Name: Wykorzystanie liposomów rusztowania do odtworzenia interakcji lipidowo-proksymalnych białko-białko in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Poznaj metodę badania interakcji białko-białko w pobliżu lipidów in vitro przy użyciu rusztowań liposomowych. Technika ta umożliwia analizę dynamiki mitochondrialnej z zachowaniem natywnych konformacji białek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy pragną podziękować za dofinansowanie otrzymane od American Heart Association (SDG12SDG9130039).

1. Przygotowanie liposomów rusztowania
UWAGA: Idealnie, początkowe eksperymenty powinny używać stosunkowo prostego i pozbawionego cech charakterystycznych rusztowania (składającego się z DOPC (1,2-dioleoilo-sn-glycero-3-fosfocholiny lub PC) i DGS-NTA(Ni2+) (1,2-dioleoilo-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-karboksypentylo)kwasu iminodiacenowego)sukcynylu](soli niklu)). Opierając się na tych eksperymentach, ładunek lipidowy, elastyczność i krzywizna mogą zostać wprowadzone jako indywidualne czynniki, które mogą zmieniać interakcje błona-proksymalne. Zmiany te można osiągnąć poprzez dodanie określonych ilości określonych składników lipidowych, w tym fosfatydyloseryny lub kardiolipiny (CL), fosfatydyloetanoloaminy (DOPE lub PE) lub ceramidu galaktozylo(β).
<ol>
	<li>Połącz lipidy rozpuszczone w chloroformie w czystej szklanej probówce. Odparować rozpuszczalnik z suchym azotem gazowym, obracając rurkę, aby utworzyć cienki film lipidowy. Usunąć resztki rozpuszczalnika za pomocą parownika odśrodkowego przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: W opisanych poniżej protokołach stosuje się różne preparaty liposomów: liposomy rusztowań (3,3% mol DGS-NTA(Ni2+) / 96,7% mol% DOPC), liposomy rusztowań z kardiolipiną (3,3% mol% DGS-NTA(Ni2+) / 10% mol% kardiolipiny / 86,7 mol% DOPC), elastyczne liposomy rusztowań z kardiolipiną (3,3% mol% DGS-NTA(Ni2+) / 10% mol% kardiolipiny / 35% mol% DOPE / 51,7% mol% DOPC) oraz wzbogacone liposomy rusztowania (10% mol% DGS-NTA(Ni2+) / 15 mol% kardiolipiny / 35 mol% DOPE / 40 mol% DOPC).</li>
	<li>Dodać bufor A (25 mM HEPES (kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy), 150 mM KCl, pH dostosowane do 7,5 za pomocą KOH) podgrzany do temperatury 37 °C tak, aby końcowe stężenie lipidów wynosiło 1–2 mM. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C z okazjonalnymi wirami w celu całkowitego zawieszenia mieszaniny lipidów (ryc. 1a).</li>
	<li>Przenieś do plastikowej probówki, umieść probówkę w ciekłym azocie do całkowitego zamrożenia (około 30 s) i umieść w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C do całkowitego rozmrożenia (około 1 - 2 min). Powtórz w sumie 4 cykle zamrażania i rozmrażania (rysunek 1b).</li>
	<li>Przygotuj ekstruder lipidowy, zanurzając 4 wsporniki filtracyjne i filtr poliwęglanowy w buforze i montując ekstruder zgodnie z instrukcją producenta. Wyciśnij roztwór lipidowy przez filtr 21 razy. Użyj delikatnego, stałego nacisku, aby zapewnić jednorodny rozkład wielkości (Rysunek 1c). 
	UWAGA: We wszystkich eksperymentach opisanych w tym protokole do wytłaczania użyto filtra poliwęglanowego 1,0 μm. Interakcję Drp1 z lipidami anionowymi można zaobserwować przy różnych średnicach liposomów w zakresie od 50 nm do 400 nm12 lub większych13. W związku z tym rozmiar filtra wynoszący 1 μm został wybrany tak, aby był idealny zarówno do aktywności GTPazy, jak i do mikroskopii elektronowej. Jeśli pożądane są inne średnice liposomów, można zastosować przygotowanie gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych14,15 (GUVs) lub małych pęcherzyków jednowarstwowych16 (SUV). Dynamiczne rozpraszanie światła można wykorzystać do oceny niejednorodności wielkości liposomów13.</li>
	<li>Wytłaczane liposomy należy przechowywać w temperaturze 4 °C i wyrzucić po 3 - 5 dniach.</li>
</ol>
2. Wykorzystanie liposomów rusztowania do analizy wiązania białek
<ol>
	<li>Przygotowanie próbki
	<ol>
		<li>Inkubować znakowany przez Hisa MffΔTM (5 μM końcowy) z liposomami rusztowania (40 mol % PC / 35 mol % PE / 15 mol% CL / 10 mol% DGS-NTA(Ni2+); 50 μM końcowy) przez co najmniej 15 minut w temperaturze pokojowej w buforze A + BME (25 mM HEPES, 150 mM KCl, 10 mM β-merkaptoenolu (BME), pH dostosowane do 7,5 za pomocą KOH). Aby uzyskać kontrolę wolną od Mff, inkubuj liposomy z białkiem kontrolnym znakowanym przez niego (takim jak GFP), aby związać i osłonić odsłonięte NTA(Ni2+). 
		UWAGA: MffΔTM wyrażono i oczyszczono zgodnie z opisem w poprzednim badaniu2. GFP oczyszczono w podobny sposób, ale pominięto etap wymiany jonowej. BME było wymagane do tych eksperymentów, ponieważ Drp1 jest wrażliwy na utlenianie, które może zmienić jego aktywność i właściwości składania.</li>
		<li>Dodać Drp1 (2 μM końcowy) i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze RT. 
		UWAGA: Drp1 wyrażano i oczyszczano zgodnie z opisem w poprzednim badaniu2. Po inkubacji z Drp1 wpływ wiązania nukleotydów na deformację błony można zbadać, inkubując jedną dodatkową godzinę z 2 mM MgCl2 i 1 mM GTP, 1 mM GMP-PCP lub buforem A + BME.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza mikroskopii elektronowej (EM) z transmisją barwienia ujemnego
	<ol>
		<li>Przenieść 5 μl próbki na arkusz folii laboratoryjnej i położyć na próbce siatkę Cu/Rh pokrytą węglem. Inkubować siatkę przez 1 minutę na próbce, zetrzeć nadmiar płynu na bibule filtracyjnej i przenieść do kropli 2% octanu uranylu. Inkubować przez 1 minutę, osuszyć nadmiar plamy na bibule filtracyjnej i przenieść do pudełka z siatką. Przechowywać w próżni O / N, aby zapewnić pełne wysuszenie.</li>
		<li>Obrazowanie próbek za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego w powiększeniu 18 500 - 30 000X w celu obserwacji zmian ultrastrukturalnych w morfologii białek i liposomów17. 
		Uwaga: Zmiany ultrastrukturalne można określić ilościowo za pomocą oprogramowania do analizy obrazu, takiego jak ImageJ13 (http://imagej.nih.gov/ij/). Dekorację białkową można zmierzyć w porównaniu z nagimi matrycami lipidowymi. Dodatkowo średnice segmentów rurowych można mierzyć od najbardziej zewnętrznej części zespołów13. Bardziej szczegółową analizę można przeprowadzić za pomocą mikroskopii krioelektronowej17. Metoda ta może być stosowana do obrazowania natywnych zespołów białkowo-lipidowych w rozpuszczalniku bez użycia barwników z metali ciężkich, które pokrywają próbkę. W ten sposób można zbadać i określić ilościowo szczegółowe cechy strukturalne, które nie są widoczne w barwieniu ujemnym, w tym zmiany w podstawowej morfologii lipidów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Wykorzystanie liposomów rusztowania do testów enzymatycznych
Uwaga: Kolorymetryczny test GTPazy18 został użyty do pomiaru uwalniania fosforanów poprzez hydrolizę GTP. Dostępne są alternatywne testy GTPazy19 i mogą być wdrażane w zależności od potrzeb.
<ol>
	<li>Inkubować znakowane przez Hisa MffΔTM (Mff), Fis1ΔTM(Fis1) lub GFP (5 μM final dla wszystkich) z liposomami rusztowania (150 μM final) przez 15 minut w temperaturze RT w buforze A + BME (objętość = 30 μL). Dodać Drp1 (500 nM final) i inkubować przez dodatkowe 15 minut w temperaturze pokojowej (objętość = 80 μl). 
	UWAGA: Fis1 został oczyszczony w podobny sposób jak Mff2, ale pominięto etap chromatografii jonowymiennej. Celem GFP znakowanej przez Hisa jest ochrona grup głównych NTA (Ni2 +) i zapobieganie niespecyficznym interakcjom ładunku z innymi białkami. Jeżeli nie zaobserwuje się żadnego skutku przy braku GFP, kontrola ta może nie być wymagana. Można również zastosować alternatywne białka blokujące (o wielkości porównywalnej do białka będącego przedmiotem zainteresowania), ale GFP pozwala na bezpośrednią wizualizację interakcji z liposomami rusztowania.</li>
	<li>Przenieść probówki do termocyklera ustawionego na 37 °C i zainicjować reakcje przez dodanie GTP i MgCl2 (odpowiednio 1 mM i 2 mM końcowy; objętość = 120 μL).</li>
	<li>W pożądanych punktach czasowych (tj. T = 5, 10, 20, 40, 60 min) przenieś 20 μl reakcji do studzienek płytki mikromiareczkowej zawierającej 5 μl 0,5 M EDTA w celu chelatowania Mg2+ i zatrzymaj reakcję.</li>
	<li>Przygotować zestaw wzorców fosforanowych, rozcieńczając KH2PO4 w buforze A + BME w celu kalibracji wyników. Użyteczny zestaw wzorców to 100, 80, 60, 40, 20, 10, 5 i 0 μM. Dodaj 20 μl każdego z nich do studzienek zawierających 5 μl 0,5 M EDTA.</li>
	<li>Dodać 150 μl odczynnika zieleni malachitowej (1 mM zielonego karbinolu malachitowego, 10 mM tetrahydratu molibdenianu amonu i 1 N HCl) do każdej studzienki i odczytać OD650 5 minut po dodaniu. 
	UWAGA: GTP jest kwasowo labilny i ulega hydrolizie w obecności odczynnika malachitowego zielonego. Upewnij się, że czas między dodaniem odczynnika malachitowego a odczytem jest stały, aby zapewnić powtarzalne wyniki.</li>
	<li>Wygeneruj krzywą wzorcową, wykreślając OD650 wzorców w funkcji stężenia fosforanów. Użyj regresji liniowej, aby określić zależność między OD650 a stężeniem fosforanu w próbce.</li>
	<li>Stosując regresję liniową, przekształć OD650 próbek reakcji białkowej na fosforan μM. Określ szybkość wytwarzania fosforanów dla każdej mieszaniny reakcyjnej, wykreślając stężenie fosforanu w funkcji czasu, i przelicz na kcat, dzieląc szybkość przez stężenie Drp1 (0,5 μM). 
	UWAGA: Do określenia szybkości wytwarzania fosforanów należy używać tylko początkowej szybkości liniowej i należy użyć co najmniej 3 punktów danych. Jeżeli szybkość reakcji jest na tyle szybka, że pierwsze trzy punkty danych nie są liniowe (tj. r2 dopasowania liniowego jest mniejsze niż 0,9), należy przeprowadzić znacznie krótszy przebieg czasowy z co najmniej 3 punktami czasowymi.</li>
</ol>

<ol><li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proteins%2C+lipids+and+detergents%3A+not+just+a+soap+opera%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+%28BBA%29+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera.</a> Biochim Biophys Acta (BBA) - Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).</li>
<li>Clinton, R. W., Francy, C. A., Ramachandran, R., Qi, X., Mears, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamin-related+Protein+1+Oligomerization+in+Solution+Impairs+Functional+Interactions+with+Membrane-anchored+Mitochondrial+Fission+Factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Dynamin-related Protein 1 Oligomerization in Solution Impairs Functional Interactions with Membrane-anchored Mitochondrial Fission Factor.</a> J Biol Chem. 291 (1), 478-492 (2016).</li>
<li>Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Fusion+and+Fission+in+Mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Fusion and Fission in Mammals.</a> Annual Review of Cell and Dev Biol. 22 (1), 79-99 (2006).</li>
<li>Bui, H. T., Shaw, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamin+Assembly+Strategies+and+Adaptor+Proteins+in+Mitochondrial+Fission%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamin Assembly Strategies and Adaptor Proteins in Mitochondrial Fission.</a> Curr Biol. 23 (19), R891-R899 (2013).</li>
<li>Elgass, K., Pakay, J., Ryan, M. T., Palmer, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+into+the+understanding+of+mitochondrial+fission%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+%28BBA%29+-+Mol+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Recent advances into the understanding of mitochondrial fission.</a> Biochim Biophys Acta (BBA) - Mol Cell Res. 1833 (1), 150-161 (2013).</li>
<li>Losón, O. C., Song, Z., Chen, H., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fis1%2C+Mff%2C+MiD49%2C+and+MiD51+mediate+Drp1+recruitment+in+mitochondrial+fission%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Fis1, Mff, MiD49, and MiD51 mediate Drp1 recruitment in mitochondrial fission.</a> Mol Biol Cell. 24 (5), 659-667 (2013).</li>
<li>Otera, H., Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mff+is+an+essential+factor+for+mitochondrial+recruitment+of+Drp1+during+mitochondrial+fission+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mff is an essential factor for mitochondrial recruitment of Drp1 during mitochondrial fission in mammalian cells.</a> J Cell Biol. 191 (6), 1141-1158 (2010).</li>
<li>Gandre-Babbe, S., van der Bliek, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Novel+Tail-anchored+Membrane+Protein+Mff+Controls+Mitochondrial+and+Peroxisomal+Fission+in+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The Novel Tail-anchored Membrane Protein Mff Controls Mitochondrial and Peroxisomal Fission in Mammalian Cells.</a> Mol Biol Cell. 19 (6), 2402-2412 (2008).</li>
<li>Koirala, S., Guo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interchangeable+adaptors+regulate+mitochondrial+dynamin+assembly+for+membrane+scission%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Interchangeable adaptors regulate mitochondrial dynamin assembly for membrane scission.</a> Proc Natl Acad Sci. 110 (15), E1342-E1351 (2013).</li>
<li>Macdonald, P. J., Stepanyants, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dimeric+equilibrium+intermediate+nucleates+Drp1+reassembly+on+mitochondrial+membranes+for+fission%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">A dimeric equilibrium intermediate nucleates Drp1 reassembly on mitochondrial membranes for fission.</a> Mol Biol Cell. 25 (12), 1905-1915 (2014).</li>
<li>Macdonald, P. J., Francy, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Splice+Variants+of+Dynamin-related+Protein+1+Differentially+Utilize+Mitochondrial+Fission+Factor+as+an+Effector+of+Cooperative+GTPase+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Distinct Splice Variants of Dynamin-related Protein 1 Differentially Utilize Mitochondrial Fission Factor as an Effector of Cooperative GTPase Activity.</a> J Biol Chem. 291 (1), 493-507 (2016).</li>
<li>Bustillo-Zabalbeitia, I., Montessuit, S., Raemy, E., Basañez, G., Terrones, O., Martinou, J. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+Interaction+with+Cardiolipin+Triggers+Functional+Activation+of+Dynamin-Related+Protein+1%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Specific Interaction with Cardiolipin Triggers Functional Activation of Dynamin-Related Protein 1.</a> PLoS ONE. 9 (7), (2014).</li>
<li>Francy, C. A., Alvarez, F. J. D., Zhou, L., Ramachandran, R., Mears, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mechanoenzymatic+Core+of+Dynamin-Related+Protein+1+Comprises+the+Minimal+Machinery+Required+for+Membrane+Constriction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The Mechanoenzymatic Core of Dynamin-Related Protein 1 Comprises the Minimal Machinery Required for Membrane Constriction.</a> J Biol Chem. 290 (18), 11692-11703 (2015).</li>
<li>Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+Vesicles%3A+Preparations+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Giant Vesicles: Preparations and Applications.</a> ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).</li>
<li>Moscho, A., Orwar, O., Chiu, D. T., Modi, B. P., Zare, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+preparation+of+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Rapid preparation of giant unilamellar vesicles.</a> Proc Natl Acad Sci. 93 (21), 11443-11447 (1996).</li>
<li>Klingler, J., Vargas, C., Fiedler, S., Keller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+ready-to-use+small+unilamellar+phospholipid+vesicles+by+ultrasonication+with+a+beaker+resonator%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Preparation of ready-to-use small unilamellar phospholipid vesicles by ultrasonication with a beaker resonator.</a> Anal Biochem. 477, 10-12 (2015).</li>
<li>Mears, J. A., Hinshaw, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+13+Visualization+of+Dynamins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chapter 13 Visualization of Dynamins.</a> Methods Cell Biol. 88, 237-256 (2008).</li>
<li>Leonard, M., Doo Song, B., Ramachandran, R., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+Colorimetric+Assays+for+Dynamin%27s+Basal+and+Stimulated+GTPase+Activities%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Robust Colorimetric Assays for Dynamin's Basal and Stimulated GTPase Activities.</a> Methods Enzymol. 404, 490-503 (2005).</li>
<li>Ingerman, E., Perkins, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dnm1+forms+spirals+that+are+structurally+tailored+to+fit+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dnm1 forms spirals that are structurally tailored to fit mitochondria.</a> J Cell Biol. 170 (7), 1021-1027 (2005).</li>
<li>Fröhlich, C., Grabiger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+oligomerization+and+mitochondrial+remodelling+of+dynamin+1-like+protein%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Structural insights into oligomerization and mitochondrial remodelling of dynamin 1-like protein.</a> EMBO J. 32 (9), 1280-1292 (2013).</li>
<li>James, D. I., Parone, P. A., Mattenberger, Y., Martinou, J. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hFis1%2C+a+Novel+Component+of+the+Mammalian+Mitochondrial+Fission+Machinery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">hFis1, a Novel Component of the Mammalian Mitochondrial Fission Machinery.</a> J Biol Chem. 278 (38), 36373-36379 (2003).</li>
<li>Yoon, Y., Krueger, E. W., Oswald, B. J., McNiven, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mitochondrial+Protein+hFis1+Regulates+Mitochondrial+Fission+in+Mammalian+Cells+through+an+Interaction+with+the+Dynamin-Like+Protein+DLP1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The Mitochondrial Protein hFis1 Regulates Mitochondrial Fission in Mammalian Cells through an Interaction with the Dynamin-Like Protein DLP1.</a> Mol Cell Biol. 23 (15), 5409-5420 (2003).</li>
<li>Osellame, L. D., Singh, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+and+independent+roles+of+Drp1+adaptors+Mff+and+MiD49%2F51+in+mitochondrial+fission%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Cooperative and independent roles of Drp1 adaptors Mff and MiD49/51 in mitochondrial fission.</a> J Cell Sci. 129 (11), 2170-2181 (2016).</li>
<li>Esposito, E. A., Shrout, A. L., Weis, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Template-Directed+Self-Assembly+Enhances+RTK+Catalytic+Domain+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">Template-Directed Self-Assembly Enhances RTK Catalytic Domain Function.</a> J Biomol Screen. 13 (8), 810-816 (2008).</li>
<li>Shrout, A. L., Esposito, E. A., Weis, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Template-directed+Assembly+of+Signaling+Proteins%3A+A+Novel+Drug+Screening+and+Research+Tool%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol+Drug+Des%22%5BJournal%5D)">Template-directed Assembly of Signaling Proteins: A Novel Drug Screening and Research Tool.</a> Chem Biol Drug Des. 71 (3), 278-281 (2008).</li>
<li>Celia, H., Wilson-Kubalek, E., Milligan, R. A., Teyton, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+a+membrane-bound+murine+MHC+class+I+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Structure and function of a membrane-bound murine MHC class I molecule.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 96 (10), 5634-5639 (1999).</li>
<li>Li, E., Wimley, W. C., Hristova, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmembrane+helix+dimerization%3A+Beyond+the+search+for+sequence+motifs%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+%28BBA%29+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Transmembrane helix dimerization: Beyond the search for sequence motifs.</a> Biochim Biophys Acta (BBA) - Biomembranes. 1818 (2), 183-193 (2012).</li>
<li>Zhang, F., Crise, B., Su, B., Hou, Y., Rose, J. K., Bothwell, A., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+diffusion+of+membrane-spanning+and+glycosylphosphatidylinositol-+linked+proteins%3A+toward+establishing+rules+governing+the+lateral+mobility+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lateral diffusion of membrane-spanning and glycosylphosphatidylinositol- linked proteins: toward establishing rules governing the lateral mobility of membrane proteins.</a> J Cell Biol. 115 (1), 75-84 (1991).</li>
<li>Ramadurai, S., Holt, A., Krasnikov, V., van den Bogaart, G., Killian, J. A., Poolman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+diffusion+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Lateral diffusion of membrane proteins.</a> J Am Chem Soc. 131 (35), 12650-12656 (2009).</li>
<li>Gambin, Y., Reffay, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+of+the+lateral+mobility+of+transmembrane+peptides+with+hydrophobic+mismatch%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Variation of the lateral mobility of transmembrane peptides with hydrophobic mismatch.</a> J Phys Chem. B. 114 (10), 3559-3566 (2010).</li>
<li>Wilson-Kubalek, E. M., Brown, R. E., Celia, H., Milligan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+nanotubes+as+substrates+for+helical+crystallization+of+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Lipid nanotubes as substrates for helical crystallization of macromolecules.</a> Proc Natl Acad Sci. 95 (14), 8040-8045 (1998).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten oferuje metodę badania interakcji białko-białko z udziałem integralnych białek błonowych. Wykorzystując modułowe rusztowanie liposomowe, badacze są w stanie ocenić aktywność jednego lub więcej białek w środowisku proksymalnym lipidów. Wcześniejsze badania wykazały podobną metodę dla enzymów receptorowych błony komórkowej24-26. Rozszerzyliśmy tę metodę, aby włączyć kofaktory lipidowe i zbadać interakcje między białkami tworzącymi mechanoenzymatyczny rdzeń maszynerii rozszczepi...

Badanie interakcji białko-błona-proksymalne białko jest trudnym przedsięwzięciem ze względu na trudności w odtworzeniu natywnego środowiska integralnych białek błonowychzaangażowanych 1. Wynika to z konieczności solubilizacji detergentów i niespójnej orientacji białek w proteoliposomach. Aby uniknąć tych problemów, zastosowaliśmy strategię, w której rozpuszczalne domeny integralnych białek błonowych są wyrażane jako białka fuzyjne znacznika Hisa, a te rozpuszczalne fragmenty są zakotwiczone w liposomach rusztowania poprzez interakcje z grupami głownymi NTA (Ni2 +) na powierzchni lipidów. Za pomocą tych rusztowań można badać interakcje lipidowo-proksymalne białek w zakresie różnych składów lipidowych i białkowych.
Skutecznie zastosowaliśmy tę metodę do zbadania krytycznych interakcji białko-białko, które rządzą składaniem kompleksu rozszczepienia mitochondriów i zbadania interakcji lipidowych, które modulują ten proces2. Podczas rozszczepienia mitochondriów konserwatywne białko przebudowujące błonę, zwane białkiem związanym z dynaminą 1 (Drp1)3, jest rekrutowane na powierzchnię zewnętrznej błony mitochondrialnej (OMM) w odpowiedzi na sygnały komórkowe, które regulują homeostazę energetyczną, sygnalizację apoptotyczną i kilka innych integralnych procesów mitochondrialnych. Ta duża, cytozolowa GTPaza jest rekrutowana na powierzchnię mitochondriów poprzez interakcje z integralnymi białkami OMM 4-8. Rola jednego z takich białek, mitochondrialnego czynnika rozszczepienia (Mff), była trudna do wyjaśnienia ze względu na pozornie słabą interakcję z Drp1 in vitro. Niemniej jednak badania genetyczne wyraźnie wykazały, że Mff jest niezbędny do pomyślnego rozszczepienia mitochondriów7,8. Metoda opisana w tym manuskrypcie była w stanie przezwyciężyć wcześniejsze niedociągnięcia poprzez wprowadzenie jednoczesnych oddziaływań lipidowych, które promują interakcje Drp1-Mff. Podsumowując, ten nowatorski test ujawnił fundamentalne interakcje kierujące montażem mitochondrialnego kompleksu rozszczepienia i zapewnił nowy etap dla trwających badań strukturalnych i funkcjonalnych tej niezbędnej maszyny molekularnej.
Do tej pory, badanie interakcji między Drp1 i Mff było skomplikowane ze względu na wrodzoną elastyczność Mff9, niejednorodność polimerów Drp12,10 oraz trudność w oczyszczaniu i odtwarzaniu pełnej długości Mff z nienaruszoną domeną transbłonową11. Zajęliśmy się tymi wyzwaniami, używając liposomów rusztowania NTA (Ni2 +) do odtworzenia Mff znakowanego His, który nie ma domeny transbłonowej (MffΔTM-His6). Strategia ta była korzystna, ponieważ MffΔTM był wyjątkowo rozpuszczalny w przypadku nadmiernej ekspresji w E. coli, a to wyizolowane białko można było łatwo odtworzyć na liposomach rusztowania. Po przywiązaniu do tych matryc lipidowych, Mff przyjął identyczną, skierowaną na zewnątrz orientację na powierzchni błony. Oprócz tych zalet dodano lipidy mitochondrialne, takie jak kardiolipina, w celu ustabilizowania fałdowania Mff i asocjacji z błoną11. Kardiolipina oddziałuje również ze zmienną domeną Drp12,12, która może stabilizować ten nieuporządkowany obszar i ułatwiać montaż maszynerii rozszczepienia.
Ta solidna metoda jest szeroko stosowana w przyszłych badaniach, które mają na celu ocenę interakcji błonowo-proksymalnych białek. Dzięki zastosowaniu dodatkowych interakcji wiązania/powinowactwa, wyrafinowanie tych badań nad rekonstytucją błony może zostać ulepszone, aby naśladować dodatkową złożoność występującą na powierzchni błon w komórkach. Jednocześnie składy lipidowe mogą być modyfikowane, aby dokładniej naśladować natywne środowiska tych kompleksów makromolekularnych. Podsumowując, metoda ta umożliwia zbadanie względnego udziału białek i lipidów w kształtowaniu morfologii błon podczas krytycznych procesów komórkowych.

<table><tbody><tr><td>Fosfatydylocholina (DOPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375</td><td></td></tr><tr><td>Fosfatydyloetanoloamina (DOPE)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850725</td><td></td></tr><tr><td>DGS-NTA(Ni2+)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>790404</td><td></td></tr><tr><td>Kardiolipina serca bydlęcego (CL)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840012</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Acros Organics</td><td></td><td></td>268320010</tr><tr><td>Wytłaczarka do liposomów</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610023</td><td></td></tr><tr><td>Cu / Rh Ujemne siatki barwiące</td><td>Ted Pella</td><td>79712</td><td></td></tr><tr><td>Rurka do mikrofug</td><td>Beckman</td><td>357448</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Jena Biosciences</td><td>NU-1012</td><td></td></tr><tr><td>GMP-PCP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3509</td><td></td></tr><tr><td>Paski płytki do mikromiareczkowania</td><td>Thermo Scientific</td><td>469949</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Acros Organics</td><td>40993-0010</td><td></td></tr><tr><td>Instant Blue Coomassie</td><td>Dye Expedeon</td><td>ISB1L</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310</td><td></td></tr><tr><td>BME</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P330</td><td></td></tr><tr><td></td><td>KOH Fisher Scientific</td><td>P250</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Acros Organics</td><td>223211000</td><td></td></tr><tr><td>4 - 20% SDS-PAGE Gel</td><td>Bio Rad</td><td>456-1096</td><td></td></tr><tr><td>4x Laemmli Loading Dye</td><td>Bio Rad</td><td>161-0747</td><td></td></tr><tr><td>HCL</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144S</td><td></td></tr><tr><td>Malachit Green Carbinol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>229105</td><td></td></tr><tr><td>Molibdenian amonu Tetrahydrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7302</td><td></td></tr><tr><td>Folia laboratoryjna</td><td>Parafilm</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Octan uranylu</td><td>Polysciences</td><td>21447</td><td></td></tr><tr><td>Tecnai T12 100 keV Mikroskop</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optima MAX</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TLA-55 Rotor</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>z chłodzeniem CentriVap Koncentrator</td><td>Labconico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler Pro Termocykler</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VersaMax Czytnik mikropłytek</td> Urządzenia <td></td><td></td><td>molekularne</td></tr></tbody></table>

wykorzystanie liposomów rusztowania do odtworzenia interakcji lipidowo-proksymalnych białko-białko in vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Badania integralnych białek błonowych in vitro są często komplikowane przez obecność hydrofobowej domeny transbłonowej. Dalsze komplikowanie tych badań polega na tym, że ponowne włączenie rozpuszczalnych w detergentach białek błonowych do liposomów jest procesem stochastycznym, w którym topologia białek jest niemożliwa do wymuszenia. W tym artykule przedstawiono alternatywną metodę dla tych trudnych technik, która wykorzystuje rusztowanie oparte na liposomach. Rozpuszczalność białek jest zwiększona przez delecję domeny transbłonowej, a aminokwasy te są zastępowane ugrupowaniem wiążącym, takim jak znacznik His. To wiązanie oddziałuje z grupą kotwiczącą (Ni2+ koordynowaną przez kwas nitrylotrioctowy (NTA(Ni2+)) dla białek znakowanych Hisem), która wymusza jednolitą topologię białek na powierzchni liposomu. Przedstawiono przykład, w którym interakcja między białkiem 1 związanym z dynaminą (Drp1) a integralnym białkiem błonowym, mitochondrialnym czynnikiem rozszczepienia (Mff), została zbadana przy użyciu tej metody liposomów rusztowania. W tej pracy wykazaliśmy zdolność Mff do efektywnej rekrutacji rozpuszczalnego Drp1 na powierzchnię liposomów, co stymulowało jego aktywność GTPazy. Co więcej, Drp1 był w stanie zbulować matrycę lipidową ozdobioną Mff w obecności określonych lipidów. Przykład ten pokazuje skuteczność liposomów rusztowań przy użyciu testów strukturalnych i funkcjonalnych oraz podkreśla rolę Mff w regulacji aktywności Drp1.

Choć wykazano, że oddziaływanie między Drp1 a Mff jest istotne dla podziału mitochondriów, jego odtworzenie in vitro okazało się trudne. Naszym celem było lepsze odwzorowanie środowiska komórkowego, w którym zachodzi interakcja Drp1 i Mff. W tym celu przygotowano liposomy zawierające ograniczoną koncentrację grup głowowych NTA(Ni2+) poprzez rehydratację filmu lipidowego zgodnie z powyższym opisem. Roztwór lipidowy składa się początkowo z pęcherzyków jednowarstwowych i ...

Ten artykuł opisuje metodę oceny interakcji i zespołów integralnych białek błonowych in vitro z różnymi czynnikami partnerskimi w środowisku lipidowo-proksymalnym.

Wykorzystanie liposomów rusztowania do odtworzenia interakcji lipidowo-proksymalnych białko-białko in vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Ogólnym celem tej techniki jest uchwycenie interakcji lipidowo-proksymalnych białko-białko in vitro. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na pytania w dziedzinie dynamiki mitochondriów, takie jak to, w jaki sposób dodatkowe lipidy mogą wpływać na interakcje białko-białko w zewnętrznej błonie mitochondriów. Główną zaletą tej techniki jest to, że wiązanie rozpuszczalnych domen białkowych z matrycami lipidowymi zapewnia osiągnięcie bardziej natywnego potwierdzenia.Co więcej, złożone interakcje między rozpuszczalnymi białkami a ich partnerami na uwięzi można ocenić w obecności zdefiniowanych kofaktorów lipidowych. Chociaż używamy tej metody do badania interakcji białek w maszynerii rozszczepienia mitochondriów, można ją również zastosować do innych kompleksów białkowych, które lokalizują się w różnych przedziałach błonowych. Tę procedurę zademonstruje Ryan, doktorant z mojego laboratorium.Najpierw połącz roztwory chloroformu pożądanych lipidów w czystej szklanej probówce. Odparować rozpuszczalnik z suchym azotem gazowym, obracając rurkę, aby utworzyć cienki film lipidowy. Następnie usuń pozostały rozpuszczalnik za pomocą parownika odśrodkowego na godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza

using-scaffold-liposomes-to-reconstitute-lipid-proximal-protein

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Aby przetestować interakcję białka z jego docelowym lipidem, zastosowano system MACS oraz kule magnetyczne skoniugowane z Aneksyną V oraz pęcherzyki lipidowe zsyntetyzowane z lipidu docelowego i fosfatydyloseryny wiążącej Aneksynę V. Białka związane z lipidem docelowym są współoczyszczane i analizowane po elucji z kulek.

Chromatografia powinowactwa oparta na pęcherzykach lipidowych z wykorzystaniem magnetycznego sortowania komórek (LIMACS): nowatorska metoda analizy oddziaływań białko-lipid

Tutaj prezentujemy protokół do wykrywania pojedynczych, zapośredniczonych przez SNARE zdarzeń fuzji między liposomami a wspieranymi dwuwarstwami w kanałach mikroprzepływowych za pomocą spolaryzowanego TIRFM, z czułością pojedynczej cząsteczki i rozdzielczością czasową ~15 ms. Uwalnianie lipidów i rozpuszczalnego ładunku może być wykrywane jednocześnie. Mierzy się wielkość liposomów, dyfuzyjność lipidów i właściwości porów fuzyjnych.

Fuzja pojedynczych proteoliposomów za pośrednictwem SNARE z dwuwarstwami na uwięzi w mikroprzepływowej komórce przepływowej monitorowanej za pomocą spolaryzowanej mikroskopii TIRF

Tutaj prezentujemy dwa ultraszybkie protokoły do rekonstytucji białek błonowych w fuzogenne proteoliposomy oraz fuzji takich proteoliposomów z docelowymi dwuwarstwami lipidowymi w celu bezdetergentowego dostarczania tych białek błonowych do dwuwarstwy pofuzyjnej. Połączenie tych podejść umożliwia szybki i łatwy w obsłudze montaż złożonych, wieloskładnikowych systemów membranowych.

Ultraszybka rekonstytucja białek błonowych w dwuwarstwach lipidowych bez użycia fusogenicznych proteoliposomów naładowanych komplementarnie.

Udostępniamy protokół do testów samoorganizacji MinD i MinE in vitro na podpartej dwuwarstwie lipidowej w otwartej komorze. Dodatkowo opisujemy, jak zamknąć test w mikrokompartmentach PDMS pokrytych lipidami, aby naśladować warunki in vivo poprzez uwięzienie reakcji.

In vitro Rekonstrukcja samoorganizujących się wzorców białkowych na podpartych dwuwarstwach lipidowych

Biologiczna fuzja błonowa jest katalizowana przez wyspecjalizowane białka fuzyjne. Pomiar właściwości fuzogennych białek można osiągnąć za pomocą testów mieszania lipidów. Przedstawiamy metodę oczyszczania rekombinowanej atlastyny Drosophila, białka pośredniczącego w homotypowej fuzji ER, odtwarzaniu go do wstępnie uformowanych liposomów i testowaniu zdolności fuzyjnej.

Rekonstytucja rekombinowanej Drosophila Atlastin w liposomach wspomagana detergentami do testów mieszających lipidy

Fuzja mitochondriów jest ważną reakcją homeostatyczną leżącą u podstaw dynamiki mitochondriów. Opisano tutaj system rekonstytucji in vitro do badania fuzji mitochondrialnej błony wewnętrznej, która może rozwiązać problem wiązania błony, dokowania, heminacji i otwierania porów. Omówiono wszechstronność tego podejścia w badaniu systemów błon komórkowych.

Modelowa platforma membranowa do odtwarzania dynamiki błon mitochondrialnych

Ten protokół opisuje efektywną metodę produkcji wysokiej jakości proteoliposomu metodą dializy dwuwarstwowej przy użyciu systemu bezkomórkowego pszenicy i liposomów. Metoda ta zapewnia odpowiednie środki do analizy funkcjonalnej białek błonowych, badań przesiewowych celów leków i opracowywania przeciwciał.

Bezkomórkowa produkcja proteoliposomów do analizy funkcjonalnej i rozwoju przeciwciał ukierunkowanych na białka błonowe

Ten protokół opisuje tworzenie się komórek naśladujących pęcherzyki jedno- i wielolipidowe, dwuwarstwy lipidowe wspierane i dwuwarstwy lipidowe zawieszone. Te modele in vitro można dostosować do różnych typów lipidów i można je wykorzystać do badania różnych interakcji molekuł i makrocząsteczek.

Montaż dwuwarstwowych modeli lipidowych naśladujących i zawieszonych w powietrzu do badania oddziaływań molekularnych

W tym manuskrypcie demonstrujemy eksperymentalne techniki hermetyzacji cytoszkieletu F-aktyny w gigantyczne jednowarstwowe pęcherzyki lipidowe (zwane również liposomami) oraz metodę tworzenia warstwy F-aktyny naśladującej korę mózgową na wewnętrznej wlotce błony liposomowej.

In vitro Rekonstrukcja cytoszkieletu aktynowego w gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych

Ten artykuł przedstawia prostą jednoetapową rekonstrukcję sieci cytoszkieletu wewnątrz oddzielonych fazowo gigantycznych pęcherzyków. Metodę tę można uogólnić i zastosować do enkapsulacji lub uwięzienia szerokiego zakresu biomolekuł.

Metody in vitro Rekonstrukcja sieci cytoszkieletu w oddzielonych fazowo gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych (GUV)

Poznaj metodę badania interakcji białko-białko w pobliżu lipidów in vitro przy użyciu rusztowań liposomowych. Technika ta umożliwia analizę dynamiki mitochondrialnej z zachowaniem natywnych konformacji białek.

Wykorzystanie liposomów rusztowania do odtworzenia interakcji lipidowo-proksymalnych białko-białko in vitro

Przeglądaj więcej filmów