Name: Wiarygodna identyfikacja żywych neuronów dopaminergicznych w hodowlach śródmózgowia przy użyciu sekwencjonowania RNA i ekspresji eGFP sterowanej przez promotor TH (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: Poznaj metodę identyfikacji żywych neuronów dopaminergicznych w hodowlach śródmózgowia myszy przy użyciu ekspresji eGFP sterowanej przez promotor TH oraz sekwencjonowania RNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z U.S. National Institutes of Health (DA017279, AG033954, DA037743), Fundacji Michaela J. Foxa oraz Caltech Innovation Initiative finansującej Millard and Muriel Jacobs Genetics and Genomics Laboratory w California Institute of Technology. Dziękujemy Brianowi Williamsowi za optymalizację protokołu bibliotecznego RNA-Seq i za udzielenie pomocy. Dziękujemy Henry'emu Amrheinowi za szkolenie obliczeniowe. Dziękujemy Barbarze J. Will za udostępnienie sprzętu i przestrzeni laboratoryjnej. Dziękujemy Igorowi Antoszeczkinowi za sekwencjonowanie biblioteki i zarządzanie obiektem.

<ol><li>Henley, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+by+nicotine+in+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation by nicotine in dopaminergic neurons.</a> Biochem Pharmacol. 86 (8), 1074-1083 (2013).</li>
<li>Marinov, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+single-cell+to+cell-pool+transcriptomes%3A+stochasticity+in+gene+expression+and+RNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">From single-cell to cell-pool transcriptomes: stochasticity in gene expression and RNA splicing.</a> Genome Res. 24 (3), 496-510 (2014).</li>
<li>Kim, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptome+analysis+reveals+dynamic+changes+in+lncRNA+expression+during+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptome analysis reveals dynamic changes in lncRNA expression during reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 16 (1), 88-101 (2015).</li>
<li>Ramskold, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-length+mRNA-Seq+from+single-cell+levels+of+RNA+and+individual+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells.</a> Nat Biotechnol. 30 (8), 777-782 (2012).</li>
<li>Gertz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposase+mediated+construction+of+RNA-seq+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Transposase mediated construction of RNA-seq libraries.</a> Genome Res. 22 (1), 134-141 (2012).</li>
<li>Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis of single cells.</a> J Vis Exp. (50), (2011).</li>
<li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+gene+and+transcript+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+TopHat+and+Cufflinks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.</a> Nat Protoc. , 562-578 (2012).</li>
<li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smoking-Relevant+Nicotine+Concentration+Attenuates+the+Unfolded+Protein+Response+in+Dopaminergic+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Smoking-Relevant Nicotine Concentration Attenuates the Unfolded Protein Response in Dopaminergic Neurons.</a> The Journal of Neuroscience. 36 (1), 65-79 (2016).</li>
<li>Henderson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Menthol+Alone+Upregulates+Midbrain+nAChRs%2C+Alters+nAChR+Subtype+Stoichiometry%2C+Alters+Dopamine+Neuron+Firing+Frequency%2C+and+Prevents+Nicotine+Reward%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Menthol Alone Upregulates Midbrain nAChRs, Alters nAChR Subtype Stoichiometry, Alters Dopamine Neuron Firing Frequency, and Prevents Nicotine Reward.</a> J Neurosci. 36 (10), 2957-2974 (2016).</li>
<li>Gong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+expression+atlas+of+the+central+nervous+system+based+on+bacterial+artificial+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes.</a> Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).</li>
<li>Kim, J., Henley, B. M., Kim, C. H., Lester, H. A., Yang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incubator+embedded+cell+culture+imaging+system+%28EmSight%29+based+on+Fourier+ptychographic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Incubator embedded cell culture imaging system (EmSight) based on Fourier ptychographic microscopy.</a> Biomed Opt Express. (8), 3097-3110 (2016).</li>
<li>Lammel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+transgenic+mouse+models+for+selective+targeting+of+midbrain+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Diversity of transgenic mouse models for selective targeting of midbrain dopamine neurons.</a> Neuron. 85 (2), 429-438 (2015).</li>
<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).</li>
<li>Dryanovski, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+entry+and+alpha-synuclein+inclusions+elevate+dendritic+mitochondrial+oxidant+stress+in+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Calcium entry and alpha-synuclein inclusions elevate dendritic mitochondrial oxidant stress in dopaminergic neurons.</a> J Neurosci. 33 (24), 10154-10164 (2013).</li>
<li>Kimm, T., Khaliq, Z. M., Bean, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Regulation+of+Action+Potential+Shape+and+Burst-Frequency+Firing+by+BK+and+Kv2+Channels+in+Substantia+Nigra+Dopaminergic+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential Regulation of Action Potential Shape and Burst-Frequency Firing by BK and Kv2 Channels in Substantia Nigra Dopaminergic Neurons.</a> J Neurosci. 35 (50), 16404-16417 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Tutaj izolujemy pojedyncze komórki z niejednorodnej populacji za pomocą znacznika fluorescencyjnego, a następnie badamy każdą komórkę za pomocą sekwencji RNA pojedynczej komórki. Donosimy, że 100% żywych komórek TH-eGFP, które zebraliśmy i zsekwencjonowaliśmy, były rzeczywiście neuronami dopaminergicznymi, w oparciu o obecność następujących trzech transkryptów genów związanych z DA, TH, DDC i slc6a3. Wszystkie komórki TH-eGFP dodatnie wykazywały ekspresję tych trzech genów, co oceniano za pomocą RNA-Seq. Było to zgodne z...

Choroba Parkinsona (PD) jest nieuleczalną, związaną z wiekiem chorobą neurodegeneracyjną. Przyczyna tego stosunkowo powszechnego zaburzenia pozostaje słabo poznana. Dochodzi do rozległej utraty neuronów w całym mózgu, z wyraźną degeneracją neuronów dopaminergicznych w istocie czarnej (SNc), co prowadzi do diagnostycznych cech klinicznych bradykinezji, sztywności i drżenia.
Pierwotne mieszane kultury zawierające neurony dopaminergiczne SNc są szczególnie istotne dla choroby Parkinsona. Neurony dopaminergiczne brzusznego obszaru nakrywki (VTA) są zaangażowane w nagrodę i uzależnienie. Pierwotne mieszane kultury embrionalne brzusznego śródmózgowia (VM) zawierają zarówno neurony dopaminergiczne (DA) SNc i VTA, jak i neurony GABA-ergiczne. Hodowle pierwotne VM mogą być przydatne do testów neuroprotekcyjnych i wyjaśnienia selektywnej wrażliwości neuronów dopaminergicznych. Nie ma wiarygodnego sposobu identyfikacji komórek dopaminergicznych w hodowli na podstawie morfologii. Tutaj opracowujemy techniki identyfikacji i pozyskiwania pojedynczych neuronów dopaminergicznych oraz konstruujemy jednokomórkowe biblioteki sekwencjonowania RNA o wysokiej wydajności.
Raportujemy reprezentatywne dane transkryptomu RNA dla pojedynczych neuronów dopaminergicznych i GABA-ergicznych wyizolowanych z kultur śródmózgowia. Protokół ten może być stosowany do neuroprotekcji, neurodegeneracji i testów farmakologicznych w celu zbadania wpływu różnych metod leczenia na transkryptom DA / GABA. Ponieważ neurony dopaminergiczne stanowią niewielką mniejszość neuronów ulegających ekspresji w pierwotnych kulturach VM, zdolność do wiarygodnej identyfikacji tych neuronów w żywych kulturach umożliwi rozszerzony zakres badań jednokomórkowych. Te nowatorskie techniki ułatwią postęp w zrozumieniu mechanizmów zachodzących na poziomie komórkowym i mogą mieć zastosowanie w innych dziedzinach neuronauki i biologii molekularnej.

<table><tbody><tr><td>Korporacja</td><td>Biochemiczna Papaina Worthington&nbsp;</td><td></td><td></td>LS003126</tr><tr><td>Roztwór soli zbalansowany przez Hanksa (HBSS), 1x</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Surowica dla koni od dawców</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>SH30074.03</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A7030-50G</td><td></td></tr><tr><td>Medium: Podłoże neuropodstawowe</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Pożywki hodowlane zawierające stabilizowaną formę L-glutaminy, L-alanylo-L-glutaminy: GlutaMAX Gibco</td><td>&nbsp;</td><td>35050-061</td><td>0,5 mM stężenie końcowe.</td></tr><tr><td>Kwas L-askorbinowy</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A7506</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>17504-044</td><td>50x roztwór podstawowy, 1x stężenie końcowe.</td></tr><tr><td>Naczynia ze szklanym dnem 35 mm</td><td>MatTek&nbsp; &nbsp;</td><td>P35GC-1.5-10-C</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-Ornityna</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>L2020</td><td>Przechowywany w temperaturze -20 & deg; C w 20 i mikro; L podwielokrotności</td></tr><tr><td>Deoksyrybonukleaza I (DNaza)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Niebieskie końcówki do pipet P1000</td><td>Sorenson Bioscience</td><td>&nbsp;Inc. 10130</td><td></td></tr><tr><td>płytka szalka Petriego 10 mm</td><td>VWR&nbsp;</td><td>25384-324</td><td></td></tr><tr><td>37 &deg; C Łaźnia</td><td></td><td></td><td></td>wodna</tr><tr><td>37 & deg; C, inkubator</td><td></td><td></td><td></td>wilgotności 5%</tr><tr><td>16% paraformaldehyd (PFA)</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki&nbsp;</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>&nbsp; X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Serum osła</td><td>Equitech&nbsp;</td><td>SD-0100HI</td><td>100% roztwór podstawowy, 1% stężenie końcowe.</td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne o standardowym wzorze</td><td>Fine Science Tools</td><td>14000-14</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze - 2x3 zęby</td><td>Narzędzia do nauki</td> o wysokiej jakości <td>11022-14</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze - Dumont #55</td><td>Narzędzia do nauki pięknej</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze - Dumont #5</td><td>Narzędzia do nauki o naprawie</td><td>11252-23</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS, pH 7,4</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Roztwór buforowany fosforanami (DPBS) 1x</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>21 G</td><td>Igła BD PrecisionGlide</td><td>305167</td><td>100 igieł</td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter Instrument</td><td>model P-87</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator&nbsp;</td><td>Instrument Suttera</td><td>&nbsp; Zestaw do sekwencjonowania MP-285</td><td></td></tr><tr><td>: Zestaw SMARTer Ultra Low RNA do sekwencjonowania Illumina</td><td>Clontech</td><td>634936</td><td>100 rnxs, w tym oligonukleotyd Advantage2PCR Kit</td></tr><tr><td>(12 i mikro; M): Oligonukleotyd SMARTer IIA (12 &mikro; m)</td><td></td><td></td> <td>Z zestawu SMARTer&nbsp;</td></tr><tr><td>Odwrotna transkryptaza (100 jednostek)</td><td>Odwrotna transkryptaza</td><td></td><td>SMARTcribe z zestawu SMARTer&nbsp;</td></tr><tr><td>Podkład 1</td><td>3' Podkład CDSIIa&nbsp;</td><td></td><td>Z zestawu SMARTer Kit</td></tr><tr><td>Primer 2</td><td>IS Starter</td><td></td> PCR <td>Z zestawu SMARTer Kit</td></tr><tr><td>50x 2 mieszanina polimeraz</td><td>50x Mieszanka polimeraz</td><td></td> Advantage 2 <td>Z zestawu SMARTer</td></tr><tr><td>10x bufor PCR</td><td>10x Bufor</td><td></td> do PCR <td>Advantage 2 Z zestawu SMARTer</td></tr><tr><td>Kolce RNA Stojak chłodzący</td><td>ThermoFisher</td><td>4456740</td><td></td></tr><tr><td>PCR</td> Stojak chłodzący <td>IsoFreeze PCR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do przygotowania próbki DNA&nbsp;</td><td>(Illumina/Nextera) Nexter</td><td>FC-121-1030</td><td>24 próbki</td></tr><tr><td>PCR master mix</td><td>Nextera PCR master mix (NPM)</td><td></td><td>Z zestawu Nextera&nbsp;</td></tr><tr><td>Koktajl starterowy PCR (PPC)&nbsp;</td><td>Koktajl starterowy Nextera PCR (PPC)&nbsp;</td><td></td><td>Z zestawu Nextera</td></tr><tr><td>Fluorometr</td><td>Zestaw Qubit ThermoFisher</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>HS DNA BioAnalyzer</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td>110 rxns</td></tr><tr><td>System elektroforezy&nbsp;</td><td>Bioanalizator Agilent 2100.</td><td>G2938C</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki magnetyczne: Agencourt AMPure&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>Chusteczka do usuwania RNA: Chusteczki RNAse Zap</td><td>Ambion</td><td>AM9786</td><td>Rozmiar 100 arkuszy</td></tr><tr><td>Zestaw testowy Qubit ds HS</td><td>Sondy molekularne&nbsp;</td><td>Q32854</td><td>500 testy</td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji żelu: Zestaw do ekstrakcji żelu Qiaquick</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Szklana rurka kapilarna</td> <td>(Kimax-51, 1,5 - 1,8 mm średn.)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige (lub odpowiednik)&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sekwencer</td><td>Instrument Illumina HiSeq</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GENSAT hydroksylaza tyrozynowa-eGFP szczep myszy&nbsp;</td><td></td><td>Numer seryjny MMRRC: 000292-UNC</td><td>Stock Tg(Th-EGFP)DJ76Gsat/Regionalne Centrum Badawcze Mutant Mouse</td></tr></tbody></table>

wiarygodna identyfikacja żywych neuronów dopaminergicznych w hodowlach śródmózgowia przy użyciu sekwencjonowania rna i ekspresji egfp sterowanej przez promotor th

Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression

W chorobie Parkinsona (PD) występuje rozległa utrata neuronów w całym mózgu z wyraźną degeneracją neuronów dopaminergicznych w SNc, co prowadzi do bradykinezji, sztywności i drżenia. Identyfikacja żywych neuronów dopaminergicznych w pierwotnych hodowlach brzusznego śródmózgowia (VM) przy użyciu markera fluorescencyjnego zapewnia alternatywny sposób badania selektywnej wrażliwości tych neuronów bez polegania na barwieniu immunologicznym utrwalonych komórek. Tutaj izolujemy, dysocjujemy i hodujemy mysie neurony VM przez 3 tygodnie. Następnie identyfikujemy neurony dopaminergiczne w kulturach za pomocą fluorescencji eGFP (napędzanej przez promotor hydroksylazy tyrozyny (TH)). Pojedyncze neurony są zbierane do probówek mikrowirówkowych za pomocą szklanych mikropipet. Następnie poddajemy lizie zebrane komórki i przeprowadzamy syntezę cDNA oraz "tagmentację" za pośrednictwem transpozonów, aby wytworzyć biblioteki RNA-Seq pojedynczej komórki1,2,3,4,5. Po przejściu kontroli jakości, biblioteki jednokomórkowe są sekwencjonowane, a następnie przeprowadzana jest analiza w celu zmierzenia ekspresji genów. Przedstawiamy wyniki transkryptomu dla poszczególnych neuronów dopaminergicznych i GABA-ergicznych wyizolowanych z kultur śródmózgowia. Donosimy, że 100% żywych komórek TH-eGFP, które zostały zebrane i zsekwencjonowane, było neuronami dopaminergicznymi. Techniki te będą miały szerokie zastosowanie w neuronauce i biologii molekularnej.

W niniejszej pracy przedstawiamy protokół hodowli neuronów brzusznej części śródmózgowia od myszy wykazującej ekspresję eGFP sterowaną przez sekwencję promotora hydroksylazy tyrozynowej, izolowania pojedynczych fluorescencyjnych neuronów z hodowli oraz pomiaru ich transkryptomu RNA przy użyciu metody RNA-seq (Rysunek 1). Dane wykazały, że 100% izolowanych i sekwencjonowanych komórek dodatnich dla TH-eGFP stanowiły neurony dopaminergiczne, co stwierdzono na podstawie obecn...

W chorobie Parkinsona (PD) neurony dopaminergiczne istoty czarnej (SNc) ulegają degeneracji, co prowadzi do dysfunkcji motorycznej. W tym miejscu przedstawiamy protokół hodowli neuronów brzusznej części śródmózgowia od myszy wyrażającej eGFP napędzany sekwencją promotora hydroksylazy tyrozyny (TH), zbierania pojedynczych neuronów fluorescencyjnych z kultur i pomiaru ich transkryptomu za pomocą sekwencji RNA.

Wiarygodna identyfikacja żywych neuronów dopaminergicznych w hodowlach śródmózgowia przy użyciu sekwencjonowania RNA i ekspresji eGFP sterowanej przez promotor TH

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, ...

Ogólnym celem tej procedury jest wiarygodna identyfikacja żywych neuronów dopaminergicznych w hodowlach śródmózgowia przy użyciu ekspresji eGFP sterowanej hydroklazą tyrozyny, zbierania pojedynczych komórek i generowania biblioteki sekwencjonowania RNA. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie choroby Parkinsona i uzależnienia od narkotyków, ponieważ umożliwia przeprowadzanie ekspresji genów i testów elektrofizjologicznych na zidentyfikowanych żywych neuronach dopaminergicznych w hodowli. Zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona środki do niezawodnej identyfikacji żywych, a nie stałych neuronów dopaminergicznych w pierwotnych brzusznych kulturach śródmózgowia.Pierwszą część procedury zademonstruje Charlene Kim, technik z laboratorium Henry'ego Lestera. Zacznij od ustabilizowania głowy zarodka myszy za pomocą kleszczy mocno umieszczonych na pysku, tak aby powierzchnia grzbietowa była dostępna. Za pomocą kleszczy trzymanych w drugiej ręce uszczypnij warstwę skóry i czaszkę tuż przed grzbietem śródmózgowia i oderwij skórę i czaszkę wzdłuż linii środkowej.Umieść kleszcze wokół grzbietu, jedną końcówką między korą a mezonfalonem, a drugą nad móżdżkiem. Ściśnij i usuń całe śródmózgowie. Umieść śródmózgowie na szalce Petriego z zimnym HBSS pod mikroskopem preparacyjnym.Pod mikroskopem preparacyjnym odwróć segment mózgu tak, aby strona brzuszna była teraz dostępna. Widoczne są teraz cztery ćwiartki. Usuń wszystkie opony mózgowe i naczynia krwionośne, delikatnie chwytając opony mózgowe kleszczami i ciągnąc w górę od mózgu.Następnie umieść jeden szczypiec kleszczowych w komorze mniej więcej pośrodku segmentu. Następnie, aby oddzielić śródmózgowie, uszczypnij grzbietowo, a następnie uszczypnij przyśrodkowo z każdej strony. Weź dwie dolne ćwiartki, wykonując boczne nacięcia po obu stronach.Brzuszny obszar nakrywki i istota pars compacta znajdują się w brzusznej dolnej części, która wydaje się gęsta. Wypreparowaną tkankę zawierającą zarówno VTA, jak i SNC umieścić w świeżym HBSS w oddzielnym obszarze szalki Petriego. Po wycięciu wszystkich segmentów mózgu użyj kleszczy i skalpela numer 11, aby poćwiartować każdą sekcję śródmózgowia na kawałki o mniej więcej równej wielkości.Następnie użyj końcówki pipety P1000 o szerokim otworze, aby przenieść wszystkie poćwiartowane segmenty śródmózgowia do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów. Po pozostawieniu tkanki do ustabilizowania się i usunięciu HBSS dodaj 500 mikrolitrów roztworu papainy. Inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut.Po inkubacji użyj końcówki P1000 o szerokim otworze, aby przenieść tylko segmenty śródmózgowia do jednomililitrowej porcji roztworu DNazy I i pozwól segmentom osiąść na dnie probówki. Następnie przenieś tylko segmenty śródmózgowia do 15-mililitrowej rurki zawierającej jeden mililitr roztworu zimnego stopu. Zastąp drugie płukanie jednym mililitrem świeżego roztworu zatrzymującego i pipetuj siedem razy w górę iw dół za pomocą końcówki pipety P1000, aby rozcierać komórki.Następnie ułóż zawiesinę komórek, powoli pipetując 200 mikrolitrów 4% roztworu BSA na dno probówki. Po odwirowaniu przy 280 x g przez sześć minut, odessać supernatant za pomocą P1000 i ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze pożywki galwanicznej. Wykonaj zliczanie komórek za pomocą hemocytometru, a następnie rozcieńczyć zawiesinę komórek do 1000 komórek na mikrolitr za pomocą pożywki galwanicznej.Umieść 120 mikrolitrów zawiesiny komórkowej na szalkach hodowlanych pokrytych poli-D-lizyną, poli-L-ornityną i lamininą natychmiast po aspiracji lamininy, aby upewnić się, że powłoka nie wyschnie i nie utworzy nierównej powierzchni. Następnie, po godzinie inkubacji, ostrożnie dodaj trzy mililitry pożywki hodowlanej do nieobsianego obszaru szalki hodowlanej, aby zminimalizować zakłócenie komórek. Po trzech tygodniach hodowli wypłucz naczynie hodowlane dwoma mililitrami PBS Dulbecco bez RNaz.Usuń DPBS. Następnie zastąp jednym mililitrem świeżego DPBS do zbioru. Użyj zestawu filtrów GFP i obiektywu 40X na odwróconym mikroskopie epifluorescencyjnym, aby zidentyfikować fluorescencyjne neurony TH dodatnie w hodowlach.Użyj mikromanipulatora do pipety nad somą komórkową. Następnie użyj plastikowej rurki przymocowanej do bocznego portu uchwytu mikropipety, aby delikatnie zassać w celu zassania neuronu do szklanej mikropipety. Natychmiast wyjąć mikropipetę zawierającą komórkę z roztworu do kąpieli i umieścić końcówkę w probówce do PCR o pojemności 0,2 mililitra zawierającej bufor reakcyjny.Złamij końcówkę o bok rurki w pobliżu dna. Następnie umieść sterylną igłę strzykawki w rozmiarze 21 z tyłu mikorprypety i wyciśnij, aby usunąć pozostały płyn ze złamanej końcówki mikropipety. Odwiruj probówkę zbiorczą przez pięć sekund za pomocą mikrowirówki stacjonarnej, a następnie zamroź ją w suchym lodzie.Podczas pracy w komorze PCR z odczynnikami na lodzie lub na bloku agregatu chłodniczego, przygotuj pierwszą mieszankę wzorcową szczepu plus 10% dodatkowej objętości w temperaturze pokojowej. I jeden mikrolitr trzech podstawowych starterów jeden i jeden mikrolitr ilościowo oznaczonych kolców RNA do próbki. Następnie inkubuj próbkę w termocyklerze przez trzy minuty w temperaturze 72 stopni Celsjusza, a następnie umieść próbki bezpośrednio na stojaku do chłodzenia PCR.Następnie dodać 5,5 mikrolitra przygotowanej mieszanki wzorcowej do probówki reakcyjnej w kratce chłodzącej PCR i wymieszać, delikatnie pipetując. Po odwirowaniu probówki przez pięć sekund inkubować w termocyklerze ustawionym na parametry pokazane teraz na ekranie. Aby oczyścić pierwszą nić cDNA, dodaj do próbki 25 mikrolitrów wirowych kulek magnetycznych o temperaturze pokojowej.Wymieszać, pipetując całą objętość w górę i w dół co najmniej 10 razy. Następnie inkubuj w temperaturze pokojowej przez osiem minut, aby cDNA związało się z kulkami. Następnie umieść próbki i kulki magnetyczne na urządzeniu do separacji magnetycznej, aż ciecz stanie się całkowicie przezroczysta, a w supernatancie nie pozostaną żadne kulki.Odessać i wyrzucić supernatant. Obracać próbkę przez pięć sekund, aby zebrać płyn z boku probówki. Umieść próbki na urządzeniu do separacji magnetycznej na 30 sekund.Następnie usuń cały pozostały supernatant za pomocą pipetera P10, aby pozostawić tylko kulki ze związanym DNA. Dodaj 50 mikrolitrów głównej mieszanki ds-cDNA PCR, a następnie uruchom program PCR do syntezy drugiej nici, aby uzyskać dwuniciowy cDNA. Ten histogram pokazuje liczbę genów kodujących białka wykrytych w bibliotekach sekwencjonowania dopaminergicznego RNA pojedynczej komórki wygenerowanych z komórek dodatnich TH-eGFP we fragmentach na kilobazę transkryptu na milion zmapowanych odczytów.W bibliotekach pojedynczych komórek wykryto od 6 000 do 8 000 genów białkowych. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu czterech do pięciu tygodni, wliczając w to czas na wyprowadzenie komórek, umożliwienie dojrzewania komórek w hodowli, zbieranie komórek i etapy generowania biblioteki, sekwencjonowanie bibliotek i wstępną analizę. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o zachowaniu wolnej od RNAzy przestrzeni roboczej do generowania biblioteki wyszukiwania RNA i zbierania komórek, utrzymywania sterylnych technik przez cały okres hodowli komórek oraz wykonywania pipet o odpowiedniej średnicy do pobierania pojedynczych komórek.Nie zapominaj, że praca z paraformaldehydem może być niezwykle niebezpieczna i należy zawsze stosować środki ostrożności, takie jak używanie dygestoriów, unikanie kontaktu ze skórą i oczami, trzymanie się z dala od źródeł ciepła i otwartego ognia oraz noszenie odpowiedniej odzieży ochrony osobistej. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak ekspresja genów i analiza sieci genów, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, w jaki sposób leczenie farmakologiczne wpływa na ekspresję białek w komórkach dopaminergicznych.

reliable-identification-living-dopaminergic-neurons-midbrain-cultures

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisano metodę przygotowania organotypowych skrawków z embrionalnego śródmózgowia myszy w stadium E12.5. Organotypowe hodowle skrawków mogą być wykorzystywane do obserwacji zachowania neuronów dopaminergicznych lub innych neuronów z brzusznej części śródmózgowia.

Organotypowe hodowle plastrów embrionalnego brzusznego śródmózgowia: system do badania rozwoju neuronów dopaminergicznych in vitro

W celu oceny funkcji i regulacji genów podczas rozwoju dopaminergicznych neuronów śródmózgowia opisujemy metodę obejmującą elektroporację in ovo konstruktów plazmidowego DNA do embrionalnych progenitorów dopaminergicznych neuronów brzusznej części śródmózgowia kurczaka. Technika ta może być wykorzystana do uzyskania wydajnej ekspresji genów zainteresowania w celu zbadania różnych aspektów rozwoju śródmózgowia i różnicowania neuronów dopaminergicznych.

In ovo elektroporacja śródmózgowia kurczaka w celu badania funkcji genów w rozwoju neuronów dopaminergicznych

Tu opisujemy dwa testy, które zostały opracowane w celu badania związanej z wiekiem neurodegeneracji neuronów dopaminergicznych (DA) w Drosophila: test ujemnej geotaksji indukowanej wspinaczkami/skurczem, który pozwala badać efekty funkcjonalne zwyrodnienia neuronów DA oraz immunobarwienie na hydroksylazę tyrozyny, które jest używane do identyfikacji i liczenia neuronów DA w całych preparatach mózgu.

Ocena fenotypow neurodegeneracyjnych w Drosophila neuronach dopaminergicznych poprzez testy wspinaczkowe i immunobarwienie całego mózgu

Neurony dopaminergiczne odgrywają istotną rolę regulacyjną w mózgu. Ich utrata jest związana z chorobą Parkinsona. W tym filmie pokazujemy, jak wygenerować pierwotne kultury centralnych neuronów dopaminergicznych z embrionalnego śródmózgowia myszy. Takie kultury są przydatne do badania ekstremalnej podatności tych neuronów na różne stresy.

Pierwotna hodowla mysich neuronów dopaminergicznych

Przyczyny degeneracji neuronów dopaminergicznych śródmózgowia podczas choroby Parkinsona nie są w pełni zrozumiałe. Systemy hodowli komórkowych stanowią niezbędne narzędzie do badania właściwości neurofizjologicznych tych neuronów. Poniżej przedstawiamy zoptymalizowany protokół, który może być wykorzystany do modelowania neurodegeneracji in vitro.

Izolacja, hodowla i długotrwałe utrzymanie pierwotnych śródmózgowiowych neuronów dopaminergicznych z embrionalnych mózgów gryzoni

Identyfikacja receptora D1-alfa dopaminy w jądrze półleżącym jest kluczowa dla wyjaśnienia dysfunkcji receptora D1 podczas choroby ośrodkowego układu nerwowego. Przeprowadziliśmy nowatorski test hybrydyzacji RNA in situ, aby uwidocznić pojedyncze cząsteczki RNA w określonym obszarze mózgu.

Identyfikacja receptora dopaminowego D1-alfa w jądrze półleżącym gryzoni za pomocą innowacyjnej technologii wykrywania RNA in situ

Ustalono metodę reaktywacji uśpionych nerwowych komórek macierzystych w hodowanych eksplantatach mózgu Drosophila. Za pomocą tej metody można oddzielić rolę sygnałów ogólnoustrojowych od sygnałów wewnętrznych w tkance w regulacji spoczynku, wejścia i wyjścia nerwowych komórek macierzystych.

Reaktywacja nerwowych komórek macierzystych w hodowanych eksplantatach mózgu Drosophila

Ten protokół opisuje hodowlę komórek ludzkich neuronów dopaminergicznych śródmózgowia, a następnie barwienie immunologiczne i generowanie profili fenotypowych neuronów na podstawie uzyskanych mikroskopowych obrazów o wysokiej zawartości, co pozwala na identyfikację zmian fenotypowych spowodowanych modulacjami genetycznymi lub chemicznymi.

Profilowanie fenotypowe neuronów dopaminergicznych śródmózgowia pochodzących z ludzkich komórek macierzystych

Podczas rozwoju kory mózgowej, neurony i komórki glejowe pochodzą ze strefy komorowej wyściełającej komorę i migrują w kierunku powierzchni mózgu. W proces ten zaangażowanych jest wiele genów. Protokół ten wprowadza technikę obrazowania poklatkowego migrujących neuronów i komórek progenitorowych glejowych.

Obrazowanie poklatkowe migrujących neuronów i progenitorów glejowych w embrionalnych wycinkach mózgu myszy

Iteracyjna hybrydyzacja in situ wspomagana ekspansją (EASI-FISH) to solidna technika, która łączy mikroskopię ekspansywną z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ (FISH) w celu wykrycia ekspresji wielu genów w grubej tkance. Protokół ten przedstawia ostatnie postępy w metodzie i jej adaptacji do znakowania nienaruszonego ośrodkowego układu nerwowego Drosophila.

Multipleksowe wykrywanie ekspresji genów w nienaruszonym mózgu Drosophila przy użyciu iteracyjnej fluorescencji in situ wspomaganej ekspansją

Badanie to przedstawia solidną metodę izolacji mRNA aksonalnych za pomocą wkładek z błony porowatej, umożliwiając całkowite rozdzielenie neuronów od neurytów oraz oczyszczanie RNA. W połączeniu z RTddPCR podejście pozwala na absolutną ilościową ilościową ilościową transkrypcję o niskiej liczbie kopii, ułatwiając badania transportu mRNA i lokalnej translacji o wysokiej czułości, powtarzalności i szerokim zastosowaniu eksperymentalnym.

Izolacja i ilościowa ilościowość mRNA aksonalnych z użyciem wkładek z błony porowatej oraz RTddPCR

Poznaj metodę identyfikacji żywych neuronów dopaminergicznych w hodowlach śródmózgowia myszy przy użyciu ekspresji eGFP sterowanej przez promotor TH oraz sekwencjonowania RNA.

Wiarygodna identyfikacja żywych neuronów dopaminergicznych w hodowlach śródmózgowia przy użyciu sekwencjonowania RNA i ekspresji eGFP sterowanej przez promotor TH (Wideo) | JoVE Journal

Wiarygodna identyfikacja żywych neuronów dopaminergicznych w hodowlach śródmózgowia przy użyciu sekwencjonowania RNA i ekspresji eGFP sterowanej przez promotor TH

Przeglądaj więcej filmów