Wykorzystanie liposomów rusztowania do odtworzenia interakcji lipidowo-proksymalnych białko-białko in vitro

Ogólnym celem tej techniki jest uchwycenie interakcji lipidowo-proksymalnych białko-białko in vitro. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na pytania w dziedzinie dynamiki mitochondriów, takie jak to, w jaki sposób dodatkowe lipidy mogą wpływać na interakcje białko-białko w zewnętrznej błonie mitochondriów. Główną zaletą tej techniki jest to, że wiązanie rozpuszczalnych domen białkowych z matrycami lipidowymi zapewnia osiągnięcie bardziej natywnego potwierdzenia.

Co więcej, złożone interakcje między rozpuszczalnymi białkami a ich partnerami na uwięzi można ocenić w obecności zdefiniowanych kofaktorów lipidowych. Chociaż używamy tej metody do badania interakcji białek w maszynerii rozszczepienia mitochondriów, można ją również zastosować do innych kompleksów białkowych, które lokalizują się w różnych przedziałach błonowych. Tę procedurę zademonstruje Ryan, doktorant z mojego laboratorium.

Najpierw połącz roztwory chloroformu pożądanych lipidów w czystej szklanej probówce. Odparować rozpuszczalnik z suchym azotem gazowym, obracając rurkę, aby utworzyć cienki film lipidowy. Następnie usuń pozostały rozpuszczalnik za pomocą parownika odśrodkowego na godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie dodaj wstępnie podgrzany bufor A, aby uzyskać końcowe stężenie lipidów od jednego do dwóch milimolów. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza z okazjonalnym wirowaniem, aby całkowicie zawiesić mieszaninę lipidów. Po inkubacji przenieś mieszaninę lipidów do plastikowej probówki i umieść probówkę w ciekłym azocie na około 30 sekund, aż do całkowitego zamrożenia.

Następnie umieść probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na jedną do dwóch minut, aż do całkowitego rozmrożenia. Następnie należy przygotować ekstruder lipidowy poprzez namoczenie czterech wsporników filtracyjnych i filtra poliwęglanowego w buforze A i zmontowanie ekstrudera zgodnie z instrukcją producenta. Wytłacz roztwór lipidowy przez filtr 21 razy, stosując delikatne stałe ciśnienie, aby zapewnić jednorodny rozkład wielkości.

Podczas wytłaczania używaj powolnego, stałego nacisku, aby zapewnić jednorodność wielkości liposomu. W przypadku filtra o grubości jednego mikrona jest to mniej ważne. Ale przy mniejszych rozmiarach filtrów może wprowadzić bardziej widoczną heterogeniczność.

Przechowuj wytłaczane liposomy w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Inkubować znakowany His mitochondrialny czynnik rozszczepienia lub Mff z liposomami rusztowania przez co najmniej 15 minut w temperaturze pokojowej w buforze A i BME. Aby uzyskać kontrolę wolną od Mff, inkubuj liposomy z białkiem kontrolnym znakowanym His, takim jak GFP, aby związać i osłonić odsłonięty nikiel-NTA.

Dodaj białko związane z dynaminą lub Drp1 do mieszaniny liposomów i inkubuj przez godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie przenieś pięć mikrolitrów próbki na arkusz folii laboratoryjnej i połóż na próbce pokrytą węglem siatkę miedziano-rodową. Po inkubacji przez jedną minutę usuń nadmiar płynu bibułą filtracyjną i dodaj kroplę 2% octanu uranylu.

Po inkubacji przez kolejną minutę usunąć nadmiar plamy bibułą filtracyjną i przenieść próbkę do pudełka z siatką. Następnego dnia zobrazuj próbki za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego w powiększeniu od 18 500 do 30 000x, aby zaobserwować ultrastrukturalne zmiany w morfologii białek i liposomów. Inkubować znakowane przez Hisa Mff i Fis1 z liposomami rusztowania przez 15 minut w temperaturze pokojowej w buforze A i BME.

Dodaj Drp1 i inkubuj każdą mieszaninę przez dodatkowe 15 minut w temperaturze pokojowej. Przenieś probówki do termocyklera ustawionego na 37 stopni Celsjusza i rozpocznij reakcje poprzez dodanie GTP i chlorku magnezu. W żądanych punktach czasowych przenieś 20 mikrolitrów każdej mieszaniny reakcyjnej do studzienek płytki mikromiareczkowej zawierającej pięć mikrolitrów 0,5 molowego EDTA w celu chelatacji magnezu i zatrzymania reakcji.

Następnie należy przygotować zestaw wzorców fosforanowych, rozcieńczając fosforan potasu w buforze A i BME, aby skalibrować wyniki. Dodaj 20 mikrolitrów każdego wzorca do studzienek zawierających pięć mikrolitrów 0,5 molowego EDTA. Dodaj 150 mikrolitrów zielonego odczynnika malachitowego do każdej studzienki.

Na koniec przeczytaj OD 650 pięć minut po każdym dodaniu. GTP będzie się powoli hydrolizować w obecności kwaśnego odczynnika malachitowego zielonego. Tak więc odczynnik ten należy dodać do wszystkich studzienek na próbki w ciągu 10 minut od pomiaru absorbancji, aby zmaksymalizować stosunek sygnału do szumu.

W przypadku braku w Drp1 ani Mff, ani GFP nie powodowały deformacji błony. I tylko liposomy bez cech zaobserwowano dla wzbogaconych liposomów rusztowania ozdobionych GFP lub ESL. Jednak, gdy Drp1 został dodany do szablonów ESL ozdobionych Mff, przebudowa liposomów była oczywista

Dekoracja SL za pomocą Mff zwiększyła aktywność GTPazy. I odwrotnie, gdy odsłonięte grupy głów NTA zostały zablokowane za pomocą GFP oznaczonego przez Hisa, ta zwiększona aktywność GTPazy została zneutralizowana. Wiązanie Fis1 pozbawionego jego domeny transbłonowej z SL również nie wywołało stymulacji aktywności GTPazy Drp1.

Podobnie jak w przypadku SL, dodanie SL / Cl do Drp1 spowodowało niewielką stymulację aktywności GTPazy, która została odwrócona przez przywiązanie Fis1 lub GFP znakowanego His do liposomów. Zaobserwowano synergię między Mff a kardiolipiną, ponieważ aktywność GTPazy Drp1 była stymulowana 2,6-krotnie, gdy inkubowano ją z SL / CL ozdobionym Mff. Gdy szablony SL/PE/CL zostały ozdobione Mff, aktywność Drp1 została zwiększona.

Zdolność Drp1 do przekształcania liposomów w kanaliki lipidowe została zwiększona przez dodanie PE do liposomów rusztowania. Po opanowaniu rusztowania te można przygotować i używać w ciągu kilku godzin, jeśli procedura zostanie wykonana prawidłowo. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody interakcji białek i lipidów, takie jak sedymentacja i testy rozpraszania światła, w celu scharakteryzowania interakcji funkcjonalnych.

Zastosowanie tej techniki pozwala osobom badającym translokację białek do zdefiniowanej błony biologicznej badać przejściowe interakcje białek i wpływ określonych kofaktorów lipidowych na tworzenie i stabilizację niezbędnych zespołów komórkowych.