Badanie struktury i funkcji mitochondriów w jajnikach Drosophila

Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie metod badania struktury i funkcji mitochondriów w żywej i utrwalonej tkance w organizmie modelowym Drosophila melanogaster. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii mitochondrialnej. Takich jak mechanizmy regulacyjne funkcji mitochondriów.

Główną zaletą tej techniki jest to, że przeprowadza szczegółową analizę zależności między strukturą a funkcją mitochondriów. Po posortowaniu pięciu znieczulonych samic much zgodnie z protokołem tekstowym, pod mikroskopem preparacyjnym użyj dwóch par kleszczy, aby odciąć klatkę piersiową od brzucha. Następnie ostrożnie przenieś brzuchy do drugiego dołka naczynia.

Używając jednej pary kleszczy do przytrzymania brzucha na tylnym końcu, użyj drugiej pary kleszczy, aby powoli wypchnąć jajniki. Następnie użyj kleszczy, aby przytrzymać pojedynczy jajnik za nieprzezroczysty tylny koniec i ostrożnie przenieś go do trzeciego dołka naczynia w celu drażnienia lub mocowania. Ostrożnie drażnij osłonkę ochronną z okolic jajników, używając kleszczy do przytrzymania tylnego końca i lekko przesuwając igłę drażniącą od tylnego do przedniego końca.

Aby przygotować komory pokryte polilizenem, umieść dwie oddzielone krople polilizenu o pojemności 20 mikrolitrów na szkle nakrywkowym szalki Petriego ze szklanym dnem. Suszyć płytki na powietrzu w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę i obrysować polilizynę na spodniej stronie płytki. Ustaw parametry skanowania w mikroskopie konfokalnym, otwierając oprogramowanie do akwizycji obrazu, a w zakładce akwizycja ustaw odpowiednie parametry skanowania.

Zaznacz pola szeregów czasowych, wybielania i regionów, aby otworzyć poszczególne karty. Następnie wprowadź odpowiednie wartości parametrów akwizycji w każdej karcie. Następnie umieść jeden wypreparowany i drażniony jajnik na zaznaczonym obszarze pokrytym polilizyną i użyj igły do drażnienia, aby rozprowadzić jajnik i oddzielić jajniki.

Umieść 10-litrową kroplę pożywki do preparowania owadów na jajniku, upewniając się, że pokryła cały obszar pokryty polilizyną. Następnie przykryj szalkę Petriego. Natychmiast po zamontowaniu jajnika umieść próbkę na stoliku mikroskopu i za pomocą okularu szybko zlokalizuj pole zainteresowania w żywej tkance.

Kliknij przycisk na żywo, aby uzyskać obraz na żywo wybranego pola zainteresowania, a następnie kliknij przycisk Zatrzymaj, aby zatrzymać skanowanie na żywo. W razie potrzeby dostosuj parametry akwizycji tak, aby wykryty sygnał fluorescencyjny znajdował się poniżej poziomów nasycenia ze zdefiniowanym tłem ustawionym poprzez dostosowanie wartości przesunięcia. Na karcie graficznej użyj narzędzia do rysowania Beziera, aby narysować mały zwrot z inwestycji, aby wyznaczyć strefę wybielania zdjęć na obrazie uzyskanym przez skanowanie.

Następnie przeprowadź akwizycję obrazu, klikając rozpocznij eksperyment. Aby przeprowadzić barwienie na żywo fluorescencyjnymi barwnikami mitochondrialnymi, należy rozcieńczyć zapas barwników w ciepłym podłożu preparacyjnym do końcowych stężeń roboczych. Po wcześniejszym wypreparowaniu i drażnieniu umieść jajniki w 200 mikrolitrach roztworu barwiącego w studzience naczynia rozwarstwiającego.

Przykryj naczynie pudełkiem owiniętym folią aluminiową, aby chronić je przed światłem i inkubuj tkankę przez 10 minut. Następnie umyj poplamione jajniki, używając kleszczy, aby ostrożnie przesunąć je do trzech kolejnych studzienek zawierających podłoże bez plamy. W przypadku jednoczesnego barwienia za pomocą TMRE, w zgodnym ogólnym barwieniu mitochondrialnym, należy najpierw przeprowadzić barwienie TMRE, a następnie bez mycia tkanki, natychmiast przenieść próbkę do ogólnego barwienia mitochondrialnego.

Po umyciu i zamontowaniu jajników, jak pokazano wcześniej w tym filmie, aby przeprowadzić obrazowanie konfokalne na próbce, zaznacz pole cięcia z, aby otworzyć zakładkę. Obróć pokrętło ostrości w kierunku dolnej części próbki podczas skanowania na żywo i kliknij przycisk Ustaw najpierw, aby zdefiniować najniższy przekrój Z. Następnie przesuń pokrętło ostrości w przeciwnym kierunku, aby zdefiniować sekcję znajdującą się na samej górze.

Wykonaj akwizycję obrazu, klikając rozpocznij eksperyment. W przypadku żywej xvivamicroskopii dane powinny być uzyskane w ciągu 15 minut od zamontowania tkanki, w przeciwnym razie na wyniki eksperymentu mogą mieć wpływ zmiany fizjologii spowodowane zaszczepieniem obumarcia tkanki. Natychmiast po rozbiorze pod wyciągiem umieść jajniki w 200 mikrolitrach świeżego PFA o temperaturze pokojowej w studzience szklanego naczynia preparacyjnego.

Inkubuj tkankę przez 15 minut, aby ją naprawić. Po umyciu jajników w PBS zgodnie z protokołem tekstowym, jeszcze w PBS, drażnić jajniki, aby ostrożnie usunąć ochronną osłonkę z włókien, która może utrudniać dostęp antygenu z przeciwciała. Przepuszczalność drażnionych jajników, umieszczając je w probówce z mikrobezpiecznikiem o pojemności 500 mikrolitrów 0,5 procent tritanu x 100 w PBS.

Następnie umieść rurkę w zakrytym pudełku i ustaw na kołysanie z prędkością 25 obr./min przez 30 minut. Usuń PBS/TX zgodnie z protokołem tekstowym, zablokuj tkankę, dodając 200 mikrolitrów BSA rozpuszczonych w 0,5 procent PBS/TX. Inkubować próbki na bujaku w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę.

Po usunięciu roztworu blokującego dodać anty-wściekłą desyclinę E i przeciwciała anty-mysie ATPB. Inkubuj tkankę na bujaczku w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Po inkubacji należy użyć PBS-TX do trzykrotnego przemycia jajników przez 15 minut każdy.

Następnie dodać 200 mikrolitrów odpowiednich przeciwciał drugorzędowych i świeży PBS-TX i inkubować w temperaturze pokojowej przez godzinę. Po dwukrotnym umyciu chusteczki dodaj haczyki do trzeciego prania. Następnie za pomocą mikropipety o pojemności jednego mililitra wyjmij zabarwione immunologicznie jajniki z probówki z mikrobezpiecznikiem do świeżej studzienki szklanego naczynia preparacyjnego zawierającego 200 mikrolitrów PBS.

Dodaj jedną kroplę podłoża mocującego na bazie glicerolu do szkiełka podstawowego i dodaj jajniki wybarwione immunologicznie jeden po drugim do podłoża mocującego. Pod mikroskopem preparacyjnym, trzymając nieprzezroczystą część jajnika kleszczami, użyj igły do drażnienia, aby delikatnie wyrwać przezroczyste jajniki z nieprzezroczystych komór dojrzałej komórki jajowej. Następnie wyjmij komory dojrzałych jaj z podłoża montażowego.

Umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku podstawowym i lekko dociśnij, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie nośnika montażowego. Suszyć próbki na powietrzu przez 15 minut przed użyciem lakieru do paznokci w celu uszczelnienia krawędzi. Na koniec wykonaj mikroskopię konfokalną w razie potrzeby.

Jak pokazano tutaj, odwrócenie skierowane do jednej z chmur mitochondrialnych związanych z komórkami nersowymi prowadzi do ponad 50-procentowej utraty sygnału fluorescencyjnego z niebiesko-białego ROI otaczającego czerwony zwrot ROI w ciągu 200 sekund, podczas gdy żółty kontrolny ROI jest minimalnie wybielony. Jajniki drosophilla wykazywały spadek sygnału wraz z głębokością tkanki i ważne jest, aby określić maksymalną głębokość tkanki, w której można wykryć florofory, takie jak TMRE i mitostain, podczas obrazowania na żywo. Analiza jakościowa z jednoczesnego barwienia TMRE i ogólnego barwienia mitochondriów pokazuje, że drisophilla germarium wykazuje wyższy potencjał mitochondrialny na jednostkę masy w stadium 2B.

Na tym rysunku analiza półjakościowa pokazuje różnicę w potencjale mitochondrialnym na jednostkę masy między AFC i MBC, analizowanymi z komory jajowej etapu 9. Obrazy te ujawniają, że wychwyt mitosoksu zachodzi w mitotycznych i postmitotycznych komórkach pęcherzykowych drisophilla. W tym eksperymencie barwienie koimmunologiczne identyfikuje podwyższony sygnał decyklinowy nakładający się na mitochondrialny sygnał ATPB i klony nole DRP1 ujemne GFP w germarium i w komorze jajowej etapu 9.

Opisane metody mogą być modyfikowane i stosowane do badania funkcji struktury mitochondrialnej w innych tkankach drzizofilskich. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak preparować, barwić i utrwalać obraz oraz żyć jajniki drisophilla w celu zbadania struktury i funkcji mitochondriów.