Wspomagany rusztowaniem przeszczep wysp trzustkowych w poduszce tłuszczowej najądrza myszy z cukrzycą

Witam wszystkich, nazywam się Kai Wang i pracuję na Wydziale Inżynierii Biomedycznej Uniwersytetu Pekińskiego w laboratorium dr Lowe'a. Obecnie osoby z cukrzycą typu pierwszego są leczone głównie zastrzykami insuliny, które nie symulują idealnie wydzielania insuliny z wysp trzustkowych. Zastąpienie utraconych wysepek przez transport wysepek może zapewnić stabilną kontrolę poziomu glukozy we krwi bez poważnych wahań.

Jednak wymóg produkcji dużej liczby wysepek wysokiej jakości i niska skuteczność nawszczepiania zagroziły powszechnemu zastosowaniu klinicznemu. Dzisiaj pokażę Wam proces izolacji wysp trzustkowych i przeszczepianie wysp trzustkowych podtrzymywanych przez rusztowanie do poduszeczki tłuszczowej najądrza myszy z cukrzycą. Kroki te wymagają dobrej znajomości struktur tkankowych i wprawnych rąk do wykonania operacji.

Spryskaj całe ciało etanolem. Wykonaj nacięcie w kształcie litery V, zaczynając od okolicy narządów płciowych. Usuń jelito przez prawą stronę myszy.

Zacisnąć żyłę wrotną i przewód żółciowy za pomocą klamry hemostatycznej. Chwyć ostrożnie dwunastnicę kleszczami i pociągnij dwunastnicę, aż przewód żółciowy zostanie nauczony. Wbić igłę dożylnie do wspólnego przewodu żółciowego przez bańkę.

Zacisnąć odcinek kanału zawierający igłę za pomocą ultra hemostatycznego zacisku. Dozuj roztwór kolagenu powoli i ze stałą szybkością. Po całkowitym napompowaniu trzustki przepchnij jelito przez lewą stronę myszy.

Widać, że przewód trzustkowy jest całkowicie napompowany. Usuń trzustkę, zaczynając koniec okrężnicy zstępującej. Użyj kleszczy, aby podnieść jelito i oddzielić je od trzustki za pomocą innych kleszczy.

Kontynuuj usuwanie trzustki, aż zostanie odczepiona od górnej części żołądka. Na koniec wyjmij trzustkę z brzucha i odetnij ją od pozostałej śledziony. Umieść trzustkę w stożkowej rurce i podawaj na lodzie.

Inkubować perfundowaną trzustkę. Zakończyć trawienie, dodając roztwory neutralizujące. Oddziel dwie zupy, energicznie potrząsając rurkami.

Przefiltruj próbki tkanki trawiennej przez drucianą siatkę. Zebrać zawiesiny wysepek do nowej stożkowej rurki. Odwirować probówki.

Ostrożnie odlewać sklarat nad osadem, nie naruszając palet z tkankami. Zawiesić palety za pomocą Histopaque, odpipetowując zawiesinę w górę i w dół przez kilka razy. Powoli pipetować HBSS wzdłuż boku probówki do górnej części roztworów histopaki.

Oba rozwiązania powinny być dobrze oddzielonymi warstwami z ostrym interfejsem. Odwirować zawiesinę przez 20 minut. Większość wysepek migruje na styk warstw histopaque i HBSS.

Usunąć całe roztwory sklarowanego osadu i przepuścić roztwory przez odwrócone sitko. Wysepki zostaną zatrzymane przez sitko. Zanurz powierzchnię utrzymującą wysepki w roztworze i delikatnie potrząśnij, aby uwolnić wysepki.

Ręcznie wybierz izolowane wysepki pod mikroskopem. Zbieraj wyseski do nowego naczynia hodowlanego. Jeśli tkanka otaczająca przewód zaczyna się nadmuchiwać, oznacza to, że igła przechodzi przez ścianę przewodu żółciowego.

Konieczna jest zmiana położenia igły i ponowna próba kaniulacji przewodu żółciowego. Gdy roztwory wypełniają trzustkę, najpierw napełnia się tkanka w pobliżu dwunastnicy, a następnie obszar w pobliżu ogona trzustki. Jeśli dwunastnica zacznie się nadmuchiwać, jak pokazano tutaj, z niebieską plamą, wyreguluj zacisk tętnicy i ponownie zaciśnij przewód żółciowy.

Umieść mysz w pozycji leżącej. Ogol brzuch. Następnie przetrzyj wacik z jodoforami, aby wysterylizować skórę.

Przykryj mysz sterylną zasłoną. Wykonaj małe nacięcie przez ścianę otrzewnej pośrodku w pobliżu okolicy narządów płciowych. Delikatnie chwyć i wyciągnij poduszeczkę tłuszczową najądrza z jamy brzusznej.

Rozłóż poduszeczkę tłuszczową na zwilżonej gazie. Umieść rusztowanie zawierające wysepki na poduszce tłuszczowej i złóż poduszeczkę tłuszczową, aby owinąć przeszczep. Zszyj poduszeczkę tłuszczową, aby zabezpieczyć wysepki zamknięte w poduszce tłuszczowej.

Delikatnie umieść poduszeczkę tłuszczową z powrotem w jamie brzusznej. Zamknij mysz, zszywając ścianę otrzewnej. Zacisnąć warstwę skórną za pomocą klipsów do ran.

Wstrzyknij podskórnie odpowiednie dawki leków przeciwbólowych i antybiotyków. Świeże, izolowane wysepki miały zazwyczaj szorstkie obrzeża pod mikroskopem optycznym. Gdy wysepki odzyskały siły po procesie izolacji, wyglądały na jasne, ciasne i uzyskały gładką powierzchnię.

Obliczona średnia średnica wysepki wynosiła około 130 mikrometrów. Rusztowania z opóźnieniem są na tyle wytrzymałe mechanicznie, że można je obsługiwać za pomocą pęsety. Porowate wysepki wsparte na rusztowaniach zostały następnie przeniesione na powierzchnię rozprowadzanej poduszeczki tłuszczowej, a następnie otoczone przez poduszkę tłuszczową.

W modelu przeszczepu syngenicznego zazwyczaj 500 wysp odwracają hipoglikemię w ciągu 10 dni. Prawidłowa glikemia utrzymywała się przez około 100 dni do momentu pobrania przeszczepów. Badania histologiczne wykazały, że wyspy trzustkowe uległy rewaskularyzacji i zostały otoczone tkanką poduszeczki tłuszczowej i rusztowaniem.

Po obejrzeniu tego filmu, wraz z praktyką, powinieneś nauczyć się kluczowych kroków związanych z izolacją i transportem wysepki. Po pierwsze, kaniulacja wspólnego przewodu żółciowego i rozszerzenie trzustki jest najtrudniejszą częścią tego protokołu. Po drugie, całkowicie otoczyć rusztowanie obciążone wyspami trzustkowymi poduszeczką tłuszczową, ponieważ niepełna enkapsulacja może doprowadzić do niepowodzenia przeszczepu.