Name: Analiza 3D tkanki mięśnia sercowego całego serca (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Poznaj metodę 3D przetwarzania tkanki mięśnia sercowego całego serca w modelu świni z zawałem. Ta technika MRI ocenia dokładność wstrzyknięć w strefę graniczną zawału.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Marlijn Jansen, Joyce Visser i Martijnowi van Nieuwburgowi za pomoc w eksperymentach na zwierzętach. Bardzo dziękujemy Martijnowi Froelingowi i Anke Wassink za ich pomoc w obrazowaniu MRI.

Eksperyment in vivo został przeprowadzony zgodnie z wytycznymi Guide for the Care and Use of Laboratory Animals opracowanymi przez Institute of Laboratory Animal Research. Eksperyment został zatwierdzony przez lokalną Komisję ds. Doświadczeń na Zwierzętach.
1. Przygotowanie roztworu do iniekcji i zatapiania
<ol>
	<li>Przygotowanie żelu do iniekcji.
	<ol>
		<li>Przygotować 1 mL żelu ureido-pirymidynowego (UPy) zgodnie z wcześniej opisanymi protokołami12,13.</li>
		<li>Dodać do roztworu superparamagnetyczne cząsteczki tlenku żelaza (SPIOs), aby uzyskać stężenie 15 µg/mL, a następnie mieszać mieszaninę przez 5 min w celu zapewnienia jednorodnego rozkładu.</li>
		<li>Dodać do roztworu fluorescencyjne mikrokulki, aby uzyskać stężenie 10 000 beads/mL, a następnie mieszać mieszaninę przez 5 min w celu zapewnienia jednorodnego rozkładu.</li>
		<li>Przechowywać otrzymaną mieszaninę w temperaturze pokojowej w ciemnym miejscu. Przed procedurą iniekcji roztwór ogrzać i wymieszać za pomocą vortexa lub mieszadła.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie roztworu do zatapiania.
	<ol>
		<li>Do wody z kranu w temperaturze pokojowej dodać agarozę (agar) do uzyskania stężenia 4 wt%.</li>
		<li>Powoli podgrzewać roztwór do temperatury wrzenia w kuchence mikrofalowej, często mieszając podczas grzania. Po osiągnięciu temperatury wrzenia przechowywać roztwór agaru w temperaturze powyżej 70 °C przez 2 h, aby umożliwić wydostanie się pęcherzyków powietrza na powierzchnię.</li>
		<li>Pozostawić agar do ostygnięcia w temperaturze pokojowej do temperatury między 50 a 60 °C do momentu zatapiania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Procedura iniekcji
<ol>
	<li>Przeprowadzić premedykację (leki przeciwarytmiczne, terapię przeciwpłytkową i leki przeciwbólowe), znieczulenie, założenie dostępu żylnego oraz intubację, zgodnie z wcześniejszym opisem14.</li>
	<li>Wykonać iniekcje za pomocą cewnika do iniekcji wewnątrzmięśniowych (Tabela materiałów). Przy każdej iniekcji 0,2 mL mieszaniny wstrzykuje się w formie jednego bolusa ze stałą prędkością około 0,3 mL/min przy użyciu urządzenia do iniekcji. Iniekcje należy rozmieścić w różnych punktach wzdłuż IBZ12.</li>
	<li>Podać 0,2 mL/kg (1,0 mmol/mL) środka kontrastowego na bazie gadolinu na 15 min przed uśmierceniem zwierzęcia.</li>
	<li>Podać dożylnie 20 mL 7,5% chlorku potasu w celu uśmiercenia zwierzęcia.</li>
	<li>Uzyskać dostęp do śródpiersia zgodnie z krokami protokołu 8.2 - 8.3, opisanymi przez Koudstaal et al.14. Przeciąć żyłę główną dolną 5 cm od prawego przedsionka i usunąć wypływającą krew za pomocą ssaka. Wyciąć serce i wypłukać je 0,9% solą fizjologiczną w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
3. Procedura zatapiania
<ol>
	<li>Przygotowanie serca.
	<ol>
		<li>Usunąć osierdzie z serca, pozostawiając przedsionki i komory nienaruszone. Przeciąć aortę wstępującą w odległości ± 1 cm powyżej zastawki aortalnej za pomocą nożyczek Klinkenberga. Przeciąć żyłę główną dolną w odległości ± 1 cm od przedsionka; analogicznie postąpić z żyłami płucnymi.</li>
		<li>Przyszyć wierzchołek serca do dna plastikowego pojemnika do zatapiania (17 x 15 x 15 cm, szer. x gł. x wys.), używając szwu 2-0, aby zapobiec wypływaniu serca podczas zatapiania (Rysunek 1A).</li>
		<li>Przyszyć pozostałą część aorty do krawędzi pojemnika za pomocą szwu 2-0, upewniając się, że serce jest wycentrowane i nie dotyka ścianek pojemnika (Rysunek 1B).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Analiza ułożenia serca; A: Schemat 3D serca w komorze. B: Serce w układzie eksperymentalnym." src="/files/ftp_upload/54974/54974fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schematyczny przegląd i zdjęcie pojemnika do zatapiania. (A) Schematyczny przegląd procesu zatapiania. Serce (kolor czerwony) jest mocowane w pojemniku (kolor niebieski) za pomocą szwów. Po wypełnieniu serca roztworem agaru, wypełniana jest przestrzeń wokół serca. Na koniec w pojemniku, obok serca, ale bez dotykania go, umieszcza się dwie sztywne plastikowe rurki (kolor żółty), które służą jako punkt odniesienia podczas rejestracji obrazu. (B) Zdjęcie serca zamocowanego w pojemniku do zatapiania. Szwy są przymocowane do krawędzi pojemnika za pomocą kleszczyków chirurgicznych. <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54974/54974fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<ol start="2">
	<li>Zatop serce w geometrii przypominającej koniec rozkurczu. 
	UWAGA: Konieczne jest zapobieganie powstawaniu pęcherzyków powietrza. Jeśli w roztworze agaru występują duże pęcherzyki powietrza, należy utrzymać agar w temperaturze 40 °C, aby pęcherzyki wypłynęły na powierzchnię.
	<ol>
		<li>Zaklemuj żyłę główną dolną za pomocą kleszczyków typu mosquito. Powoli wstrzyknij ciekły agar za pomocą strzykawki 50-mL do prawego przedsionka przez żyłę główną górną, aż prawy przedsionek i komora zostaną całkowicie wypełnione.</li>
		<li>Zaklemuj żyły płucne za pomocą kleszczyków typu mosquito. Delikatnie wprowadź strzykawkę 50-mL wypełnioną agarem w kierunku wstecznym przez zastawki aortalne. Powoli wstrzykuj roztwór do lewej komory (LV), aż LV i lewy przedsionek zostaną całkowicie wypełnione. Po wypełnieniu LV zaklemuj aortę, aby zatrzymać agar w LV.</li>
		<li>Wlej pozostały agar do pojemnika, aż serce zostanie w pełni zakryte. Umieść w pojemniku do zatapiania dwie sztywne plastikowe rurki, które będą służyć jako struktury referencyjne do późniejszej rejestracji obrazów (Rycina 1A). Upewnij się, że rurki nie dotykają ścianek pojemnika ani serca.</li>
		<li>Pozostaw agar do stężenia w temperaturze 2 - 7 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Pozyskiwanie obrazów
<ol>
	<li>Wykonać poprzeczne skany MRI ex vivo serca osadzonego w pojemniku.
	<ol>
		<li>Umieścić pojemnik z osadzonym sercem w cewce głowowej (Tabela materiałów).</li>
		<li>Ustawić kąt nachylenia warstw równolegle do dna pojemnika. Stosować tę samą orientację i kąt nachylenia w każdej sekwencji MRI ex vivo.</li>
		<li>W celu wizualizacji mięśnia sercowego wykonać sekwencję z odwróconym odzyskiwaniem z tłumieniem płynu (FLAIR) z następującymi parametrami: czas repetycji [TR]/czas echa [TE] = 10 s/140 ms, kąt odchylenia = 90°, rozmiar piksela = 0.5 x 0.5 mm, pole widzenia [FOV] = 169 x 169 mm, macierz 320 x 320 i grubość warstwy 3 mm.</li>
		<li>W celu wizualizacji zawału mięśnia sercowego wykonać sekwencję z późnym wzmocnieniem gadolinem (LGE) z następującymi parametrami: [TR]/[TE] = 5.53 ms/1.69 ms, kąt odchylenia = 25°, rozmiar piksela = 1.0 x 1.0 mm, [FOV] = 169 x 169 mm, macierz 176 x 176 i grubość warstwy 3 mm.</li>
		<li>W celu wizualizacji SPIO wykonać sekwencję gradientową T2*-zależną z następującymi parametrami: [TR]/[TE] = 88.7 ms/15 równomiernie rozłożonych TEs w zakresie 1.9 - 24.6 ms, kąt odchylenia = 15°, rozmiar piksela = 0.5 x 0.5 mm, [FOV] = 169 x 169 mm, macierz 320 x 320 i grubość warstwy 3 mm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obróbka tkanek
	<ol>
		<li>Odwrócić pojemnik do góry dnem i doprowadzić do przedostania się powietrza między agarem a ściankami pojemnika, aby usunąć z niego stałą żel agaru wraz z sercem. Wyjąć plastikowe pręty z agaru.</li>
		<li>Pokroić blok agaru zawierający serce na plastry o grubości 5 mm, od wierzchołka do podstawy serca, używając krojaka do mięsa. Zachować ten sam kąt nachylenia cięcia, co w uzyskanych obrazach MR, krojąc równolegle do dna bloku agaru.</li>
		<li>Barwić plastry agaru (wraz z sercem) przez 15 min w 1% roztworze chlorku 2,3,5-trifenylotetrazoliu (TTC) rozpuszczonego w 0,9% soli fizjologicznej w temperaturze 37 °C, a następnie sfotografować plastry z obu stron z widoku prostopadłego (Rycina 2A). Następnie ostrożnie wypłukać plastry w 0,9% soli fizjologicznej. 
		UWAGA: W niniejszym badaniu zastosowano zestaw dSLR z odpowiednim obiektywem, statyw i jednorodne oświetlenie. Jednakże fotografie służyły jedynie jako kontrola do oceny obszaru blizny, więc można było zastosować inny zestaw.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie fluorescencyjne 
	UWAGA: W zależności od długości fal wzbudzenia i emisji fluorescencyjnych mikrokulek, należy dobrać odpowiedni blok filtrów i lasery wzbudzające (np. czerwone mikrokulki użyte w tym badaniu mają długości fal wzbudzenia i emisji odpowiednio 580 nm i 605 nm; w związku z tym wybrany laser wzbudzający i filtry przepustowe ustawiono odpowiednio na 532 nm, 580/30 nm i 610/30 nm).
	<ol>
		<li>Wybrać tryb obrazowania fluorescencyjnego w skanerze wielotrybowym. Ustawić lampę fotopowielającą na 430 V lub wartość równoważną, a rozmiar piksela na 100 x 100 µm. Wybrać laser wzbudzający (532 nm) najbliższy długości fali wzbudzenia fluorescencyjnych mikrokulek.</li>
		<li>Dla pierwszego bloku filtrów wybrać filtr przepustowy (580/30 nm), który pokrywa się z długością fali emisji wstrzykniętych kulek fluorescencyjnych (kanał 1). Dla drugiego bloku filtrów wybrać filtr przepustowy (610/30) poza zakresem długości fali emisji (kanał 2). 
		UWAGA: Drugi blok filtrów służy jako kontrola negatywna i do usuwania autofluorescencji przy jednoczesnym zachowaniu miejsc wstrzyknięcia.</li>
		<li>Zeskanować obie strony plastrów agaru w trybie fluorescencyjnym wielotrybowego skanera laserowego, korzystając z dwóch kanałów. Upewnić się, że każdy plaster został zeskanowany w całości, wliczając w to otwory referencyjne.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Postprocessing
UWAGA: Pierwszym krokiem w postprocesowaniu obrazów jest ręczna segmentacja mięśnia sercowego przy użyciu opracowanych wewnętrznie skryptów w celu wyznaczenia granic endokardium i epikardium, a także miejsc wstrzyknięcia. Procedura ta jest identyczna zarówno dla obrazowania MRI, jak i skanów fluorescencyjnych.
<ol>
	<li>Wykonaj segmentację mięśnia sercowego w skanach MRI.
	<ol>
		<li>Wysegmentuj granice wsierdzia i osierdzia LV na obrazach z sekwencji MRI FLAIR.</li>
		<li>Skopiuj segmentację LV z kroku 5.1.1 do zbioru danych LGE-MRI i wysegmentuj bliznę w sekwencji MRI LGE.</li>
		<li>Skopiuj segmentację mięśnia sercowego z kroku 5.1.1 do zbioru danych T2*-weighted i wysegmentuj złogi SPIO w mięśniu sercowym LV.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przetwórz obrazy fluorescencyjne i wykonaj segmentację.
	<ol>
		<li>Wczytaj pliki uzyskane ze skanera w trybie zmiennym i utwórz oddzielny obraz dla każdego przekroju serca.</li>
		<li>Obróć lustrzanie przekroje, które zostały zeskanowane w orientacji od podstawy do wierzchołka, a następnie posortuj obrazy fluorescencyjne w stos dla obu kanałów w orientacji od wierzchołka do podstawy.</li>
		<li>Wysegmentuj granice wsierdzia i osierdzia LV na obrazach fluorescencyjnych.</li>
		<li>Wykonaj ręczną segmentację blizny na obrazach fluorescencyjnych, wykorzystując skany LGE-MRI oraz fotografie do potwierdzenia morfologii blizny.</li>
		<li>Odejmij stos obrazów z kanału 2 od stosu obrazów z kanału 1, aby wyeliminować autofluorescencję. Ręcznie wysegmentuj złogi fluorescencyjnych mikrokulek, wykorzystując obrazy T2* do potwierdzenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby stworzyć anatomicznie poprawną geometrię 3D, wykonaj sztywną rejestrację przekrojów w stosie obrazów w oparciu o struktury referencyjne (otwory utworzone przez sztywne rurki). Oblicz i zapisz zastosowane przesunięcie oraz obrót każdego obrazu.</li>
	<li>Zastosuj zapisane transformacje do stosów obrazów i segmentacji. Przeprowadź liniową interpolację segmentacji obu stron przekrojów, aby zrekonstruować oryginalną grubość przekroju i stworzyć model 3D danych.</li>
</ol>
6. Analiza
<ol>
	<li>Wykonaj pomiary 2D i/lub 3D odległości między centrami miejsc wstrzyknięcia a IBZ w celu oceny dokładności wstrzyknięcia. Odległość należy mierzyć wzdłuż granicy wschołkowej segmentacji LV. Na rysunku 2C i 2F przykład pomiarów 2D i 3D został zaznaczony czerwoną linią.</li>
</ol>

<ol><li>Nowbar, A. N., Howard, J. P., Ja Finegold,, Asaria, P., Francis, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2014+global+geographic+analysis+of+mortality+from+ischaemic+heart+disease+by+country%2C+age+and+income%3A+statistics+from+World+Health+Organisation+and+United+Nations%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">2014 global geographic analysis of mortality from ischaemic heart disease by country, age and income: statistics from World Health Organisation and United Nations.</a> Int J Cardiol. 174 (2), 293-298 (2014).</li>
<li>Kannel, W. B., Belanger, A. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2000773">Epidemiology of heart failure.</a> Am Heart J. 121 (3), 951-957 (1991).</li>
<li>Ibáñez, B., Heusch, G., Ovize, M., Van De Werf, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolving+therapies+for+myocardial+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Coll+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Evolving therapies for myocardial ischemia/reperfusion injury.</a> J Am Coll Cardiol. 65 (14), 1454-1471 (2015).</li>
<li>Bartunek, J., Vanderheyden, M., Hill, J., Terzic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+as+biologics+for+cardiac+repair+in+ischaemic+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Heart%22%5BJournal%5D)">Cells as biologics for cardiac repair in ischaemic heart failure.</a> Heart. 96 (10), 792-800 (2010).</li>
<li>Orlic, D., Kajstura, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+cells+regenerate+infarcted+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium.</a> Nature. 410 (6829), 701-705 (2001).</li>
<li>Nguyen, P. K., Lan, F., Wang, Y., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging%3A+Guiding+the+Clinical+Translation+of+Cardiac+Stem+Cell+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Imaging: Guiding the Clinical Translation of Cardiac Stem Cell Therapy.</a> Circ Res. 109 (8), 962-979 (2011).</li>
<li>Psaltis, P. J., Worthley, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoventricular+electromechanical+mapping-the+diagnostic+and+therapeutic+utility+of+the+NOGA+XP+Cardiac+Navigation+System%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cardiovasc+Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Endoventricular electromechanical mapping-the diagnostic and therapeutic utility of the NOGA XP Cardiac Navigation System.</a> J Cardiovasc Transl Res. 2 (1), 48-62 (2009).</li>
<li>Tomkowiak, M. T., Klein, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+transendocardial+therapeutic+delivery+guided+by+MRI-x-ray+image+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Catheter+Cardiovasc+Interv%22%5BJournal%5D)">Targeted transendocardial therapeutic delivery guided by MRI-x-ray image fusion.</a> Catheter Cardiovasc Interv. 78 (3), 468-478 (2011).</li>
<li>Dauwe, D. F., Nuyens, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+rotational+angiography+fused+with+multimodal+imaging+modalities+for+targeted+endomyocardial+injections+in+the+ischaemic+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Heart+J+Cardiovasc+Imaging%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional rotational angiography fused with multimodal imaging modalities for targeted endomyocardial injections in the ischaemic heart.</a> Eur Heart J Cardiovasc Imaging. 15 (8), 900-907 (2014).</li>
<li>van Slochteren, F. J., van Es, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodality+infarct+identification+for+optimal+image-guided+intramyocardial+cell+injections%5BTitle%5D)+AND+%22Neth+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Multimodality infarct identification for optimal image-guided intramyocardial cell injections.</a> Neth Heart J. 22 (11), 493-500 (2014).</li>
<li>van Slochteren, F. J., van Es, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+dimensional+fusion+of+electromechanical+mapping+and+magnetic+resonance+imaging+for+real-time+navigation+of+intramyocardial+cell+injections+in+a+porcine+model+of+chronic+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cardiovasc+Imaging%22%5BJournal%5D)">Three dimensional fusion of electromechanical mapping and magnetic resonance imaging for real-time navigation of intramyocardial cell injections in a porcine model of chronic myocardial infarction.</a> Int J Cardiovasc Imaging. 32 (5), 833-843 (2016).</li>
<li>Pape, aC. H., Bakker, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Injectable+and+Drug-loaded+Supramolecular+Hydrogel+for+Local+Catheter+Injection+into+the+Pig+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">An Injectable and Drug-loaded Supramolecular Hydrogel for Local Catheter Injection into the Pig Heart.</a> J Vis Exp. (100), (2015).</li>
<li>Bastings, M. M. C., Koudstaal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast+pH-switchable+and+self-healing+supramolecular+hydrogel+carrier+for+guided%2C+local+catheter+injection+in+the+infarcted+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Healthc+Mater%22%5BJournal%5D)">A fast pH-switchable and self-healing supramolecular hydrogel carrier for guided, local catheter injection in the infarcted myocardium.</a> Adv Healthc Mater. 3 (1), 70-78 (2014).</li>
<li>Koudstaal, S., Jansen of Lorkeers, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+infarction+and+functional+outcome+assessment+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Myocardial infarction and functional outcome assessment in pigs.</a> J. Vis. Exp. (86), (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przetwarzanie tkanek mięśnia sercowego 3D całego serca zgodnie z tym protokołem zapewnia ustrukturyzowaną metodę, która umożliwia analizę 3D zawału, IBZ i wykonanych iniekcji w odniesieniu do anatomii serca. Objętość wypełnienia serca zależy od pożądanej analizy. W tym badaniu, aby ocenić dokładność iniekcji, staraliśmy się wypełnić serce tak, aby jak najbardziej przypominało geometrię końcoworozkurczową. Aby to wyegzekwować, wierzchołek lewej komory jest przymocowany do dna pojemnika, a LV jest wypełniany agarem, podcza...

Choroba niedokrwienna serca była główną przyczyną zgonów na świecie przez ostatnie dziesięciolecia1. Ostre leczenie po zawale mięśnia sercowego ma na celu przywrócenie przepływu krwi do mięśnia sercowego poprzez przezskórną interwencję wieńcową lub pomostowanie aortalno-wieńcowe. W ciężkich zawałach duży obszar mięśnia sercowego jest zbliznowaciały, a przypadki te często prowadzą do niewydolności niedokrwiennej serca (HF)2. Obecne możliwości leczenia niewydolności serca koncentrują się na profilaktyce i zachowaniu funkcji serca u pacjentów z niewydolnością serca, ale nie na regeneracji.
W ostatnim dziesięcioleciu terapie regeneracyjne serca były badane jako opcja leczenia HF3. Terapia ta ma na celu dostarczenie substancji biologicznych, takich jak komórki macierzyste lub czynniki wzrostu, bezpośrednio do uszkodzonego mięśnia sercowego w celu wywołania rewaskularyzacji, ochrony kardiomiocytów, różnicowania i wzrostu4. Aby uzyskać optymalny efekt terapeutyczny, przypuszcza się, że substancja biologiczna musi zostać wstrzyknięta do strefy granicznej zawału (IBZ), aby ułatwić dobrą perfuzję tkanek dla przeżycia biologicznej i optymalnego efektu dla strefy docelowej5,6. Opracowano wiele technik identyfikacji i wizualizacji IBZ w celu kierowania iniekcjami domięśniowymi mięśnia sercowego7,8,9,10,11. Oprócz identyfikacji i wizualizacji IBZ, dostawa opiera się również na zastosowanych biomateriałach i cewnikach iniekcyjnych. Aby zweryfikować dokładność wstrzykiwania technik podawania, wymagana jest dokładna i odtwarzalna metoda oznaczania ilościowego.
Opracowaliśmy protokół przetwarzania tkanek mięśnia sercowego całego serca, który oferuje obrazowanie dwuwymiarowe (2D) i trójwymiarowe (3D), które może być wykorzystane do celów badań jakościowych i ilościowych. Protokół obejmuje proces osadzania i cyfrowej analizy obrazu. W niniejszej pracy przedstawiono protokół oceny dokładności celowania iniekcji domięśniowych w IBZ w dużym świńskim modelu przewlekłego zawału mięśnia sercowego.

<table><tbody><tr><td>0,9% sól fizjologiczna</td><td>Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Roche Diagnostics</td><td></td><td>Wielofunkcyjny agar klasy naukowej</td></tr><tr><td>Skaner fluorescencji biomolekularnej Typhoon 9410&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pojemnik</td><td></td><td></td> do zatapiania <td>Plastik, wymiary 17 x 14,5 x 14 cm</td></tr><tr><td>FluoSpheres Mikrosfery polistyrenowe</td><td>Invitrogen</td><td>F8834</td><td>czerwony, 10 i mikro; </td></tr><tr><td>m Gadolinium</td><td>Gadovist</td><td></td><td>1.0 mmol/mL</td></tr><tr><td>dS 32-kanałowa cewka głowicy</td><td>Philips</td><td></td><td>Lub podobny</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td>Aby zapewnić kompatybilność 2015a lub nowszy</td></tr><tr><td>Krajalnica do mięsa</td> Cewnik iniekcyjne <td>Berkel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Myostar</td><td>Biosense Webster</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Super paramagnetyczne cząstki tlenku żelaza</td><td>Sinerem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorek trifenylotetrazolu</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UPy-PEG10k</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vicryl 2-0</td><td>Ethicon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analiza 3d tkanki mięśnia sercowego całego serca

3D Whole-heart Myocardial Tissue Analysis

Terapie regeneracyjne serca mają na celu ochronę i naprawę uszkodzonego serca u pacjentów z chorobą niedokrwienną serca. Poprzez wstrzyknięcie komórek macierzystych lub innych środków biologicznych, które nasilają angio- lub waskulogenezę do strefy granicznej zawału (IBZ), poprawia się perfuzja tkanek, a mięsień sercowy może być chroniony przed dalszym uszkodzeniem. Aby uzyskać maksymalny efekt terapeutyczny, przypuszcza się, że substancja regeneracyjna najlepiej jest dostarczana do IBZ. Wymaga to dokładnych iniekcji i doprowadziło do opracowania nowych technik iniekcji. Aby zwalidować te nowe techniki, opracowaliśmy protokół walidacji oparty na analizie tkanki mięśnia sercowego. Protokół ten obejmuje przetwarzanie tkanki mięśnia sercowego w całym sercu, które umożliwia szczegółową dwuwymiarową (2D) i trójwymiarową (3D) analizę anatomii serca oraz iniekcje domięśniowe mięśnia sercowego. U świni zawał mięśnia sercowego powstał w wyniku 90-minutowego zamknięcia lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej. Cztery tygodnie później mieszaninę hydrożelu z superparamagnetycznymi cząstkami tlenku żelaza (SPIO) i kulkami fluorescencyjnymi wstrzyknięto do IBZ przy użyciu minimalnie inwazyjnego dostępu wsierdziowego. 1 godzinę po zabiegu iniekcji świnia została poddana eutanazji, a serce wycięto i zatopiono w agarozie (agarze ). Po zestaleniu się agaru wykonano rezonans magnetyczny (MRI), cięcie serca i obrazowanie fluorescencyjne. Po przetworzeniu obrazu przeprowadzono analizę 3D w celu oceny dokładności celowania IBZ. Protokół ten zapewnia ustrukturyzowaną i powtarzalną metodę oceny dokładności celowania wstrzyknięć domięśniowych do IBZ. Protokół może być z łatwością zastosowany, gdy pożądane jest przetwarzanie tkanki bliznowatej i/lub walidacja dokładności wstrzyknięcia całego serca.

Zatapianie tkanki
Poprzez proces zatapiania ustalono geometrię odpowiadającą końcowej rozkurczowej fazie cyklu serca. Agar skutecznie przylegał do tkanki serca, co umożliwiło pocięcie tkanki pod pożądanym kątem przy zachowaniu jednakowej grubości plastrów (Rycina 2A oraz 2C).
Ocena blizn oraz miejsca wstrzyknięcia
<p class="jove_content"...

Ten protokół opisuje nowatorską metodę 3D porównywania tkanki mięśnia sercowego całego serca z MRI. Ma to na celu dokładną ocenę iniekcji domięśniowych w strefie granicznej zawału przewlekłego świńskiego modelu zawału mięśnia sercowego.

Analiza 3D tkanki mięśnia sercowego całego serca

Cardiac regenerative therapies aim to protect and repair the injured heart in patients with ischemic heart disease. By injecting stem cells or other ...

Narrator}Ogólnym celem tego protokołu jest ułatwienie ustrukturyzowanej i powtarzalnej metody przetwarzania tkanek 3D całego serca, która może być wykorzystana do oceny dokładności celowania wstrzyknięć domięśniowych do strefy granicznej zawału. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie medycyny kardioregeneracyjnej, takie jak rozwój praktyki i optymalizacja technik iniekcji. Główną zaletą tej techniki jest to, że oferuje ona ustandaryzowaną i powtarzalną metodę przetwarzania tkanek 3D całego serca.Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku rozwoju terapii regeneracyjnych serca i walidacji dokładności iniekcji w normalnych technikach podawania. Celem tej terapii komórkami macierzystymi serca jest wstrzyknięcie komórek do strefy granicznej zawału w celu stymulacji miejscowego unaczynienia i ochrony kardiomiocytów. Uchwycenie serca w końcowej fazie rozkurczowej wymaga praktyki i cierpliwości.Wizualna demonstracja tych kroków ma kluczowe znaczenie. Zacznij od oddzielenia osierdzia od serca, w które wstrzyknięto mikrogranulki, pozostawiając przedsionki i komory w stanie nienaruszonym. Po usunięciu całej tkanki użyj nożyczek Klinkenberga, aby wypreparować aortę wstępującą około jednego centymetra powyżej zastawki aortalnej i przeciąć dolną żyłę główną i płucną około jednego centymetra od przedsionka.Po przymocowaniu wierzchołka serca do dna plastikowego pojemnika do osadzania, aby zapobiec flotacji, umieść szwy 2-0 przez pozostałą część aorty do krawędzi pojemnika i przymocuj serce. Uważaj, aby serce było wyśrodkowane i nie dotykało ścianek pojemnika. Gdy narząd zostanie zabezpieczony w końcowej geometrii rozkurczowej, użyj zacisków na komary, aby chwycić dolną żyłę główną i użyj 50-mililitrowej strzykawki, aby powoli wstrzyknąć świeżo przygotowany agar o temperaturze od 50 do 60 stopni Celsjusza do prawego przedsionka przez górną żyłę kawałkową, aż zarówno prawy przedsionek, jak i komora zostaną całkowicie wypełnione.Aby uzyskać osadzone serce jak najbardziej zbliżone do końcowej geometrii rozkurczowej, przymocuj wierzchołek lewej komory do dna pojemnika i wypełnij prawą komorę agarem, podczas gdy żyły płucne są zaciśnięte. Następnie umieść zacisk na komary na żyłach płucnych i delikatnie przełóż nową strzykawkę o pojemności 50 mililitrów wypełnioną agarem w kierunku wstecznym przez zastawki aortalne. Powoli wstrzykiwać roztwór do lewej komory, aż komora i lewy przedsionek zostaną całkowicie wypełnione, zaciskając aortę po wypełnieniu lewej komory.Teraz wlej pozostały agar do pojemnika, aż serce zostanie całkowicie pokryte i umieść dwie sztywne plastikowe rurki w pojemniku do zatapiania, aby służyły jako struktury odniesienia podczas rejestracji obrazu. Następnie umieść serce w temperaturze od dwóch do siedmiu stopni Celsjusza na co najmniej cztery godziny, aby zestalić agar. Po obrazowaniu metodą rezonansu magnetycznego odwróć pojemnik do góry nogami i pozwól, aby powietrze między agarem a bokami pojemnika usunęło stały roztwór agaru i serce z pojemnika.Usuń plastikowe pręty. Następnie użyj krajalnicy do mięsa, aby pokroić blok agaru i serce na pięciomilimetrowe plastry od wierzchołka do podstawy serca, tnąc równolegle do dna bloku agarowego, aby kątowanie plastrów było takie samo, jak w uzyskanych obrazach rezonansu magnetycznego. Po uzyskaniu wszystkich wycinków należy zabarwić próbki tkanek w TTC.Po 15 minutach sfotografuj plastry po obu stronach pod prostopadłym kątem, a następnie ostrożnie opłucz kawałki w 0,9% soli fizjologicznej. Aby zobrazować próbki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, wybierz obrazowanie w trybie fluorescencji na skanerze w trybie zmiennym i ustaw rozmiar piksela na 100 na 100 mikronów. Dla pierwszego bloku filtra wybierz filtr pasmowo-przepustowy, który nakłada się na długość fali emisji fluorescencji kulkowej w kanale pierwszym, a następnie filtr pasmowo-przepustowy dla drugiego bloku filtra poza długością fali emisji w kanale drugim.Następnie należy dobrać odpowiedni blok filtra, ustawić rurkę fotopowielacza na odpowiednie napięcie, a laser wzbudzający na długość fali wzbudzenia najbliższą długości fali wstrzykiwanych mikrogranulek. Po uzyskaniu wszystkich obrazów, w odpowiednim oprogramowaniu do przetwarzania końcowego, należy podzielić mięsień sercowy oraz granice lewej komory śród- i nasierdziowej na obrazach rezonansu magnetycznego, a następnie podobną segmentację mięśnia sercowego i miejsc wstrzyknięć na obrazach fluorescencyjnych. Następnie interpoluj liniowo segmenty zarejestrowane na obrazie z obu stron wycinków, aby zrekonstruować oryginalną grubość próbki i utworzyć model 3D danych.Z sercem zabezpieczonym w końcowej geometrii rozkurczowej, jak właśnie pokazano, w tym reprezentatywnym eksperymencie agar z powodzeniem przylegał do tkanki serca, umożliwiając przecięcie tkanki pod pożądanym kątem o równej grubości warstwy. Zarówno na obrazach fluorescencji 2D, jak i rezonansu magnetycznego, blizna i miejsca wstrzyknięcia są wyraźnie różne. Obrazy rezonansu magnetycznego wzmocnionego TTC TTC i późnym gadolinem zapewniają kontrolę oceny blizn w obrazowaniu fluorescencyjnym.Obrazowanie post-processingowe umożliwia rekonstrukcję geometrii 3D serca ex vivo na podstawie segmentacji i obrazów fluorescencyjnych, co pozwala na ocenę dokładności iniekcji 3D. W tym badaniu osady iniekcyjne i strefa graniczna zawału były chronione na ścianie wsierdzia i mierzono odległości między występami na powierzchni wsierdzia. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak ocena chirurgiczna, kwantyfikacja wielkości zawału lub walidacja innych modalności obrazowania trójwymiarowego.Zastosowaliśmy tę technikę do oceny dokładności iniekcji w strefę graniczną zawału. Badania te zostały przeprowadzone w celu poprawy terapii kardioregeneracyjnej niewydolności serca. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować serce, jak osadzać i przetwarzać tkankę serca oraz jak wykonywać obrazowanie fluorescencyjne próbek tkanki serca.

3d-whole-heart-myocardial-tissue-analysis

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Echokardiografia jest powszechnie używana do nieinwazyjnego charakteryzowania i ilościowego określania zmian w strukturze i funkcji serca. Opisujemy algorytm obrazowania oparty na ultradźwiękach, który oferuje ulepszony zastępczy pomiar mikrostruktury mięśnia sercowego i może być wykonywany przy użyciu ogólnodostępnego oprogramowania do analizy obrazu.

Ultradźwiękowa ocena mikrostruktury mięśnia sercowego

Ta metoda opisuje użycie Kwantowej Mikrotomografii Komputerowej (MicroCT) do oceny morfologii, funkcji, perfuzji, metabolizmu i żywotności serca za pomocą jodowego środka kontrastowego u myszy z eksperymentalnie wywołanym niedokrwieniem mięśnia sercowego. Technika ta może być stosowana do nieniszczącego, wysokoprzepustowego, podłużnego obrazowania in vivo różnych zwierzęcych modeli chorób ludzkiego serca.

In vivo (in vivo) Ilościowa ocena struktury, funkcji, perfuzji i żywotności mięśnia sercowego za pomocą mikrotomografii komputerowej serca

Ten protokół opisuje metodę opartą na pleśni sieciowej do tworzenia trójwymiarowych, wolnych od rusztowań tkanek serca o zadowalającej integralności strukturalnej i synchronicznym zachowaniu bicia.

Oparta na formie metoda trójwymiarowego tworzenia tkanki serca bez rusztowań

W tym artykule przedstawiamy krok po kroku protokół akwizycji i analizy objętościowej i analizy śledzenia plamek lewej komory za pomocą echokardiografii 3D, szczególnie skupiając się na praktycznych aspektach, które maksymalizują wykonalność tej techniki.

Ocena struktury i funkcji lewej komory za pomocą echokardiografii 3D

Tutaj opisujemy łatwą w użyciu metodologię generowania 3D samodzielnie składających się układów mikrotkanek serca składających się z wcześniej zróżnicowanych, indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych, fibroblastów serca i komórek śródbłonka. Ta przyjazna dla użytkownika i wymagająca niewielkiej liczby komórek technika generowania mikrotkanek serca może zostać wdrożona do modelowania chorób i wczesnych etapów opracowywania leków.

Wytwarzanie matryc mikrotkanek serca 3D przy użyciu ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC, fibroblastów serca i komórek śródbłonka

Celem tego protokołu jest wyjaśnienie i zademonstrowanie rozwoju trójwymiarowego (3D) modelu mikroprzepływowego wysoce wyrównanej tkanki serca ludzkiego, składającej się z kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych hodowanych wspólnie z fibroblastami serca (CF) w biomimetycznym hydrożelu na bazie kolagenu, do zastosowań w inżynierii tkankowej serca, badaniach przesiewowych leków i modelowaniu chorób.

Opracowywanie zorganizowanej w 3D ludzkiej tkanki serca w ramach platformy mikroprzepływowej

Przedstawiamy metodę mezoskopowej rekonstrukcji całego serca myszy poprzez połączenie nowych osiągnięć w transformacji tkanek i barwieniu z rozwojem osiowo skanowanego mikroskopu świetlnego.

Mezoskopowe obrazowanie optyczne całego serca myszy

Tutaj prezentujemy protokół uzyskiwania wysokiej rozdzielczości obrazów mikrotomografii komputerowej zdrowych i patologicznych całych serc dużych ssaków z selektywnym wzmocnieniem kontrastu.

Techniki przygotowania tkanek do obrazowania mikrotomografii komputerowej ze wzmocnieniem kontrastowym modeli serca dużych ssaków z chorobami przewlekłymi

Ten protokół przedstawia kompleksowy potok do analizy próbek pobranych z ludzkich serc, które obejmują mikroskopijne i makroskopowe skale.

Rurociąg do wieloskalowych trójwymiarowych badań anatomicznych ludzkiego serca

Trójwymiarowa (3D) rekonstrukcja uszkodzenia serca w reperfuzji ostrego zawału mięśnia sercowego (repAMI) umożliwia wierną kwantyfikację i kolokalizację powiązanych wzorców wpływających na chorobę. W tym przypadku zapewniono zautomatyzowane obrazowanie sterowane arkuszem świetlnym do jednoczesnego pomiaru uszkodzenia serca, obszaru ryzyka i odpowiedzi komórek odpornościowych.

Jednoczesna analiza 3D uszkodzenia serca i odpowiedzi immunologicznej w ostrym zawale mięśnia sercowego z reperfuzją przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej arkusza światła

Obecny test chlorku 2,3,5-trifenylotetrazolu (TTC) wprowadza udoskonalony protokół barwienia TTC, który umożliwia analizę uszkodzeń mięśnia sercowego w mikroskopijnej rozdzielczości, tworząc wysokiej jakości obrazy pozwalające na dokładną i wiarygodną ocenę wielkości zawału oraz żywotności kardiomiocytów na poziomie komórkowym.

Mikroskopowy test chlorku 2,3,5-trifenyltetrazolu do dokładnej i wiarygodnej analizy uszkodzeń mięśnia sercowego

Poznaj metodę 3D przetwarzania tkanki mięśnia sercowego całego serca w modelu świni z zawałem. Ta technika MRI ocenia dokładność wstrzyknięć w strefę graniczną zawału.

Analiza 3D tkanki mięśnia sercowego całego serca

Przeglądaj więcej filmów