Name: Badanie struktury i funkcji mitochondriów w jajnikach Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Poznaj metody analizy struktury i funkcji mitochondriów w żywych i utrwalonych tkankach jajników Drosophila melanogaster. Techniki te pozwalają szczegółowo badać relację struktura-funkcja organelli.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Leenie Patel i Diamond Woodard za pomoc w przygotowaniu pożywki dla Drosophila oraz dr Igorowi Chesnokovowi za udostępnienie stereomikroskopu podłączonego do kamery.

<ol><li>Nunnari, J., Suomalainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+in+sickness+and+in+health%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: in sickness and in health.</a> Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).</li>
<li>Youle, R. J., van der Bliek, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+fission%2C+fusion%2C+and+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial fission, fusion, and stress.</a> Science. 337 (6098), 1062-1065 (2012).</li>
<li>Mitra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+fission-fusion+as+an+emerging+key+regulator+of+cell+proliferation+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial fission-fusion as an emerging key regulator of cell proliferation and differentiation.</a> Bioessays. , (2013).</li>
<li>Kageyama, Y., Zhang, Z., Sesaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+division%3A+molecular+machinery+and+physiological+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial division: molecular machinery and physiological functions.</a> Curr Opin Cell Biol. 23 (4), 427-434 (2011).</li>
<li>Chen, H., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+functions+of+mitochondrial+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Physiological functions of mitochondrial fusion.</a> Ann N Y Acad Sci. 1201, 21-25 (2010).</li>
<li>Liesa, M., Shirihai, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dynamics+in+the+regulation+of+nutrient+utilization+and+energy+expenditure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dynamics in the regulation of nutrient utilization and energy expenditure.</a> Cell Metab. 17 (4), 491-506 (2013).</li>
<li>Hoppins, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+mitochondrial+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The regulation of mitochondrial dynamics.</a> Curr Opin Cell Biol. 29, 46-52 (2014).</li>
<li>Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+4%2C+Analysis+of+mitochondrial+dynamics+and+functions+using+imaging+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol.+Chapter%22%5BJournal%5D)">Chapter 4, Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter. , 21-21 (2010).</li>
<li>Mitra, K., Rikhy, R., Lilly, M., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DRP1-dependent+mitochondrial+fission+initiates+follicle+cell+differentiation+during+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DRP1-dependent mitochondrial fission initiates follicle cell differentiation during Drosophila oogenesis.</a> J Cell Biol. 197 (4), 487-497 (2012).</li>
<li>Klusza, S., Deng, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((At+the+crossroads+of+differentiation+and+proliferation%3A+precise+control+of+cell-cycle+changes+by+multiple+signaling+pathways+in+Drosophila+follicle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">At the crossroads of differentiation and proliferation: precise control of cell-cycle changes by multiple signaling pathways in Drosophila follicle cells.</a> Bioessays. 33 (2), 124-134 (2011).</li>
<li>Sahai-Hernandez, P., Castanieto, A., Nystul, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+models+of+epithelial+stem+cells+and+their+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila models of epithelial stem cells and their niches.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (3), 447-457 (2012).</li>
<li>Parker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mitochondrial+pool+of+cyclin+E%2C+regulated+by+Drp1%2C+is+linked+to+cell-density-dependent+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">A new mitochondrial pool of cyclin E, regulated by Drp1, is linked to cell-density-dependent cell proliferation.</a> J Cell Sci. 128 (22), 4171-4182 (2015).</li>
<li>Mitra, K., Wunder, C., Roysam, B., Lin, G., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hyperfused+mitochondrial+state+achieved+at+G1-S+regulates+cyclin+E+buildup+and+entry+into+S+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A hyperfused mitochondrial state achieved at G1-S regulates cyclin E buildup and entry into S phase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (29), 11960-11965 (2009).</li>
<li>Shidara, Y., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defects+in+mitochondrial+axonal+transport+and+membrane+potential+without+increased+reactive+oxygen+species+production+in+a+Drosophila+model+of+Friedreich+ataxia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Defects in mitochondrial axonal transport and membrane potential without increased reactive oxygen species production in a Drosophila model of Friedreich ataxia.</a> J Neurosci. 30 (34), 11369-11378 (2010).</li>
<li>Zielonka, J., Kalyanaraman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroethidine-+and+MitoSOX-derived+red+fluorescence+is+not+a+reliable+indicator+of+intracellular+superoxide+formation%3A+another+inconvenient+truth%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth.</a> Free Radic Biol Med. 48 (8), 983-1001 (2010).</li>
<li>Haack, T., Bergstralh, D. T., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Damage+to+the+Drosophila+follicle+cell+epithelium+produces+%26%2334%3Bfalse+clones%26%2334%3B+with+apparent+polarity+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Open%22%5BJournal%5D)">Damage to the Drosophila follicle cell epithelium produces &#34;false clones&#34; with apparent polarity phenotypes.</a> Biol Open. 2 (12), 1313-1320 (2013).</li>
<li>Murphy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+mitochondria+produce+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">How mitochondria produce reactive oxygen species.</a> Biochem J. 417 (1), 1-13 (2009).</li>
<li>Mandal, S., Guptan, P., Owusu-Ansah, E., Banerjee, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+regulation+of+cell+cycle+progression+during+development+as+revealed+by+the+tenured+mutation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial regulation of cell cycle progression during development as revealed by the tenured mutation in Drosophila.</a> Dev Cell. 9 (6), 843-854 (2005).</li>
<li>Tipping, M., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+a+model+for+context-dependent+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Drosophila as a model for context-dependent tumorigenesis.</a> J Cell Physiol. 229 (1), 27-33 (2014).</li>
<li>Herranz, H., Eichenlaub, T., Cohen, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+in+Drosophila%3A+Imaginal+Discs+as+a+Model+for+Epithelial+Tumor+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cancer in Drosophila: Imaginal Discs as a Model for Epithelial Tumor Formation.</a> Curr Top Dev Biol. 116, 181-199 (2016).</li>
<li>Pandey, U. B., Nichols, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+disease+models+in+Drosophila+melanogaster+and+the+role+of+the+fly+in+therapeutic+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery.</a> Pharmacol Rev. 63 (2), 411-436 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Kluczowe kroki w ramach protokołu
Fotowybielanie: Zapobieganie nadmiernemu fotowybielaniu próbek fluorescencyjnych jest absolutnie niezbędne do przeprowadzenia skutecznej mikroskopii konfokalnej. W związku z tym czas potrzebny na zlokalizowanie próbek przez okular lub ustawienie parametrów akwizycji obrazu w trybie skanowania na żywo powinien być zminimalizowany, aby zminimalizować fotowybielanie.
Uszkodzenie tkanek: Ponieważ mitochondria są ...

Mitochondria są klasycznie opisywane jako komórkowa elektrownia, ponieważ są głównymi miejscami produkcji energii w zróżnicowanych komórkach. Ponadto mitochondria odgrywają kluczową rolę w metabolizmie, wytwarzaniu ciepła, modyfikacji lipidów, homeostazie wapnia i redoks, orkiestracji procesów sygnalizacji komórkowej itp. Mitochondria odgrywają również aktywną rolę w indukcji śmierci komórki2, a także w regulacji cyklu komórkowego3. Taka wielofunkcyjność rodzi następujące fundamentalne pytania: a) w jaki sposób mitochondria wykonują wszystkie te funkcje jednocześnie i b) czy istnieją określone pule lub podstrefy mitochondrialne, które są wyspecjalizowane dla różnych funkcji? W tym kontekście ważne jest, aby zauważyć, że wielofunkcyjne mitochondria są dynamiczne pod względem kształtu, wielkości i struktury w poszczególnych komórkach oraz że kształt mitochondriów w stanie ustalonym może się różnić w zależności od typu komórki. Dziesięciolecia badań z różnych laboratoriów sugerują, że zmiana kształtu, rozmiaru i struktury mitochondriów, zwana zbiorczo dynamiką mitochondriów, ma kluczowe znaczenie dla utrzymania różnych funkcji mitochondriów4,5,6. Odkrycia te wskazują na możliwość, że mitochondria mogą osiągać swoją wielofunkcyjność dzięki swojej dynamice strukturalnej.
Trwają intensywne wysiłki mające na celu zrozumienie zależności między strukturą a funkcją mitochondriów. Dynamika struktury mitochondriów jest utrzymywana przede wszystkim przez ich zdolność do ulegania ze sobą rozszczepieniu i fuzji. Rozszczepienie dużych mitochondriów przekształca je w mniejsze elementy mitochondrialne, podczas gdy fuzja między dwoma mniejszymi mitochondriami łączy je w większy element mitochondrialny7. Co więcej, może dojść do przejściowego zespolenia dwóch mitochondriów, aby umożliwić mieszanie ich zawartości. Zdarzenia rozszczepienia i fuzji wewnętrznej i zewnętrznej błony mitochondrialnej są starannie regulowane przez określone zestawy białek. Podstawowa maszyneria rozszczepienia składa się z białka związanego z dynaminą 1 (Drp1), które jest rekrutowane z cytozolu do mitochondriów poprzez interakcję z niektórymi białkami mitochondrialnymi w dobrej wierze (np. Fis1 lub Mff1), podczas gdy funkcja Drp1 może być również regulowana przez inne białka na powierzchni mitochondriów4. Chociaż Drp1 działa na błonie zewnętrznej, jego zdolności rozszczepienia wpływają również na błonę wewnętrzną. Orkiestracja rozszczepienia zewnętrznych i wewnętrznych błon mitochondrialnych nie jest dobrze poznana. Z drugiej strony, fuzja błony wewnętrznej jest regulowana w rdzeniu przez aktywność Opa1, podczas gdy mitofuzyny regulują fuzję błony zewnętrznej5. Równowaga przeciwdziałających zdarzeń rozszczepienia i fuzji mitochondriów dyktuje kształt mitochondriów w stanie ustalonym. Na przykład zahamowanie rozszczepienia mitochondriów skutkowałoby całkowitą i nieprzeciwstawną fuzją, podczas gdy nadmierna aktywność rozszczepienia mitochondriów skutkowałaby fragmentacją mitochondriów3.
Badanie relacji między strukturą a funkcją mitochondriów obejmuje przede wszystkim dwa uzupełniające się podejścia: a) analizy fenotypów komórkowych i organizmów po manipulacji genetycznej mitochondrialnych białek rozszczepienia/fuzji oraz b) bezpośrednie oceny struktury i funkcji mitochondriów. Warto zauważyć, że analizy genetyczne nie zawsze mogą ujawnić bezpośrednią funkcjonalność danej cząsteczki (w tym przypadku białek rozszczepienia/fuzji mitochondriów), ponieważ fenotypy mogą powstać w wyniku efektów wtórnych. Dlatego niezwykle ważne jest opracowanie i wykorzystanie narzędzi do bezpośredniego badania struktury i funkcji mitochondriów. Każda ocena struktury mitochondriów wymaga różnych narzędzi mikroskopowych. Zastosowanie mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek znacznie posunęło naprzód badania dynamiki mitochondriów, ponieważ dynamikę mitochondriów można monitorować zarówno jakościowo, jak i ilościowo przy użyciu odpowiednich narzędzi i technik mikroskopii fluorescencyjnej8. Narzędzia oparte na mikroskopii fluorescencyjnej zostały opracowane w celu zbadania struktury i funkcji mitochondriów w żywych i utrwalonych tkankach Drosophila melanogaster, wyjaśniając znaczenie dynamiki mitochondriów in vivo9. Te i pokrewne metody opisano tutaj, a ich celem jest zbadanie struktury i funkcji mitochondriów w jajniku Drosophila.
Jajnik Drosophila składa się z linii zarodkowej i linii somatycznej, które wywodzą się z odpowiednich dorosłych komórek macierzystych rezydujących w germarium10,11. Szesnaście syncytialnych komórek rozrodczych (GC) zostaje otoczonych przez somatyczne komórki pęcherzykowe (FC), tworząc indywidualne komory jajowe, które wyłaniają się z zarodka (ryc. 1). Jedna z 16 GC zostaje zaangażowana, aby stać się oocytem, a pozostałe 15 GC przekształca się w komórki pielęgniarskie, które wspierają wzrost komory oocytowej, ułatwiając dojrzewanie komórki jajowej przed jej złożeniem. Większość FC przechodzi 9 rund podziałów mitotycznych przed wyjściem z mitotycznego cyklu komórkowego, aby ostatecznie różnicować się w wzorzystą warstwę komórek nabłonka składającą się z komórek pęcherzyków przednich (AFC), tylnych komórek pęcherzykowych (PFC) i komórek głównego ciała (MBC). Kolejne komory jajowe są połączone komórkami łodygowymi, które są zróżnicowanymi komórkami, które również pochodzą z FC we wczesnym okresie rozwoju. Kształt mitochondriów regulowany przez białko rozszczepienia mitochondriów Drp1 bierze czynny udział w procesie różnicowania podczas prawidłowego rozwoju warstwy FC jajnika Drosophila 9,12. Metody stosowane w tych badaniach w celu identyfikacji udziału Drp1 w rozwoju warstwy komórek pęcherzykowych Drosophila opisano tutaj.

<table><tbody><tr><td>Grace's Media (medium do preparowania owadów)</td><td>Fisher Scientific</td><td>30611031-2</td><td></td></tr><tr><td>41 Paraformaldehyd AQ</td><td>Mikroskopia elektroniczna Sciences</td><td>50-259-99</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker Green (ogólne barwienie mitochondriów)</td><td>Life Technologies</td><td>m7514</td><td>Rekonstytucja i podajenie</td></tr><tr><td>nadchloranu estru etylowego tetrametylorodaminy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>87917-25MG</td><td>Rekonstytucja i podwielokrotnienie</td></tr><tr><td>MitoSox (barwienie Mito-Ros)</td><td>Life Technologies</td><td>m36008</td><td>Rekonstytucja i podwielokrotnienie</td></tr><tr><td>PolyLysine</td><td>MP Biomedicals</td><td>ICN15017625</td><td></td></tr><tr><td>Fiolki na muchy</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS-515</td><td></td></tr><tr><td>Stożkowe muchy</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS-355</td><td></td></tr><tr><td>Fiolka muchowa Flugs</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS273</td><td></td></tr><tr><td>Fly Conical Flugs</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS 277</td><td></td></tr><tr><td>Jazzmix Pokarm Drosophila (pokarm Drosophila)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS153</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9647-50G</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało cykliny E (d-300)</td><td>Przeciwciało Santa Cruz</td><td>sc-33748</td><td></td></tr><tr><td>ATPB [3D5] - Marker mitochondrialny</td><td>AbCam</td><td>ab14730</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-165-146</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-175-144</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield</td><td>Szkiełka</td><td></td> mikroskopowe Fisher Scientific H100 <td></td></tr><tr><td>Azer Scientific EverMark Select</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-026-252</td><td></td></tr><tr><td>Szklana osłona mikroskopu</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>Mat Tek Corp&nbsp; Naczynie Mircrowell ze szklanym dnem</td><td>Fisher Scientific</td><td>P35G-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Aktywne suszone drożdże</td> Mikroskop konfokalny <td>Fisher Scientific ICN10140001</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM 700</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Fine</td><td>Science Technologies</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Niklowany uchwyt na szpilki Moria</td><td>Fine Science Technologies</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>Minutien Pins</td><td>Fine Science Technologies</td><td>26002-15</td><td></td></tr><tr><td>MYFP ( w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 )</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>7194</td><td></td></tr><tr><td>Fly</td><td>Pad Fly stuff</td><td>59-118</td><td></td></tr><tr><td>Blowgun</td><td>Fly stuff</td><td>54-104</td><td></td></tr><tr><td>Igła do dmuchawki</td><td>Flystuff</td><td>54-119</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analiz</td><td>Carl Zeiss</td><td>Zen&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie analityczne</td><td>Open source</td><td>Image J</td><td></td></tr><tr><td>Research Mikroskop Macro Zoom</td><td>Olympus</td><td>MVX10</td><td></td></tr><tr><td>QICAM Fast 1394 Chłodzony aparat cyfrowy, 12-bitowy, mono&nbsp;</td><td>QImaging</td><td>QIC-F-M-12-C</td><td></td></tr><tr><td>QCapture Pro 5.1</td><td>QImaging</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

badanie struktury i funkcji mitochondriów w jajnikach drosophila

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Analiza zależności między strukturą a funkcją mitochondriów jest niezbędna do dokładnego zrozumienia mechanizmów regulacyjnych funkcjonalności mitochondriów. Mikroskopia fluorescencyjna jest niezastąpionym narzędziem do bezpośredniej oceny struktury i funkcji mitochondriów w żywych komórkach oraz do badania zależności struktura-funkcja mitochondriów, która jest przede wszystkim modulowana przez cząsteczki rządzące rozszczepieniem i fuzją między mitochondriami. W pracy opisano i zademonstrowano specyficzne metody badania struktury i funkcji mitochondriów w żywych, jak i utrwalonych tkankach w organizmie modelowym Drosophila melanogaster. Tkanką z wyboru jest tutaj jajnik Drosophila, który można wyizolować i poddać działaniu mikroskopii konfokalnej ex vivo na żywo. Ponadto w artykule opisano, jak genetycznie manipulować białkiem rozszczepienia mitochondriów, Drp1, w jajnikach Drosophila w celu zbadania udziału rozszczepienia mitochondriów napędzanego przez Drp1 w modulowaniu relacji struktura-funkcja mitochondriów. Szerokie zastosowanie takich metod znajduje odzwierciedlenie w już opublikowanych, a także w nowych danych. Opisane metody można dalej rozszerzyć w celu zrozumienia bezpośredniego wpływu składników odżywczych i/lub czynników wzrostu na właściwości mitochondriów ex vivo. Biorąc pod uwagę, że dysregulacja mitochondriów leży u podstaw etiologii różnych chorób, oczekuje się, że opisane innowacyjne metody opracowane w genetycznie podatnym organizmie modelowym, Drosophila, znacząco przyczynią się do zrozumienia mechanistycznych szczegółów relacji między strukturą a funkcją mitochondriów oraz do opracowania strategii terapeutycznych ukierunkowanych na mitochondria.

Opisane metody mogą być wykorzystane do badania struktury i funkcji mitochondriów w żywych i utrwalonych jajnikach Drosophila (Rysunek 2B). Poniżej przedstawiono przykłady spodziewanych wyników uzyskanych za pomocą opisanych metod.
Disekcja jajnika Drosophila: Po dalszej sekcji z odciętych odwłoków (Rycina 3B) całych osobników Drosophila (Rycina 3A</stro...

Analiza zależności między strukturą a funkcją mitochondriów jest niezbędna do dokładnego zrozumienia mechanizmów regulacyjnych funkcjonalności mitochondriów. W artykule opisano i zademonstrowano specyficzne metody badania struktury i funkcji mitochondriów w żywych i utrwalonych jajnikach Drosophila.

Badanie struktury i funkcji mitochondriów w jajnikach Drosophila

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial ...

Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie metod badania struktury i funkcji mitochondriów w żywej i utrwalonej tkance w organizmie modelowym Drosophila melanogaster. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii mitochondrialnej. Takich jak mechanizmy regulacyjne funkcji mitochondriów.Główną zaletą tej techniki jest to, że przeprowadza szczegółową analizę zależności między strukturą a funkcją mitochondriów. Po posortowaniu pięciu znieczulonych samic much zgodnie z protokołem tekstowym, pod mikroskopem preparacyjnym użyj dwóch par kleszczy, aby odciąć klatkę piersiową od brzucha. Następnie ostrożnie przenieś brzuchy do drugiego dołka naczynia.Używając jednej pary kleszczy do przytrzymania brzucha na tylnym końcu, użyj drugiej pary kleszczy, aby powoli wypchnąć jajniki. Następnie użyj kleszczy, aby przytrzymać pojedynczy jajnik za nieprzezroczysty tylny koniec i ostrożnie przenieś go do trzeciego dołka naczynia w celu drażnienia lub mocowania. Ostrożnie drażnij osłonkę ochronną z okolic jajników, używając kleszczy do przytrzymania tylnego końca i lekko przesuwając igłę drażniącą od tylnego do przedniego końca.Aby przygotować komory pokryte polilizenem, umieść dwie oddzielone krople polilizenu o pojemności 20 mikrolitrów na szkle nakrywkowym szalki Petriego ze szklanym dnem. Suszyć płytki na powietrzu w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę i obrysować polilizynę na spodniej stronie płytki. Ustaw parametry skanowania w mikroskopie konfokalnym, otwierając oprogramowanie do akwizycji obrazu, a w zakładce akwizycja ustaw odpowiednie parametry skanowania.Zaznacz pola szeregów czasowych, wybielania i regionów, aby otworzyć poszczególne karty. Następnie wprowadź odpowiednie wartości parametrów akwizycji w każdej karcie. Następnie umieść jeden wypreparowany i drażniony jajnik na zaznaczonym obszarze pokrytym polilizyną i użyj igły do drażnienia, aby rozprowadzić jajnik i oddzielić jajniki.Umieść 10-litrową kroplę pożywki do preparowania owadów na jajniku, upewniając się, że pokryła cały obszar pokryty polilizyną. Następnie przykryj szalkę Petriego. Natychmiast po zamontowaniu jajnika umieść próbkę na stoliku mikroskopu i za pomocą okularu szybko zlokalizuj pole zainteresowania w żywej tkance.Kliknij przycisk na żywo, aby uzyskać obraz na żywo wybranego pola zainteresowania, a następnie kliknij przycisk Zatrzymaj, aby zatrzymać skanowanie na żywo. W razie potrzeby dostosuj parametry akwizycji tak, aby wykryty sygnał fluorescencyjny znajdował się poniżej poziomów nasycenia ze zdefiniowanym tłem ustawionym poprzez dostosowanie wartości przesunięcia. Na karcie graficznej użyj narzędzia do rysowania Beziera, aby narysować mały zwrot z inwestycji, aby wyznaczyć strefę wybielania zdjęć na obrazie uzyskanym przez skanowanie.Następnie przeprowadź akwizycję obrazu, klikając rozpocznij eksperyment. Aby przeprowadzić barwienie na żywo fluorescencyjnymi barwnikami mitochondrialnymi, należy rozcieńczyć zapas barwników w ciepłym podłożu preparacyjnym do końcowych stężeń roboczych. Po wcześniejszym wypreparowaniu i drażnieniu umieść jajniki w 200 mikrolitrach roztworu barwiącego w studzience naczynia rozwarstwiającego.Przykryj naczynie pudełkiem owiniętym folią aluminiową, aby chronić je przed światłem i inkubuj tkankę przez 10 minut. Następnie umyj poplamione jajniki, używając kleszczy, aby ostrożnie przesunąć je do trzech kolejnych studzienek zawierających podłoże bez plamy. W przypadku jednoczesnego barwienia za pomocą TMRE, w zgodnym ogólnym barwieniu mitochondrialnym, należy najpierw przeprowadzić barwienie TMRE, a następnie bez mycia tkanki, natychmiast przenieść próbkę do ogólnego barwienia mitochondrialnego.Po umyciu i zamontowaniu jajników, jak pokazano wcześniej w tym filmie, aby przeprowadzić obrazowanie konfokalne na próbce, zaznacz pole cięcia z, aby otworzyć zakładkę. Obróć pokrętło ostrości w kierunku dolnej części próbki podczas skanowania na żywo i kliknij przycisk Ustaw najpierw, aby zdefiniować najniższy przekrój Z. Następnie przesuń pokrętło ostrości w przeciwnym kierunku, aby zdefiniować sekcję znajdującą się na samej górze.Wykonaj akwizycję obrazu, klikając rozpocznij eksperyment. W przypadku żywej xvivamicroskopii dane powinny być uzyskane w ciągu 15 minut od zamontowania tkanki, w przeciwnym razie na wyniki eksperymentu mogą mieć wpływ zmiany fizjologii spowodowane zaszczepieniem obumarcia tkanki. Natychmiast po rozbiorze pod wyciągiem umieść jajniki w 200 mikrolitrach świeżego PFA o temperaturze pokojowej w studzience szklanego naczynia preparacyjnego.Inkubuj tkankę przez 15 minut, aby ją naprawić. Po umyciu jajników w PBS zgodnie z protokołem tekstowym, jeszcze w PBS, drażnić jajniki, aby ostrożnie usunąć ochronną osłonkę z włókien, która może utrudniać dostęp antygenu z przeciwciała. Przepuszczalność drażnionych jajników, umieszczając je w probówce z mikrobezpiecznikiem o pojemności 500 mikrolitrów 0,5 procent tritanu x 100 w PBS.Następnie umieść rurkę w zakrytym pudełku i ustaw na kołysanie z prędkością 25 obr./min przez 30 minut. Usuń PBS/TX zgodnie z protokołem tekstowym, zablokuj tkankę, dodając 200 mikrolitrów BSA rozpuszczonych w 0,5 procent PBS/TX. Inkubować próbki na bujaku w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę.Po usunięciu roztworu blokującego dodać anty-wściekłą desyclinę E i przeciwciała anty-mysie ATPB. Inkubuj tkankę na bujaczku w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Po inkubacji należy użyć PBS-TX do trzykrotnego przemycia jajników przez 15 minut każdy.Następnie dodać 200 mikrolitrów odpowiednich przeciwciał drugorzędowych i świeży PBS-TX i inkubować w temperaturze pokojowej przez godzinę. Po dwukrotnym umyciu chusteczki dodaj haczyki do trzeciego prania. Następnie za pomocą mikropipety o pojemności jednego mililitra wyjmij zabarwione immunologicznie jajniki z probówki z mikrobezpiecznikiem do świeżej studzienki szklanego naczynia preparacyjnego zawierającego 200 mikrolitrów PBS.Dodaj jedną kroplę podłoża mocującego na bazie glicerolu do szkiełka podstawowego i dodaj jajniki wybarwione immunologicznie jeden po drugim do podłoża mocującego. Pod mikroskopem preparacyjnym, trzymając nieprzezroczystą część jajnika kleszczami, użyj igły do drażnienia, aby delikatnie wyrwać przezroczyste jajniki z nieprzezroczystych komór dojrzałej komórki jajowej. Następnie wyjmij komory dojrzałych jaj z podłoża montażowego.Umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku podstawowym i lekko dociśnij, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie nośnika montażowego. Suszyć próbki na powietrzu przez 15 minut przed użyciem lakieru do paznokci w celu uszczelnienia krawędzi. Na koniec wykonaj mikroskopię konfokalną w razie potrzeby.Jak pokazano tutaj, odwrócenie skierowane do jednej z chmur mitochondrialnych związanych z komórkami nersowymi prowadzi do ponad 50-procentowej utraty sygnału fluorescencyjnego z niebiesko-białego ROI otaczającego czerwony zwrot ROI w ciągu 200 sekund, podczas gdy żółty kontrolny ROI jest minimalnie wybielony. Jajniki drosophilla wykazywały spadek sygnału wraz z głębokością tkanki i ważne jest, aby określić maksymalną głębokość tkanki, w której można wykryć florofory, takie jak TMRE i mitostain, podczas obrazowania na żywo. Analiza jakościowa z jednoczesnego barwienia TMRE i ogólnego barwienia mitochondriów pokazuje, że drisophilla germarium wykazuje wyższy potencjał mitochondrialny na jednostkę masy w stadium 2B.Na tym rysunku analiza półjakościowa pokazuje różnicę w potencjale mitochondrialnym na jednostkę masy między AFC i MBC, analizowanymi z komory jajowej etapu 9. Obrazy te ujawniają, że wychwyt mitosoksu zachodzi w mitotycznych i postmitotycznych komórkach pęcherzykowych drisophilla. W tym eksperymencie barwienie koimmunologiczne identyfikuje podwyższony sygnał decyklinowy nakładający się na mitochondrialny sygnał ATPB i klony nole DRP1 ujemne GFP w germarium i w komorze jajowej etapu 9.Opisane metody mogą być modyfikowane i stosowane do badania funkcji struktury mitochondrialnej w innych tkankach drzizofilskich. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak preparować, barwić i utrwalać obraz oraz żyć jajniki drisophilla w celu zbadania struktury i funkcji mitochondriów.

studying-mitochondrial-structure-and-function-in-drosophila-ovaries

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy protokół opisuje zastosowanie mikroiniekcji i obrazowania o wysokiej rozdzielczości w zarodku syncytialnym Drosophila melanogaster w celu badania mitozy.

Techniki mikroiniekcji do badania mitozy w embrionie syncytialnym Drosophila melanogaster

Kinetochor jest miejscem, w którym SAC inicjuje swój sygnał monitorujący segregację mitotyczną siostrzanych chromatyd. Opisano metodę wizualizacji rekrutacji i wymiany jednego z białek kinetochoru oraz jej koordynacji z ruchem chromosomów w embrionach Drosophila przy użyciu laserowego skanującego systemu konfokalnego Leica.

Badanie punktu kontrolnego mitozy poprzez obrazowanie dynamicznego zachowania białek kinetochorowych i ruchu chromosomów w żywych zarodkach syncytialnych Drosophila

Ten film opisuje ogólną anatomię jajnika Drosophila i przedstawia metodę preparowania jajników do obrazowania na żywo lub stałego.

Drosophila melanogaster (Drosophila melanogaster) Rozwarstwienie jajników: technika przygotowania tkanek ex vivo

Mitochondria odgrywają kluczową rolę w regulacji metabolizmu i homeostazy. Subtelne zmiany w metabolizmie mitochondrialnym, które wpływają na fizjologię organizmu, mogą być trudne do wykrycia w badaniach metabolomicznych całego organizmu. Tutaj opisujemy metodę izolacji, która zwiększa wykrywanie subtelnych zmian metabolicznych u Drosophila melanogaster.

Przygotowanie frakcji wzbogaconych w mitochondria do analizy metabolicznej u Drosophila

Oogeneza Drosophila nadal jest wyjątkowo przydatna w badaniach nad proliferacją i dziedziczeniem mitochondriów. Manuskrypt ten opisuje szczegółowy protokół używany do oznaczania replikującego się mitochondrialnego DNA (mtDNA) w dorosłych jajnikach Drosophila za pomocą 5-etynylo-2'-deoksyurydyny (EdU), co ułatwia odkrycie mechanizmów związanych z dziedziczeniem mitochondriów, które wcześniej były dyskusyjne.

In Situ Znakowanie replikacji mitochondrialnego DNA w dorosłych jajnikach Drosophila za pomocą barwienia EdU

Przedstawiamy protokoły pobierania, przygotowania i obrazowania dojrzałych oocytów Drosophila. Metody te pozwalają na wizualizację zachowania chromosomów oraz składania i funkcji wrzeciona podczas mejozy.

Techniki obrazowania prometafazy i metafazy mejozy I w utrwalonych oocytach Drosophila

W tym protokole demonstrujemy zastosowanie tomografii elektronowej o przekroju szeregowym do wyjaśnienia struktury mitochondrialnej w mięśniu lotu pośredniego Drosophila.

Ultrastruktura mitochondrialna 3D mięśnia lotu pośredniego Drosophila ujawniona przez tomografię elektronową o przekroju szeregowym

W tym artykule opisana jest metoda pomiaru zużycia tlenu za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości w permeabilizowanych piersiach Drosophila. Technika ta wymaga minimalnej ilości tkanki w porównaniu z klasyczną techniką izolacji mitochondriów, a uzyskane wyniki są bardziej istotne fizjologicznie.

Pomiar mitochondrialnego zużycia tlenu w przepuszczalnych włóknach Drosophila przy użyciu minimalnych ilości tkanki

Błona podstawna jest niezbędna do morfogenezy tkanek i narządów podczas rozwoju. Aby lepiej zrozumieć mechanizmy prowadzące do prawidłowego umiejscowienia tej struktury, w przedstawionym protokole opisano metody wizualizacji i charakterystyki wewnątrzkomórkowego transportu i wydzielania białek błony podstawnej w komórkach nabłonka za pomocą mikroskopii konfokalnej i superrozdzielczej.

Obrazowanie konfokalne i superrozdzielcze spolaryzowanego transportu wewnątrzkomórkowego i wydzielania białek błony podstawnej podczas oogenezy Drosophila

Tutaj prezentujemy protokół respirometrii o wysokiej rozdzielczości do analizy bioenergetyki u zmutowanych muszek owocowych PINK1B9-null. W metodzie wykorzystuje się protokół SUIT (Substrate-Uncouplingr-Inhibitor-Titration).

Analiza funkcji mitochondriów u Drosophila melanogaster PINK1B9-Null mutant przy użyciu respirometrii o wysokiej rozdzielczości

Poznaj metody analizy struktury i funkcji mitochondriów w żywych i utrwalonych tkankach jajników Drosophila melanogaster. Techniki te pozwalają szczegółowo badać relację struktura-funkcja organelli.

Badanie struktury i funkcji mitochondriów w jajnikach Drosophila

Przeglądaj więcej filmów