td><td>Różne</td><td></td><td>systemy lokalne lub oparte na chmurze, preferowane przez użytkownika</td></tr></tbody></table>

analiza metagenomiczna kiszonki

Metagenomic Analysis of Silage

Metagenomika jest zdefiniowana jako bezpośrednia analiza kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA) oczyszczonego z próbek środowiskowych i umożliwia taksonomiczną identyfikację obecnych w nich społeczności mikroorganizmów. Istnieją dwa główne podejścia metagenomiczne; sekwencjonowanie regionu kodującego gen 16S rRNA, który wykazuje wystarczającą zmienność między taksonami do identyfikacji, oraz sekwencjonowanie typu shotgun, w którym genomy organizmów obecnych w próbce są analizowane i przypisywane do "operacyjnych jednostek taksonomicznych"; gatunków, rodzajów lub rodzin w zależności od zakresu sekwencjonowania. 
W tym badaniu, sekwencjonowanie shotgun zostało użyte do analizy społeczności mikrobiologicznej obecnej w kiszonce dla bydła i, w połączeniu z szeregiem narzędzi bioinformatycznych, do kontroli jakości i filtrowania odczytów sekwencji DNA, przeprowadzenia klasyfikacji taksonomicznej populacji drobnoustrojów obecnych w próbce kiszonki i uzyskania funkcjonalnej adnotacji sekwencji. Metody te zostały wykorzystane do identyfikacji potencjalnie szkodliwych bakterii, które istniały w kiszonce, co wskazuje na psucie się kiszonki. Jeśli zepsuta kiszonka nie zostanie usunięta, to po spożyciu może być potencjalnie śmiertelna dla zwierząt gospodarskich.

Przed analizą bioinformatyczną surowe odczyty sekwencji zostały przycięte, a adaptery usunięte przy użyciu oprogramowania Trimmomatic 28. Po etapie przycinania i filtrowania liczba odczytów została zredukowana do 50% odczytów sekwencji (Tabela 1). Średnia wartość phred dla zasad po kontroli jakości wynosiła &gt;30 (Rysunek 2).
Pary sekwencji DNA posiadające nakładające się regiony zostały połączone przy użyciu oprogramowania FLASH 29 w celu wygenerowania pojedynczych, dłuższych odczytów; odczyty nienakładające się zachowano w osobnym pliku. Pomyślnie połączono 45,47% odczytów (105 343). Po połączeniu odczytów za pomocą programu FLASH, otrzymane wydłużone fragmenty poddano klasyfikacji taksonomicznej bakterii przy użyciu oprogramowania Kraken 7, a następnie zwizualizowano za pomocą oprogramowania Krona (Rysunek 3).
Większość gatunków bakteryjnych obecnych w metagenomie kiszonki należy do 4 typów prokariotycznych: Firmicutes (34%), Actinobacteria (28%), Proteobacteria (27%) oraz Bacteroidetes (7%). Rozkład klas obecnych w tych typach przedstawiono na Rysunku 4. Najliczniejszymi gatunkami w metagenomie były Lactobacillus spp. (24%; Firmicutes), Corynebacterium spp. (8%; Actinobacteria), Propionibacterium spp. (3%; Actinobacteria) oraz Prevotella spp. (3%; Bacteroidetes). Zaobserwowano również gatunki istotne dla zdrowia zwierząt i powiązane z chorobami; w próbce kiszonki przewidziano obecność Clostridium spp. (1%), Bacillus spp. (0,6%) oraz Listeria spp. (0,2%).
Przeprowadzono adnotację funkcjonalną zmontowanych odczytów. Metagenom został zmontowany za pomocą assemblera SPAdes 30 z wykorzystaniem przyciętych i przefiltrowanych odczytów parzystych oraz pojedynczych, co pozwoliło na wygenerowanie 92 284 skafoldów. W celu zidentyfikowania celulaz przewidziano białka przy użyciu MG-RAST i poddano je adnotacji z wykorzystaniem bazy danych Carbohydrate-Active enZYmes (CAZy). Spośród 97 562 przewidzianych białek 6357 zaadnotowano jako domniemane enzymy aktywne w odniesieniu do węglowodanów, należące do jednej z pięciu klas enzymów tworzących bazę CAZy (Rycina 5). Wyniki zwizualizowano w formie diagramu Venna przy użyciu oprogramowania InteractiVenn 50, co pozwoliło przedstawić rozkład adnotacji białkowych, w tym tych zawierających adnotacje z więcej niż jednej klasy enzymów CAZy. Spośród nich 3861 białek wykazuje przewidywaną aktywność hydrolazy glikozydowej i zostaną one poddane dalszej charakterystyce laboratoryjnej w celu potwierdzenia funkcji.
<img alt="Schemat przetwarzania danych metagenomicznych; kroki obejmują przycinanie odczytów, składanie oraz przewidywanie proteomu." src="/files/ftp_upload/54936/54936fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Bioinformatyczny schemat metagenomiczny do analizy kiszonki. Do zbadania mikrobiomu kiszonki zastosowano dwa główne podejścia: klasyfikację taksonomiczną oraz adnotację funkcjonalną. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres wyników jakości sekwencjonowania DNA; porównanie odczytów surowych i przyciętych; analiza bioinformatyczna." src="/files/ftp_upload/54936/54936fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Jakość sekwencji na pojedynczą zasadę przed i po przycinaniu oraz usuwaniu adapterów. Wykres jakości sekwencji na pojedynczą zasadę z programu FASTQC przedstawia średnią wartość phred wzdłuż długości odczytów sekwencji przed i po kontroli jakości. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat analizy różnorodności mikrobiologicznej; drzewo filogenetyczne z 105 343 przyciętych sekwencji z programu FLASH." src="/files/ftp_upload/54936/54936fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Klasyfikacja taksonomiczna mikrobiomu bakteryjnego kiszonki litej. Klasyfikację przyciętych i nakładających się odczytów sekwencji z programu FLASH przeprowadzono przy użyciu Kraken 7, a następnie zwizualizowano za pomocą programu krona. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres słupkowy rozmieszczenia typów bakterii; obejmuje Firmicutes, Actinobacteria; wyniki badania mikrobiomu." src="/files/ftp_upload/54936/54936fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Rozkład klas taksonomicznych dla 4 najliczniejszych typów w mikrobiomie bakteryjnym kiszonki stałej. Procentowy udział każdej klasy bakterii w ramach czterech najliczniejszych typów. Firmicutes: Clostridia (czerwony) i Bacilli (ciemnoniebieski); Proteobacteria: delta/epsilon (różowy), alpha (jasnoniebieski), gamma (pomarańczowy) i beta (turkusowy); Bacteroidetes: Flavobacteriia (ciemnoniebieski) i Bacteroidia (jasnozielony); Actinobacteria: Coriobacteriia (ciemnofioletowy) i inne Actinobacteria (ciemnozielony). <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig4large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Diagram Venna; analiza nakładania się zbiorów danych; grupowanie porównawcze; część wspólna danych badawczych." src="/files/ftp_upload/54936/54936fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Adnotacja CAZy przewidywanego proteomu w mikrobiomie kiszonki stałej. Diagram Venna przedstawiający rozkład pięciu klas enzymów w adnotacjach CAZy w przewidywanym proteomie mikrobiomu kiszonki stałej. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td># Surowych odczytów</td>
			<td rowspan="2"># Odczytów po filtrowaniu (parzystych)</td>
			<td># Odczytów po filtrowaniu</td>
			<td rowspan="2"># Odczytów po FLASH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(parzystych)</td>
			<td>(nieparzystych)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,374,949 x2</td>
			<td>231,679 x2</td>
			<td>1,892,534</td>
			<td>105,343</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Tabela podsumowująca odczyty sekwencjonowania.

Metagenomics została wykorzystana do zbadania mikrobiomu paszy dla bydła na kiszonkę. Analizę przeprowadzono za pomocą sekwencjonowania typu shotgun. Podejście to wykorzystano do scharakteryzowania składu zbiorowiska mikrobiologicznego w paszy dla bydła.

Analiza metagenomiczna kiszonki

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest zrozumienie społeczności bakteryjnej obecnej w próbce kiszonki, chociaż procedury te można zastosować do wielu różnych typów próbek. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania podczas identyfikacji zbiorowisk prokariotycznych występujących w złożonych systemach mikrobiologicznych, takich jak w przedstawionym przypadku kiszonka na paszę dla zwierząt. Główną zaletą tej techniki jest to, że zamiast bardziej konwencjonalnego sekwencjonowania amplikonów 16S stosuje się sekwencjonowanie typu shotgun, co umożliwia znacznie większą dokładność przy klasyfikacji mikrobiomu.Metodę tę można zastosować do szerokiej gamy innych próbek, w których mogą tworzyć się złożone mikrokosmosy, takich jak ludzkie jelita, na powierzchni skóry, w próbkach wody, a nawet wokół biurowego ekspresu do kawy. Do ekstrakcji DNA z próbki kiszonki służy zestaw handlowy. Rozpocznij tę procedurę od dodania od 100 do 400 miligramów próbki do 978 mikrolitrów buforu fosforanu sodu i 122 mikrolitrów buforu do lizy gleby w dostarczonej probówce do lizy.Uwzględnić kontrolę ujemną, w której nie ma próbki kiszonki. Homogenizować próbki, umieszczając probówki do lizy w homogenizatorze na 40 sekund z prędkością 6,0 metrów na sekundę. Odwirowywać lizaty przez 15 minut.Przenieść supernatant do czystej probówki mikrowirówkowej zawierającej 250 mikrolitrów roztworu osadu białkowego i wymieszać roztwór, odwracając 10 razy. Następnie wirować przez pięć minut. Przenieść supernatant do czystej 15-mililitrowej probówki wirówkowej, która zawiera jeden mililitr matrycy wiążącej DNA.Wymieszaj roztwór, ciągle odwracając probówkę przez trzy minuty. Pozostawić mieszaninę do osiadania przez trzy minuty, następnie wyrzucić 500 mikrolitrów supernatantu i wymieszać pozostały supernatant przez pipetowanie. Przenieść 600 mikrolitrów zawiesiny do filtra wirowego i odwirować przy 14 000 razy G przez jedną minutę.Wyrzucić filtrat i powtórzyć proces z pozostałą zawiesiną. Po odrzuceniu filtratu dodać 500 mikrolitrów buforu do matrycy wiążącej DNA w filtrze wirowym, wymieszać pipetując i odwirować przy 14 000 razy G przez jedną minutę. Wyrzuć filtrat i odwiruj filtr wirowy przez dwie minuty, aby upewnić się, że cały bufor płuczący został usunięty.Suszyć filtr wirowy w temperaturze 23 stopni Celsjusza przez pięć minut. Dodaj 100 mikrolitrów wstępnie podgrzanej wody wolnej od DNaz do matrycy wiążącej DNA i przenieś filtr wirowy do czystej 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej. Wirować przy 14 000 razy G przez jedną minutę, aby wymyć DNA.Przechowuj DNA w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, dopóki nie będzie potrzebne do dalszej analizy. DNA wyekstrahowane z próbek kiszonki zostanie oczyszczone za pomocą kulek oczyszczających DNA. Wyjmij koraliki z lodówki i pozostaw je w temperaturze 23 stopni Celsjusza co najmniej 30 minut przed użyciem.Dodać dwie objętości kulek do każdej próbki DNA i inkubować roztwór w temperaturze 23 stopni Celsjusza przez pięć minut. Umieścić próbki na magnesie separacyjnym na pięć minut, a następnie wyrzucić supernatant. Umyj koraliki dwukrotnie 200 mikrolitrami świeżego 80% etanolu.Suszyć koraliki na powietrzu przez 10 minut Koraliki muszą być wystarczająco suche, ale nie nadmiernie wysuszone, dlatego ważne jest, aby przed kontynuowaniem dokładnie sprawdzić koraliki. Wyjmij próbki z magnesu separacyjnego, dodaj 50 mikrolitrów buforu elucyjnego i wymieszaj przez pipetowanie. Inkubować zawiesinę w temperaturze 23 stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie umieścić próbki z powrotem na magnesie rozdzielającym na trzy minuty.Przenieś supernatant zawierający DNA do czystej probówki i wyrzuć kulki. Aby rozpocząć tę procedurę, przygotuj roztwór roboczy, używając stosunku buforu do odczynnika 199 do jednego. Dodaj 10 mikrolitrów każdego wzorca DNA do 190 mikrolitrów roztworu roboczego.Dodaj 10 mikrolitrów oczyszczonego DNA do 190 mikrolitrów roztworu roboczego. Inkubować próbki wzorca i DNA w temperaturze 23 stopni Celsjusza przez dwie minuty. Następnie przeanalizuj wzorce przed próbkami DNA na fluorometrze, postępując zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie.Istotne jest, aby oczyszczone DNA było dobrej jakości i dokładnie określone ilościowo, więc jeśli istnieją jakiekolwiek wątpliwości co do jakości i stężenia DNA, ekstrakcję DNA należy powtórzyć. Biblioteka sekwencjonowania shotgun jest przygotowywana przy użyciu komercyjnego zestawu do przygotowywania biblioteki. Rozcieńczyć próbki DNA do 0,2 nanograma na mikrolitr za pomocą buforu elucyjnego.Wymieszaj pięć mikrolitrów oczyszczonego DNA z 10 mikrolitrami buforu do znakowania i pięcioma mikrolitrami mieszanki enzymów do znakowania. Inkubować próbki w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez pięć minut. Dodać pięć mikrolitrów buforu neutralizującego do każdej próbki i inkubować roztwór w temperaturze 23 stopni Celsjusza przez pięć minut.Następnie dodaj pięć mikrolitrów każdego ze wskaźników sekwencjonowania specyficznych dla próbki i 15 mikrolitrów mastermixu PCR. Umieść próbki w termocyklerze i wykonaj PCR. Oczyść przygotowane DNA przy użyciu metody oczyszczania kulkowego, jak pokazano wcześniej, ale z końcową elucją, w której znajduje się 30 mikrolitrów buforu elucyjnego.Następnie DNA jest sekwencjonowane, a do analizy danych sekwencji wykorzystuje się szereg narzędzi bioinformatycznych zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Klasyfikacja taksonomiczna mikrobiomu bakteryjnego została przeprowadzona za pomocą oprogramowania Kracken, a następnie zwizualizowana za pomocą oprogramowania CHROMA. Większość gatunków bakterii obecnych w metagenomie kiszonki znajduje się w obrębie czterech prokariotycznych fila, firmicutes w 34%, actinobacteria w 28%, proteobacteria w 27% i bactoroitis w 7%. Wskazano również rozkład klas obecnych w tych fila.Adnotacja funkcjonalna przeprowadzona na zmontowanych odczytach zaowocowała 6 357 przewidywanymi białkami oznaczonymi jako przypuszczalny aktywny enzym węglowodanowy i jedna z pięciu klas enzymów, które składają się na bazę danych aktywnych enzymów węglowodanowych. Ten diagram Venna przedstawia rozkład adnotacji białek, w tym zawierających więcej niż jedną adnotację klasy enzymów. Spośród nich przewidywano, że 3 591 będzie miało aktywność hydrolazy glikozydowej.Po opanowaniu przygotowanie bibliotek sekwencjonowania DNA można zakończyć w ciągu jednego dnia, jeśli zostanie wykonane prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby upewnić się, że nie ma zanieczyszczenia krzyżowego między próbkami i zawsze używać odpowiednich kontroli, takich jak ślepa próba. Po tej procedurze można przeprowadzić inne analizy biofomatyczne w celu walidacji klasyfikacji dokonanych przez Krackena.Te techniki metagenomiczne umożliwiają naukowcom badanie mikrobiomu w wielu złożonych systemach. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować biblioteki sekwencjonowania metagenomicznego DNA i przeprowadzić analizy bioinformatyczne uzyskanych odczytów sekwencji DNA. Nie zapominaj, że praca z odczynnikami wiążącymi DNA może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze nosić środki ostrożności, takie jak rękawiczki i fartuchy laboratoryjne.

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

W niniejszym protokole ekspresja genów w drożdżach (Saccharomyces cerevisiae) ulega zmianie po narażeniu na stres oksydacyjny wywołany dodaniem nadtlenku wodoru (H2O2), który jest środkiem utleniającym.

Analiza mikromacierzy dla Saccharomyces cerevisiae

Korzystając z przykładu dróg oddechowych mukowiscydozy, manuskrypt przedstawia kompleksowy przepływ pracy obejmujący kombinację podejść metagenomicznych i metatranskryptomicznych w celu scharakteryzowania społeczności mikrobiologicznych i wirusowych w próbkach związanych ze zwierzętami.

Oczyszczanie nieczystości: sekwencjonowanie metagenomów i metatranskryptomów ze złożonych próbek związanych ze zwierzętami

Konsorcja mikrobiologiczne w ulach trzmieli wzbogacają i zachowują pyłek dla larw pszczół. Wykorzystując sekwencjonowanie nowej generacji, wraz z eksperymentami laboratoryjnymi i terenowymi, manuskrypt ten opisuje protokoły stosowane do testowania hipotezy, że pozostałości fungicydów zmieniają mikrobiom pyłku i demografię kolonii, ostatecznie prowadząc do utraty kolonii.

Techniki empiryczne, metagenomiczne i obliczeniowe rzucają światło na mechanizmy, za pomocą których fungicydy zagrażają zdrowiu pszczół

Technologia nanoporowa do sekwencjonowania biomolekuł ma szerokie zastosowanie w naukach przyrodniczych, w tym do identyfikacji patogenów, monitorowania bezpieczeństwa żywności, analizy genomicznej, metagenomicznego monitorowania środowiska i charakterystyki oporności bakterii na antybiotyki. W artykule przedstawiono procedurę metagenomicznego sekwencjonowania DNA gleby w celu identyfikacji gatunków z wykorzystaniem technologii sekwencjonowania nanoporowego.

Sekwencjonowanie DNA w nanoporach do metagenomicznej analizy gleby

Tutaj opisujemy protokół uzyskiwania danych o sekwencji amplikonów mikrobiomów gleby, ryzosfery i korzeni. Informacje te mogą być wykorzystane do zbadania składu i różnorodności zbiorowisk mikrobiologicznych związanych z roślinami i nadają się do stosowania w odniesieniu do szerokiej gamy gatunków roślin.

Badanie mikrobiomu korzeni: ekstrakcja danych o społeczności bakteryjnej z gleby, ryzosfery i endosfery korzeni

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania próbek DNA z mikrobiomów żywności i środowiska do wspólnego wykrywania i subtypowania Salmonelli poprzez sekwencjonowanie quasimetagenomiczne. Połączone zastosowanie wzbogacania hodowli, separacji immunomagnetycznej (IMS) i amplifikacji z wielokrotnym przemieszczeniem (MDA) pozwala na skuteczną koncentrację genomowego DNA Salmonelli z próbek żywności i środowiska.

Analiza quasi-metagenomiczna salmonelli z próbek żywności i środowiska

Ten protokół opisuje pojedynczą przepustowość dla uzupełniających technik analitycznych i omicznych, której kulminacją jest w pełni sparowana charakterystyka naturalnej materii organicznej i proteomiki mikrobiologicznej w różnych ekosystemach. Podejście to pozwala na solidne porównania w celu identyfikacji szlaków i przemian metabolicznych ważnych dla opisu produkcji gazów cieplarnianych i przewidywania reakcji na zmiany środowiskowe.

Jednoprzepustowe komplementarne techniki analityczne o wysokiej rozdzielczości do charakteryzowania złożonych mieszanin naturalnej materii organicznej

Tutaj prezentujemy protokół opisujący metagenomiczny amplikon do określania społeczności bakteryjnej winogron Traminette, winogron fermentujących i końcowego wina.

Profilowanie społeczności bakteryjnej fermentujących winogron traminette podczas produkcji wina przy użyciu sekwencjonowania amplikonów metagenomicznych

Przedstawiono metodę analizy metabolomicznej jęczmienia. Metoda obejmuje frakcjonowanie i derywatyzację metabolitów oraz ich analizę za pomocą chromatografii gazowej/spektrometrii mas (GC/MS). Analiza metabolomiczna może być wykorzystana do określenia wpływu międzyplonów i stresu suszy na ziarno.

Analiza metabolomiczna jęczmienia metodą chromatografii gazowej/spektrometrii mas

Protokół ten umożliwia szybką i opłacalną ocenę składu mikroorganizmów w produktach mlecznych poprzez połączenie kulturologii z MALDI-TOF MS. Dostarcza wyniki taksonomiczne porównywalne z sekwencjonowaniem 16S rRNA, z krótszym czasem realizacji niż tradycyjne metody hodowla.

Ocena bezpieczeństwa mikroorganizmów w mleczarstwach za pomocą profilowania bakteryjnego proteomicznego za pomocą podejścia MALDI

Poznaj metagenomiczną analizę kiszonki przy użyciu sekwencjonowania shotgun i bioinformatyki. Protokół obejmuje ekstrakcję DNA, przygotowanie biblioteki oraz klasyfikację taksonomiczną bakterii w celu wykrycia oznak psucia paszy.

Analiza metagenomiczna kiszonki

Przeglądaj więcej filmów