Eksperymentalny protokół wykrywania sinic w próbkach ciekłych i stałych za pomocą chipa mikromacierzy przeciwciał

Ogólnym celem tej procedury jest określenie obecności wielu szczepów sinic w próbkach ciekłych i stałych za pomocą testu immunologicznego z mikromacierzą fluorescencyjną. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie środowiska, monitorowania i gospodarki wodnej, takie jak obecność toksyn wytwarzających bakterie wytwarzające protooksyny, zanim zakwity staną się widoczne gołym okiem. Główną zaletą tej techniki jest to, że wiele szczepów sinic i wiele próbek może być monitorowanych jednocześnie w okresie trzech, czterech godzin, zarówno in situ, jak i w laboratorium.

Tak więc te metody mogą zapewnić wgląd w różnorodność biologiczną. Może być również stosowany w innych dziedzinach, takich jak monitorowanie instalacji rolniczych, wykrywanie życia w środowiskach szczepów lub eksploracja planetarna. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, nie będą walczyć.

Ze względu na prostotę przetwarzania próbek i łatwiejszą interpretację wyników. Po wytworzeniu i oczyszczeniu przeciwciał zgodnie z protokołem tekstowym, dodaj 100 mikrolitrów DMSO do komercyjnej fiolki zawierającej barwnik do znakowania, jeden miligram białka. Po rozpuszczeniu barwnika oznaczyć oczyszczone przeciwciała, dodając dwa mikrolitry barwnika do 50 mikrolitrów każdego preparatu przeciwciał.

Reakcje etykietowania należy utrzymywać w temperaturze otoczenia w ciągłym mieszaniu na platformie wibracyjnej przez jedną godzinę. Po oczyszczeniu znakowanych przeciwciał zgodnie z protokołem tekstowym, załadować małą porcję do spektrofotometru i zmierzyć absorbancję przy 280 i 650 nanometrach. Oblicz wydajność etykietowania, postępując zgodnie z zaleceniami dostawcy.

Aby wytworzyć CYANOCHIP, przygotuj 30 mikrolitrów każdego oczyszczonego przeciwciała, mieszając jeden miligram na mililitr przeciwciała w buforze do drukowania białka 1X o objętości 01% na objętość Tween 20. Przygotuj 30 mikrolitrów następujących roztworów drukarskich jako kontrole. 1X białkowy bufor drukarski z 01% objętości na wolumin Tween 20.

Każde białko Oczyszczona surowica przedimmunologiczna w ilości jednego miligrama na mililitr w buforze drukującym białko 1X z 01%Tween 20 i jednym miligramem na mililitr BSA oraz 1X buforem do drukowania białka z 01% Tween 20. Dodaj 30 mikrolitrów na dołek przygotowanych roztworów drukarskich do wysokiej jakości mikropłytek 384-dołkowych. Po ustawieniu robota drukującego i podłoży szkiełek zgodnie z protokołem tekstowym, umieść wszystkie przeciwciała i kontrole na szkiełkach w potrójnym wzorze plamki o średnicy około 180 do 200 mikronów.

Do pobierania próbek w środowisku należy użyć sterylnej strzykawki, aby zebrać od jednego do 100 mililitrów płynów i zagęścić komórki, przepuszczając próbkę przez filtr o wielkości porów o wielkości trzech mikronów. W razie potrzeby należy pobrać próbki stałe ze skał lub gleby i przechowywać je w sterylnych probówkach. Próbki można badać w małym laboratorium terenowym.

Dodaj jeden mililitr buforu do inkubacji ekstrakcyjnej, aby odzyskać biomasę zebraną w filtrze i użyj szpatułki, aby zeskrobać filtr do 15-mililitrowej probówki. Za pomocą ręcznego procesora ultradźwiękowego lub poprzez kilkukrotne pipetowanie w górę i w dół, próbka jest agregowana i homogenizowana. Ponadto zważyć do 0,5 grama próbki stałej w osobnej probówce o pojemności 10 mililitrów i dodać do dwóch mililitrów buforu ekstrakcyjnego.

Zanurz sondę sonikatora w rurce i poddaj sonizacji za pomocą ręcznego procesora ultradźwiękowego lub innego urządzenia ultradźwiękowego. Trzymając próbkę na lodzie, wykonaj co najmniej pięć 30-sekundowych cykli w 30 kilohercach, zatrzymując się na 30 sekund między sonikami. Aby przygotować ekstrakt filtratu do testu immunologicznego, użyj 10-mililitrowej strzykawki połączonej z nylonowym uchwytem filtra o wielkości porów od pięciu do 20 mikronów, aby przefiltrować roztwór do 1,5-mililitrowej probówki w celu usunięcia piasku, gliny i innego gruboziarnistego materiału.

Z plamkami mikromacierzy skierowanymi w dół, połóż szkiełko na kropli roztworu blokującego o objętości od 100 do 200 mikrolitrów i inkubuj przez trzy do pięciu minut. Używając kleszczyków z plastikową końcówką i unikając stref mikromacierzy, ostrożnie podnieś szkiełko. Zanurzyć szkiełko w świeżym roztworze blokującym i inkubować szkiełko z łagodnym mieszaniem przez 30 minut.

Aby wysuszyć szkiełko, umieść je w wirówce przystosowanej do szkiełek mikroskopowych i krótko zakręć. Ustaw szkiełko w kasecie hybrydyzacyjnej z trzema na osiem dołków mikromacierzowych, postępując zgodnie z instrukcjami dostawcy. Alternatywnie, po zmodyfikowaniu wzoru drukowania przeciwciał, skonfiguruj niestandardową kasetę, taką jak ta pokazana tutaj, lub po prostu użyj slajdów okładkowych do konfiguracji.

Po zmontowaniu szkiełka i kasety należy odpipetować do 50 mikrolitrów każdej próbki ekstraktu lub rozcieńczyć ją w buforze inkubacyjnym do ekstrakcji do każdej studzienki kasety. Alternatywnie, załaduj próbki do innych urządzeń inkubacyjnych lub po prostu użyj szkiełek podstawowych. Jako ślepą próbę należy odpipetować 50 mikrolitrów buforu TBSTRR do co najmniej dwóch oddzielnych studzienek kasety.

Próbki należy inkubować w temperaturze otoczenia przez godzinę i mieszać pipetując co 15 minut lub inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 12 godzin. Aby umyć mikromacierze, odłóż kasetę i ostrożnie postukaj nią o czysty chłonny papier. Następnie umyj studzienki, dodając do każdej z nich 150 mikrolitrów buforu do inkubacji ekstrakcyjnej i usuń bufor, stukając w papier chłonny, jak poprzednio.

Powtórz pranie jeszcze trzy razy. Do każdej studzienki dodaj 50 mikrolitrów mieszaniny przeciwciał fluorescencyjnych, która zawiera 17 przeciwciał szczepu antycyjanobakteryjnego. Próbki należy inkubować w temperaturze otoczenia przez godzinę lub w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 12 godzin.

Aby umyć mikromacierze, ostrożnie odłóż kasetę i delikatnie postukaj nią o czysty chłonny papier. Następnie dodaj 150 mikrolitrów buforu do inkubacji ekstrakcji przed usunięciem go przez stukanie w ręcznik papierowy. Powtórz pranie trzy razy.

Następnie zdemontuj kasetę i zanurz szkiełko w roztworze 0,1X PBS w celu szybkiego spłukania. Szybko odwirować jak poprzednio, aby wysuszyć szkiełko. Za pomocą skanera fluorescencyjnego zeskanuj szkiełko w poszukiwaniu fluorescencji przy maksymalnym piku emisji dla dalekiej czerwieni barwnika fluorescencyjnego.

Wykonaj kilka zdjęć mikromacierzy przy różnych parametrach skanowania, zmieniając wartość wzmocnienia. Na koniec załaduj siatkę, określ ilościowo, a następnie przetwórz i przeanalizuj dane zgodnie z protokołem tekstowym. Test immunologiczny CYANOCHIP multiplex zademonstrowany w tym filmie został wykorzystany do przeprowadzenia testu w celu jednoczesnej identyfikacji najbardziej odpowiednich gatunków sinic słodkowodnych, wymienionych w tej tabeli.

Próbki wody pobrane na brzegu zbiornika słodkowodnego analizowano za pomocą testu mikromacierzowego. Główne dodatnie reakcje immunologiczne odpowiadały przeciwciałom przeciwko planktonicznym sinicom z gatunku microcystis oraz bentosowym gatunkom leptolyngbya. Niższe sygnały fluorescencyjne uzyskano dla gatunków planktonowych nostocales aphanizomenon, anabaena, microcystis flos-aquae i gatunków bentosowych rivularia.

Mikromacierz została również zweryfikowana poprzez przetestowanie suchej maty mikrobiologicznej z antarktydy w celu zbadania obecności markerów sinicowych. Dodatnie reakcje przeciwciał uzyskano wobec sinic bentosowych, gatunków anabaena i leptolyngbya. Dodatkowe dodatnie reakcje immunologiczne wykryto w przypadku przeciwciał przeciwko sinicom planktonowym, takim jak gatunki microcystis, aphanizomenon i planktothrix rubescens.

Wreszcie, sygnały te uzyskano z przeciwciał przeciwko innym gatunkom bentosu, w tym gatunkom tolypothrix i gatunkom Anabaena. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu trzech, czterech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo, z wyłączeniem produkcji przeciwciał i wyrównywania. Dzięki jednoczesnej inkubacji próbki i przeciwciałom fluorescencyjnym można zaoszczędzić jedną godzinę.

Podejmując się tych procedur, należy pamiętać, aby przygotować mieszaninę przeciwciał fluorescencyjnych z przeciwciałem w optymalnym rozcieńczeniu roboczym. Zgodnie z tymi procedurami można wykonać inne metody, takie jak mikroskopia optyczna lub ekstrakcja DNA i specyficzna amplifikacja PCR, w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak stężenie w glebie lub potwierdzenie rodzaju wykrytego szczepu. Po jej opracowaniu, technika ta utoruje drogę naukowcom zajmującym się monitorowaniem środowiska do badania zbiorników wodnych, w procesach bikulturowych, gospodarce słodkowodnej lub badaniach ekologii mikrobiologicznej, niezależnie od rodzaju próbki.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak znakować przeciwciała fluorescencją, manipulować mikromacierzami przeciwciał, wykonywać multipleksowy test immunologiczny oraz analizować i interpretować wyniki testów immunologicznych mikromacierzy. Nie zapominaj, że praca z ultradźwiękami może być niebezpieczna, a środki ostrożności, takie jak noszenie ochronników słuchu lub inne szczególne środki ostrożności, powinny być zawsze podejmowane podczas wykonywania tych procedur.