Wiarygodna identyfikacja żywych neuronów dopaminergicznych w hodowlach śródmózgowia przy użyciu sekwencjonowania RNA i ekspresji eGFP sterowanej przez promotor TH

Ogólnym celem tej procedury jest wiarygodna identyfikacja żywych neuronów dopaminergicznych w hodowlach śródmózgowia przy użyciu ekspresji eGFP sterowanej hydroklazą tyrozyny, zbierania pojedynczych komórek i generowania biblioteki sekwencjonowania RNA. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie choroby Parkinsona i uzależnienia od narkotyków, ponieważ umożliwia przeprowadzanie ekspresji genów i testów elektrofizjologicznych na zidentyfikowanych żywych neuronach dopaminergicznych w hodowli. Zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona środki do niezawodnej identyfikacji żywych, a nie stałych neuronów dopaminergicznych w pierwotnych brzusznych kulturach śródmózgowia.

Pierwszą część procedury zademonstruje Charlene Kim, technik z laboratorium Henry'ego Lestera. Zacznij od ustabilizowania głowy zarodka myszy za pomocą kleszczy mocno umieszczonych na pysku, tak aby powierzchnia grzbietowa była dostępna. Za pomocą kleszczy trzymanych w drugiej ręce uszczypnij warstwę skóry i czaszkę tuż przed grzbietem śródmózgowia i oderwij skórę i czaszkę wzdłuż linii środkowej.

Umieść kleszcze wokół grzbietu, jedną końcówką między korą a mezonfalonem, a drugą nad móżdżkiem. Ściśnij i usuń całe śródmózgowie. Umieść śródmózgowie na szalce Petriego z zimnym HBSS pod mikroskopem preparacyjnym.

Pod mikroskopem preparacyjnym odwróć segment mózgu tak, aby strona brzuszna była teraz dostępna. Widoczne są teraz cztery ćwiartki. Usuń wszystkie opony mózgowe i naczynia krwionośne, delikatnie chwytając opony mózgowe kleszczami i ciągnąc w górę od mózgu.

Następnie umieść jeden szczypiec kleszczowych w komorze mniej więcej pośrodku segmentu. Następnie, aby oddzielić śródmózgowie, uszczypnij grzbietowo, a następnie uszczypnij przyśrodkowo z każdej strony. Weź dwie dolne ćwiartki, wykonując boczne nacięcia po obu stronach.

Brzuszny obszar nakrywki i istota pars compacta znajdują się w brzusznej dolnej części, która wydaje się gęsta. Wypreparowaną tkankę zawierającą zarówno VTA, jak i SNC umieścić w świeżym HBSS w oddzielnym obszarze szalki Petriego. Po wycięciu wszystkich segmentów mózgu użyj kleszczy i skalpela numer 11, aby poćwiartować każdą sekcję śródmózgowia na kawałki o mniej więcej równej wielkości.

Następnie użyj końcówki pipety P1000 o szerokim otworze, aby przenieść wszystkie poćwiartowane segmenty śródmózgowia do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów. Po pozostawieniu tkanki do ustabilizowania się i usunięciu HBSS dodaj 500 mikrolitrów roztworu papainy. Inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut.

Po inkubacji użyj końcówki P1000 o szerokim otworze, aby przenieść tylko segmenty śródmózgowia do jednomililitrowej porcji roztworu DNazy I i pozwól segmentom osiąść na dnie probówki. Następnie przenieś tylko segmenty śródmózgowia do 15-mililitrowej rurki zawierającej jeden mililitr roztworu zimnego stopu. Zastąp drugie płukanie jednym mililitrem świeżego roztworu zatrzymującego i pipetuj siedem razy w górę iw dół za pomocą końcówki pipety P1000, aby rozcierać komórki.

Następnie ułóż zawiesinę komórek, powoli pipetując 200 mikrolitrów 4% roztworu BSA na dno probówki. Po odwirowaniu przy 280 x g przez sześć minut, odessać supernatant za pomocą P1000 i ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze pożywki galwanicznej. Wykonaj zliczanie komórek za pomocą hemocytometru, a następnie rozcieńczyć zawiesinę komórek do 1000 komórek na mikrolitr za pomocą pożywki galwanicznej.

Umieść 120 mikrolitrów zawiesiny komórkowej na szalkach hodowlanych pokrytych poli-D-lizyną, poli-L-ornityną i lamininą natychmiast po aspiracji lamininy, aby upewnić się, że powłoka nie wyschnie i nie utworzy nierównej powierzchni. Następnie, po godzinie inkubacji, ostrożnie dodaj trzy mililitry pożywki hodowlanej do nieobsianego obszaru szalki hodowlanej, aby zminimalizować zakłócenie komórek. Po trzech tygodniach hodowli wypłucz naczynie hodowlane dwoma mililitrami PBS Dulbecco bez RNaz.

Usuń DPBS. Następnie zastąp jednym mililitrem świeżego DPBS do zbioru. Użyj zestawu filtrów GFP i obiektywu 40X na odwróconym mikroskopie epifluorescencyjnym, aby zidentyfikować fluorescencyjne neurony TH dodatnie w hodowlach.

Użyj mikromanipulatora do pipety nad somą komórkową. Następnie użyj plastikowej rurki przymocowanej do bocznego portu uchwytu mikropipety, aby delikatnie zassać w celu zassania neuronu do szklanej mikropipety. Natychmiast wyjąć mikropipetę zawierającą komórkę z roztworu do kąpieli i umieścić końcówkę w probówce do PCR o pojemności 0,2 mililitra zawierającej bufor reakcyjny.

Złamij końcówkę o bok rurki w pobliżu dna. Następnie umieść sterylną igłę strzykawki w rozmiarze 21 z tyłu mikorprypety i wyciśnij, aby usunąć pozostały płyn ze złamanej końcówki mikropipety. Odwiruj probówkę zbiorczą przez pięć sekund za pomocą mikrowirówki stacjonarnej, a następnie zamroź ją w suchym lodzie.

Podczas pracy w komorze PCR z odczynnikami na lodzie lub na bloku agregatu chłodniczego, przygotuj pierwszą mieszankę wzorcową szczepu plus 10% dodatkowej objętości w temperaturze pokojowej. I jeden mikrolitr trzech podstawowych starterów jeden i jeden mikrolitr ilościowo oznaczonych kolców RNA do próbki. Następnie inkubuj próbkę w termocyklerze przez trzy minuty w temperaturze 72 stopni Celsjusza, a następnie umieść próbki bezpośrednio na stojaku do chłodzenia PCR.

Następnie dodać 5,5 mikrolitra przygotowanej mieszanki wzorcowej do probówki reakcyjnej w kratce chłodzącej PCR i wymieszać, delikatnie pipetując. Po odwirowaniu probówki przez pięć sekund inkubować w termocyklerze ustawionym na parametry pokazane teraz na ekranie. Aby oczyścić pierwszą nić cDNA, dodaj do próbki 25 mikrolitrów wirowych kulek magnetycznych o temperaturze pokojowej.

Wymieszać, pipetując całą objętość w górę i w dół co najmniej 10 razy. Następnie inkubuj w temperaturze pokojowej przez osiem minut, aby cDNA związało się z kulkami. Następnie umieść próbki i kulki magnetyczne na urządzeniu do separacji magnetycznej, aż ciecz stanie się całkowicie przezroczysta, a w supernatancie nie pozostaną żadne kulki.

Odessać i wyrzucić supernatant. Obracać próbkę przez pięć sekund, aby zebrać płyn z boku probówki. Umieść próbki na urządzeniu do separacji magnetycznej na 30 sekund.

Następnie usuń cały pozostały supernatant za pomocą pipetera P10, aby pozostawić tylko kulki ze związanym DNA. Dodaj 50 mikrolitrów głównej mieszanki ds-cDNA PCR, a następnie uruchom program PCR do syntezy drugiej nici, aby uzyskać dwuniciowy cDNA. Ten histogram pokazuje liczbę genów kodujących białka wykrytych w bibliotekach sekwencjonowania dopaminergicznego RNA pojedynczej komórki wygenerowanych z komórek dodatnich TH-eGFP we fragmentach na kilobazę transkryptu na milion zmapowanych odczytów.

W bibliotekach pojedynczych komórek wykryto od 6 000 do 8 000 genów białkowych. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu czterech do pięciu tygodni, wliczając w to czas na wyprowadzenie komórek, umożliwienie dojrzewania komórek w hodowli, zbieranie komórek i etapy generowania biblioteki, sekwencjonowanie bibliotek i wstępną analizę. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o zachowaniu wolnej od RNAzy przestrzeni roboczej do generowania biblioteki wyszukiwania RNA i zbierania komórek, utrzymywania sterylnych technik przez cały okres hodowli komórek oraz wykonywania pipet o odpowiedniej średnicy do pobierania pojedynczych komórek.

Nie zapominaj, że praca z paraformaldehydem może być niezwykle niebezpieczna i należy zawsze stosować środki ostrożności, takie jak używanie dygestoriów, unikanie kontaktu ze skórą i oczami, trzymanie się z dala od źródeł ciepła i otwartego ognia oraz noszenie odpowiedniej odzieży ochrony osobistej. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak ekspresja genów i analiza sieci genów, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, w jaki sposób leczenie farmakologiczne wpływa na ekspresję białek w komórkach dopaminergicznych.