Name: Wspomagany rusztowaniem przeszczep wysp trzustkowych w poduszce tłuszczowej najądrza myszy z cukrzycą (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: Poznaj izolację wysp trzustkowych i przeszczep wspomagany rusztowaniem do poduszki tłuszczowej najądrza myszy z cukrzycą. Ta metoda odwraca hiperglikemię i poprawia przeżycie przeszczepu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować Wei Zhangowi z Guanhao Biotech za dostarczenie rusztowań z decelularyzacji. Dziękujemy Xiao-hong Peng za pomocne dyskusje. Badania te były wspierane finansowo przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (projekt nr 31322021).

Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt Uniwersytetu Pekińskiego (IACUC, IACUC nr COE-LuoY-1).
1. Izolacja wysepek
<ol>
	<li>Przygotowanie odczynników i sprzętu.
	<ol>
		<li>Zrekonstytuować proszek kolagenazy P (2 U/mg) w HBSS, aby otrzymać roztwór o stężeniu 5 mg/mL, a następnie przefiltrować go przez filtr 0,22 µm w celu usunięcia bakterii. Przygotować alikwoty po 0,6 mL roztworu kolagenazy P w stożkowych probówkach 15-mL i przechowywać w temperaturze -20 °C. 
		UWAGA: Podczas użytkowania każdą alikwot rozcieńcza się HBSS, aby otrzymać 6-mL roztwory robocze o końcowych stężeniach 0,5 mg/mL lub 1 U/mL (ilość wystarczająca do opracowania 3 myszy). Roztwór roboczy należy przechowywać w lodzie i zużyć w ciągu 1 h. Roztworu roboczego nie należy rozmrażać ani ponownie zamrażać do dalszego użytku.</li>
		<li>Przygotować roztwór neutralizujący poprzez dodanie FBS (2,5%) i P/S (1%) do HBSS; roztwór przechowywać w lodzie. Przygotować 60 mL roztworu neutralizującego do opracowania 6 myszy.</li>
		<li>W celu przygotowania pożywki do hodowli wysepek dodać D-glukozę (7 mM), FBS (10%) oraz P/S (1%) do pożywki RPMI 1640.</li>
		<li>Zautoklawować instrumenty chirurgiczne w temperaturze 115 °C przez 30 min przy ciśnieniu 15 psi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kanalizacja trzustki.
	<ol>
		<li>Przygotować 12 mL roztworu roboczego kolagenazy, zgodnie z opisem w kroku 1.1.1, dla 6 myszy (w wieku 12 tygodni). Napełnić strzykawkę 10-mL ilością 9 mL roztworu roboczego i podłączyć ją do igły dożylnej 27 G. Strzykawkę przechowywać w lodzie i zużyć roztwór w ciągu 1 h.</li>
		<li>Uśmiercić mysz poprzez zwichnięcie kręgów szyjnych. Położyć mysz na plecach na ręczniku papierowym, ogonem skierowanym w stronę operatora. Spryskać całe ciało 70% etanolem, tak aby było całkowicie wilgotne.</li>
		<li>Wyciąć otwór w kształcie litery V, zaczynając od okolic narządów płciowych i prowadząc cięcie do przepony, używając nożyczek sekcyjnych i pęsety. Odchylić skórę w stronę klatki piersiowej, aby całkowicie odsłonić jamę brzuszną.</li>
		<li>Przesunąć jelita na prawą stronę myszy i odsłonić trzustkę oraz wspólny przewód żółciowy. Ostrożnie chwycić dwunastnicę pęsetą i pociągnąć ją, aż przewód żółciowy zostanie napięty (Rycina 1A-1 i A-2).</li>
		<li>Zlokalizować żyłę wrotną i przewód żółciowy prowadzący do wątroby. Zaciisnąć żyłę wrotną i przewód żółciowy mikroclampem hemostatycznym. 
		UWAGA: Zaciśnięcie zapobiega nadmiernemu krwawieniu oraz przedostawaniu się kolagenazy do wątroby.</li>
		<li>Trzymając nadal jelito pęsetą, zlokalizować miejsce występowania brodawki łączącej przewód żółciowy z dwunastnicą. Wprowadzić igłę dożylną 27G do wspólnego przewodu żółciowego poprzez brodawkę (Rycina 1B-1 i B-2).</li>
		<li>Podać około 200 µL roztworu roboczego kolagenazy, aby sprawdzić, czy kanulacja przebiega przez cały przewód żółciowy. Jeśli roztwór kolagenazy zaczyna wypełniać przewód (Rycina 1C-1 i C2), oznacza to, że igła znajduje się w świetle przewodu; zaciisnąć odcinek przewodu zawierający igłę za pomocą zacisku hemostatycznego do tętnic i podać pozostałe 2 mL roztworu powolnym, stałym strumieniem w ciągu 1 min (Rycina 2A-1, A-2 i B-1). 
		UWAGA: Jeśli tkanka otaczająca przewód zaczyna pęcznieć (Rycina 2B-2), oznacza to, że igła przebiła ścianę przewodu żółciowego, co wymaga ponownego ustawienia igły i ponownej próby kanulacji przewodu żółciowego. Podobnie, jeśli dwunastnica zaczyna pęcznieć (Rycina 2C-1 i C-2), należy skorygować położenie zacisku hemostatycznego do tętnic i ponownie zkanulować przewód żółciowy. W miarę wypełniania trzustki roztworem kolagenazy, najpierw pęcznieje tkanka w pobliżu dwunastnicy, a następnie obszar w pobliżu ogona trzustki. Perfuzja ogona trzustki (płata śledzionowego) jest istotna dla maksymalizacji wydajności wyizolowanych wysepek.</li>
		<li>Po całkowitym wypełnieniu trzustki (Rycina 2C-1), przesunąć jelita na lewą stronę myszy i wyciąć trzustkę, zaczynając od zstępującego odcinka okrężnicy. Użyć pęsety do uniesienia jelit i oddzielenia ich od trzustki za pomocą drugiej pęsety. Kontynuować usuwanie trzustki, aż zostanie oddzielona od górnej części żołądka. Na koniec unieść trzustkę z jamy brzusznej i odciąć ją od pozostałej części śledziony. 
		UWAGA: Cały proces oddzielania powinien być przeprowadzony szybko, ponieważ trawienie trwa nadal podczas usuwania organu.</li>
		<li>Umieścić trzustkę w pustej stożkowej probówce 15-mL i pozostawić w lodzie. Powtórzyć powyższą procedurę dla pozostałych myszy. Wszystkie trzustki należy przetworzyć w ciągu 1 h, niezwłocznie przechodząc do kroku 1.3, aby zapobiec nadmiernemu trawieniu przez kolagenazę P.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Schemat anatomiczny i zdjęcia z sekcji przedstawiające przewód żółciowy, ampułę, wątrobę i nerkę w układzie chirurgicznym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54995/54995fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Fotografie przedstawiające kanulację przewodu żółciowego oraz perfuzję trzustki roztworami kolagenazy. (A1) Odciąganie dwunastnicy do momentu naciągnięcia przewodu żółciowego. (ampulla: trójkątny, mleczny obszar na powierzchni dwunastnicy; bile duct: sznurowata, mleczna struktura na powierzchni). (B1) Wprowadzanie igły do przewodu żółciowego od strony ampuły. (C1) Rozszerzanie trzustki poprzez wstrzyknięcie enzymu. (A2, B2, oraz C2) Schematyczne przedstawienie procedur pokazanych odpowiednio na zdjęciach A1, B1 i C1. <a href="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54995/54995fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat eksperymentu wypełniania przewodu, pokazujący proces wstrzykiwania barwnika oraz wynikowe zmiany w przewodzie i dwunastnicy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54995/54995fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Rozwiązywanie problemów podczas kanulacji. (A1) Końcówka igły wprowadzona do światła przewodu żółciowego. (A2) Przewód wypełniony roztworami enzymów. (B1) Igła wprowadzona do światła przewodu żółciowego, a przewód wypełniony niebieskim barwnikiem. (B2) W wyniku nieprawidłowej kanulacji igła znajduje się poniżej przewodu żółciowego, a po podaniu niebieskiego barwnika widoczna jest jedynie napuchnięta torebka. (C1) Prawidłową kanulację potwierdza rozszerzenie trzustki. (C2) W wyniku nieprawidłowego zaciskania niebieski barwnik przedostaje się do dwunastnicy, powodując jej rozszerzenie. <a href="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54995/54995fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<ol start="3">
	<li>Trawienie i oczyszczanie wysepek.
	<ol>
		<li>Inkubować probówki stożkowe zawierające perfundowaną trzustkę w temperaturze 37 °C przez 17 min. 
		UWAGA: Czas inkubacji może różnić się w zależności od wieku i gatunku zwierzęcia.</li>
		<li>Przerwać trawienie, dodając 7 mL roztworu neutralizującego i umieszczając probówki na lodzie.</li>
		<li>Rozbić tkankę, energicznie wstrząsając probówkami (np. 20 razy w ciągu 10 s), aż do uzyskania drobnych cząstek tkanki. 
		UWAGA: Wydajność wysepek będzie niska, jeśli trzustka nie zostanie całkowicie rozbita.</li>
		<li>Przefiltrować próbki strawionej tkanki przez siatkę drucianą o oczkach 0,5 mm, aby usunąć niestrawione fragmenty tkanki. Zebrać zawiesiny wysepek do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 mL.</li>
		<li>Wirować probówki przez 3 min przy 230 x g i 4 °C, a następnie ostrożnie odlać nadsącz, nie naruszając pelletów tkankowych.</li>
		<li>Resuspendować pellety od 3 myszy w 4 mL gradientu gęstości polisacharydowej poprzez delikatne mieszanie na wortexie lub kilkakrotne pipetowanie zawiesiny w górę i w dół. Powoli nalać 4 mL HBSS po ściance probówki na powierzchnię roztworów polisacharydowych. 
		UWAGA: Dwa roztwory powinny tworzyć wyraźnie oddzielone warstwy z ostrą granicą styku. 
		UWAGA: Dodawanie HBSS należy przeprowadzać ostrożnie, aby nie naruszyć gradientu gęstości polisacharydowej na dnie.</li>
		<li>Wirować zawiesinę przez 20 min przy 900 x g i 4 °C, wybierając bardzo niską prędkość przyspieszenia. Zakończyć wirowanie bez hamowania. 
		UWAGA: Jest to etap oczyszczania wysepek z komórek egzokrynnych; większość wysepek migruje do granicy między warstwami polisacharydów i HBSS, natomiast większość komórek egzokrynnych osiada na dnie.</li>
		<li>Usunąć całą objętość 8 mL nadsączu za pomocą pipety 15-mL o szerokim otworze. Przepuścić roztwory przez odwrócone sitko o rozmiarze oczek 70 µm. 
		UWAGA: Wysepki zostaną dalej oczyszczone i zatrzymane na sitku, podczas gdy komórki egzokrynn przejdą przez filtr. 
		Uwaga: Gradient gęstości polisacharydowej jest toksyczny dla komórek; filtracja pomoże wysepkom pozbyć się polisacharydów.</li>
		<li>Nalać 2 mL zimnego roztworu neutralizującego do szalki Petriego o średnicy 35 mm. Odwrócić sitko komórkowe stroną górną do dołu, zanurzyć powierzchnię zatrzymującą wysepki w roztworze i delikatnie potrząsać, aby uwolnić wysepki.</li>
		<li>Wybrać wysepki ręcznie pod mikroskopem, używając pipety 20-µL z białym końcowym. 
		UWAGA: Wysepki są żółtawymi, zwartymi agregatami komórkowymi (Rysunek 3A), podczas gdy zanieczyszczająca tkanka lub komórki egzokrynn mają strukturę czarnawą i luźną w obrazie mikroskopu dissectingowego.</li>
		<li>Umieścić około 200 wysepek w szalce 35-mm z 2 mL pożywki hodowlanej i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 przez 12 h. 
		UWAGA: Z jednej 12-tygodniowej myszy C57BL/6J można zazwyczaj pozyskać 150-300 wysepek. Wysepki mają tendencję do tworzenia agregatów podczas hodowli, a duże wysepki (&gt;300 µm) są podatne na martwicę centralną (Rysunek 1B, wstawka). Dobrze wstrząsnąć zawiesiną, aby równomiernie rozmieścić wysepki w szalce i ograniczyć ich zlepianie się.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Hodowla wysepek na rusztowaniu
UWAGA: DCS posiada porowatość wynoszącą około 79%, grubość około 0,6 mm oraz rozmiar porów w zakresie od 12 do 300 µm.
<ol>
	<li>Wyciąć rusztowania w formie dysków o średnicy 7 mm, namoczyć je w 70% etanolu, a następnie przemyć roztworem HBSS. Umieścić rusztowania w 24-dołkowych wkładkach do hodowli tkankowej. 
	UWAGA: Świeże wyizolowane wysepki po nocnej hodowli są jasne i zwarte, o gładkich krawędziach (Rycyna 3B).</li>
	<li>Delikatnie zakręcić naczyniem i zebrać wysepki z jego środka za pomocą pipety 20 µL z białą końcówką. Przenieść wysepki na rusztowania (250 wysepek/rusztowanie) przy użyciu pipety i dodać 2 mL pożywki hodowlanej do dołka. Hodować wysepki przez 12 h przed transplantacją.</li>
</ol>
3. Transplantacja wysepek w miejscu EFP
<ol>
	<li>Indukcja cukrzycy u myszy biorców.
	<ol>
		<li>Umieścić myszy C57BL/6J (w wieku powyżej 10 tygodni) w czystej klatce z dostępem do wody, ale bez pożywienia. Poddać myszy 10-godzinnemu postowi przed indukcją cukrzycy.</li>
		<li>Przygotować roztwory buforowe o wartościach pH 4,2-4,5, mieszając 0,1 M kwas cytrynowy z 0,1 M cytrynianem sodu. Rozpuścić STZ (10 mg/mL) w świeżo przygotowanym buforze i wysterylizować roztwór, przepuszczając go przez filtr 0,22 µm. 
		UWAGA: STZ jest światłoczuły i traci aktywność w ciągu 10 min; świeży roztwór STZ należy zawsze przygotowywać bezpośrednio przed wstrzyknięciem.</li>
		<li>Wstrzyknąć każdej myszy C57BL/6J dojamowo STZ w dawce 140-150 mg/kg. 
		UWAGA: Dawka różni się w zależności od wieku i gatunku zwierzęcia. Przed rozpoczęciem formalnego eksperymentu zaleca się przeprowadzenie małoscale'owego testu optymalizacji dawki dla danego gatunku.</li>
		<li>Pobrać krew z żyły ogonowej i monitorować poziom glukozy we krwi za pomocą glukometru w 2., 3. i 4. dniu po wstrzyknięciu STZ. 
		UWAGA: Zwierzęta są gotowe do transplantacji wysepek, gdy przez dwa kolejne dni wykazują hiperglikemię (poziom glukozy we krwi na czczo &gt; 16,7 mM).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transplantacja wysepek do miejsca EFP.
	<ol>
		<li>Zanestetyzować myszy, podając dojamowo pentobarbital (50 mg/kg). Umieścić mysz w pozycji grzbietowej na ręczniku papierowym, ogonem skierowanym w stronę operatora. Szeroko ogolić brzuch, aby usunąć sierść z okolic miejsca nacięcia. Przymocować wszystkie cztery kończyny taśmą i całkowicie przemyć skórę, używając naprzemiennie gazików z alkoholem i jodoforem, poruszając nimi okrężnie w celu sterylizacji miejsca nacięcia. Przykryć mysz sterylnym obłożem, pozostawiając dostęp jedynie do obszaru nacięcia. Wykonać nacięcie ściany otrzewnej o długości 7 mm w linii środkowej, blisko okolic narządów płciowych. 
		UWAGA: Wszystkie instrumenty używane podczas operacji, w tym rękawiczki, powinny być sterylne.</li>
		<li>Ostrożnie chwycić i wyjąć EFP z jamy brzusznej za pomocą pęsety. Rozłożyć EFP na zwilżonej sterylnej gazie. Umieścić rusztowanie zawierające wysepki na EFP i złożyć EFP, aby owinąć transplantat. Zabezpieczyć bezpośredni kontakt między wysepkami a EFP, zszywając EFP rozpuszczalnymi szwami 6-0. Zwilżyć powierzchnię EFP sterylnym roztworem soli fizjologicznej za pomocą nasączonego patyczka bawełnianego, aby zapobiec wysychaniu EFP.</li>
		<li>Ostrożnie umieścić EFP z powrotem w jamie brzusznej. Zamknąć nacięcie, zszywając ścianę otrzewną i spinając warstwę skóry klipsami do ran.</li>
		<li>Wstrzyknąć podskórnie buprenorfinę (0,1 mg/kg) jako środek przeciwbólowy.</li>
		<li>Wstrzyknąć podskórnie 1 mL soli fizjologicznej, aby zapobiec odwodnieniu.</li>
		<li>Umieścić mysz w klatce na podkładce grzewczej, aż do momentu wybudzenia z narkozy.</li>
		<li>Sprawdzić poziom glukozy we krwi (po posiłku) dwa dni później, pobierając krew z żyły ogonowej. W przypadku odzyskiwania przeszczepu powtórzyć powyższe procedury transplantacyjne, ostrożnie wyciągnąć EFP, użyć szwu 3-0 do podwiązania końca tkanki tłuszczowej przylegającej do najądrza, zamknąć naczynia krwionośne, wyeksplantować przeszczep EFP i zabezpieczyć go do badania histologicznego. 
		UWAGA: Eksplantacja wysepek powinna ponownie spowodować hiperglikemię u myszy biorców w ciągu 3 dni, co potwierdza funkcjonalność przeszczepu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).</li>
<li>Shapiro, A. M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+Trial+of+the+Edmonton+Protocol+for+Islet+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">International Trial of the Edmonton Protocol for Islet Transplantation.</a> N Engl J Med. 355, 1318-1330 (2006).</li>
<li>Ryan, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Five-year+follow-up+after+clinical+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Five-year follow-up after clinical islet transplantation.</a> Diabetes. 54, 2060-2069 (2005).</li>
<li>Merani, S., Toso, C., Emamaullee, J., Shapiro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+implantation+site+for+pancreatic+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Surg%22%5BJournal%5D)">Optimal implantation site for pancreatic islet transplantation.</a> Br J Surg. 95, 1449-1461 (2008).</li>
<li>Schmidt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+islets+find+a+new+transplant+home+in+the+omentum%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Pancreatic islets find a new transplant home in the omentum.</a> Nat Biotechnol. 35 (1), (2017).</li>
<li>Dufour, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+ectopic+site+for+islet+transplantation%2C+using+biodegradable+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Development of an ectopic site for islet transplantation, using biodegradable scaffolds.</a> Tissue Eng. 11, 1323-1331 (2005).</li>
<li>Weaver, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+Release+of+Dexamethasone+from+Organosilicone+Constructs+for+Local+Modulation+of+Inflammation+in+Islet+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Controlled Release of Dexamethasone from Organosilicone Constructs for Local Modulation of Inflammation in Islet Transplantation.</a> Tissue Eng Part A. 21, 2250-2261 (2015).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Micro+to+Macro%3A+The+Hierarchical+Design+in+a+Micropatterned+Scaffold+for+Cell+Assembling+and+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">From Micro to Macro: The Hierarchical Design in a Micropatterned Scaffold for Cell Assembling and Transplantation.</a> Adv Mater. 29, (2017).</li>
<li>Blomeier, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+Scaffolds+as+Synthetic+Microenvironments+for+Extrahepatic+Islet+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Polymer Scaffolds as Synthetic Microenvironments for Extrahepatic Islet Transplantation.</a> Transplantation. 82, 452-459 (2006).</li>
<li>Gibly, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrahepatic+islet+transplantation+with+microporous+polymer+scaffolds+in+syngeneic+mouse+and+allogeneic+porcine+models%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Extrahepatic islet transplantation with microporous polymer scaffolds in syngeneic mouse and allogeneic porcine models.</a> Biomaterials. 32, 9677-9684 (2011).</li>
<li>Moskalewski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Culture+of+the+Islets+of+Langerhans+of+the+Guinea+Pig%5BTitle%5D)+AND+%22Gen+Comp+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Isolation and Culture of the Islets of Langerhans of the Guinea Pig.</a> Gen Comp Endocrinol. 5, 342-353 (1965).</li>
<li>Lacy, P. E., Kostianovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+the+isolation+of+intact+islets+of+Langerhans+from+the+rat+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Method for the isolation of intact islets of Langerhans from the rat pancreas.</a> Diabetes. 16, 35-39 (1967).</li>
<li>Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+for+Murine+Islet+Isolation+and+Subcapsular+Kidney+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation.</a> J Vis Exp. (50), (2011).</li>
<li>Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+islet+isolation+from+mouse+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for islet isolation from mouse pancreas.</a> Nat Protoc. 4, 1649-1652 (2009).</li>
<li>Stull, N. D., Breite, A., McCarthy, R., Tersey, S. A., Mirmira, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Islet+of+Langerhans+Isolation+using+a+Combination+of+Purified+Collagenase+and+Neutral+Protease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease.</a> J Vis Exp. (67), (2012).</li>
<li>Sakata, N., Yoshimatsu, G., Tsuchiya, H., Egawa, S., Unno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+diabetes+mellitus+for+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Diabetes+Res%22%5BJournal%5D)">Animal models of diabetes mellitus for islet transplantation.</a> Exp Diabetes Res. , 256707(2012).</li>
<li>Schmidt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+islets+find+a+new+transplant+home+in+the+omentum%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">Pancreatic islets find a new transplant home in the omentum.</a> Nat Biotech. 35, 8-8 (2017).</li>
<li>Londono, R., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biologic+scaffolds+for+regenerative+medicine%3A+mechanisms+of+in+vivo+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Biologic scaffolds for regenerative medicine: mechanisms of in vivo remodeling.</a> Ann Biomed Eng. 43, 577-592 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Perfuzja trzustki i czas trawienia to dwa kluczowe parametry, które wpływają na wydajność i jakość wysp trzustkowych. Moskalewski jako pierwszy poinformował o użyciu surowej mieszanki kolagenazy do trawienia mielonej trzustki świnki morskiej11. Lacy i wsp. opisali wstrzyknięcie enzymów do systemu przewodów w celu perfuzji trzustki, co znacznie zwiększyło wydajność wysp trzustkowych12. Perfuzja przewodowa enzymu pozwala na maksymalne wystawienie powierzchni trzustki...

Cukrzyca typu 1 (T1D) to autoimmunologiczne zaburzenie endokrynologiczne, w którym komórki wysp trzustkowych są ablowane przez układ odpornościowy, co sprawia, że pacjenci są zależni od wstrzykiwania egzogennej insuliny przez całe życie. Protokół z Edmonton stanowi kamień milowy w badaniach klinicznych nad przeszczepem wysp trzustkowych; Wyspy trzustkowe zostały wprowadzone przez żyłę wrotną i przeszczepione w miejscu wewnątrzwątrobowym1. Jednak dwie główne przeszkody - nieodpowiednie źródła wysepek dawczych i słabe wszczepienie wysp trzustkowych - uniemożliwiają szerokie powodzenie przeszczepu wysp trzustkowych2. Zwykle wysepki muszą być pobrane od trzech zmarłych dawców, aby odwrócić stan hiperglikemiczny jednego pacjenta; Wynika to z niskiej wydajności procedur izolacji wysp trzustkowych i utraty wysp trzustkowych po przeszczepie. W szczególności, mimo że wyspy trzustkowe po przeszczepie były skąpane w krwi bogatej w tlen, bezpośredni kontakt z krwią często wywoływał natychmiastową reakcję zapalną za pośrednictwem krwi (IBMIR), która mogła spowodować ostrą utratę wysp. W dłuższej perspektywie uważa się, że stopniowa utrata wysp trzustkowych u pacjentów odpowiadała za spadek wskaźników odwrócenia cukrzycy w grupach klinicznych, które mogły osiągnąć 90% w pierwszym roku i spadły do 30% i 10% odpowiednio 2 i 5 lat po przeszczepie3.
Przeszczepianie wysp trzustkowych w miejscach pozawątrobowych było atrakcyjną strategią zmniejszania bezpośredniego kontaktu wysp trzustkowych z krwią, jednocześnie ograniczając przeszczepy do bardziej określonych miejsc w porównaniu do infuzji wewnątrzwątrobowej. W ciągu ostatnich lat przeprowadzono badania w torebce nerkowej, oku, mięśniach, poduszeczkach tłuszczowych i przestrzeniach podskórnych, wykazując, że wysepki w tych miejscach są w stanie przetrwać i funkcjonować w celu przywrócenia normoglikemii4. Ponadto wysepki w tych miejscach można odzyskać, co umożliwia biopsję, a nawet dalsze procedury wymiany. Miejsca pozawątrobowe wykazują zatem duży potencjał do klinicznego przeszczepu5.
Rusztowania oparte na biomateriale były intensywnie badane pod kątem transplantacji komórek i inżynierii tkankowej. Rusztowania trójwymiarowe (3D) zwykle zawierają porowate struktury i mogą służyć jako szablony komórkowe do generowania struktury przestrzennej/organizacji komórek lub jako zbiorniki zapewniające kontrolowane uwalnianie sygnałów bioaktywnych. Rusztowania zostały również wykonane z materiałów polimerowych, takich jak poli(glikolid-L-laktyd)6, poli(dimetylosiloksan)7 i termoplastyczny poli(uretan)8, do przeszczepiania wysepek w EFP. W porównaniu z bezpośrednim przeszczepem wysp trzustkowych, stwierdzono, że zastosowanie rusztowań zmniejsza utratę wysp trzustkowych, zapobiegając ich przeciekaniu do jamy wewnątrzotrzewnowej 9,10, zapewniając mechaniczną ochronę i modulując miejscową reakcję zapalną. W ten sposób rusztowania mogą być rozwijane w celu wspomagania wszczepiania wysp trzustkowych w miejscach przeszczepów7.
W tym badaniu zamierzamy zademonstrować paradygmat przeszczepiania wysp trzustkowych w EFP, przeprowadzany na modelach mysich przy użyciu DCS. Rusztowania pochodzące z matryc zewnątrzkomórkowych cieszą się w ostatnich latach dużym zainteresowaniem ze względu na lepszą biokompatybilność i bardziej naturalne porowate struktury w porównaniu z produktami syntetycznymi. W tym miejscu opisujemy solidny protokół izolacji w celu uzyskania wysp trzustkowych z wysoką wydajnością od myszy C57BL / 6J. DCS przetworzone z osierdzia bydła zostały następnie obsiane wyspami trzustkowymi, a przeszczepy przeszczepiono do EFP w syngenicznych modelach cukrzycy. Normoglicemię u myszy osiągnięto w ciągu 10 dni i utrzymywała się do 100 dni, aż do usunięcia przeszczepów.

<table><tbody><tr><td>Nożyczki preparacyjne</td><td>Kleszcze medyczne Ningbo Siatka druciana</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>o</td><td></td><td></td></tr><tr><td>średnicy 0,5 mm</td><td>Ningbo Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; Filtr siatkowy do komórek m</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Zacisk hemostatyczny tętnicy</td><td>Ningbo Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopijny zacisk hemostatyczny</td><td>Ningbo Medyczne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>kleszcze hemostatyczne</td><td>Ningbo Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wchłanialne szwy 6-0 PGLA&nbsp;</td><td>JINHUAN</td><td></td><td>Z igłą</td></tr><tr><td>Klips do ran</td><td>Ningbo Medyczny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>wacik bawełniany</td><td>Ningbo Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gauze</td><td>Ningbo Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterylne serwety</td><td>Ningbo Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml strzykawka</td><td>JINGHUAN</td><td></td><td></td></tr> 1 <tr><td>ml strzykawka</td><td>JINGHUAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Igła dożylna 27G</td><td>JINGHUAN</td><td>0,45x15 RWSB</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Probówka Eppendorf</td><td>Axygen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15mL rurka stożkowa</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>50mL Rurka stożkowa</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>35mm Bez obróbki&nbsp; Naczynia Corning</td><td></td><td>430588</td><td></td></tr><tr><td>Transwell</td><td>Corning</td><td>3422</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &mu; m filtr</td><td>Pall</td><td>PN4612</td><td></td></tr><tr><td>10 ml pipeta serologiczna</td><td>Corning</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Napełniacz do pipet S1</td><td>Thermo Scientific</td><td>9501</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta (2-20&mu; L)</td><td>Axygen</td><td>AP-20</td><td>AXYPETTM</td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s Zrównoważony roztwór soli&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>C14175500CP</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza P</td><td>Roche</td><td>COLLP-RO</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1077</td><td>Sigma</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>11879-20</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>D-glukoza</td><td>Gibco</td><td>A24940-01</td><td></td></tr><tr><td>Glukometr</td><td>Roche</td><td></td><td>ACCU-CHEK</td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Streptozotocyna</td><td>Sigma</td><td>V900890</td><td>VetecTM</td></tr><tr><td>Hydrat chloralu</td><td>J& K</td><td>C0073</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian sodu</td><td>Sigma</td><td>71497</td><td></td></tr><tr><td>Kwas cytrynowy</td><td>Sigma</td><td>C2404</td><td></td></tr><tr><td>Jodofory</td><td>Ningbo Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J, 10-12 tygodni</td><td>VitalRiver</td><td></td><td>Pekin, Chiny</td></tr><tr><td>Rusztowanie bezkomórkowe</td><td>Guanhao Biotec</td><td>131102</td><td>Guangzhou, Chiny</td></tr></tbody></table>

wspomagany rusztowaniem przeszczep wysp trzustkowych w poduszce tłuszczowej najądrza myszy z cukrzycą

Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice

Klinicznie udowodniono, że przeszczep wysp trzustkowych jest skuteczny w leczeniu cukrzycy typu 1. Jednak obecna strategia przeszczepiania wewnątrzwątrobowego może powodować ostre reakcje z krwią pełną i skutkować słabym wszczepieniem wysp trzustkowych. W tym miejscu przedstawiamy solidny protokół przeszczepiania wysp trzustkowych w miejscu przeszczepu pozawątrobowego - poduszeczce tłuszczowej najądrza (EFP) - w modelu myszy z cukrzycą. Opisano protokół izolacji i oczyszczania wysp trzustkowych z wysoką wydajnością od myszy C57BL / 6J, a także metodę przeszczepu wykonywaną przez wysiew wysp trzustkowych na rusztowanie bezkomórkowe (DCS) i wszczepienie ich w miejscu EFP u syngenicznych myszy C57BL / 6J, u których streptozotocyna stała się cukrzycą. Przeszczep DCS zawierający 500 wysp trzustkowych odwrócił stan hiperglikemii w ciągu 10 dni, podczas gdy wolne wyspy trzaskowe bez DCS wymagały co najmniej 30 dni. Normoglikemia utrzymywała się przez okres do 3 miesięcy, aż do momentu eksplantacji przeszczepu. Podsumowując, projekt DCS usprawnił wszczepianie wysp trzustkowych do pozawątrobowego miejsca EFP, które można łatwo pobrać i które może stanowić powtarzalną i użyteczną platformę do badania materiałów rusztowań, a także innych parametrów przeszczepu wymaganych do udanego wszczepienia wysp trzustkowych.

Nasza metoda zaciskania, wykonywana przy użyciu mikroskopijnego zacisku hemostatycznego, jest prosta i pozwala zaoszczędzić czas w porównaniu z techniką ligacji szwem. Izolacja i oczyszczanie około 1200 wysepek z 6 myszy zajęły w przybliżeniu 4 h. Świeżo wyizolowane wysepki pod mikroskopem optycznym miały zazwyczaj chropowaty obrys (Rysunek 3A). Po regeneracji wysepek po procesie izolacji, stały się one jasne i zwarte, a ich powierzchnia wygładziła się. Jedna...

Ten protokół demonstruje izolację mysich wysepek i zasiewanie ich na rusztowaniu zdecelularycznym. Wyspy trzustkowe wsparte na rusztowaniach przeszczepiono do poduszeczki tłuszczowej najądrza myszy z cukrzycą indukowaną streptozotocyną (STZ). Wyspy trzustkowe przetrwały w miejscu przeszczepu i odwróciły stan hiperglikemii.

Wspomagany rusztowaniem przeszczep wysp trzustkowych w poduszce tłuszczowej najądrza myszy z cukrzycą

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy ...

Witam wszystkich, nazywam się Kai Wang i pracuję na Wydziale Inżynierii Biomedycznej Uniwersytetu Pekińskiego w laboratorium dr Lowe'a. Obecnie osoby z cukrzycą typu pierwszego są leczone głównie zastrzykami insuliny, które nie symulują idealnie wydzielania insuliny z wysp trzustkowych. Zastąpienie utraconych wysepek przez transport wysepek może zapewnić stabilną kontrolę poziomu glukozy we krwi bez poważnych wahań.Jednak wymóg produkcji dużej liczby wysepek wysokiej jakości i niska skuteczność nawszczepiania zagroziły powszechnemu zastosowaniu klinicznemu. Dzisiaj pokażę Wam proces izolacji wysp trzustkowych i przeszczepianie wysp trzustkowych podtrzymywanych przez rusztowanie do poduszeczki tłuszczowej najądrza myszy z cukrzycą. Kroki te wymagają dobrej znajomości struktur tkankowych i wprawnych rąk do wykonania operacji.Spryskaj całe ciało etanolem. Wykonaj nacięcie w kształcie litery V, zaczynając od okolicy narządów płciowych. Usuń jelito przez prawą stronę myszy.Zacisnąć żyłę wrotną i przewód żółciowy za pomocą klamry hemostatycznej. Chwyć ostrożnie dwunastnicę kleszczami i pociągnij dwunastnicę, aż przewód żółciowy zostanie nauczony. Wbić igłę dożylnie do wspólnego przewodu

scaffold-supported-transplantation-islets-epididymal-fat-pad-diabetic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Nasz protokół został opracowany w celu czystego i łatwego wprowadzania wysepek lub komórek pod torebkę nerkową myszy. Komórki są zagęszczane w postaci pelletów w końcowej części cewki używanej do transplantacji komórek pod torebkę nerkową. Prostota tej techniki zmniejsza stres dla komórek oraz myszy.

Transplantacja wysepek trzustkowych do torebki nerki u myszy z cukrzycą

Przeszczepianie wyizolowanych wysepek zostało zaproponowane jako potencjalna metoda leczenia cukrzycy typu 1. W niniejszym materiale opisujemy metodę izolacji wysepek z trzustek myszy oraz ich transplantacji do przestrzeni podtorebkowej nerki.

Metoda izolacji wysepek mysich i przeszczepiania podtorebkowego do nerki

Wprowadzono metodę przeszczepiania wysp trzustkowych u myszy. Wyizolowane wysepki miesza się z hydrożelem, a mieszaninę umieszcza się w woreczku omentalnym myszy z cukrzycą. Następnie monitorowany jest poziom glukozy we krwi i wykonywana jest analiza immunohistochemiczna.

Metoda przeszczepu wysp trzustkowych do sieci u myszy

Przeszczep wysp trzustkowych jest sposobem na osiągnięcie normoglikemii w cukrzycy typu 1. Ten artykuł koncentruje się na technice przeszczepiania drogą wewnątrzwrotną w celu utrzymania prawidłowego poziomu glukozy u myszy z cukrzycą.

Wewnątrzportalowy przeszczep wysp trzustkowych w modelu mysim

Tutaj prezentujemy protokół walidacji in vivo terapii komórkowej opartej na hydrożelu, zilustrowany przykładem przeszczepu wysp trzustkowych. Implantacja h-Omental Matrix Islet filliNG (hOMING) pozwala na implantację mieszaniny komórkowo-hydrożelowej między warstwami omentalnymi, w pobliżu naczyń krwionośnych, aby zmaksymalizować wszczepienie w odpowiednim środowisku metabolicznym.

Przeszczep wysp trzustkowych wewnątrzomentalnych za pomocą h-Omental Matrix Islet filliNG (hOMING)

W tym protokole opisana jest metoda izolacji i przeszczepu mysich wysp trzustkowych do pachwinowej podskórnej białej tkanki tłuszczowej. Izolowane syngeniczne mysie wysepki są przeszczepiane mysiemu biorcy za pomocą hydrożelu z błony podstawnej. Monitorowany jest poziom glukozy we krwi biorców i przeprowadzana jest analiza histologiczna przeszczepów wysp trzustkowych.

Pachwinowy podskórny model przeszczepu białej tkanki tłuszczowej (ISWAT) mysich wysp trzustkowych

Ta metoda przeszczepiania wysp trzustkowych pokrytych tłuszczem jest odpowiednia do wykrywania wszczepionych wysp trzustkowych w jamie wewnątrzotrzewnowej. Co ważne, nie wymaga stosowania środków wiążących biologicznie ani szycia.

Przeszczep wysp trzustkowych pokrytych tłuszczem z wykorzystaniem białej tkanki tłuszczowej najądrza

Tutaj prezentujemy wyrafinowane procedury chirurgiczne dotyczące skutecznego przeprowadzenia przeszczepu wysp trzustkowych wewnątrz portalu, klinicznie istotnej, ale technicznie trudnej procedury chirurgicznej u myszy.

Minimalizacja krwawienia z żyły wrotnej po infuzji podczas przeszczepu wysp trzustkowych wewnątrzwątrobowych u myszy

Oferujemy minimalnie inwazyny protokół do domięśniowej transplantacji wyspików komórek macierzystych trzustki pochodzących z ludzkich komórek macierzystych do szczurów immunodeficytarnych w celu in vivo implantacji i dalszej analizy.

Przeszczep domięśniowy ludzkich pluripotentnych komórek macierzystych pochodzenia trzustkowego do szczurów

Dokładny, oparty na przyczynowości kwantyfikacja globalnej funkcji rozkurczowej została osiągnięta dzięki opartej na modelowaniu kinematycznym analizie przepływu rozkurczowego za pomocą formalizmu Parametryzowanego Wypełnienia Rozkurczowego (PDF). PDF generuje unikalne parametry sztywności, relaksacji i obciążenia oraz wyjaśnia "nową" fizjologię, dostarczając jednocześnie czułych i specyficznych wskaźników dysfunkcji.

Kwantyfikacja globalnej funkcji rozkurczowej za pomocą analizy przepływu transmisyjnego opartej na modelowaniu kinematycznym za pomocą sparametryzowanego formalizmu wypełnienia rozkurczowego

Poznaj izolację wysp trzustkowych i przeszczep wspomagany rusztowaniem do poduszki tłuszczowej najądrza myszy z cukrzycą. Ta metoda odwraca hiperglikemię i poprawia przeżycie przeszczepu.

Wspomagany rusztowaniem przeszczep wysp trzustkowych w poduszce tłuszczowej najądrza myszy z cukrzycą

Przeglądaj więcej filmów