Analiza 3D tkanki mięśnia sercowego całego serca
12 kwietnia 2017
Ten protokół opisuje nowatorską metodę 3D porównywania tkanki mięśnia sercowego całego serca z MRI. Ma to na celu dokładną ocenę iniekcji domięśniowych w strefie granicznej zawału przewlekłego świńskiego modelu zawału mięśnia sercowego.
Narrator}Ogólnym celem tego protokołu jest ułatwienie ustrukturyzowanej i powtarzalnej metody przetwarzania tkanek 3D całego serca, która może być wykorzystana do oceny dokładności celowania wstrzyknięć domięśniowych do strefy granicznej zawału. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie medycyny kardioregeneracyjnej, takie jak rozwój praktyki i optymalizacja technik iniekcji. Główną zaletą tej techniki jest to, że oferuje ona ustandaryzowaną i powtarzalną metodę przetwarzania tkanek 3D całego serca.
Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku rozwoju terapii regeneracyjnych serca i walidacji dokładności iniekcji w normalnych technikach podawania. Celem tej terapii komórkami macierzystymi serca jest wstrzyknięcie komórek do strefy granicznej zawału w celu stymulacji miejscowego unaczynienia i ochrony kardiomiocytów. Uchwycenie serca w końcowej fazie rozkurczowej wymaga praktyki i cierpliwości.
Wizualna demonstracja tych kroków ma kluczowe znaczenie. Zacznij od oddzielenia osierdzia od serca, w które wstrzyknięto mikrogranulki, pozostawiając przedsionki i komory w stanie nienaruszonym. Po usunięciu całej tkanki użyj nożyczek Klinkenberga, aby wypreparować aortę wstępującą około jednego centymetra powyżej zastawki aortalnej i przeciąć dolną żyłę główną i płucną około jednego centymetra od przedsionka.
Po przymocowaniu wierzchołka serca do dna plastikowego pojemnika do osadzania, aby zapobiec flotacji, umieść szwy 2-0 przez pozostałą część aorty do krawędzi pojemnika i przymocuj serce. Uważaj, aby serce było wyśrodkowane i nie dotykało ścianek pojemnika. Gdy narząd zostanie zabezpieczony w końcowej geometrii rozkurczowej, użyj zacisków na komary, aby chwycić dolną żyłę główną i użyj 50-mililitrowej strzykawki, aby powoli wstrzyknąć świeżo przygotowany agar o temperaturze od 50 do 60 stopni Celsjusza do prawego przedsionka przez górną żyłę kawałkową, aż zarówno prawy przedsionek, jak i komora zostaną całkowicie wypełnione.
Aby uzyskać osadzone serce jak najbardziej zbliżone do końcowej geometrii rozkurczowej, przymocuj wierzchołek lewej komory do dna pojemnika i wypełnij prawą komorę agarem, podczas gdy żyły płucne są zaciśnięte. Następnie umieść zacisk na komary na żyłach płucnych i delikatnie przełóż nową strzykawkę o pojemności 50 mililitrów wypełnioną agarem w kierunku wstecznym przez zastawki aortalne. Powoli wstrzykiwać roztwór do lewej komory, aż komora i lewy przedsionek zostaną całkowicie wypełnione, zaciskając aortę po wypełnieniu lewej komory.
Teraz wlej pozostały agar do pojemnika, aż serce zostanie całkowicie pokryte i umieść dwie sztywne plastikowe rurki w pojemniku do zatapiania, aby służyły jako struktury odniesienia podczas rejestracji obrazu. Następnie umieść serce w temperaturze od dwóch do siedmiu stopni Celsjusza na co najmniej cztery godziny, aby zestalić agar. Po obrazowaniu metodą rezonansu magnetycznego odwróć pojemnik do góry nogami i pozwól, aby powietrze między agarem a bokami pojemnika usunęło stały roztwór agaru i serce z pojemnika.
Usuń plastikowe pręty. Następnie użyj krajalnicy do mięsa, aby pokroić blok agaru i serce na pięciomilimetrowe plastry od wierzchołka do podstawy serca, tnąc równolegle do dna bloku agarowego, aby kątowanie plastrów było takie samo, jak w uzyskanych obrazach rezonansu magnetycznego. Po uzyskaniu wszystkich wycinków należy zabarwić próbki tkanek w TTC.
Po 15 minutach sfotografuj plastry po obu stronach pod prostopadłym kątem, a następnie ostrożnie opłucz kawałki w 0,9% soli fizjologicznej. Aby zobrazować próbki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, wybierz obrazowanie w trybie fluorescencji na skanerze w trybie zmiennym i ustaw rozmiar piksela na 100 na 100 mikronów. Dla pierwszego bloku filtra wybierz filtr pasmowo-przepustowy, który nakłada się na długość fali emisji fluorescencji kulkowej w kanale pierwszym, a następnie filtr pasmowo-przepustowy dla drugiego bloku filtra poza długością fali emisji w kanale drugim.
Następnie należy dobrać odpowiedni blok filtra, ustawić rurkę fotopowielacza na odpowiednie napięcie, a laser wzbudzający na długość fali wzbudzenia najbliższą długości fali wstrzykiwanych mikrogranulek. Po uzyskaniu wszystkich obrazów, w odpowiednim oprogramowaniu do przetwarzania końcowego, należy podzielić mięsień sercowy oraz granice lewej komory śród- i nasierdziowej na obrazach rezonansu magnetycznego, a następnie podobną segmentację mięśnia sercowego i miejsc wstrzyknięć na obrazach fluorescencyjnych. Następnie interpoluj liniowo segmenty zarejestrowane na obrazie z obu stron wycinków, aby zrekonstruować oryginalną grubość próbki i utworzyć model 3D danych.
Z sercem zabezpieczonym w końcowej geometrii rozkurczowej, jak właśnie pokazano, w tym reprezentatywnym eksperymencie agar z powodzeniem przylegał do tkanki serca, umożliwiając przecięcie tkanki pod pożądanym kątem o równej grubości warstwy. Zarówno na obrazach fluorescencji 2D, jak i rezonansu magnetycznego, blizna i miejsca wstrzyknięcia są wyraźnie różne. Obrazy rezonansu magnetycznego wzmocnionego TTC TTC i późnym gadolinem zapewniają kontrolę oceny blizn w obrazowaniu fluorescencyjnym.
Obrazowanie post-processingowe umożliwia rekonstrukcję geometrii 3D serca ex vivo na podstawie segmentacji i obrazów fluorescencyjnych, co pozwala na ocenę dokładności iniekcji 3D. W tym badaniu osady iniekcyjne i strefa graniczna zawału były chronione na ścianie wsierdzia i mierzono odległości między występami na powierzchni wsierdzia. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak ocena chirurgiczna, kwantyfikacja wielkości zawału lub walidacja innych modalności obrazowania trójwymiarowego.
Zastosowaliśmy tę technikę do oceny dokładności iniekcji w strefę graniczną zawału. Badania te zostały przeprowadzone w celu poprawy terapii kardioregeneracyjnej niewydolności serca. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować serce, jak osadzać i przetwarzać tkankę serca oraz jak wykonywać obrazowanie fluorescencyjne próbek tkanki serca.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje nową metodę trójwymiarowego porównania tkanki mięśnia sercowego całego serca z obrazami MRI. Metoda ta ułatwia ocenę wtryskiwań wewnątrzmięśniowych w strefie przyrannej zawału w chronicznym świńskim modelu zawału mięśnia sercowego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Badania nad układem sercowo-naczyniowym
- Kardiologiczna medycyna regeneracyjna
- Zawał mięśnia sercowego
Wprowadzenie
- Wstrzyknięcia domięśniowe do mięśnia sercowego są kluczowe dla terapii kardiologicznych.
- Znormalizowane metody przetwarzania tkanek są niezbędne dla zapewnienia powtarzalności wyników.
- Techniki obrazowania 3D zwiększają dokładność oceny wstrzyknięć.
- Niniejsze badanie koncentruje się na strefie brzeżnej zawału w modelu świńskim.
Cel badania
- Opracowanie ustrukturyzowanej metody przetwarzania trójwymiarowej tkanki całego serca.
- Ocena dokładności celowania w przypadku wstrzykiwań wewnątrzmięśniowych w mięsień sercowy.
- Optymalizacja technik wstrzykiwania w medycynie kardioregeneracyjnej.
Zastosowane metody
- Protokół przetwarzania trójwymiarowej tkanki całego serca.
- Obrazowanie rezonansem magnetycznym (MRI) do porównania tkanek.
- Przewlekły świński model zawału mięśnia sercowego.
- Techniki rejestracji fazy rozkurczowej końcowej.
Główne wyniki
- Znormalizowana metoda poprawia powtarzalność w przetwarzaniu tkanek.
- Zwiększona dokładność w ocenie celowania iniekcji.
- Potencjalne implikacje dla terapii regeneracyjnych serca.
- Walidacja technik iniekcji w celu poprawy wyników.
Wnioski
- Protokół zapewnia niezawodną metodę trójwymiarowej oceny tkanki mięśnia sercowego.
- Wspiera on opracowywanie skutecznych terapii kardiologicznych.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tym ustandaryzowanym podejściu.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie przemysłowe
Precyzyjne celowanie podczas wstrzykiwania domięśniowego w mięsień sercowy jest kluczowe dla oceny terapii regeneracyjnych serca, ponieważ błędne podanie preparatu może zaburzyć oceny skuteczności w modelach przedklinicznych. Niniejszy protokół umożliwia standaryzowane przetwarzanie tkanek całego serca w 3D w celu ilościowego określenia dokładności wstrzyknięcia w strefie brzeżnej zawału, co wspiera mechanistyczne ograniczanie ryzyka w interwencjach opartych na komórkach macierzystych i produktach biologicznych. Dzięki zapewnieniu powtarzalnej walidacji przestrzennej zwiększa on pewność prognostyczną w decyzjach na wczesnym etapie odkrywania kandydatów na leki sercowo-naczyniowe.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez potwierdzenie precyzyjnego dostarczenia substancji regeneracyjnych do strefy brzeżnej zawału.
- Wartość operacyjna: Dostarcza ustandaryzowaną metodę ograniczania ryzyka w zakresie oddziaływania na cel poprzez dokładne przestrzenne potwierdzenie depozycji biologicznej.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie ilościowych odczytów przestrzennych 3D, które wspomagają standaryzację testów dla systemów dostarczania wewnątrzmięśniowego do mięśnia sercowego.
- Wartość operacyjna: Ułatwia przygotowanie zwalidowanych przekrojów tkanek do późniejszych przepływów pracy w analizach fluorescencyjnych i opartych na MRI.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wspiera walidację systemów istotnych dla badania chorób poprzez powiązanie dokładności iniekcji z wynikami funkcjonalnymi w modelach przewlekłego zawału mięśnia sercowego.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość translacyjną od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną poprzez standaryzację przetwarzania tkanek w różnych ośrodkach badawczych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w proces odkrywania leków, umożliwiając walidację po wstrzyknięciu po zidentyfikowaniu związku wiodącego, przed badaniami przedklinicznymi nad skutecznością, co zapewnia, że obserwowane efekty biologiczne wynikają z prawidłowego dostarczenia preparatu do odpowiedniej struktury anatomicznej.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez poprzez potwierdzenie, czy wstrzyknięte biopreparaty docierają do zamierzonego mikrośrodowiska strefy brzeżnej zawału.
- Przesiew: Zapewnia gotowość do analizy dzięki standaryzowanemu krojeniu tkanek, obrazowaniu i rekonstrukcji 3D w celu spójnej oceny dostarczania związków lub komórek.
- Analityka: Dostarcza ilościowych pomiarów zmiennych zależnych (np. odległości od miejsca wstrzyknięcia do strefy brzeżnej), co umożliwia obiektywne porównanie technik dostarczania.
- Badania translacyjne: Łączy się z ciągłością przedkliniczną poprzez walidację osadzania substancji regeneracyjnych w anatomicznie zdefiniowanej strefie brzeżnej zawału, zgodnie z celami minimalizacji ryzyka mechanistycznego.
- Ponowne wykorzystanie w organizacji: Tworzy platformę przetwarzania tkanek, którą można wykorzystać w wielu programach regeneracji serca i różnych sposobach wstrzykiwania.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w kwestii tego, czy efekty terapeutyczne wynikają z prawidłowego zaangażowania celu.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i standaryzację między laboratoriami dzięki zdefiniowanym protokołom zatapiania, krojenia i obrazowania.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji typu go/no-go poprzez odfiltrowywanie wyników fałszywie dodatnich spowodowanych wstrzyknięciem poza cel, co zwiększa efektywność kapitałową.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju z uwzględnieniem ryzyka, potwierdzając dostarczenie substancji do miejsca docelowego przed zainwestowaniem w kosztowne badania nad wynikami funkcjonalnymi.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie postępowania z tkanką serca, MRI oraz obrazowania fluorescencyjnego w celu dokładnej segmentacji i rekonstrukcji 3D.
- Metoda jest zależna od dostępu do systemów MRI, skanerów o zmiennych trybach pracy oraz oprogramowania do postprocesingu umożliwiającego rejestrację obrazów i modelowanie 3D.
- Niezbędna jest standaryzacja orientacji zatopienia, grubości przekrojów i protokołów barwienia w obrębie zespołów badawczych, aby zapewnić porównywalność danych.
- Adaptacja do różnych systemów modelowych może wymagać dostosowania temperatury zatapiania, kąta cięcia oraz czasu barwienia w zależności od rozmiaru i składu tkanki.
- Ograniczenia praktyczne obejmują deformację tkanki podczas zatapiania oraz konieczność precyzyjnego uchwycenia geometrii w końcowej rozkurczu w celu zachowania wierności anatomicznej.
