Name: Hodowla i knockdown genów za pośrednictwem dwuniciowego RNA u chrząszcza skórnego, Dermestes maculatus (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Poznaj metody RNAi w chrząszczu Dermestes maculatus do badania funkcji genów w embriogenezie i u dorosłych osobników. Technika ta umożliwia analizę biologii rozwoju i ewolucji bez potrzeby pełnego sekwencjonowania genomu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Alison Heffer i Yong Lu za ustawienie aparatu do mikroiniekcji i podzielenie się swoją bezcenną wiedzą i doświadczeniem z RNAi owadów. Prace te były wspierane przez National Institutes of Health (R01GM113230 do L.P.).

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podczas gdy niewielka liczba wyrafinowanych systemów modelowych (myszy, muchy, robaki) została opracowana wXX wieku, w XXIwieku pojawiła się fala nowych systemów zwierzęcych opracowywanych w laboratoriach na całym świecie. Te nowe systemy pozwalają naukowcom na rozwiązywanie porównawczych, ewolucyjnych pytań, których nie można zbadać wyłącznie za pomocą "standardowych" systemów modelowych. To wdrożenie nowych modeli wymaga szybkiego rozwoju metod hodowli laboratoryjnej, identyfikacji genów i podejść...

W 1998 roku Fire i Mello donieśli, że dwuniciowy RNA (dsRNA) może indukować inhibicję funkcji genów u Caenorhabditis elegans1. Odpowiedź ta, wywołana przez dsRNA, została nazwana interferencją RNA (RNAi), a wyciszanie genów zapśredniczone przez RNAi okazało się zachowane u zwierząt, roślin i grzybów2-7. U roślin i niektórych zwierząt RNAi działa systemowo, co oznacza, że efekt może rozprzestrzeniać się na inne komórki/tkanki, do których dsRNA nie został wprowadzony bezpośrednio (przegląd w8-10). Naukowcy wykorzystali tę endogenną komórkową odpowiedź RNAi, projektując cząsteczki dsRNA celujące w interesujące ich geny, co pozwala na wyciszenie (knockdown) funkcji genu bez bezpośredniej manipulacji w genomie (przegląd w11-14).
RNAi jest potężnym narzędziem do badań funkcjonalnych ze względu na następujące zalety. Po pierwsze, dzięki RNAi można celować w gen nawet przy minimalnych informacjach o jego sekwencji. Jest to szczególnie istotne w badaniach organizmów niemodelowych, dla których brakuje danych genomowych lub transkryptomicznych. Po drugie, w organizmach, w których odpowiedź RNAi ma charakter silnie systemowy, wyciszanie genów za pośrednictwem RNAi można przeprowadzać niemal na każdym etapie rozwoju. Cecha ta jest bardzo użyteczna przy badaniu funkcji genów plejotropowych. Po trzecie, w niektórych przypadkach efekty RNAi rozprzestrzeniają się na gonady i potomstwo, tak że fenotypy obserwuje się u potomstwa15,16. Zjawisko to, znane jako rodzicielskie RNAi (pRNAi), jest szczególnie korzystne w przypadku genów wpływających na rozwój embrionalny, ponieważ liczne potomstwo wyprodukowane przez jednego wstrzykniętego rodzica można badać bez bezpośredniej manipulacji jajami. Z tych względów pRNAi jest metodą z wyboru. Jednakże, jeśli pRNAi jest nieskuteczne, na przykład w przypadku genów niezbędnych do oogenezy, należy zastosować embrionalne RNAi (eRNAi). Po czwarte, RNAi może być wykorzystane do wygenerowania odpowiednika serii allelicznej, ponieważ ilość dostarczonego dsRNA można zmieniać w określonym zakresie, aby wywołać defekty od słabych do silnych. Taka gradacja fenotypów może być pomocna w zrozumieniu funkcji genu, gdy jest on zaangażowany w złożony proces i/lub całkowita utrata funkcji jest letalna. Po piąte, dostarczanie dsRNA jest zazwyczaj łatwe i wykonalne, zwłaszcza u zwierząt wykazujących silne systemowe odpowiedzi RNAi. dsRNA można wprowadzić poprzez mikroiniekcję1,5, karmienie/spożycie17,18, namaczanie19,20 oraz dostarczanie za pośrednictwem wirusów/bakterii21,22. Po szóste, w przeciwieństwie do niektórych metod celowania/edycji genów, przy użyciu RNAi nie ma potrzeby przesiewania organizmów niosących mutację ani przeprowadzania krzyżówek genetycznych w celu wygenerowania homozygot. Dlatego w porównaniu z wieloma innymi technikami badania funkcji genów, RNAi jest szybkie, niedrogie i może być stosowane w badaniach przesiewowych na dużą skalę23-25.
Szerokie zastosowanie RNAi umożliwia prowadzenie badań funkcjonalnych w szerokim zakresie organizmów, rozszerzając grupę gatunków dostępnych do badań poza tradycyjne systemy modelowe, dla których opracowano narzędzia genetyczne. Na przykład, badania z wykorzystaniem systemów niemodelowych są niezbędne do uzyskania wglądu w ewolucję genów i sieci genowych poprzez porównanie funkcji ortologów z gatunków reprezentujących różne tryby rozwoju lub wykazujących odmienne cechy morfologiczne26-29. Tego typu badania pozwolą na lepsze zrozumienie różnorodności biologicznej, co wpłynie zarówno na badania stosowane, jak i podstawowe.
Owady, będące największą grupą zwierząt na planecie, dają ogromne możliwości badania mechanizmów leżących u podstaw różnorodności. Ponadto owady są zazwyczaj małe, mają krótkie cykle życiowe, wysoką płodność i są łatwe w hodowli laboratoryjnej. W ciągu ostatnich dwóch dekad metodę RNAi z powodzeniem zastosowano u owadów z różnych rzędów, w tym Diptera (muchówki)5, Lepidoptera (motyle)30, Coleoptera (żukowate)16,31, Hymenoptera (błonkówki: piłkowskrzydłe, osy, mrówki i pszczoły)32, Hemiptera (pluskwiaki), Isoptera (termity)34, Blattodea (karaczany)35, Orthoptera (pasikonikowate: świerszcze, koniki polne, szarańcze i świerszcze)36 oraz Phthiraptera (wszy)37. Skuteczne zastosowanie RNAi dostarczyło danych funkcjonalnych do badań nad wzorcowaniem we wczesnej embriogenezie (oś przednio-tylna32, oś grzbietowo-brzuszna28, segmentacja26,38), determinacją płci39,40, biosyntezą chityny/kutykuli41, sygnalizacją ekdyzonową42, zachowaniami społecznymi43 i wieloma innymi procesami. Metody RNAi opracowane dla różnych gatunków owadów mogą przynieść dodatkowe korzyści, ponieważ prawdopodobnie okażą się przydatne w zwalczaniu szkodników (przegląd w44-46). Efekty RNAi będą specyficzne dla danego genu, jak i gatunku, o ile do celowania zostaną wybrane regiony niezakonserwowane. W przypadku pożytecznych gatunków owadów, takich jak pszczoły miodne i jedwabniki, celowanie w geny niezbędne do przetrwania wirusów lub pasożytów w celu opanowania infekcji może stanowić nową strategię ochrony tych gatunków47,48.
Dermestes maculatus (D. maculatus), znany powszechnie jako chrząszcz skórzany, występuje na całym świecie z wyjątkiem Antarktydy. Jako owad holometaboliczny, cykl życiowy D. maculatus obejmuje stadia embrionalne, larwalne, poczwarki oraz stadium imago (Rycina 1). Ze względu na to, że żywi się on tkanką miękką, D. maculatus jest wykorzystywany w muzeach do szkieletowania martwych zwierząt, a entomolodzy sądowi mogą go wykorzystać do szacowania czasu zgonu49,50. D. maculatus żywi się produktami pochodzenia zwierzęcego, w tym padliną, suszonym mięsem, serem oraz poczwarkami/kokonami innych owadów, powodując tym samym szkody w gospodarstwach domowych, zapasach żywności oraz w przemyśle jedwabniczym, serowarskim i mięsnym 51,52. Zastosowanie RNAi u tego chrząszcza mogłoby zapewnić wydajny i przyjazny dla środowiska sposób na zminimalizowanie jego wpływu gospodarczego. Nasze laboratorium wykorzystało D. maculatus jako nowy model owada do badania segmentacji53. Oprócz podatności na hodowlę laboratoryjną, D. maculatus jest interesujący dla badań podstawowych, ponieważ jest gatunkiem o rozwoju średniozarodkowym (intermediate-germ developer), co czyni go użytecznym gatunkiem do badania przejścia między rozwojem krótkozarodkowym a długozarodkowym.
<img alt="Schemat cyklu życiowego owada: stadia jaja, larwy, poczwarki i osobnika dorosłego wraz z pomiarami skali." src="/files/ftp_upload/54976/54976fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Cykl życiowy D. maculatus. Fotografie D. maculatus w różnych stadiach rozwojowych, zgodnie z oznaczeniami. Cykl życiowy od jaja do osobnika dorosłego trwa trzy tygodnie w 30 °C, lecz dłużej w niższych temperaturach. (A, F) Świeżo złożone embriony są białe lub jasnożółte i owalne, o długości około 1,5 mm. Embriogeneza trwa ~55 hr w 30 °C. (B, C i G) Larwy posiadają ciemno pigmentowane pasy i są pokryte szczecinkami. Larwy przechodzą przez kilka stadiów rozwojowych (instarów) w zależności od środowiska, a ich długość może przekroczyć 1 cm. (D, H) Młode poczwarki są jasnożółte. Poczwarcowanie trwa ~ 5 - 7 dni w 30 °C. (E, I) Krótko po wykluciu na ciele dorosłego chrząszcza pojawia się ciemna pigmentacja. Osobniki dorosłe mogą żyć do kilku miesięcy, a jedna samica może złożyć setki embrionów w ciągu swojego życia. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54976/54976fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Wcześniej wykazaliśmy, że RNAi jest skuteczną metodą wyciszania funkcji genów u D. maculatus53. W niniejszej pracy dzielimy się naszym doświadczeniem w hodowli kolonii D. maculatus w warunkach laboratoryjnych, przedstawiając szczegółowe protokoły przygotowania RNAi zarówno w stadium embrionalnym, jak i u osobników rodzicielskich, a także procedury wstrzykiwania, opieki poiniekcyjnej oraz analizy fenotypowej. Metody wyciszania genów za pośrednictwem dsRNA i metody analizy zaprezentowane w tym opracowaniu nie tylko dostarczają szczegółowych informacji niezbędnych do badania zagadnień dotyczących D. maculatus, ale mają również potencjalne znaczenie dla zastosowania RNAi u innych nie modelowych gatunków chrząszczy i owadów.

<table><tbody><tr><td>Dermestes maculatus żywe chrząszcze</td><td>Nasze laboratorium lub Carolina Biological Supply</td><td>#144168</td><td>Nasz szczep laboratoryjny został zweryfikowany za pomocą kodu kreskowego COI; nie można wykluczyć odmiany szczepu z Karoliny</td></tr><tr><td>Mokrą karmę dla kotów</td><td>Fancy Feast</td><td></td><td>Kawałki mięsa z sosem. Można kupić w większości sklepów z karmą dla zwierząt i sklepach spożywczych</td></tr><tr><td>Sucha karma dla psów</td><td>Purina Puppy Chow</td><td></td><td>Można kupić w większości sklepów z karmą dla zwierząt i sklepach spożywczych</td></tr><tr><td>Klatka na owady (rozmiar średni, 30,5 x 19 x 20,3 cm)</td><td>Exo Terra</td><td>PT2260</td><td>Do utrzymania kolonii. W razie potrzeby można użyć większej klatki</td></tr><tr><td>Klatka na owady (rozmiar mini, 17,8 x 10,2 x 12,7 cm)</td><td>Exo Terra</td><td>PT2250</td><td>Do pobierania zarodków</td></tr><tr><td>szalka Petriego</td><td>VWR</td><td>89038-968</td><td></td></tr><tr><td>Wacik</td><td>Fisher</td><td>22-456-883</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do transkrypcji Megascript T7</td><td>Fisher</td><td>AM1334</td><td>Na 40 reakcji</td></tr><tr><td>Pompa pneumatyczna</td><td>WPI</td><td>PV830</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt kapilarny</td><td>WPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>NARISHIGE</td><td>MN-151</td><td></td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna (90&nbsp; mm)</td> <td>VWR</td><td>28342-010</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik spożywczy (zielony)</td> <td>McCormick</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kapilara ze szkła borokrzemianowego</td><td>Hilgenberg</td><td>1406119</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz igieł (ściągacz do mikropipet)</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko mikroskopowe</td><td>WorldWide Life Sciences Division</td><td>41351157</td><td></td></tr><tr><td>Folia uszczelniająca (Parafilm M)</td><td>Fisher</td><td>13-374-12</td><td></td></tr><tr><td>Model 801 Strzykawka (10&nbsp; &mikro; l)</td><td>Igła Hamilton</td><td>7642-01</td><td></td></tr><tr><td>(rozmiar 32)&nbsp;</td><td>Hamilton</td><td>7762-05</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór utrwalający (Pampel's)</td><td>BioQuip Products, Inc.</td><td>1184C</td><td>Toksyczny, należy obchodzić się z nim pod wyciągiem</td></tr><tr><td>Kleszcz (DUMONT #5)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe (24 x 50 mm, nr 1.5)</td><td>Globe Scientific</td><td>1415-15</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Femtotips Końcówka do pipet do mikroładowarek</td><td>Fisher</td><td>E5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopia preparcyjna do wstrzykiwań zarodków</td><td>Leica</td><td>M420</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopia preparcyjna do wizualizacji fenotypowej larw</td><td>Zeiss</td><td>SteREO Discover. Mikroskopia V12</td><td></td></tr><tr><td>DIC</td><td>Zeiss</td><td>AXIO Imager. M1</td><td></td></tr></tbody></table>

hodowla i knockdown genów za pośrednictwem dwuniciowego rna u chrząszcza skórnego, dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Postępy w genomice zwiększyły możliwość badania różnorodności biologicznej na niespotykaną dotąd skalę. Jednak sama sekwencja nie będzie pouczająca bez narzędzi do badania funkcji genów. Opracowanie i wymiana szczegółowych protokołów tworzenia nowych systemów modelowych w laboratoriach oraz narzędzi do przeprowadzania badań funkcjonalnych ma zatem kluczowe znaczenie dla wykorzystania potencjału genomiki. Coleoptera (chrząszcze) są największym kladem owadów i zajmują praktycznie wszystkie typy siedlisk na planecie. Oprócz zapewnienia idealnych modeli do badań podstawowych, badania nad chrząszczami mogą mieć wpływ na zwalczanie szkodników, ponieważ często są one szkodnikami w gospodarstwach domowych, rolnictwie i przemyśle spożywczym. Przedstawiono szczegółowe protokoły hodowli i utrzymania kolonii laboratoryjnych D. maculatus oraz przeprowadzania interferencji za pośrednictwem dsRNA u D. maculatus. Opisano zarówno procedury embrionalne, jak i rodzicielskie RNAi - w tym ustawienie aparatury, przygotowanie, wstrzyknięcie i rekonwalescencję po wstrzyknięciu. Przedstawiono również metody analizy fenotypów embrionalnych, w tym żywotności, wad wzoru u wyklutych larw oraz preparatów kutykulowych dla niewyklutych larw. Testy te, wraz z hybrydyzacją in situ i barwieniem immunologicznym dla markerów molekularnych, sprawiają, że D. maculatus jest dostępnym systemem modelowym do badań podstawowych i stosowanych. Dostarczają one również przydatnych informacji do ustanawiania procedur w innych powstających systemach modelowania owadów.

Laboratorium autorów wykorzystywało technologię RNAi do badania ewolucji funkcjonalnej genów regulujących segmentację u owadów53,55. Choć wszystkie owady są segmentowane, geny regulujące ten proces wydają się ulec zróżnicowaniu podczas radiacji owadów26,38,56-63. Przesiewy genetyczne u Drosophila pozwoliły zidentyfikować zestaw dziewięciu genów segmentacji typu pair-rule, które odpowiadają za promowanie tworzenia segmentów ciała64-70. W niniejszej...

Tutaj prezentujemy protokoły hodowli chrząszcza pośredniego zarodka, Dermestes maculatus (D. maculatus) w laboratorium. Udostępniamy również protokoły dla embrionalnego i rodzicielskiego RNAi oraz metody analizy fenotypów embrionalnych w celu zbadania funkcji genów u tego gatunku.

Hodowla i knockdown genów za pośrednictwem dwuniciowego RNA u chrząszcza skórnego, Dermestes maculatus

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie funkcji genów w Dermestes maculatus, nowym systemie modelowania owadów, który reprezentuje różnorodny klad chrząszczy i ułatwia badanie podstawowych i stosowanych pytań badawczych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii rozwoju, biologii ewolucyjnej i nie tylko, umożliwiając badanie funkcji genów w zarodkach i osobach dorosłych Derestes. Główną zaletą tej techniki jest to, że interferencja RNA może być wykorzystana do celowania w dowolny gen, opierając się tylko na informacjach o sekwencji, nawet w przypadku braku pełnej sekwencji genomu.Przedstawione tu metody nie tylko zapewniają podejście do badania funkcji genów u Dermestes. Mogą być również stosowane do opracowywania nowych systemów modelowania owadów i potencjalnie do zwalczania szkodników owadzich. Aby przygotować klatkę hodowlaną dla D.maculatus, najpierw rozprowadź cienką warstwę wiórów drzewnych w średniej wielkości klatce dla owadów.Umieść kawałek styropianu w klatce, aby larwy miały środowisko do przepoczwarzania się. Dodaj do klatki od dwudziestu do pięćdziesięciu dorosłych chrząszczy lub larw w późnym stadium rozwojowym. Umieść mokrą karmę dla

rearing-double-stranded-rna-mediated-gene-knockdown-hide-beetle

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

W niniejszym protokole łączymy wyciszanie genów za pomocą RNAi z testem diurezy in vivo, aby zbadać wpływ wyciszenia wybranych genów na wydalanie płynów przez komary.

Wyciszenie genów za pomocą RNAi oraz test diurezy in vivo u dorosłych samic komarów Aedes aegypti

W tym protokole opisujemy dwie strategie, które jednocześnie tłumią dwa geny (podwójny knockdown genu) u pszczół miodnych. Następnie przedstawiamy, jak wykorzystać test odpowiedzi na rozszerzenie trąby (PER) do zbadania wpływu knockdownu podwójnego genu na percepcję smakową pszczoły miodnej.

Pomiar podwójnego knockdownu genu i percepcji smakowej za pośrednictwem RNAi u pszczół miodnych (Apis mellifera)

Podczas gdy karmienie dsRNA u C. elegans jest potężnym narzędziem do oceny funkcji genów, obecne protokoły dla dużych ekranów żywieniowych skutkują zmienną skutecznością eliminacji. Opisujemy ulepszony protokół wykonywania badań przesiewowych karmienia RNAi na dużą skalę, który skutkuje wysoce skutecznym i powtarzalnym obniżeniem ekspresji genów.

Wielkoskalowy knockdown genów u C. elegans przy użyciu bibliotek zasilających dsRNA do generowania odpornych fenotypów utraty funkcji

RNA (RNAi) są podstawą badań nad Tribolium. W tym miejscu przedstawiamy przegląd naszej techniki RNAi larwalnych w Tribolium castaneum. Larwalne RNAi to prosta, ale potężna technika, która zapewnia szybki dostęp do fenotypów utraty funkcji, umożliwiając naukowcom badanie funkcji genów w różnych kontekstach.

Interferencja larwalnego RNA u chrząszcza mącznego (Tribolium castaneum)

Tutaj opisujemy procedurę hamowania funkcji genów u komarów wektorów chorób za pomocą chitozanu/interferujących nanocząsteczek RNA, które są połykane przez larwy.

Wyciszanie genów za pośrednictwem chitozanu/interferujących nanocząstek RNA w larwach komarów wektorów chorób

Interferencja RNA (RNAi) jest niezwykle cennym narzędziem do odkrywania funkcji genów. Jednak zdolność do celowania w geny za pomocą RNAi w stadiach przeddorosłych jest ograniczona w przypadku głównego wektora malarii u ludzi Anopheles gambiae. Opisujemy protokół RNAi w celu zmniejszenia funkcji genu poprzez bezpośrednią iniekcję podczas rozwoju poczwarki.

Dostarczanie RNAi do poczwarek Anopheles gambiae

Tutaj prezentujemy protokół wstrzykiwania jaj świerszczy, technikę, która służy jako podstawowa metoda w wielu eksperymentach na świerszczu, w tym, ale nie tylko, interferencji RNA i manipulacji genomem.

Wstrzykiwanie jaj Gryllus bimaculatus

Interferencja RNA jest szeroko stosowaną, potężną techniką manipulowania ekspresją genów na określonych etapach rozwoju. Tutaj opisujemy niezbędne kroki do wdrożenia tej techniki u wodnego chrząszcza nurkującego Thermonectus marmoratus, od nabycia sekwencji genów po knockdown genów wpływających na strukturę lub zachowanie.

Interferencja RNA u chrząszczy wodnych jako potężne narzędzie do manipulowania ekspresją genów w określonych punktach rozwojowych

Udostępniamy szczegółowy protokół interferencji RNA za pośrednictwem elektroporacji u owadów z rzędu Odonata (ważki i ważki) przy użyciu ważki niebieskoogoniastej (Ischnura senegalensis: Coenagironidae: Zygoptera) i ważki srokatej (Pseudothemis zonata: Libellulidae: Anisoptera).

Metoda interferencji RNA za pośrednictwem elektroporacji w Odonata

Prezentowany tutaj jest protokół mikroiniekcji zarodka Helicoverpa armigera (Hübner) i identyfikacji mutantów nokautujących, stworzony przez edycję genomu CRISPR/Cas9. Zmutowane owady umożliwiają dalsze badania funkcji genów i interakcji między różnymi genami in vivo.

Mikroiniekcja zarodka i identyfikacja mutanta nokautującego Helicoverpa armigera z edytowanym genomem CRISPR/Cas9 (Hübner)

Niniejszy protokół opisuje krok po kroku wytyczne dotyczące technik działania RNAi w P. americana.

Zastosowania interferencji RNA u karalucha amerykańskiego

Poznaj metody RNAi w chrząszczu Dermestes maculatus do badania funkcji genów w embriogenezie i u dorosłych osobników. Technika ta umożliwia analizę biologii rozwoju i ewolucji bez potrzeby pełnego sekwencjonowania genomu.

Hodowla i knockdown genów za pośrednictwem dwuniciowego RNA u chrząszcza skórnego, Dermestes maculatus

Przeglądaj więcej filmów