Name: Inżynieria sztucznych czynników w celu specyficznego manipulowania alternatywnym splicingiem w komórkach ludzkich (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: Poznaj metodę inżynierii sztucznych czynników splicingowych do specyficznej manipulacji alternatywnym splicingiem w komórkach ludzkich. Technika ta pozwala badać regulację RNA w chorobach nowotworowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant NIH R01-CA158283 i grant NSFC 31400726 dla Z.W. Y.W. jest finansowany przez Young Thousand Talents Program i National Natural Science Foundation of China (granty 31471235 i 81422038). X.Y. jest finansowany przez podoktorancką fundację naukową Chin (2015M571612).

<ol><li>Wang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+isoform+regulation+in+human+tissue+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes.</a> Nature. 456 (7221), 470-476 (2008).</li>
<li>Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+surveying+of+alternative+splicing+complexity+in+the+human+transcriptome+by+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing.</a> Nat Genet. 40 (12), 1413-1415 (2008).</li>
<li>Wang, Z., Burge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splicing+regulation%3A+from+a+parts+list+of+regulatory+elements+to+an+integrated+splicing+code%5BTitle%5D)+AND+%22Rna%22%5BJournal%5D)">Splicing regulation: from a parts list of regulatory elements to an integrated splicing code.</a> Rna. 14 (5), 802-813 (2008).</li>
<li>Matera, A. G., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+day+in+the+life+of+the+spliceosome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A day in the life of the spliceosome.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (2), 108-121 (2014).</li>
<li>Singh, R. K., Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-mRNA+splicing+in+disease+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Pre-mRNA splicing in disease and therapeutics.</a> Trends Mol Med. 18 (8), 472-482 (2012).</li>
<li>Wang, G. -S., Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splicing+in+disease%3A+disruption+of+the+splicing+code+and+the+decoding+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Splicing in disease: disruption of the splicing code and the decoding machinery.</a> Nat Rev Genet. 8 (10), 749-761 (2007).</li>
<li>Li, Y. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+splicing+is+a+primary+link+between+genetic+variation+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA splicing is a primary link between genetic variation and disease.</a> Science. 352 (6285), 600-604 (2016).</li>
<li>Scotti, M. M., Swanson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+mis-splicing+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA mis-splicing in disease.</a> Nat Rev Genet. 17 (1), 19-32 (2016).</li>
<li>Black, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+alternative+pre-messenger+RNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing.</a> Annu Rev Biochem. 72 (1), 291-336 (2003).</li>
<li>Graveley, B. R., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arginine%2Fserine-rich+domains+of+SR+proteins+can+function+as+activators+of+pre-mRNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+cell%22%5BJournal%5D)">Arginine/serine-rich domains of SR proteins can function as activators of pre-mRNA splicing.</a> Mol cell. 1 (5), 765-771 (1998).</li>
<li>Del Gatto-Konczak, F., Olive, M., Gesnel, M. -C., Breathnach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hnRNP+A1+recruited+to+an+exon+in+vivo+can+function+as+an+exon+splicing+silencer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">hnRNP A1 recruited to an exon in vivo can function as an exon splicing silencer.</a> Mol Cell Biol. 19 (1), 251-260 (1999).</li>
<li>Auweter, S. D., Oberstrass, F. C., Allain, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-specific+binding+of+single-stranded+RNA%3A+is+there+a+code+for+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Sequence-specific binding of single-stranded RNA: is there a code for recognition.</a> Nucleic Acids Res. 34 (17), 4943-4959 (2006).</li>
<li>Dong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+and+modular+binding+code+for+cytosine+recognition+in+Pumilio%2FFBF+%28PUF%29+RNA-binding+domains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Specific and modular binding code for cytosine recognition in Pumilio/FBF (PUF) RNA-binding domains.</a> J Biol Chem. 286 (30), 26732-26742 (2011).</li>
<li>Filipovska, A., Razif, M. F., Nygård, K. K., Rackham, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+universal+code+for+RNA+recognition+by+PUF+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">A universal code for RNA recognition by PUF proteins.</a> Nat Chem Biol. 7 (7), 425-427 (2011).</li>
<li>Wei, H., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+RNA-binding+proteins+with+diverse+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+RNA%22%5BJournal%5D)">Engineering RNA-binding proteins with diverse activities.</a> Wiley Interdiscip Rev RNA. 6 (6), 597-613 (2015).</li>
<li>Wang, Y., Cheong, C. -G., Hall, T. M. T., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+splicing+factors+with+designed+specificities%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Engineering splicing factors with designed specificities.</a> Nat Methods. 6 (11), 825-830 (2009).</li>
<li>Choudhury, R., Tsai, Y. S., Dominguez, D., Wang, Y., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+RNA+endonucleases+with+customized+sequence+specificities%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Engineering RNA endonucleases with customized sequence specificities.</a> Nat Commun. 3, 1147(2012).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complex+network+of+factors+with+overlapping+affinities+represses+splicing+through+intronic+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A complex network of factors with overlapping affinities represses splicing through intronic elements.</a> Nat Struct Mol Biol. 20 (1), 36-45 (2013).</li>
<li>McCabe, B. C., Gollnick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+levels+of+trp+RNA-binding+attenuation+protein+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Cellular levels of trp RNA-binding attenuation protein in Bacillus subtilis.</a> J Bacteriol. 186 (15), 5157-5159 (2004).</li>
<li>Wang, Y., Ma, M., Xiao, X., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intronic+splicing+enhancers%2C+cognate+splicing+factors+and+context-dependent+regulation+rules%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Intronic splicing enhancers, cognate splicing factors and context-dependent regulation rules.</a> Nat Struct Mol Biol. 19 (10), 1044-1052 (2012).</li>
<li>Choudhury, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+splicing+activator+DAZAP1+integrates+splicing+control+into+MEK%2FErk-regulated+cell+proliferation+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The splicing activator DAZAP1 integrates splicing control into MEK/Erk-regulated cell proliferation and migration.</a> Nat Commun. 5, (2014).</li>
<li>Xiao, X., Wang, Z., Jang, M., Burge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coevolutionary+networks+of+splicing+cis-regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Coevolutionary networks of splicing cis-regulatory elements.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (47), 18583-18588 (2007).</li>
<li>Wang, Z., Xiao, X., Van Nostrand, E., Burge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+and+specific+functions+of+exonic+splicing+silencers+in+splicing+control%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">General and specific functions of exonic splicing silencers in splicing control.</a> Mol Cell. 23 (1), 61-70 (2006).</li>
<li>Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+lentiviral+vectors+for+transducing+cells+from+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system.</a> J Vis Exp. (63), e4031(2012).</li>
<li>Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+purification+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Production and purification of lentiviral vectors.</a> Nat Protoc. 1 (1), 241-245 (2006).</li>
<li>Venables, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+and+alternative+splicing+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Aberrant and alternative splicing in cancer.</a> Cancer Res. 64 (21), 7647-7654 (2004).</li>
<li>Cooke, A., Prigge, A., Opperman, L., Wickens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+translational+regulation+using+the+PUF+protein+family+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Targeted translational regulation using the PUF protein family scaffold.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (38), 15870-15875 (2011).</li>
<li>He, C., Zhou, F., Zuo, Z., Cheng, H., Zhou, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+view+of+cancer-specific+transcript+variants+by+subtractive+transcriptome-wide+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">A global view of cancer-specific transcript variants by subtractive transcriptome-wide analysis.</a> PloS one. 4 (3), 4732(2009).</li>
<li>Venables, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+alternative+splicing+markers+for+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of alternative splicing markers for breast cancer.</a> Cancer Res. 68 (22), 9525-9531 (2008).</li>
<li>Shapiro, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+EMT-Driven+Alternative+Splicing+Program+Occurs+in+Human+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">An EMT-Driven Alternative Splicing Program Occurs in Human Breast Cancer.</a> PLoS Genet. 7 (8), 1002218(2011).</li>
<li>David, C. J., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+pre-mRNA+splicing+regulation+in+cancer%3A+pathways+and+programs+unhinged%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Alternative pre-mRNA splicing regulation in cancer: pathways and programs unhinged.</a> Genes Dev. 24 (21), 2343-2364 (2010).</li>
<li>Ladomery, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+alternative+splicing+is+another+hallmark+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cell+biol%22%5BJournal%5D)">Aberrant alternative splicing is another hallmark of cancer.</a> Int J Cell biol. 2013, (2013).</li>
<li>Karni, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gene+encoding+the+splicing+factor+SF2%2FASF+is+a+proto-oncogene%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The gene encoding the splicing factor SF2/ASF is a proto-oncogene.</a> Nat Struct Mol Biol. 14 (3), 185-193 (2007).</li>
<li>Anczukòw, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SRSF1-regulated+alternative+splicing+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+cell%22%5BJournal%5D)">SRSF1-regulated alternative splicing in breast cancer.</a> Mol cell. 60 (1), 105-117 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Niniejszy raport zawiera szczegółowy opis projektowania i budowy sztucznych czynników splicingowych, które mogą specyficznie manipulować alternatywnym splicing docelowego genu. Metoda ta wykorzystuje unikalny tryb wiązania RNA powtórzeń PUF w celu wytworzenia rusztowania wiążącego RNA o niestandardowej specyficzności. Może być używany do aktywacji lub ponownego słączenia.
Krytycznym krokiem w tym protokole jest wygenerowanie przeprogramowanej domeny PUF, która definiuje specyfikę ESF. Protokół...

Większość ludzkich genów jest poddawana alternatywnemu splicingowi (AS) w celu wytworzenia wielu izoform o różnych aktywnościach, co znacznie zwiększyło złożoność kodowania genomu1,2. AS stanowi główny mechanizm regulujący funkcję genów i jest ściśle regulowany przez różne szlaki na różnych etapach komórkowych i rozwojowych3,4. Ponieważ nieprawidłowa regulacja splicingu jest częstą przyczyną chorób u ludzi5,6,7,8, ukierunkowana regulacja splicingu staje się atrakcyjną drogą terapeutyczną.
Zgodnie z uproszczonym modelem regulacji splicingu, AS jest głównie kontrolowany przez Splicing Regulatory cis-Elements (SREs) w pre-mRNA, które funkcjonują jako wzmacniacze splicingu lub tłumiki alternatywnych eksonów. Te SRE w szczególności rekrutują różne transaktywne czynniki białkowe (tj. czynniki splicingowe), które promują lub hamują reakcję splicingu3,9. Większość transakcyjnych czynników splicingu ma oddzielne specyficzne dla sekwencji domeny wiążące RNA, które rozpoznają swoje cele, oraz domeny efektorowe do kontrolowania splicingu. Najbardziej znanymi przykładami są członkowie rodziny białek bogatych w serynę/argininę (SR), które zawierają N-końcowe motywy rozpoznawania RNA (RRM), które wiążą egzoniczne wzmacniacze splicingu, oraz C-końcowe domeny RS, które promują inkluzję eksonów10. I odwrotnie, hnRNP A1 wiąże się z egzonicznymi tłumikami splicingowymi poprzez domeny RRM i hamuje inkluzję eksonów poprzez C-końcową domenę bogatą w glicynę11. Korzystając z takich modułowych konfiguracji, naukowcy powinni być w stanie zaprojektować sztuczne czynniki splicingu, łącząc określoną domenę wiążącą RNA (RBD) z różnymi domenami efektorowymi, które aktywują lub hamują splicing.
Kluczem takiego projektu jest użycie RBD, który rozpoznaje dane cele z programowalną specyficznością wiązania RNA, która jest analogiczna do trybu wiązania DNA w domenie TALE. Jednak większość natywnych czynników splicingu zawiera domeny RRM lub K Homology (KH), które rozpoznają krótkie elementy RNA o słabym powinowactwie, a zatem nie mają predykcyjnego rozpoznawania RNA-białka "kod"12. RBD białek powtórzeń PUF (tj. domena PUF) ma unikalny tryb rozpoznawania RNA, co pozwala na przeprojektowanie domen PUF w celu specyficznego rozpoznawania różnych celów RNA13,14. Kanoniczna domena PUF zawiera osiem powtórzeń trzech α-helis, z których każda rozpoznaje pojedynczą zasadę w celu 8-nt RNA. Łańcuchy boczne aminokwasów w określonych pozycjach drugiej α-helisy tworzą specyficzne wiązania wodorowe z krawędzią zasady Watsona-Cricka, która określa specyficzność wiązania RNA każdego powtórzenia (ryc. 1A). Kod do rozpoznawania zasad RNA powtórzeń PUF jest zaskakująco prosty (Rysunek 1A), co pozwala na generowanie domen PUF, które rozpoznają każdą możliwą kombinację 8-zasad (sprawdzone przez Wei i Wang15).
Ta modułowa zasada projektowania pozwala na generowanie Engineered Splicing Factor (ESF), który składa się z dostosowanej domeny PUF i domeny modulacji splicingu (tj. domeny SR lub domeny bogatej w Gly). Te ESF mogą funkcjonować zarówno jako aktywatory splicingu, jak i jako inhibitory do kontrolowania różnych typów zdarzeń splicingu i okazały się przydatne jako narzędzia do manipulowania splicing endogennych genów związanych z chorobami ludzkimi16,17. Jako przykład skonstruowaliśmy ESF typu PUF-Gly, aby specyficznie zmienić splicing genu Bcl-x, przekształcając antyapoptotyczną długą izoformę (Bcl-xL) w proapoptotyczną krótką izoformę (Bcl-xS). Przesunięcie proporcji izoformy Bcl-x było wystarczające do uwrażliwienia kilku komórek nowotworowych na wiele przeciwnowotworowych leków stosowanych w chemioterapii16, co sugeruje, że te sztuczne czynniki mogą być przydatne jako potencjalne odczynniki terapeutyczne.
Oprócz kontrolowania splicingu za pomocą znanych domen efektorowych splicingu (np. domeny bogatej w RS lub Gly), zmodyfikowane czynniki PUF mogą być również wykorzystywane do badania aktywności nowych czynników splicingowych. Na przykład, stosując to podejście, wykazaliśmy, że domena C-końcowa kilku białek SR może aktywować lub hamować splicing podczas wiązania z różnymi regionami pre-mRNA18, że bogaty w alaninę motyw RBM4 może hamować splicing19, oraz że bogaty w prolinę motyw DAZAP1 może wzmacniać splicing20,21. Te nowe domeny funkcjonalne mogą być używane do konstruowania dodatkowych typów sztucznych czynników w celu precyzyjnego dostrojenia splicingu.

<table><tbody><tr><td>Polimeraza DNA o wysokiej wierności (Phusion High-Fidelity) z buforem PCR</td><td>Ligaza DNA New England Biolabs</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>(ligaza DNA T4)</td>Odczynnik do transfekcji liposomalnej New <td>England Biolabs</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>(Lipofectamine 2000)</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Zredukowana pożywka surowicy (Opti-MEM)</td><td>Gibco</td><td>31985-062</td><td></td></tr><tr><td>RNA bufor ekstrakcyjny (odczynnik TRIzol)</td> <td>ambion</td><td>15596018</td><td>odczynnik TRIzol zawiera fenol, który może powodować oparzenia. Nosić rękawice podczas obchodzenia się</td></tr><tr><td>z PBS (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III Odwrotna transkryptaza (RT)</td><td>Invitrogen</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało kaspazy-3</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>9668</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało PARP</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>9542</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało Bcl-x</td><td>BD Bioscience</td><td>610211</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało beta-aktyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5441</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało alfa-tubuliny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5168</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało FLAG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4042</td><td></td></tr><tr><td>Membrana nitrocelulozowa</td><td>Amersham-Pharmacia</td><td>RPN203D</td><td></td></tr><tr><td>ECL Odczynniki do wykrywania Western Blotting</td><td>Invitrogen</td><td>WP20005</td><td></td></tr><tr><td>Cy5-dCTP</td><td>GE Healthcare</td><td>PA55021</td><td></td></tr><tr><td>Aktywowany fluorescencyjnie sortownik komórek (FACS)</td><td>BD Bioscience</td><td>FACSCalibur&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Medium (DMEM)</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Jodek propidyny (PI)</td><td>Sigma</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7638-5G</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Promega</td><td>H5142</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lizyna&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P-4832</td><td>Filtruj-sterylizuj i przechowuj w temperaturze 4 stopni; C</td></tr><tr><td>Vector pWPXLd</td><td>Addgene</td><td>12258</td><td></td></tr><tr><td>Vector pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>Vector psPAX2</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>DNaza I (bez RNaz)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>Oligo(dT)18 Primer</td><td>Thermo Scientific</td><td>SO131&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało wtórne przeciwko mysom (przeciwciało anty-mysie IgG, przeciwciało sprzężone z HRP)</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>7076S</td><td></td></tr></tbody></table>

inżynieria sztucznych czynników w celu specyficznego manipulowania alternatywnym splicingiem w komórkach ludzkich

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

Przetwarzanie większości eukariotycznych RNA odbywa się za pośrednictwem białek wiążących RNA (RBP) o modułowych konfiguracjach, w tym modułu rozpoznawania RNA, który specyficznie wiąże cel pre-mRNA i domenę efektorową. Wcześniej wykorzystaliśmy unikalny tryb wiązania RNA domeny PUF w ludzkim Pumilio 1 do wygenerowania programowalnego rusztowania wiążącego RNA, które zostało wykorzystane do inżynierii różnych sztucznych RBP w celu manipulowania metabolizmem RNA. W tym miejscu opisano szczegółowy protokół konstruowania Engineered Splicing Factors (ESF), które są specjalnie zaprojektowane do modulowania alternatywnego splicingu docelowych genów. Protokół obejmuje sposób projektowania i konstruowania niestandardowego rusztowania PUF dla określonego celu RNA, jak konstruować plazmid ekspresyjny ESF poprzez fuzję zaprojektowanej domeny PUF i domeny efektorowej oraz jak używać ESF do manipulowania splicing docelowych genów. W reprezentatywnych wynikach tej metody opisaliśmy również powszechne testy aktywności ESF z wykorzystaniem reporterów splicingowych, zastosowanie ESF w hodowanych komórkach ludzkich oraz późniejszy efekt zmian splicingu. Postępując zgodnie ze szczegółowymi protokołami zawartymi w tym raporcie, możliwe jest zaprojektowanie i wygenerowanie EFS do regulacji różnych typów alternatywnego splicingu (AS), zapewniając nową strategię badania regulacji splicingu i funkcji różnych izoform splicingu. Co więcej, łącząc różne domeny funkcjonalne z zaprojektowaną domeną PUF, naukowcy mogą zaprojektować sztuczne czynniki, które celują w określone RNA, aby manipulować różnymi etapami przetwarzania RNA.

Niniejszy raport opisuje kompletny protokół projektowania i konstrukcji ESF oraz reporterów splicingu. Przedstawia on również dalsze zastosowanie ESF w manipulowaniu AS endogennych genów16. Aby zilustrować typowe wyniki zmian splicingu indukowanych przez ESF, posłużymy się przykładem danych z naszych poprzednich prac. ESF z różnymi domenami funkcjonalnymi mogą być wykorzystywane do promowania lub hamowania inkluzji docelowego eksonu kasety (Ryc...

Ten raport opisuje metodę bioinżynierii do projektowania i konstruowania nowych sztucznych czynników splicingu (ASF), które specyficznie modulują splicing docelowych genów w komórkach ssaków. Metoda ta może być dalej rozszerzana w celu inżynierii różnych sztucznych czynników w celu manipulowania innymi aspektami metabolizmu RNA.

Inżynieria sztucznych czynników w celu specyficznego manipulowania alternatywnym splicingiem w komórkach ludzkich

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Ogólnym celem tego protokołu jest zaprojektowanie sztucznych czynników splicingu, które mogą specyficznie manipulować alternatywnym splicing danego celu. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie przetwarzania RNA, takie jak regulacja i nieprawidłowa regulacja naprzemiennego splicingu w komórkach nowotworowych. Główną zaletą tej techniki jest jej elastyczność.Możemy zaprojektować sztuczne czynniki, które albo promują, albo hamują różne rodzaje alternatywnego splicingu w dowolnych genach. Tę procedurę zademonstrują Huan-Huan, pracownik naukowy mojego laboratorium, oraz Qianyun, doktor habilitowany w moim laboratorium. DNA PUF typu dzikiego jest używane jako szablon do generowania dostosowanego rusztowania domeny PUF.Użyj starterów PCR zawierających sekwencje PUF, które specyficznie rozpoznają różne nukleotydy RNA w każdej pozycji. Dla każdego powtórzenia PUF użyj czterech różnych podkładów, aby rozpoznać inną bazę w każdej pozycji. W pierwszej rundzie PCR użyj pokazanych par starterów, aby wygenerować sekwencje kodujące dla czterech powtórzeń PUF, uniwersalnych fragmentów mostka i fragmentów czapeczki.W drugiej rundzie użyj produktów PCR wygenerowanych w ost

engineering-artificial-factors-to-specifically-manipulate-alternative

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Wykazano, że Wykazano, że alternatywna regulacja splicingu przyczynia się do przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego (EMT), niezbędnego programu komórkowego w różnych procesach fizjologicznych i patologicznych. W tym miejscu opisujemy metodę wykorzystującą indukowalny model EMT do wykrywania alternatywnego splicingu podczas EMT.

Wykrywanie alternatywnego splicingu podczas przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego

Tutaj opisujemy protokół mający na celu zbadanie wpływu nieprawidłowego splicingu na lekooporność w guzach litych i nowotworach hematologicznych. W tym celu przeanalizowaliśmy profile transkryptomiczne rodzicielskich i opornych modeli in vitro za pomocą sekwencjonowania RNA i ustaliliśmy metodę opartą na qRT-PCR w celu walidacji genów kandydujących.

Wykorzystanie sekwencjonowania RNA do wykrywania nowych wariantów splicingu związanych z opornością na leki w modelach nowotworów in vitro

Opisano protokół hybrydyzacji in situ (ISH), który wykorzystuje krótkie oligonukleotydy antysensowne do wykrywania alternatywnych wzorców splicingu pre-mRNA w sekcjach mózgu myszy.

Analiza ilościowa alternatywnego splicingu pre-mRNA w skrawkach mózgu myszy przy użyciu testu hybrydyzacji RNA in situ

Klonujemy i analizujemy geny reporterowe generujące koliste RNA. Te geny reporterowe są większe niż konstrukty do analizy splicingu liniowego i zawierają elementy Alu. Aby zbadać koliste RNA, konstrukty są transfekowane do komórek, a otrzymany RNA jest analizowany za pomocą RT-PCR po usunięciu liniowego RNA.

Wykorzystanie pierwiastka aluminiowego zawierającego minigeny do analizy kolistych RNA

Ten protokół opisuje konwersję fibroblastów skóry w mioblasty i ich różnicowanie w miotuby. Linie komórkowe pochodzą od pacjentów z zaburzeniami nerwowo-mięśniowymi i mogą być wykorzystywane do badania mechanizmów patologicznych i testowania strategii terapeutycznych.

Bezpośrednie przeprogramowanie ludzkich fibroblastów w mioblasty w celu zbadania terapii zaburzeń nerwowo-mięśniowych

Ten protokół przedstawia szybkie i użyteczne narzędzie do oceny roli białka o niescharakteryzowanej funkcji w alternatywnej regulacji splicingu po leczeniu chemioterapeutycznym.

Wykorzystanie narzędzia E1A Minigene do badania zmian splicingu mRNA

Alternatywny splicing (AS) i alternatywna poliadenylacja (APA) rozszerzają różnorodność izoform transkryptu i ich produktów. W tym miejscu opisujemy protokoły bioinformatyczne do analizy masowych testów sekwencjonowania RNA i sekwencjonowania końca 3' w celu wykrycia i wizualizacji AS i APA różniących się w różnych warunkach eksperymentalnych.

Identyfikacja alternatywnego splicingu i poliadenylacji w danych sekwencyjnych RNA

Ten protokół opisuje test reporterowy minigenu do monitorowania wpływu mutacji miejsca 5'-splicingu na splicing i rozwija supresorowe U1 snRNA w celu ratowania indukowanego mutacjami hamowania splicingu. Konstrukty reporterowe i supresorowe U1 snRNA ulegają ekspresji w komórkach HeLa, a splicing jest analizowany przez wydłużenie startera lub RT-PCR.

Test komórkowy oparty na reporterze do monitorowania wydajności splicingu

Nowatorskie strategie wiernego modelowania mutacji somatycznych w krwiotwórczych komórkach macierzystych i progenitorowych (HSPC) są niezbędne do lepszego badania biologii hematopoetycznych komórek macierzystych i nowotworów hematologicznych. W tym miejscu opisano protokół modelowania heterozygotycznych mutacji typu gain-of-function w HSPC poprzez połączenie użycia CRISPR/Cas9 i podwójnej transdukcji dawcy rAAV.

Inżynieria onkogennych heterozygotycznych mutacji wzmocnienia funkcji w ludzkich hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych

Ten protokół opisuje metodę efektywnej transfekcji siRNA w świeżo wyizolowanych ludzkich cytotrofoblastach kosmkowych za pomocą mikroporacji i identyfikacji kompleksów DNA-białko w tych komórkach. Transfekowane komórki mogą być monitorowane za pomocą analiz Western blot i EMSA podczas 4-dniowego czasu hodowli.

Transfekcja siRNA i analizy EMSA na świeżo wyizolowanych ludzkich cytotrofoblastach kosmkowych

Poznaj metodę inżynierii sztucznych czynników splicingowych do specyficznej manipulacji alternatywnym splicingiem w komórkach ludzkich. Technika ta pozwala badać regulację RNA w chorobach nowotworowych.

Inżynieria sztucznych czynników w celu specyficznego manipulowania alternatywnym splicingiem w komórkach ludzkich

Przeglądaj więcej filmów