Inżynieria sztucznych czynników w celu specyficznego manipulowania alternatywnym splicingiem w komórkach ludzkich

Ogólnym celem tego protokołu jest zaprojektowanie sztucznych czynników splicingu, które mogą specyficznie manipulować alternatywnym splicing danego celu. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie przetwarzania RNA, takie jak regulacja i nieprawidłowa regulacja naprzemiennego splicingu w komórkach nowotworowych. Główną zaletą tej techniki jest jej elastyczność.

Możemy zaprojektować sztuczne czynniki, które albo promują, albo hamują różne rodzaje alternatywnego splicingu w dowolnych genach. Tę procedurę zademonstrują Huan-Huan, pracownik naukowy mojego laboratorium, oraz Qianyun, doktor habilitowany w moim laboratorium. DNA PUF typu dzikiego jest używane jako szablon do generowania dostosowanego rusztowania domeny PUF.

Użyj starterów PCR zawierających sekwencje PUF, które specyficznie rozpoznają różne nukleotydy RNA w każdej pozycji. Dla każdego powtórzenia PUF użyj czterech różnych podkładów, aby rozpoznać inną bazę w każdej pozycji. W pierwszej rundzie PCR użyj pokazanych par starterów, aby wygenerować sekwencje kodujące dla czterech powtórzeń PUF, uniwersalnych fragmentów mostka i fragmentów czapeczki.

W drugiej rundzie użyj produktów PCR wygenerowanych w ostatnim kroku jako matryc z pokazanymi kombinacjami starterów, aby wygenerować sekwencje kodujące dla kodów rozpoznawania RNA R-jeden do R-cztery i R-pięć do R-osiem. W trzeciej rundzie użyj produktów z rundy drugiej i połącz cztery do pięciu jako szablony ze starterem R-one do przodu i starterem odwróconym R-eight, aby wygenerować sekwencje kodowania dla R-jeden do R-eight bez nasadek. W czwartej rundzie PCR użyj R-jeden do R-osiem, pięciokrotnej zaślepki pierwszej i potrójnej pierwszej zaślepki jako szablonów, aby wygenerować sekwencje kodujące dla kompletnych domen PUF.

Aby rozpocząć transfekcję komórek HEK-293T, wymieszaj odczynnik do transfekcji liposomalnej, delikatnie odwracając butelki. Następnie rozcieńczyć dwa mikrolitry odczynnika do transfekcji liposomalnej w 50 mikrolitrach zredukowanej pożywki surowicy na transfekcję. Delikatnie wymieszaj, a następnie inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Następnie rozcieńczyć 04 mikrogramy wektora ekspresji domeny bogatej w glicynę i 0,2 mikrograma modułowego plazmidu reporterowego splicingu w 50 mikrolitrach zredukowanej pożywki surowicy w sterylnej probówce. Następnie rozcieńczyć 0,4 mikrograma wektora ekspresji domeny efektorowej RS i 0,2 mikrograma plazmidu reporterowego PGZ-three w 50 mikrolitrach zredukowanej pożywki surowicy. Na koniec rozcieńczyć 0,4 mikrograma wektora ekspresyjnego PGL-RS-PUF i 0,2 mikrograma plazmidów reporterowych PEZ-1B lub PEZ-2F w 50 mikrolitrach zredukowanej pożywki surowicy w sterylnej probówce.

Po pięciu minutach inkubacji w temperaturze pokojowej delikatnie wymieszać rozcieńczony odczynnik do transfekcji liposomalnej z rozcieńczonymi mieszaninami plazmidów. Inkubować końcowe mieszanki przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodać mieszaniny transfekcji zawierające wektory ekspresji do każdej studzienki 24-dołkowej płytki wysianej komórkami HEK-293 i inkubować przez co najmniej 12 godzin w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Po 12 godzinach inkubacji zbierz transfekowane komórki przez trypsynizację i odwirowanie. Po odwirowaniu wyrzuć pożywkę i dodaj 0,5 mililitra buforu do ekstrakcji RNA na probówkę. Dodaj 0,1 mililitra chloroformu na 0,5 mililitra buforu do ekstrakcji RNA do każdej próbki.

Po inkubacji odwirować probówki przez 15 minut w temperaturze 12 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza. Następnie przenieś wodną bazę do świeżej probówki. Dodać 0,25 mililitra izopropanolu na 0,5 mililitra buforu do ekstrakcji RNA użytego w początkowej homogenizacji.

Wymieszaj przez wirowanie i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Po odwirowaniu, jak poprzednio, osad RNA jest zwykle widoczny na dnie probówki. Odrzucić supernatant i przemyć osad RNA 0,5 mililitra 75% etanolu na 0,5 mililitra buforu do ekstrakcji RNA.

Energicznie wirować, a następnie odwirowywać w temperaturze 7 500 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po wirowaniu usuń supernatant i wysusz granulki RNA na powietrzu. Rozpuść RNA w 50 mikrolitrach wody wolnej od RNaz.

Następnie dodaj dwa mikrolitry po pięć jednostek na mikrolitr DNazy-jeden, siedem mikrolitrów buforu 10X i 11 mikrolitrów wody do każdego 50-mikrolitrowego roztworu RNA. Po inkubacji podgrzej roztwory do 70 stopni Celsjusza przez 15 minut, aby dezaktywować DNazę. Po przeprowadzeniu reakcji odwrotnej transkryptazy w celu zsyntetyzowania cDNA z każdej próbki, dodaj składniki reakcji PCR oznaczonej jako ciało w kolejności pokazanej na ekranie do probówek PCR.

Przygotować jedną reakcję na próbkę. Uruchom program RT-PCR na termocyklerze. Na koniec rozpuść produkty PCR przez elektroforezę za pomocą 10% żelu poliakrylamidowego z buforem TBE.

Użyj skanera fluorescencyjnego, aby zwizualizować produkty i zmierz ilość każdej splecionej izoformy za pomocą oprogramowania do densytometrii. Do testu immunofluorescencyjnego w celu pomiaru apoptozy należy przygotować mieszankę transfekcyjną zawierającą plazmidy o ekspresji domeny bogatej w glicynę, jak pokazano wcześniej, oraz transfekcyjne komórki HeLa hodowane na szkiełkach pokrytych polilizyną w sześciodołkowej płytce. 24 godziny po transfekcji utrwalić komórki na szkiełkach nakrywkowych jednym mililitrem 4% paraformaldehydu w 1x PBS przez 20 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie delikatnie umyj komórki na szkiełkach nakrywkowych dwoma mililitrami 1x PBS przez pięć minut. Następnie przepuszczaj komórki za pomocą 0,2% Triton X-100 w 1x PBS przez 10 minut. Po trzykrotnym umyciu 1x PBS jak poprzednio, zablokuj niespecyficzne wiązanie 3% albuminą surowicy bydlęcej w 1x PBS przez 10 minut.

Rozcieńczyć przeciwciało flagowe jeden do 1 000 w 3% BSA w PBS i pipetować 30 mikrolitrów rozcieńczonego przeciwciała flagowego na arkuszu parafilmu. Użyj kleszczyków, aby usunąć szkiełko nakrywkowe. Ostrożnie osusz nadmiar buforu chusteczkami laboratoryjnymi, a następnie umieść szkiełko nakrywkowe komórką do dołu na roztworze przeciwflagowym.

Inkubować przez godzinę w temperaturze pokojowej. Po inkubacji dodać około 500 mikrolitrów 1x PBS po stronie komórkowej szkiełka nakrywkowego, aż unosi się na wierzchu roztworu. Włóż go z powrotem do płytki sześciodołkowej z 1x PBS w dołkach.

Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym na parafilmie, jak poprzednio, przez 15 minut. Umyć jak poprzednio, a następnie zamontować szkiełka nakrywkowe na szkiełkach mikroskopowych za pomocą medium montażowego zawierającego DAPI. Wizualizuj komórki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i fotografuj je za pomocą aparatu cyfrowego.

Korzystając z mikroskopii immunofluorescencyjnej, wiele komórek eksprymujących Gly-PUF-531 miało pofragmentowane DNA jądrowe, co wskazuje, że ulegały apoptozie. Jako kontrola, komórki eksprymujące Gly-PUF typu dzikiego miały mniej fragmentaryczne DNA jądrowe w porównaniu z komórkami transfekowanymi Gly-PUF-531. W tym przypadku mikroskopia immunofluorescencyjna z użyciem przeciwciała antyflagowego połączonego z komórkami barwionymi DAPI pokazuje, że Gly-PUF-531 zlokalizowany jest głównie w jądrach transfekowanych komórek.

Gly-PUF typu dzikiego zlokalizowany jest również w jądrach transfekowanych komórek, co sugeruje, że te ESF dysocjują od swoich celów, gdy w pełni złożone mRNA są transportowane do cytoplazmy. Odsetek komórek apoptotycznych z rozdrobnionym jądrowym DNA mierzono z losowo wybranych pól obrazów mikroskopii fluorescencyjnej. Po opanowaniu, budowa rusztowań PUF ze specyficznością wiązania RNA może być wykonana w ciągu dwóch dni, jeśli jest wykonana prawidłowo.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak konkretnie manipulować alternatywnym splicing w ludzkich komórkach poprzez inżynierię sztucznych czynników.