Hodowla i knockdown genów za pośrednictwem dwuniciowego RNA u chrząszcza skórnego, Dermestes maculatus
28 grudnia 2016
Tutaj prezentujemy protokoły hodowli chrząszcza pośredniego zarodka, Dermestes maculatus (D. maculatus) w laboratorium. Udostępniamy również protokoły dla embrionalnego i rodzicielskiego RNAi oraz metody analizy fenotypów embrionalnych w celu zbadania funkcji genów u tego gatunku.
Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie funkcji genów w Dermestes maculatus, nowym systemie modelowania owadów, który reprezentuje różnorodny klad chrząszczy i ułatwia badanie podstawowych i stosowanych pytań badawczych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii rozwoju, biologii ewolucyjnej i nie tylko, umożliwiając badanie funkcji genów w zarodkach i osobach dorosłych Derestes. Główną zaletą tej techniki jest to, że interferencja RNA może być wykorzystana do celowania w dowolny gen, opierając się tylko na informacjach o sekwencji, nawet w przypadku braku pełnej sekwencji genomu.
Przedstawione tu metody nie tylko zapewniają podejście do badania funkcji genów u Dermestes. Mogą być również stosowane do opracowywania nowych systemów modelowania owadów i potencjalnie do zwalczania szkodników owadzich. Aby przygotować klatkę hodowlaną dla D.maculatus, najpierw rozprowadź cienką warstwę wiórów drzewnych w średniej wielkości klatce dla owadów.
Umieść kawałek styropianu w klatce, aby larwy miały środowisko do przepoczwarzania się. Dodaj do klatki od dwudziestu do pięćdziesięciu dorosłych chrząszczy lub larw w późnym stadium rozwojowym. Umieść mokrą karmę dla kotów na szalce Petriego lub łódce do ważenia jako źródło pożywienia.
Przykryj klatkę siatkową szmatką i umieść ją w inkubatorze. Przed rozpoczęciem pobierania zarodków należy najpierw dokładnie sprawdzić, czy w klatce nie ma zarodków i usunąć je. Gdy klatka jest czysta, umieść w niej rozciągnięty wacik i inkubuj kolonię w temperaturze 30 stopni Celsjusza.
Po upływie odpowiedniego czasu zbierz wacik i usuń wszystkie obecne osoby dorosłe, a następnie umieść je z powrotem w klatce. Na kawałku czarnego papieru budowlanego delikatnie ściśnij wacik i powoli rozerwij go na cienkie włókno, tak aby obecne jajka spadły na papier. Weź standardową pokrywkę szalki Petriego i użyj kawałka czarnej bibuły filtracyjnej, aby przykryć wnętrze.
Przyklej kawałek taśmy dwustronnej wzdłuż krawędzi standardowego szkiełka mikroskopowego. Umieść szkiełko mikroskopowe na czarnej bibule filtracyjnej w pokrywie szalki Petriego. Biorąc papier zawierający pobrane zarodki, delikatnie postukaj, aby przenieść zarodki na pokrywę szalki Petriego.
Za pomocą pędzla wyrównaj zarodki na taśmie prostopadle do szkiełka, z przednim lub tylnym końcem w kierunku krawędzi. Aby rozpocząć RNAi, najpierw nabierz 2-4 mikrolitry dsRNA do 20-mikrolitrowej końcówki do pipety z mikroładowarką. Włóż końcówkę do wstępnie naciągniętej szklanej kapilary, zwanej igłą, i delikatnie odpipetuj roztwór do igły.
Zamocuj igłę w szklanym uchwycie kapilarnym, a następnie zamontuj uchwyt kapilarny w mikromanipulatorze. Następnie ostrożnie przenieś szkiełko z przymocowanymi zarodkami na stolik mikroskopu preparacyjnego. Przesuń szkiełko, aby umieścić jeden zarodek na środku pola i ustaw ostrość mikroskopu.
Patrząc w lunetę sekcyjną, ustaw końcówkę kapilary za pomocą mikromanipulatora. Zbliż końcówkę do końca pierwszego zarodka w rzędzie. Włącz dopływ azotu lub powietrza, a następnie ustaw przełącznik wyboru wejścia elektromagnesu na podciśnienie.
Ustaw regulator ciśnienia wyrzutu na 10-15 psi, w zależności od aparatu. Otwórz kapilarę, a kolorowy roztwór dsRNA wypełni końcówkę, gotową do wstrzyknięcia. Przesuń końcówkę naczynia włosowatego do przodu i delikatnie nakłuj zarodek.
Przy idealnych ustawieniach ciśnienia żaden płyn embrionalny nie wpłynie do naczynia włosowatego. Naciśnij przełącznik nożny, aby wyrzucić dsRNA do zarodka, aż do podania odpowiedniej ilości. Pozostaw końcówkę wewnątrz zarodka na około dwie sekundy, a następnie ostrożnie ją usuń.
Po wstrzyknięciu wszystkich zarodków umieścić szkiełko na szalce Petriego. Dodaj mokry wacik do naczynia, uważając, aby nie zetknął się ze szkiełkiem. Przykryj szalkę Petriego i owiń ją folią uszczelniającą.
Oznacz go typem dsRNA, stężeniem, datą, godziną i liczbą wstrzykniętych zarodków. Na koniec umieść naczynie w inkubatorze w temperaturze 30 stopni Celsjusza, aż wyklują się zarodki. Aby wykonać pRNAi, najpierw zbierz poczwarki z kolonii.
Posortuj poczwarki samca i samicy do dwóch oddzielnych naczyń i umieść je w inkubatorze o temperaturze 30 stopni Celsjusza. Codziennie sprawdzaj płytki pod kątem zamkniętych chrząszczy i przenieś te osobniki na dwie oddzielne szalki Petriego dla dorosłych samców i samic. Karmić te dorosłe osobniki i utrzymywać płytki co drugi dzień, aż do momentu, gdy wystarczająca liczba dorosłych osobników zostanie zamknięta, aby rozpocząć wstrzykiwanie.
Gdy basen dla dorosłych jest kompletny, znieczul samicę chrząszcza i przytrzymaj pojedynczą brzuszną stronę do góry jedną ręką, trzymając strzykawkę w drugiej. Delikatnie przeniknąć przez błonę segmacoria między sternitami 2 i 3. Sprawdź skalę strzykawki i powoli dozuj około dwóch mikrolitrów na samicę.
Po wstrzyknięciu należy przytrzymać igłę nieruchomo przez co najmniej 5 sekund, a następnie ostrożnie ją wyjąć. Przenieś wstrzyknięte samice na szalkę Petriego z karmą dla kotów. Odpowiednio oznacz danie.
Umieść naczynie w inkubatorze o temperaturze 30 stopni Celsjusza. Po 24 godzinach przenieś samice, którym wstrzyknięto zastrzyk, do mini klatki i dodaj równą liczbę młodych samców, którym nie wstrzyknięto szczepionki. Oznacz klatkę i dodaj karmę dla kotów.
Umieść klatkę w inkubatorze o temperaturze 30 stopni Celsjusza, aby umożliwić krycie. Powstałe w ten sposób potomstwo można następnie zbadać w celu określenia skutków działania pRNAi. Zdjęcie przedstawia potomstwo osobnika pRNAi, któremu wstrzyknięto DS GFP, białko zielonej fluorescencji jako kontrolę.
Tutaj, podobnie jak w przypadku osobników typu dzikiego, potomstwo wykluwało się z jednym pigmentowanym paskiem na segment. Sąsiadujące ze sobą barwione paski oddzielone były niepigmentowaną szczeliną. Po sparowanych pRNAi, dotknięte chorobą potomstwo wykluło się ze zrośniętymi sąsiednimi pigmentowanymi paskami, wskazującymi na wadliwe granice segmentów.
Nasilenie fenotypowe było zmienne, ale fuzje konsekwentnie pojawiały się w pewnych regionach granicznych, co wskazuje na regułę par, taką jak defekty. Podobnie, fenotypy kutykuli niewyklutych zarodków po sparowanym knockdown wykazały utratę segmentów brzusznych, a także skrócenie długości ciała. Barwienie wczesnych zarodków przeciwciałem w celu zbadania defektów molekularnych wykazało paski ekspresji o jednakowej intensywności w każdym segmencie u osób kontrolnych.
W przeciwieństwie do tego, zmniejszoną ekspresję wykryto w naprzemiennych paskach u potomstwa samic z wstrzykniętym sparowanym Dmac dsRNA. Ten wzorzec zmniejszonej ekspresji jest zgodny z wadliwym wzorem naskórka obserwowanym u dotkniętych chorobą wyklutych larw. Tutaj po raz pierwszy przedstawiamy nasz protokół niszczenia interesującego genu, podczas wczesnego rozwoju embrionalnego u Dermestes maculatus, za pomocą interferencji RNA.
Podejmując się tych zabiegów, należy pamiętać o wykorzystaniu zarodków lub dorosłych samic na odpowiednim etapie. Po opanowaniu wstrzyknięcia około 100 zarodków lub 10 dorosłych kobiet można wykonać w ciągu pół godziny. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak barwienie zarodków lub ilościowy PCR, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące mechanizmów regulacji genów.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak założyć kolonię laboratoryjną Dermestes i przeprowadzić zarówno embrionalną, jak i rodzicielską interferencję RNA u tego chrząszcza. Obecnie tylko niewielka liczba modeli owadów jest dostępna do badań funkcjonalnych. Przedstawione tu techniki torują naukowcom drogę do wykorzystania Dermestes jako systemu modelowego, rozszerzając zakres owadów podatnych na molekularną analizę genetyczną.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokoły dotyczące wychowu chrząszcza Dermestes maculatus w warunkach laboratoryjnych. Zawiera również szczegóły dotyczące metod interferencji RNA (RNAi) embrionalnej i rodzicielskiej oraz analizowanie fenotypów embrionalnych w celu badania funkcji genów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia rozwojowa
- Biologia ewolucyjna
- Systemy modelowe owadów
Tło
- Dermestes maculatus to nowy system modelowy owadów.
- Ten gatunek reprezentuje zróżnicowaną klasę chrząszczy.
- Badanie umożliwia zaawansowane i zastosowane pytania badawcze.
- Interferencja RNA może mieć na celu dowolny gen na podstawie informacji sekwencyjnych.
Cel badania
- Aby zbadać funkcję genu w Dermestes maculatus.
- Aby umożliwić testowanie funkcji genu w embrionach i dorosłych osobnikach.
- Aby opracować nowe systemy modelowe owadów i kontrolować szkodniki.
Zastosowane metody
- Protokoły dotyczące wychowu Dermestes maculatus.
- Techniki interferencji RNA embrionalnej i rodzicielskiej.
- Metody analizy fenotypów embrionalnych.
- Przygotowanie klatek wychowowych za pomocą wiórek drewnianych.
Główne wyniki
- Udane wychowanie Dermestes maculatus w warunkach laboratoryjnych.
- Skuteczna technika RNAi do badania funkcji genów.
- Wgląd w biologię rozwojową i ewolucjonistyczną.
- Potencjalne zastosowania w strategiach kontroli szkodników.
Wnioski
- Dermestes maculatus służy jako wartościowy model do badań nad funkcją genów.
- Metody można dostosować do innych gatunków owadów.
- Wyniki badań przyczyniają się do lepszego zrozumienia biologii owadów.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Double-stranded RNA-mediated gene knockdown in Dermestes maculatus enables functional genomics in a previously underutilized beetle model, expanding the toolkit for target validation in insect systems. This approach supports early-stage discovery by allowing direct interrogation of gene function based solely on sequence data, even in the absence of a full genome. The protocol's adaptability positions it as a reusable capability for both basic research and translational applications in pest management and model system development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables hypothesis-driven gene function testing in a new insect model.
- Supports biological de-risking by clarifying gene roles in development and patterning.
- Facilitates predictive confidence in target selection through observable phenotypic outcomes.
Screening & Assay Development
- Prepares validated beetle systems for downstream genetic and phenotypic assays.
- Standardizes RNAi delivery and phenotype scoring for reproducibility across experiments.
- Generates quantitative outputs such as viability and patterning defects for comparative analysis.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker discovery by enabling molecular marker analysis post-knockdown.
- Provides continuity from gene perturbation to phenotype, supporting risk-adjusted advancement decisions.
- Offers mechanistic de-risking for pest control strategies by linking gene function to observable traits.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery continuum from early gene function interrogation to preclinical model development, supporting both target validation and translational research in insect systems.
- Discovery Biology: Facilitates null hypothesis testing and pathway clarification via targeted gene knockdown.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative phenotypic readouts for assay development.
- Analytics: Enables statistical comparison of viability, patterning, and molecular marker expression.
- Translational Research: Connects gene perturbation to biomarker analysis, supporting preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Protocols are adaptable to other emerging insect models, broadening R&D impact.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in gene function studies.
- Operational Value: Standardizes rearing, injection, and analysis workflows for scalability and reproducibility.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by enabling early de-risking.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets and model systems for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in insect handling, microinjection, and phenotypic analysis.
- Needs access to dissecting microscopes, micromanipulators, and molecular marker assays.
- Demands cross-team standardization for injection protocols and phenotype scoring.
- Adaptable to other insect models with consideration for species-specific rearing and injection parameters.
- Limitations include the need for precise staging and handling to ensure reproducibility and data quality.
