Analiza metagenomiczna kiszonki

Ogólnym celem tego eksperymentu jest zrozumienie społeczności bakteryjnej obecnej w próbce kiszonki, chociaż procedury te można zastosować do wielu różnych typów próbek. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania podczas identyfikacji zbiorowisk prokariotycznych występujących w złożonych systemach mikrobiologicznych, takich jak w przedstawionym przypadku kiszonka na paszę dla zwierząt. Główną zaletą tej techniki jest to, że zamiast bardziej konwencjonalnego sekwencjonowania amplikonów 16S stosuje się sekwencjonowanie typu shotgun, co umożliwia znacznie większą dokładność przy klasyfikacji mikrobiomu.

Metodę tę można zastosować do szerokiej gamy innych próbek, w których mogą tworzyć się złożone mikrokosmosy, takich jak ludzkie jelita, na powierzchni skóry, w próbkach wody, a nawet wokół biurowego ekspresu do kawy. Do ekstrakcji DNA z próbki kiszonki służy zestaw handlowy. Rozpocznij tę procedurę od dodania od 100 do 400 miligramów próbki do 978 mikrolitrów buforu fosforanu sodu i 122 mikrolitrów buforu do lizy gleby w dostarczonej probówce do lizy

Uwzględnić kontrolę ujemną, w której nie ma próbki kiszonki. Homogenizować próbki, umieszczając probówki do lizy w homogenizatorze na 40 sekund z prędkością 6,0 metrów na sekundę. Odwirowywać lizaty przez 15 minut.

Przenieść supernatant do czystej probówki mikrowirówkowej zawierającej 250 mikrolitrów roztworu osadu białkowego i wymieszać roztwór, odwracając 10 razy. Następnie wirować przez pięć minut. Przenieść supernatant do czystej 15-mililitrowej probówki wirówkowej, która zawiera jeden mililitr matrycy wiążącej DNA.

Wymieszaj roztwór, ciągle odwracając probówkę przez trzy minuty. Pozostawić mieszaninę do osiadania przez trzy minuty, następnie wyrzucić 500 mikrolitrów supernatantu i wymieszać pozostały supernatant przez pipetowanie. Przenieść 600 mikrolitrów zawiesiny do filtra wirowego i odwirować przy 14 000 razy G przez jedną minutę.

Wyrzucić filtrat i powtórzyć proces z pozostałą zawiesiną. Po odrzuceniu filtratu dodać 500 mikrolitrów buforu do matrycy wiążącej DNA w filtrze wirowym, wymieszać pipetując i odwirować przy 14 000 razy G przez jedną minutę. Wyrzuć filtrat i odwiruj filtr wirowy przez dwie minuty, aby upewnić się, że cały bufor płuczący został usunięty.

Suszyć filtr wirowy w temperaturze 23 stopni Celsjusza przez pięć minut. Dodaj 100 mikrolitrów wstępnie podgrzanej wody wolnej od DNaz do matrycy wiążącej DNA i przenieś filtr wirowy do czystej 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej. Wirować przy 14 000 razy G przez jedną minutę, aby wymyć DNA.

Przechowuj DNA w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, dopóki nie będzie potrzebne do dalszej analizy. DNA wyekstrahowane z próbek kiszonki zostanie oczyszczone za pomocą kulek oczyszczających DNA. Wyjmij koraliki z lodówki i pozostaw je w temperaturze 23 stopni Celsjusza co najmniej 30 minut przed użyciem.

Dodać dwie objętości kulek do każdej próbki DNA i inkubować roztwór w temperaturze 23 stopni Celsjusza przez pięć minut. Umieścić próbki na magnesie separacyjnym na pięć minut, a następnie wyrzucić supernatant. Umyj koraliki dwukrotnie 200 mikrolitrami świeżego 80% etanolu.

Suszyć koraliki na powietrzu przez 10 minut Koraliki muszą być wystarczająco suche, ale nie nadmiernie wysuszone, dlatego ważne jest, aby przed kontynuowaniem dokładnie sprawdzić koraliki. Wyjmij próbki z magnesu separacyjnego, dodaj 50 mikrolitrów buforu elucyjnego i wymieszaj przez pipetowanie. Inkubować zawiesinę w temperaturze 23 stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie umieścić próbki z powrotem na magnesie rozdzielającym na trzy minuty.

Przenieś supernatant zawierający DNA do czystej probówki i wyrzuć kulki. Aby rozpocząć tę procedurę, przygotuj roztwór roboczy, używając stosunku buforu do odczynnika 199 do jednego. Dodaj 10 mikrolitrów każdego wzorca DNA do 190 mikrolitrów roztworu roboczego.

Dodaj 10 mikrolitrów oczyszczonego DNA do 190 mikrolitrów roztworu roboczego. Inkubować próbki wzorca i DNA w temperaturze 23 stopni Celsjusza przez dwie minuty. Następnie przeanalizuj wzorce przed próbkami DNA na fluorometrze, postępując zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie.

Istotne jest, aby oczyszczone DNA było dobrej jakości i dokładnie określone ilościowo, więc jeśli istnieją jakiekolwiek wątpliwości co do jakości i stężenia DNA, ekstrakcję DNA należy powtórzyć. Biblioteka sekwencjonowania shotgun jest przygotowywana przy użyciu komercyjnego zestawu do przygotowywania biblioteki. Rozcieńczyć próbki DNA do 0,2 nanograma na mikrolitr za pomocą buforu elucyjnego.

Wymieszaj pięć mikrolitrów oczyszczonego DNA z 10 mikrolitrami buforu do znakowania i pięcioma mikrolitrami mieszanki enzymów do znakowania. Inkubować próbki w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez pięć minut. Dodać pięć mikrolitrów buforu neutralizującego do każdej próbki i inkubować roztwór w temperaturze 23 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Następnie dodaj pięć mikrolitrów każdego ze wskaźników sekwencjonowania specyficznych dla próbki i 15 mikrolitrów mastermixu PCR. Umieść próbki w termocyklerze i wykonaj PCR. Oczyść przygotowane DNA przy użyciu metody oczyszczania kulkowego, jak pokazano wcześniej, ale z końcową elucją, w której znajduje się 30 mikrolitrów buforu elucyjnego.

Następnie DNA jest sekwencjonowane, a do analizy danych sekwencji wykorzystuje się szereg narzędzi bioinformatycznych zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Klasyfikacja taksonomiczna mikrobiomu bakteryjnego została przeprowadzona za pomocą oprogramowania Kracken, a następnie zwizualizowana za pomocą oprogramowania CHROMA. Większość gatunków bakterii obecnych w metagenomie kiszonki znajduje się w obrębie czterech prokariotycznych fila, firmicutes w 34%, actinobacteria w 28%, proteobacteria w 27% i bactoroitis w 7%. Wskazano również rozkład klas obecnych w tych fila.

Adnotacja funkcjonalna przeprowadzona na zmontowanych odczytach zaowocowała 6 357 przewidywanymi białkami oznaczonymi jako przypuszczalny aktywny enzym węglowodanowy i jedna z pięciu klas enzymów, które składają się na bazę danych aktywnych enzymów węglowodanowych. Ten diagram Venna przedstawia rozkład adnotacji białek, w tym zawierających więcej niż jedną adnotację klasy enzymów. Spośród nich przewidywano, że 3 591 będzie miało aktywność hydrolazy glikozydowej.

Po opanowaniu przygotowanie bibliotek sekwencjonowania DNA można zakończyć w ciągu jednego dnia, jeśli zostanie wykonane prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby upewnić się, że nie ma zanieczyszczenia krzyżowego między próbkami i zawsze używać odpowiednich kontroli, takich jak ślepa próba. Po tej procedurze można przeprowadzić inne analizy biofomatyczne w celu walidacji klasyfikacji dokonanych przez Krackena.

Te techniki metagenomiczne umożliwiają naukowcom badanie mikrobiomu w wielu złożonych systemach. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować biblioteki sekwencjonowania metagenomicznego DNA i przeprowadzić analizy bioinformatyczne uzyskanych odczytów sekwencji DNA. Nie zapominaj, że praca z odczynnikami wiążącymi DNA może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze nosić środki ostrożności, takie jak rękawiczki i fartuchy laboratoryjne.