Name: Mysi model do przeszczepu trzustki przy użyciu zmodyfikowanej techniki mankietowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 19 s
Description: Poznaj zmodyfikowaną technikę mankietową do przeszczepu trzustki u myszy. Model ten umożliwia badanie uszkodzeń przeszczepu związanych z niedokrwieniem i reperfuzją oraz ocenę wczesnej funkcji endokrynnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty #2008-1-596 i #UNI-0404/1956 "Tiroler Wissenschaftsfonds (TWF)" (https://www.tirol.gv.at/en/), oraz przez grant #2013-042018 "MUI-Start Förderungsprogramm" Uniwersytetu Medycznego w Innsbrucku.

Aby uniknąć reakcji alloimmunologicznych i dokładnie zbadać uszkodzenia przeszczepu związane z uszkodzeniem niedokrwiennym reperfuzji, powinna być używana para syngeniczna dawca-biorca. W tym protokole samce 10-12-tygodniowych myszy C57BL6 (H2b) o wadze od 26 do 28 g wykorzystano jako pary dawca-biorca o dopasowanej wielkości. Wszystkie zwierzęta były trzymane w obiekcie wolnym od barier patogennych i otrzymywały opiekę człowieka zgodnie z "Zasadami opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi" opracowanymi przez National Society for Medical Research oraz "Przewodnikiem opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych" przygotowanym przez National Academy of Sciences i opublikowanym przez National Institutes of Health (publikacja NIH nr 86-23, Poprawiony w 1985 r.). Austriackie Ministerstwo Edukacji, Nauki i Kultury zatwierdziło eksperymenty opisane w tym manuskrypcie (BMWF-66.011/0056-II/3b/2011).
1. Zaopatrzenie trzustki
<ol>
	<li>Znieczulić zwierzę dawcy za pomocą dootrzewnowego (i.p.) wstrzyknięcia ksylazyny (5 mg/kg masy ciała) i ketaminy (100 mg/kg masy ciała) za pomocą igły o rozmiarze 27 (G).</li>
	<li>Ogol włosy w okolicy brzucha za pomocą golarki elektrycznej i przymocuj mysz do pola operacyjnego w pozycji leżącej za pomocą pasm taśmy.</li>
	<li>Trzykrotnie wyszoruj pole operacyjne gazami nasączonymi chlorheksydyną.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie brzucha w linii środkowej z obustronnym przedłużeniem podżebrowym za pomocą nożyczek. Delikatnie zewnętrzizuj wnętrzności po lewej stronie sterylnymi wacinowymi patyczkami i zawiń je w zwilżoną gazę. Podnieś ksyloidę czaszkową za pomocą zacisku na komary, aby zapewnić maksymalne odsłonięcie jamy brzusznej w kolejnych krokach.</li>
	<li>Za pomocą igły 19 G wstrzyknąć 400 μl jałowego roztworu heparyny i chlorku sodu w stosunku 1:4 do heparynizacji do żyły głównej dolnej (IVC). Po wyjęciu igły należy poddać zwierzę eutanazji poprzez wykrwawienie przez przecięcie aorty.</li>
	<li>Wypreparuj aortę brzuszną między początkiem tętnicy krezkowej górnej a prawą tętnicą nerkową, delikatnie oddzielając tkankę włóknistą za pomocą kleszczy z zakrzywioną końcówką. Podkop aortę i zawiąż ją jedwabną ligaturą 8/0.</li>
	<li>Zidentyfikuj więzadło wątrobowo-odnerkowe, które biegnie między dwunastnicą postodźwiernikową a wnęką wątroby. Podziel przewód żółciowy poniżej wejścia do przewodu torbielowatego po podwiązaniu dystalnym, a następnie delikatnie rozetnij i przeciąć żyłę wrotną tak dystalnie, jak to możliwe, aby mieć wystarczającą długość do wykonania zespolenia u biorcy.</li>
	<li>Używając kleszczyków z zakrzywioną końcówką, tępo wypreparuj aortę brzuszną, zaczynając od poprzedniej ligatury (patrz krok 1.6). Podkop tkankę okołoaortalną za pomocą kleszczy z zakrzywioną końcówką, zawiąż ją jedwabną ligaturą 8/0 i przetnij nożyczkami.
	<ol>
		<li>Za pomocą kleszczy dwubiegunowych skoaguluj wszystkie jego gałęzie lędźwiowe i przeciąć aortę nożyczkami jak najbliżej przepony, aby zapewnić wystarczającą długość do zespolenia naczynia. Na koniec przeciąć już zawiązaną aortę nad lewą tętnicą nerkową.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ukrwić trzustkę za pomocą strzykawki 19 G z 5 ml roztworu perfuzji histydyny, tryptofanu i ketoglutaranu o temperaturze 4 °C w sposób wsteczny przez aortę brzuszną, aż do uzyskania klarownego ścieku z żyły wrotnej. Stosować niskie ciśnienie, aby uniknąć powstania obrzęku. 
	UWAGA: Wykonaj kroki od 1.5 do 1.9 w szybki i ustandaryzowany sposób, aby uniknąć odchyleń spowodowanych ciepłym niedokrwiennym pogorszeniem odzyskanego przeszczepu.</li>
	<li>Włóż wnętrzności do jamy otrzewnej za pomocą sterylnych patyczków bawełnianych.</li>
	<li>Za pomocą kleszczyków z zakrzywioną końcówką oddziel trzustkę stopniowo, zaczynając od dwunastnicy zaodźwierniowej i przesuwając się do przodu, aż do więzadła Treitza. Na tych etapach zidentyfikuj beznaczyniowe obszary tkanki łącznej między trzustką a ścianą dwunastnicy.
	<ol>
		<li>Dosadnie wypreparuj te obszary za pomocą kleszczy z zakrzywioną końcówką, aby wyizolować naczynia łączące trzustkę z dwunastnicą. Przełóż jedwabną ligaturę 8/0 wokół każdej izolowanej struktury naczyniowej i zawiąż ją.</li>
		<li>Na koniec przeciąć strukturę naczyniową nożyczkami w kierunku ściany dwunastnicy. W ten sam sposób użyj jedwabnego szwu 8/0, aby oddzielić trzustkę od krezki, okrężnicy poprzecznej i żołądka. 
		UWAGA: Podczas tej procedury podwiązywany jest przewód choledocho-trzustkowy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zidentyfikuj więzadło żołądkowo-śledzionowe biegnące od śledziony do żołądka oraz krótkie gałęzie żołądka, podnosząc żołądek czaszkowo i przecinając go nożyczkami. Pozostaw śledzionę przyczepioną do odzyskanego przeszczepu. 
	UWAGA: Aby zminimalizować ponowne rozgrzewanie przeszczepu, należy przepłukać trzustkę w sposób ciągły za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml z igłą 19 G z zimnym roztworem perfuzyjnym histydyny, tryptofanu i ketoglutaranu przechowywanym na lodzie.</li>
	<li>Na koniec usuń trzustkę z miejsca dawczego (<silna klasa="xfig">Ryc. 1B), chwytając śledzionę kleszczami, i przenieś ją do biorcy.
	<ol>
		<li>Alternatywnie, aby wywołać ciężkie uszkodzenie reperfuzyjne niedokrwienne, należy przechowywać przeszczep w sterylnym roztworze perfuzyjnym o temperaturze 4 °C przez 16 godzin przed wszczepieniem go zwierzęciu biorcy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie odbiorcy
<ol>
	<li>Znieczulić zwierzę biorcy za pomocą iniekcji dożylnej ksylazyny (5 mg/kg masy ciała) i ketaminy (100 mg/kg masy ciała) za pomocą igły 27 G.</li>
	<li>Ogol prawą boczną część szyjki macicy za pomocą golarki elektrycznej i umieść mysz na polu operacyjnym w pozycji leżącej. Napraw mysz za pomocą pasm taśmy. Unikaj nadmiernego rozciągania przednich kończyn, aby uniknąć pogorszenia oddychania.</li>
	<li>Trzykrotnie wyszoruj pole operacyjne za pomocą gazy nasączonej chlorheksydyną.</li>
	<li>Wykonaj prawe przyśrodkowe, lekko skośne nacięcie skóry od nacięcia szyjnego do odpowiedniego kąta żuchwy.</li>
	<li>Dosadnie zidentyfikuj i zmobilizuj boczne gałęzie prawej żyły szyjnej zewnętrznej. Skoaguluj je za pomocą kleszczy bipolarnych i przetransektuj je nożyczkami.</li>
	<li>Podnieś prawy płat podżuchwowego śliniaka czaszkowo, zidentyfikuj szypułkę naczyniową i kauteryzuj ją za pomocą kleszczy dwubiegunowych. Usuń płatek, przecinając kauteryzowaną szypułkę nożyczkami.</li>
	<li>Analogicznie do kroku 2.5 zidentyfikuj wszystkie przyśrodkowe gałęzie żyły szyjnej zewnętrznej, kauteryzuj je kleszczami dwubiegunowymi i przetnij nożyczkami. Podeprzeć zewnętrzną żyłę szyjną za pomocą zakrzywionych kleszczy końcowych tak czaszkowo, jak to możliwe, i podwiązaj ją za pomocą dwóch jedwabnych ligatur 8/0, pozostawiając wystarczająco dużo miejsca między ligaturami.</li>
	<li>Przeciąć żyłę szyjną zewnętrzną między dwiema wcześniej umieszczonymi ligaturami prostymi nożyczkami.</li>
	<li>Przełóż bliższy koniec żyły szyjnej zewnętrznej przez mankiet polietylenowy (średnica wewnętrzna 0,75 mm, średnica zewnętrzna 0,94 mm) i przymocuj uchwyt mankietu za pomocą żylnego zacisku mikrohemostatu.</li>
	<li>Zdejmij krawat na końcu kikuta naczynia i przełóż naczynie nad mankietem. Przymocuj żyłę na mankiecie za pomocą okrągłej ligatury jedwabnej 8/0 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>Proksymalnie i dystalnie kauteryzuj powierzchowną część prawego mięśnia mostkowo-obojczykowo-sutkowego, przeciąć go nożyczkami i usunąć.</li>
	<li>Delikatnie zmobilizuj wspólną tętnicę szyjną, podważ ją poniżej rozwidlenia i podwiąż dwukrotnie, uważając, aby nie wiązać rozwidlenia tętnicy szyjnej. Przetnij naczynie między krawatami.</li>
	<li>Podobnie jak w kroku 2.9, przełóż bliższy koniec tętnicy szyjnej wspólnej przez mankiet poliamidowy (średnica wewnętrzna 0,57 mm, średnica zewnętrzna 0,6 mm) i przymocuj go za pomocą zacisku mikronaczyniowego tętniczego.</li>
	<li>Usuń więzadło na końcu kikuta naczyniowego i delikatnie poszerz światło za pomocą rozszerzaczy naczyń. Przełóż naczynie na mankiet tętniczy i przymocuj je za pomocą jedwabnej ligatury 8/0 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
</ol>
3. Implantacja
<ol>
	<li>Umieść przeszczep w okolicy szyi biorcy, używając śledziony jako uchwytu, z głową zorientowaną na bok, ogonem wraz ze śledzioną przyśrodkowo, a naczynie brzusznie doogonowo. Użyj bawełnianych patyczków, aby prawidłowo ustawić przeszczep.</li>
	<li>Delikatnie przeciągnąć żyłę wrotną przeszczepu trzustki nad zewnętrzną żyłą szyjną zwierzęcia biorcy, która została wcześniej przecięta i przymocowana do odpowiedniego mankietu (patrz krok 2.10). Napraw to za pomocą okrągłej jedwabnej ligatury 8/0.</li>
	<li>Przeciągnij kikut aorty brzusznej przeszczepu nad zerwaną wspólną tętnicą szyjną zwierzęcia biorcy. Zamocuj to za pomocą obwodowej ligatury jedwabnej 8/0 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C).</li>
	<li>Zidentyfikuj naczynia śledziony w pobliżu wnęki śledziony i podważ je za pomocą kleszczy z zakrzywioną końcówką. Zawiąż je jedwabnymi ligaturami 8/0 i przetnij naczynia śledziony, aby usunąć śledzionę. Na koniec skróć krawaty.</li>
	<li>Za pomocą zacisku z kleszczami najpierw zdejmij zacisk na mankiecie żylnym. Następnie zdejmij zacisk tętniczy. 
	UWAGA: Jeśli przeszczep się powiódł, przeszczep trzustki zostanie natychmiast poddany reperfuzji, wykazując jednorodny różowawy kolor i widoczną pulsację tętniczą (<silna klasa = "xfig" >Ryc. 1D).</li>
	<li>Zwilż przeszczep normotermicznym roztworem soli</li> fizjologicznej.
	<li>Zdejmij uchwyt mankietu żylnego za pomocą prostych kleszczy.</li>
	<li>Zamknij ranę pooperacyjną za pomocą biegnącego szwu 6/0.</li>
</ol>
4. Opieka pooperacyjna (punkt końcowy)
<ol>
	<li>Po zabiegu należy zastosować podskórnie do 0,5 ml soli fizjologicznej (s.c.) w celu uzupełnienia śródoperacyjnego ubytku płynów za pomocą igły 19 G.</li>
	<li>Trzymaj zwierzę biorcy na poduszce grzewczej do czasu całkowitego wyzdrowienia ze znieczulenia.</li>
	<li>Po przebudzeniu zwierzę biorcy należy zwrócić do obiektu mieszkalnego, gdzie może mieć dostęp do jedzenia i wody ad libitum.</li>
	<li>Aby zapobiec bólom pooperacyjnym, należy podawać bezpośrednio po operacji (1) buprenorfinę (0,1 mg/kg m.c.) co 12 godzin przez pierwsze 5 dni i (2) karprofen 4 mg/kg m.c. co 12 h s.c. przez pierwszy tydzień.</li>
	<li>W celu oszacowania prawidłowego spożycia składników odżywczych należy codziennie monitorować masę ciała (g) każdego biorcy. Utrata masy ciała o ponad 10-15% w porównaniu z masą ciała w dniu operacji, apatia, kalectwo, bardzo zgięte plecy, a także chirurgiczne infekcje boczne stanowią punkty końcowe.
	<ol>
		<li>W takim przypadku, jak również po osiągnięciu klinicznego punktu końcowego, zwierzę należy uśmiercić, stosując końcową inhalację izofluranu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Gruessner, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2011+update+on+pancreas+transplantation%3A+comprehensive+trend+analysis+of+25%2C000+cases+followed+up+over+the+course+of+twenty-four+years+at+the+International+Pancreas+Transplant+Registry+%28IPTR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Diabet+Stud%22%5BJournal%5D)">2011 update on pancreas transplantation: comprehensive trend analysis of 25,000 cases followed up over the course of twenty-four years at the International Pancreas Transplant Registry (IPTR).</a> Rev Diabet Stud. 8 (1), 6-16 (2011).</li>
<li>Troppmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complications+after+pancreas+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Organ+Transplant%22%5BJournal%5D)">Complications after pancreas transplantation.</a> Curr Opin Organ Transplant. 15 (1), 112-118 (2010).</li>
<li>Fernández-Cruz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+and+graft+pancreatitis+following+combined+pancreas-renal+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Surg%22%5BJournal%5D)">Native and graft pancreatitis following combined pancreas-renal transplantation.</a> Br J Surg. 80 (11), 1429-1432 (1993).</li>
<li>Eltzschig, H. K., Eckle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemia+and+reperfusion-from+mechanism+to+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Ischemia and reperfusion-from mechanism to translation.</a> Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).</li>
<li>Konigsrainer, A., Habringer, C., Krausler, R., Margreiter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+of+pancreas+transplantation+in+the+rat+securing+pancreatic+juice+for+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Transpl.+Int%22%5BJournal%5D)">A technique of pancreas transplantation in the rat securing pancreatic juice for monitoring.</a> Transpl. Int. 3 (3), 181-182 (1990).</li>
<li>Lee, S., Tung, K., Koopmans, H., Chandler, J., Orloff, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/4552365">Pancreaticoduodenal transplantation in the rat.</a> Transplantation. 13 (4), 421-425 (1972).</li>
<li>Tori, M., Ito, T., Matsuda, H., Shirakura, R., Nozawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+of+mouse+pancreaticoduodenal+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Microsurgery%22%5BJournal%5D)">Model of mouse pancreaticoduodenal transplantation.</a> Microsurgery. 19 (2), 61-65 (1999).</li>
<li>Oberhuber, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+cervical+heart+transplantation+model+using+a+modified+cuff+technique%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine cervical heart transplantation model using a modified cuff technique.</a> J Vis Exp. (92), e50753(2014).</li>
<li>Brandacher, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrahydrobiopterin+compounds+prolong+allograft+survival+independently+of+their+effect+on+nitric+oxide+synthase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Tetrahydrobiopterin compounds prolong allograft survival independently of their effect on nitric oxide synthase activity.</a> Transplantation. 81 (4), 583-589 (2006).</li>
<li>Zou, Y., Brandacher, G., Margreiter, R., Steurer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cervical+heterotopic+arterialized+liver+transplantation+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Cervical heterotopic arterialized liver transplantation in the mouse.</a> J Surg Res. 93 (1), 97-100 (2000).</li>
<li>Zhou, Y., Gu, X., Xiang, J., Qian, S., Chen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+on+suture+versus+cuff+anastomosis+in+mouse+cervical+cardiac+transplant%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Clin+Transplant%22%5BJournal%5D)">A comparative study on suture versus cuff anastomosis in mouse cervical cardiac transplant.</a> Exp Clin Transplant. 8 (3), 245-249 (2010).</li>
<li>Liu, X. Y., Xue, L., Zheng, X., Yan, S., Zheng, S. S. <a target="_blank" href="http://www.hbpdint.com/EN/abstract/abstract2949.shtml">Pancreas transplantation in the mouse.</a> Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 9 (3), 254-258 (2010).</li>
<li>Maglione, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+pretreatment+with+tetrahydrobiopterin+saves+pancreatic+isografts+from+ischemia+reperfusion+injury+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Donor pretreatment with tetrahydrobiopterin saves pancreatic isografts from ischemia reperfusion injury in a mouse model.</a> Am J Transplant. 10 (10), 2231-2240 (2010).</li>
<li>Drognitz, O., Obermaier, R., von Dobschuetz, E., Pisarski, P., Neeff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas+transplantation+and+ischemia-reperfusion+injury%3A+current+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Pancreas%22%5BJournal%5D)">Pancreas transplantation and ischemia-reperfusion injury: current considerations.</a> Pancreas. 38 (2), 226-227 (2009).</li>
<li>White, S., Shaw, J., Sutherland, D. <a target="_blank" href="http://www.thelancet.com/journals/lancet/article/PIIS0140-6736(09)60609-7/abstract">Pancreas transplantation.</a> Lancet. 373 (9677), 1808-1817 (2009).</li>
<li>Morath, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+pancreas-kidney+transplantation+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transplant%22%5BJournal%5D)">Simultaneous pancreas-kidney transplantation in type 1 diabetes.</a> Clin Transplant. 23 (Suppl 21), 115-120 (2009).</li>
<li>Perseghin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-sectional+assessment+of+the+effect+of+kidney+and+kidney-pancreas+transplantation+on+resting+left+ventricular+energy+metabolism+in+type+1+diabetic-uremic+patients%3A+a+phosphorous-31+magnetic+resonance+spectroscopy+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Coll+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Cross-sectional assessment of the effect of kidney and kidney-pancreas transplantation on resting left ventricular energy metabolism in type 1 diabetic-uremic patients: a phosphorous-31 magnetic resonance spectroscopy study.</a> J Am Coll Cardiol. 46 (6), 1085-1092 (2005).</li>
<li>Secchi, A., Caldara, R., La Rocca, E., Fiorina, P., Di Carlo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+disease+and+neoplasms+after+pancreas+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular disease and neoplasms after pancreas transplantation.</a> Lancet. 352 (9121), 65(1998).</li>
<li>Kirk, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crossing+the+bridge%3A+large+animal+models+in+translational+transplantation+research%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Crossing the bridge: large animal models in translational transplantation research.</a> Immunol Rev. 196, 176-196 (2003).</li>
<li>de Jong, M., Maina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+mice+and+humans%3A+are+they+the+same%3F--Implications+in+cancer+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">Of mice and humans: are they the same?--Implications in cancer translational research.</a> J Nucl Med. 51 (4), 501-504 (2010).</li>
<li>Niimi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+technique+for+heterotopic+cardiac+transplantation+in+mice%3A+experience+of+3000+operations+by+one+surgeon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Heart+Lung+Transplant%22%5BJournal%5D)">The technique for heterotopic cardiac transplantation in mice: experience of 3000 operations by one surgeon.</a> J Heart Lung Transplant. 20 (10), 1123-1128 (2001).</li>
<li>Maglione, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+technique+for+heterotopic+vascularized+pancreas+transplantation+in+mice+to+assess+ischemia+reperfusion+injury+and+graft+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">A novel technique for heterotopic vascularized pancreas transplantation in mice to assess ischemia reperfusion injury and graft pancreatitis.</a> Surgery. 141 (5), 682-689 (2007).</li>
<li>Cardini, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crucial+role+for+neuronal+nitric+oxide+synthase+in+early+microcirculatory+derangement+and+recipient+survival+following+murine+pancreas+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Crucial role for neuronal nitric oxide synthase in early microcirculatory derangement and recipient survival following murine pancreas transplantation.</a> PLoS One. 9 (11), e112570(2014).</li>
<li>Maglione, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+lethal+murine+pancreas+ischemia+reperfusion+injury+is+specific+for+tetrahydrobiopterin%5BTitle%5D)+AND+%22Transpl+Int%22%5BJournal%5D)">Prevention of lethal murine pancreas ischemia reperfusion injury is specific for tetrahydrobiopterin.</a> Transpl Int. 25 (10), 1084-1095 (2012).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Uszkodzenie przeszczepu związane z IRI jest nieodłącznie związane z przeszczepem narządów litych i charakteryzuje się zaburzeniem mikrokrążenia. Nagromadzenie kilku metabolitów w fazie niedokrwiennej i zainicjowanie kaskad zapalnych, w których pośredniczą głównie reaktywne formy tlenu i azotu, powoduje uszkodzenie tkanek podczas reperfuzji przeszczepu4. Kaskada ta może zagrozić nie tylko krótkoterminowemu, ale także długoterminowemu sukcesowi, a co za tym idzie, znacząco wpływa na przeżycie pacjentów14. Do tej pory skojarzone przeszczepienie nerki i trzustki stanowi terapię z wyboru dla pacjentów cierpiących na cukrzycę typu 1 ze schyłkową niewydolnością nerek15. Kilka badań wykazało, że udany połączony przeszczep nerki i trzustki nie tylko przywraca i chroni funkcję przeszczepu nerki u biorców z cukrzycą, ale także stabilizuje lub nawet odwraca wtórne powikłania, w tym neuropatię oraz mikro- i makroangiopatię 16,17,18.
Pomimo ciągłych wysiłków w zakresie redukcji, wymiany i udoskonalania (3 R) w badaniach na zwierzętach, reprodukcja złożonych procesów patofizjologicznych, takich jak IRI, jest po prostu niemożliwa w warunkach in vitro. Dlatego modele zwierzęce są nadal uważane za idealne narzędzie do badań translacyjnych19,20. Modele myszy, takie jak ten opisany tutaj, mają kilka zalet w porównaniu z modelami szczurów lub innych zwierząt. Należą do nich dostępność ogromnej ilości genetycznie dobrze zdefiniowanych szczepów myszy wsobnych (np. szczepów transgenicznych i knock-out), mnóstwo narzędzi do analizy molekularnej, a także łatwa i tania obsługa21. Dużą zaletą opisywanego modelu jest technika mankietu bez szwu. Dzięki zastosowaniu przedstawionej w niniejszym tekście techniki możliwe jest osiągnięcie wskaźników sukcesu na poziomie >90%, co jest znacznie lepsze w porównaniu z poprzednio opisanymi modelami22. Stosując tę technikę bez szwów, znacznie zmniejszyliśmy częste powikłania, takie jak wstrząs hipowolemiczny, zakrzepica i zwężenie zespoleń12. Kolejną zaletą tej metody jest dodatkowe ułożenie przeszczepu w jamie brzusznej, co wiąże się z szybką rekonwalescencją pooperacyjną biorcy. Dodatkowo, lokalizacja szyjki macicy sprawia, że doskonale nadaje się do analiz in vivo, takich jak obrazowanie na żywo przeszczepu przez eksteriorację bez żadnego napięcia22.
Główną wadą tego modelu jest niedrożność przewodu trzustkowego, która nie przypomina rzeczywistości klinicznej. W tym modelu drenaż zewnątrzwydzielniczy jest zarządzany poprzez związanie przewodu chrzęstno-trzustkowego. W dłuższej perspektywie powoduje to wyraźne zwłóknienie i atrofię gruczołu, nie prowadząc do zapalenia trzustki po przeszczepie22. Ze względu na to pogorszenie stanu tkanki zewnątrzwydzielniczej, które zaobserwowaliśmy już w 30 dniu po przeszczepie, uważamy, że ten model nie nadaje się do długotrwałej obserwacji. W przeciwieństwie do tego, niezaburzona funkcja hormonalna sprawia, że kontrola gylcemiczna biorcy jest łatwym narzędziem do codziennej oceny funkcji przeszczepu 13,23,24.
Te cechy sprawiają, że jest to idealny model do analizy wczesnych urazów przeszczepu związanych z długimi okresami konserwacji lub z różnymi rozwiązaniami i technikami konserwacji. Aby osiągnąć optymalny sukces z tym modelem, należy wziąć pod uwagę kilka kluczowych kroków. Sama trzustka jest bardzo podatna na manipulacje. Dlatego delikatne obchodzenie się z patyczkami bawełnianymi podczas odzyskiwania narządów i podczas implantacji minimalizuje uraz mechaniczny. Należy unikać bezpośredniego chwytania gruczołu kleszczami, ponieważ nieuchronnie doprowadziłoby to do poważnego uszkodzenia przeszczepu. Z tego samego powodu śledziona jest odzyskiwana wraz z trzustką i służy jako uchwyt. Jest to również ustalone w praktyce klinicznej. Kolejną pułapką jest zimna perfuzja, którą uzyskuje się przez kikut aorty przy użyciu roztworu perfuzji histydyny, tryptofanu i ketoglutaranu o temperaturze 4 °C. W ten sposób można uniknąć nadmiernego obrzęku gruczołu poprzez delikatne perfuzję przeszczepu. Pozostały roztwór perfuzyjny należy użyć do zwilżenia przeszczepu, aby utrzymać jego niską temperaturę podczas rekonwalescencji narządu.
Jeśli chodzi o przygotowanie biorcy, staranne rozwarstwienie zarówno żyły szyjnej zewnętrznej, jak i tętnicy szyjnej wspólnej stanowi podstawę do udanej rewaskularyzacji. W szczególności konieczne jest całkowite odsłonięcie żyły poprzez usunięcie nie tylko wszystkich dopływów, ale także otaczającej tkanki tłuszczowej, aby uniknąć zewnętrznego ucisku i zwężenia przez pozostałą tkankę tłuszczową. Dobór odpowiednich średnic mankietów ma kluczowe znaczenie. Na podstawie wspólnych doświadczeń, w przypadku myszy o masie ciała od 25 do 28 g odpowiednia jest średnica wewnętrzna 0,57 mm w przypadku mankietu tętniczego i od 0,75 do 0,8 mm w przypadku mankietu żylnego. Precyzyjne, czyste cięcie krawędzi mankietów jest obowiązkowe, aby uniknąć rozerwania kikuta naczynia. Rozszerzenie naczyń, zwłaszcza tętnicy, najlepiej osiąga się przy użyciu rozszerzaczy naczyń z cienkimi końcówkami. Z reguły naczynie powinno być w stanie poszerzyć się do dwukrotnego prześwietlenia mankietu. Podczas procesu odklejania naczynia i mocowania go na mankiecie zalecamy ustabilizowanie zacisków naczyniowych poprzez umieszczenie ich pod płatem skóry, ponieważ ułatwia to ten kluczowy krok.
Jak już wspomniano, technika mankietu bez szwów stanowi łatwą metodę zespolenia naczyniowego i może być wykonana w ciągu 5 minut. Jednak prawidłowe ułożenie przeszczepu w okolicy szyi biorcy ma ogromne znaczenie dla prawidłowej rewaskularyzacji. W związku z tym należy przewidzieć ostateczne prawidłowe umiejscowienie przeszczepu w okolicy szyi, aby umożliwić bezpieczne, proste i pozbawione napięć zespolenie zarówno żyły, jak i tętnicy. Należy unikać zbyt długich naczyń, ponieważ może to prowadzić do zablokowania odpływu z powodu załamania. Z tego samego powodu po reperfuzji należy również usunąć uchwyt mankietu w zespoleniu żylnym. W przypadku miejscowych krwawień z przeszczepu trzustki skuteczną hemostazę można osiągnąć poprzez delikatne uciskanie strony krwawiącej przez 5 minut za pomocą bawełnianych patyczków. Jest to jedyny skuteczny sposób radzenia sobie z tego rodzaju komplikacjami. Kauteryzacja, mimo że wysoce selektywna, powodowała utratę przeszczepu w prawie wszystkich przypadkach z powodu martwiczego zapalenia trzustki.
Podsumowując, opracowaliśmy metodę przeszczepu trzustki u myszy przy użyciu techniki mankietu bez szwów, która jest technicznie i mikrochirurgicznie wykonalna i ma doskonałe wskaźniki sukcesu. Biorąc pod uwagę postępujące zwłóknienie trzustki spowodowane niedrożnością przewodu, model ten najlepiej nadaje się do obszarów badawczych koncentrujących się na wczesnych uszkodzeniach przeszczepu. Niniejszy manuskrypt ma na celu umożliwienie naukowcom bezpiecznego ustanowienia tego modelu w ich laboratoriach.

Jednoczesny przeszczep nerki i trzustki (SPK) reprezentuje obecny standard opieki nad pacjentami cierpiącymi na cukrzycę i schyłkową niewydolność nerek. Udany przeszczep skutkuje długotrwałą niezależnością od insuliny związaną ze stabilizacją lub nawet regresją mikroangiopatii cukrzycowej i lepszą jakością życia1. Jednak w przeciwieństwie do innych powszechnych przeszczepów narządów litych, takich jak przeszczepy nerek i wątroby, przeszczepy trzustki są bardziej podatne na uszkodzenie reperfuzyjne niedokrwienne (IRI). Zgłaszane przypadki zachorowań sięgające 35% zagrażają nie tylko przeżyciu przeszczepu, ale nawet pacjenta2,3.
Stres oksydacyjny, zaburzenia mikrokrążenia, zwiększona ekspresja cytokin prozapalnych i cząsteczki adhezyjne skutkujące w końcu aktywacją śródbłonka i utratą jego integralności, zostały przypisane temu nieallogenicznemu uszkodzeniu przeszczepu4. Jak dotąd dokładne mechanizmy molekularne IRI są w dużej mierze nieznane i mogą się różnić w zależności od narządu.
Pomimo znacznego postępu w wykorzystaniu modeli in vitro, rozwój modeli zwierzęcych jest kluczowy dla pogłębienia wiedzy na temat mechanizmów molekularnych związanych z zmianami przeszczepów związanych z IRI po przeszczepie trzustki. U gryzoni opracowano kilka modeli przeszczepu trzustki5,6, ale tylko jeden jest zgłoszony u myszy7. Piętą achillesową tego bardzo wymagającego zabiegu mikrochirurgicznego jest niski wskaźnik przeżycia wynoszący 46%. Jednak modele mysie stanowią najlepszy model do badań związanych z przeszczepami, ponieważ można do nich zastosować najszerszą gamę narzędzi analizy molekularnej. Opierając się na bogatym doświadczeniu mikrochirurgicznym na myszach z różnymi przeszczepami narządów8,9,10, opracowaliśmy nową, wysoce powtarzalną technikę heterotopowego przeszczepu trzustki szyjnej u myszy z >90% skutecznością przy użyciu techniki mankietu bez szwów. Dzięki tej technice powikłania związane z zespoleniami są zredukowane do minimum i można osiągnąć wysoki wskaźnik sukcesu w porównaniu z modelem szwów11. Do tej pory tylko jeden model myszy o podobnych wskaźnikach sukcesu został opisany przez Liu et al12. Jednak do tej pory nie opublikowano żadnych badań z wykorzystaniem tego modelu.

<table><tbody><tr><td>Adventitia Nożyczki</td><td>S& T</td><td>S-00102</td><td>Kleszcze</td></tr><tr><td>proste Dumont # 7</td><td>FST</td><td>&nbsp; 11271- 30</td><td>Zakrzywiona końcówka 0,17 x 0,1 mm</td></tr><tr><td>Yasargil Clip Mini Permanent 7mm</td><td>Aesculap</td><td>FE720K</td><td></td></tr><tr><td>Mikroklips do naczyń</td><td>S& T</td><td>B1 00396 V</td><td></td></tr><tr><td>Dylatator zbiornika</td><td>S& T</td><td>D-5a.2, 00125</td><td></td></tr><tr><td>Aplikator klipsów</td><td>S & T</td><td>CAF-4 00072</td><td>do mankietu żylnego</td></tr><tr><td></td><td>Aesculap</td><td>FE572K&nbsp;</td><td>do mankietu tętniczego</td></tr><tr><td>Rurka polietylenowa</td><td>Portex Ltd</td><td></td><td>Średnica wewnętrzna 0,75 mm do mankietu żylnego</td></tr><tr><td>Rurki poliamidowe</td><td>Vention Medical&nbsp;</td><td>141-0051</td><td>Średnica wewnętrzna 0,8 mm (Alternatywa dla rurki polietylenowej firmy Portex Ltd)</td></tr><tr><td>Rurka polimidowa</td><td>Vention Medical</td><td>141-0033</td><td>Średnica wewnętrzna 0,57 mm do mankietu</td></tr> tętniczego <tr><td>Kleszcze bipolarne</td><td>Micromed</td><td>140-100-015</td><td></td></tr><tr><td>Ligatury jedwabne 8/0</td><td>Catgut GmbH, Merkuramed</td><td>17209008</td><td></td></tr><tr><td>Custodiol HTK solution</td><td>Dr. Franz K&ouml; hler Chemie</td><td>59997</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin Graeub</td><td>aniMedica GmbH</td><td>32554</td><td></td></tr><tr><td>Xylasol Graeub</td><td>aniMedica GmbH</td><td>50855</td><td></td></tr></tbody></table>

mysi model do przeszczepu trzustki przy użyciu zmodyfikowanej techniki mankietowej

Mouse Model for Pancreas Transplantation Using a Modified Cuff Technique

Modele myszy mają kilka zalet w badaniach transplantacyjnych, w tym łatwą obsługę, różnorodność genetycznie dobrze zdefiniowanych szczepów oraz dostępność najszerszego zakresu sond molekularnych i odczynników do przeprowadzania badań in vivo i in vitro. Opierając się na naszych doświadczeniach z różnymi modelami przeszczepu myszy, opracowaliśmy heterotopowy model przeszczepu trzustki u myszy z zamiarem przeanalizowania mechanizmów leżących u podstaw ciężkiego uszkodzenia reperfuzyjnego związanego z ciężkim uszkodzeniem reperfuzyjnym związanym z przeszczepem. W przeciwieństwie do wcześniej opisanych technik z wykorzystaniem technik szwów, tutaj opisujemy nową procedurę z wykorzystaniem techniki mankietu bez szwów. 
W ostatnich latach przeprowadziliśmy ponad 300 przeszczepów trzustki u myszy z ogólnym wskaźnikiem sukcesu >90%, co nigdy wcześniej nie opisano w transplantacji trzustki u myszy. Szkielet tej techniki mankietu bez szwów do rewaskularyzacji przeszczepu składa się z dwóch głównych etapów: (I) naciągnięcia naczynia biorczego na mankiet z polietylenu/poliamidu i zamocowania go za pomocą ligatury obwodowej oraz (II) umieszczenia naczynia dawczego nad naczyniem biorcy i zamocowania go za pomocą drugiej ligatury obwodowej. Wynikająca z tego ciągłość warstwy śródbłonka skutkuje mniejszą liczbą zmian zakrzepowych przy wysokich wskaźnikach drożności i wreszcie wysokich wskaźnikach powodzenia.
W tym modelu, zespolenie tętnicze osiąga się poprzez przeciągnięcie aorty brzusznej przeszczepu dawcy nad zniszczoną tętnicą szyjną wspólną zwierzęcia biorcę. Drenaż żylny przeszczepu uzyskuje się poprzez przeciągnięcie żyły wrotnej przeszczepu przez zerwaną żyłę szyjną zewnętrzną biorcy. Manuskrypt ten zawiera szczegółowe informacje i kluczowe etapy procedur odzyskiwania i implantacji narządów, które pozwolą naukowcom posiadającym umiejętności mikrochirurgiczne na pomyślne przeprowadzenie przeszczepu w swoich laboratoriach.

W ciągu ostatniej dekady przeprowadziliśmy ponad 300 transplantacji trzustki u myszy. Po opracowaniu protokołu ogólny wskaźnik przeżywalności wyniósł &gt;90%. Główną przyczyną niepowodzeń były krwawienia pooperacyjne, a następnie zakrzepica przeszczepu z następującym po niej śmiertelnym martwiczym zapaleniem trzustki w przeszczepie. W obu przypadkach punkty końcowe osiągnięto w ciągu 24 h i dokonano eutanazji zwierząt. W tej serii nie odnotowano zaburzeń neurologicznych, objawów takich jak dysfagia ani infekcji w miejscu operacji.
Aby zbadać funkcję endokrynną przeszczepionych graftów, a tym samym potwierdzić poprawność modelu, u myszy biorców wywołano hiperglikemię poprzez podanie pojedynczej dawki streptozotocyny do jam brzusznych (312,5 mg/kg masy ciała) na 4 dni przed operacją. Myszy uznano za hiperglikemiczne, jeśli poziom glukozy we krwi wynosił &gt;300 mg/dL. Rysunek 2A przedstawia poziomy glukozy we krwi w różnych grupach. Myszy, które otrzymały grafty bez przedłużonego czasu zimnego niedokrwienia wynoszącego 16 h, osiągnęły normoglikemię w ciągu 24 h po transplantacji i utrzymywały ten stan metaboliczny przez cały okres obserwacji. W przeciwieństwie do nich, zwierzęta nieprzeszczepione pozostały hiperglikemiczne. Ponieważ interesował nas wpływ uszkodzenia graftu związanego z urazem reperfuzyjnym na funkcję endokrynną, dodaliśmy trzecią grupę, w której grafty poddano 16 h przedłużonego czasu zimnego niedokrwienia (CIT) oraz 45 min czasu ciepłego niedokrwienia (WIT). Myszy otrzymujące te grafty nie osiągnęły normoglikemii i musiały zostać uśmiercone po 48 h z powodu rozwoju ciężkiego zapalenia trzustki, które w tym modelu okazało się śmiertelne13.
Model ten jest użyteczny w różnych projektach mających na celu badanie wczesnego uszkodzenia przeszczepu związanego z urazem reperfuzyjnym po niedokrwieniu. Dalsze badania obejmowały m.in. konfokalną fluorescencyjną mikroskopię witalną w celu ilościowej oceny zaburzeń mikrokrążenia, przeprowadzoną 2 h po transplantacji. Kontrast mikro naczyń przeszczepów zwiększono poprzez wstrzyknięcie 0,3 mL 0,4% dekstranu znakowanego fluoresceiną izotiocyjanianem (MW 150 000) do żyły prącia. Rysunek 2B przedstawia prawidłowy wzór kapilarny w trzustce naiwnej myszy oraz w przeszczepionej trzustce, która nie była poddana przedłużonemu CIT (Rysunek 2C). W przeciwieństwie do tego, Rysunek 2D pokazuje rozpad mikrokrążenia w wyniku poddania przeszczepu trzustki przedłużonemu CIT.
<img alt="Metody chirurgicznego zespolania w próbkach tkanek; A-D przedstawiają różne techniki szwów i zbliżenia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54998/54998fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Zdjęcia śródoperacyjne. (A) Widok śródoperacyjny naczyń biorcy przygotowanych do zespolenia. Żyła szyjna zewnętrzna (1) została wywinięta na polietylenowy mankiet żylny i utrwalona okrężną ligaturą z jedwabiu 8/0. Analogicznie, tętnica szyjna wspólna (2) została wywinięta i utrwalona na mniejszym poliamidowym mankiecie tętniczym. Pasek skali 1 mm. (B) Przeszczep trzustki ex situ. Żyła wrotna (1) i kikut aorty brzusznej (2) niezbędne do zespolenia naczyniowego. Śledziona (3) jest pobierana wraz z trzustką i służy jako uchwyt. Śledziona zostanie usunięta przed reperfuzją przeszczepu. Pasek skali 1 cm. (C) Widok śródoperacyjny zespolenia. Żyła wrotna (1) jest naciągnięta na mankiet wywiniętej żyły szyjnej zewnętrznej (2) i utrwalona okrężnym szwem z jedwabiu 8/0. Podobnie, kikut aorty brzusznej (3) jest naciągnięty na mankiet wywiniętej tętnicy szyjnej wspólnej (4). Pasek skali 1 mm. (D) Widok śródoperacyjny reperfundowanego przeszczepu trzustki po 5 min reperfuzji: Po zdjęciu zacisku żylnego, a następnie tętniczego, prawidłowo przeszczepiona trzustka wykazuje jednolity różowy kolor. Śledziona została usunięta przed reperfuzją (1: podwiązane naczynie śledzionowe). Pasek skali 1 cm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54998/54998fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres poziomu glikemii i obrazy mikroskopowe przedstawiające strukturę tkanki w skali 100 μm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54998/54998fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Funkcja endokrynna przeszczepionej trzustki i konfokalna mikroskopia fluorescencyjna in vivo. Rycina 2A przedstawia wykres liniowy poziomu glukozy we krwi u myszy z przeszczepem bez CIT (n = 10, PTX w/o CIT, linia niebieska), myszy nieprzeszczepionych (n = 11, no PTX, linia czerwona) oraz myszy otrzymujących przeszczepy poddane przedłużonemu CIT (PTX + 16 h CIT, n = 10, linia zielona). U wszystkich biorców wcześniej wywołano hiperglikemię za pomocą streptozotocyny w dawce 312,5 mg/kg m.c. i.p. Podczas gdy wszyscy biorcy przeszczepów bez CIT byli w stanie przeżyć cały okres obserwacji (50 dni) z zachowaną funkcją endokrynną, myszy nieprzeszczepione pozostawały w stanie hiperglikemii przez cały okres obserwacji. Myszy otrzymujące przeszczepy poddane 16 h CIT nie powróciły do normoglikemii i musiały zostać uśmiercone 48 h po operacji przeszczepienia z powodu utraty masy ciała przekraczającej 10-15%. Myszy, które przeżyły cały okres obserwacji, uśmiercono w 50. dniu po ostatnim pomiarze glikemii. Mikrokrążenie w przeszczepionych graftach oceniono za pomocą konfokalnej intravitalnej mikroskopii fluorescencyjnej 2 h po transplantacji. Jako kontrolę posłużyła trzustka naiwna. Rycina 2B przedstawia regularny wzór naczyń kapilarnych w trzustce naiwnej. Regularna sieć kapilarna jest widoczna również w przeszczepionych graftach, które nie były poddane przedłużonemu CIT (Rycina 2C). W przeciwieństwie do tego, w przeszczepionych graftach poddanych przedłużonemu CIT obserwuje się rozpad mikrokrążenia (Rycina 2D). Pasek skali 100 µm. Dane na wykresie przedstawiono jako ± odchylenie standardowe. PTX: przeszczep trzustki; CIT: czas zimnego niedokrwienia; w/o: bez <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54998/54998fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej ryciny.</a>

Wśród przeszczepów narządów litych w jamie brzusznej, przeszczepy trzustki są podatne na poważne uszkodzenia przeszczepu związane z reperfuzją niedokrwienną, co ostatecznie prowadzi do wczesnej utraty przeszczepu. Protokół ten opisuje model przeszczepu trzustki u myszy przy użyciu techniki mankietu bez szwów, idealnie nadającej się do analizy tych wczesnych, szkodliwych uszkodzeń.

Mysi model do przeszczepu trzustki przy użyciu zmodyfikowanej techniki mankietowej

Mouse models have several advantages in transplantation research, including easy handling, a variety of genetically well-defined strains, and the ...

Nazywam się Benno Cardini, reprezentuję Laboratorium Badawcze Daniela Swarovskiego w Katedrze Chirurgii Trzewnej, Transplantologii i Klatki Piersiowej Uniwersytetu Medycznego w Innsbrucku. Dzisiaj zaprezentujemy model mysi do transplantacji trzustki z wykorzystaniem zmodyfikowanej techniki mankietowej. Znieczul zwierzę dawcy poprzez dokonać podania ketaminy i ksylazyny drogą dostępu dootrzewnowego, a następnie ogol region brzucha.Następnie umieść odbiorcę na polu operacyjnym w pozycji tyłem i trzykrotnie przemyj obszar chirurgiczny chlorheksydyną. Teraz wykonaj laparotomię pośrodkową od okolicy łonowej do wyrostka miecza oraz rozszerz nacięcie podżebrowo po obu stronach, aby uzyskać lepszą widoczność pola operacyjnego. Następnie wyprowadź narządy wewnętrzne na lewą stronę i wstrzyknij heparynę do żyły głównej dolnej poniżej nerek.W następnym kroku zlokalizuj aortę brzuszną proksymalnie względem skrzyżowania z lewą żyłą nerkową, odseparuj aortę i podwiąż ją w tym miejscu. Następnie przejdź do wnęki wątroby, zidentyfikuj i wypreparuj wspólny przewód żółciowy w pobliżu wątroby, a następnie podwiąż go blisko trzustki. Na koniec przetnij wspólny przewód żółciowy powyżej podwiązania.Następnie wypreparuj żyłę wrotną w pobliżu wątroby, aby uzyskać odpowiednią długość do wykonania anastomozy żylnej. Jako wskazówkę: pozostaw niewielki fragment wątroby na żyle wrotnej, co ułatwi jej późniejszą identyfikację. Następnie odseparuj lewą żyłę nerkową w tkance okołoaortycznej i podwiąż ją.Następnie przetnij żyłę nerkową oraz tkankę okołoaortalną, pozostając po prawej stronie podwiązania. Dalej, tępym sposobem odseparuj aortę brzuszną od pnia trzewnego aż do przepony, podetnij aortę w pobliżu przepony i przetnij ją w tym miejscu. Następnie zidentyfikuj i koaguluj wszystkie gałęzie lędźwiowe, a potem je przetnij.Następnie przetnij aortę poniżej wcześniej założanej ligatury. Teraz przeprowadź perfuzję trzustki poprzez łatkę aortalną, używając lodowatego roztworu perfuzyjnego, aż do momentu pojawienia się odpływu z żyły wrotnej. Na górze widoczna jest perfundowana żyła wrotna, a poniżej perfundowana aorta.Następnie umieść wnętrzności z powrotem w jamie otrzewnowej i stopniowo oddziel trzustkę od jelita, używając jedwabnych ligatur 8-0. Zaczynając od regionu pozapylorycznego, dwukrotnie podkopyj dwunastnicę i przeciągnij przez nią jedwabną ligaturę 8-0. Następnie zwiąż ją i ostro oddziel trzustkę od dwunastnicy.Postępowanie to powtarza się wielokrotnie, aż do osiągnięcia więzadła Treitza. Niezbędne jest, aby nie uszkodzić dwunastnicy, ponieważ mogłoby to wykluczyć przeszczep z eksperymentów ze względu na możliwe zanieczyszczenie. Po całkowitym oddzieleniu trzustki od dwunastnicy należy przejść do krezki, podciąć ją, podwiązać, a następnie przeciąć.Analogicznie do poprzednich etapów, oddziel trzustkę od okrężnicy poprzecznej poprzez jej podkopanie, podwiązanie, a na koniec przecięcie. Następnie, stosując tę samą metodę, oddziel trzustkę od obszaru dróg żółciowych poprzez jej ostre wycięcie po uprzednim podwiązaniu. W dalszej kolejności tępym sposobem oddziel trzustkę od żołądka.Zidentyfikuj lewą tętnicę żołądkową, podwiąż ją i przetnij. Na koniec usuń trzustkę wraz z przymocowaną śledzioną i umieść ją w lodowatym roztworze reperfuzyjnym do czasu dalszej implantacji. Śledzionę wykorzystaj jako uchwyt.Analogicznie do dawcy, znieczul zwierzę biorcę poprzez dostrzykieniowy wstrzyknięcie ketaminy i ksylazyny do jamy otrzewnowej, a następnie wygol region szyjny. Następnie ułóż zwierzę biorcę na polu operacyjnym w pozycji na plecach i trzy razy przemyj region szyjny chlorheksydyną. Następnie wykonaj nacięcie skóry od nacięcia szyjnego aż do prawego kąta żuchwy.Następnie zidentyfikuj wszystkie odgałęzienia boczne prawej żyły szyjnej zewnętrznej, zmobilizuj je, odseparuj od tkanek i przetnij po koagulacji bipolarnej. Potem uchwyć dolny biegun prawej ślinianki podżuchwowej, unieś go w kierunku głowowym i wypreparuj po koagulacji bipolarnej naczyń doprowadzających. Teraz przetnij wszystkie odgałęzienia przyśrodkowe prawej żyły szyjnej zewnętrznej po koagulacji bipolarnej.Podwiąż żyłę szyjną zewnętrzną tak kranialnie, jak to możliwe, w dwóch miejscach, a następnie przetnij ją pomiędzy podwiązaniami. Przeciągnij proksymalny koniec żyły szyjnej zewnętrznej przez polietylenową mankietkę. Ważne jest, aby uchwyt mankietki był skierowany w stronę chirurga operującego.W następnym kroku nałóż mikro naczyniowy zacisk żylny od strony bocznej. Następnie zwilż żyłę heparyną, usuń ligaturę i delikatnie naciągnij żyłę na mankiet polietylenowy. Na koniec zamocuj żyłę na mankiecie za pomocą okrężnej ligatury z jedwabiu 8-0, wykonując jeden węzeł z tyłu i trzy z przodu.Aby uzyskać dostęp do prawej tętnicy szyjnej wspólnej, należy zmobilizować i przeciąć prawy mięsień mostkowo-obojczykowo-sutkowy po uprzedniej koagulacji proksymalnej i dystalnej. Następnie delikatnie zmobilizuj tętnicę szyjną wspólną, uważając, aby nie uszkodzić sąsiednich struktur, takich jak nerw błędny. Podobnie jak w przypadku żyły, tętnicę szyjną wspólną należy podwiązać dwukrotnie, jak najbardziej kranialnie, a następnie przeciąć pomiędzy podwiązkami.Następnie przeprowadź naczynie przez mankiet tętniczy. Na koniec zamocuj mankiet tętniczy za pomocą kleszczyków mikronaczyniowych, prowadząc je od strony przyśrodkowej. Następnie usuń ligaturę i poszerz światło tętnicy, używając rozszerzaczy naczyń.Po odpowiednim poszerzeniu światła naczynia, naciągnij tętnicę na mankiet tętniczy. Na koniec, analogicznie do żyły, przymocuj tętnicę za pomocą ligatury jedwabnej 8-0. Tutaj widoczna jest żyła i tętnica przygotowane do zespolenia tętniczo-żylnego.W celu implantacji umieść przeszczep na zwilżonej gazie Ace w regionie szyjnym. Następnie przeciągnij żyłę wrotną przez pętlę z jedwabnej nici 8-0, skróć żyłę, aby uzyskać anastomozę bez napięcia, a następnie naciągnij żyłę wrotną na mankiet żylny. Na koniec utrwal żyłę okrężną ligaturą z jedwabiu 8-0.Analogicznie do żyły, przeprowadź kikut aorty przez pętlę ligatury i skróć aortę. Następnie naciągnij aortę na mankiet tętniczy i na koniec przymocuj ją okrężną ligaturą z jedwabiu 8-0. Przed reperfuzją zidentyfikuj naczynia śledzionowe, podwiąż je, a następnie wypreparuj ostrym narzędziem i usuń śledzionę.W celu reperfuzji najpierw zdejmij zacisk żylny, a następnie zacisk tętniczy. Prawidłowa reperfuzja przeszczepu objawia się widocznym tętnieniem tętnicy oraz różowym zabarwieniem całego przeszczepu. Nawilż przeszczep normotermicznym roztworem soli fizjologicznej.Przed zamknięciem rany należy usunąć uchwyt mankietu żylnego, aby uniknąć załamania naczynia. Na koniec ranę zamyka się szwem ciągłym 6-0 i wstrzykuje podskórnie 0,5 milliliters soli fizjologicznej w temperaturze normotermicznej. W celu walidacji modelu przebadano funkcję endokrynną przeszczepionej trzustki.U myszy wywołano hipoglikemię poprzez podanie streptozotocyny na cztery dni przed operacją; uznano je za hipoglikemiczne, jeśli poziom glukozy we krwi przekraczał 300 mg%. Ten wykres liniowy przedstawia poziom glukozy we krwi u żywych, nieprzeszczepionych myszy kontrolnych (kolor czerwony), a także u biorców przeszczepów, które nie były narażone na przedłużony czas zimnego niedokrwienia (kolor niebieski). Dodatkowo, na zielono przedstawiono poziom glukozy we krwi u biorców przeszczepów trzustki narażonych na 16 godzin zimnego niedokrwienia.Żywe myszy pozostawały w stanie hipoglikemii przez cały okres obserwacji. W przeciwieństwie do nich, przeszczepienie graftów trzustkowych, które nie były narażone na przedłużony czas zimnego niedokrwienia, doprowadziło do normalizacji glikemii w ciągu 24 godzin, co potwierdziło funkcję endokrynną przeszczepu. Przeszczepienie graftów narażonych na 16 godzin zimnego niedokrwienia nie przywróciło prawidłowej glikemii u biorców.Co więcej, w tej grupie wszystkie myszy musiały zostać uśmiercone w ciągu 48 godzin z powodu wczesnego uszkodzenia przeszczepu związanego z urazem reperfuzyjnym po niedokrwieniu. W tym filmie przedstawiliśmy metodę transplantacji trzustki u myszy z wykorzystaniem techniki bezszwowej z użyciem mankietu. Jest ona technicznie i mikrosurgicznie wykonalna i charakteryzuje się doskonałym wskaźnikiem sukcesu.Jednakże, biorąc pod uwagę postępujące włóknienie trzustki wynikające z niedrożności przewodów, w naszej opinii model ten najlepiej nadaje się do obszarów badawczych koncentrujących się na wcześniejszych uszkodzeniach przeszczepu związanych z urazem reperfuzyjnym.

mouse-model-for-pancreas-transplantation-using-modified-cuff

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Nasz protokół został opracowany w celu czystego i łatwego wprowadzania wysepek lub komórek pod torebkę nerkową myszy. Komórki są zagęszczane w postaci pelletów w końcowej części cewki używanej do transplantacji komórek pod torebkę nerkową. Prostota tej techniki zmniejsza stres dla komórek oraz myszy.

Transplantacja wysepek trzustkowych do torebki nerki u myszy z cukrzycą

Przeszczepianie wyizolowanych wysepek zostało zaproponowane jako potencjalna metoda leczenia cukrzycy typu 1. W niniejszym materiale opisujemy metodę izolacji wysepek z trzustek myszy oraz ich transplantacji do przestrzeni podtorebkowej nerki.

Metoda izolacji wysepek mysich i przeszczepiania podtorebkowego do nerki

Ten film opisuje protokół szczepienia ludzkich wysp trzustkowych do przedniej komory oka myszy w celu monitorowania rewaskularyzacji ludzkich przeszczepów wysp trzustkowych in vivo. Pomaga również zrozumieć udział komórek biorcy i dawcy w promowaniu enkapsulacji i unaczynienia przeszczepu.

Szczepienie wysp trzustkowych: metoda wszczepiania wysp trzustkowych do przedniej komory oka myszy w celu obrazowania in vivo

Film wyjaśnia krokową metodę chirurgiczną do ortotopowego wszczepienia fragmentu guza od dawcy nowotworowego do trzustki myszy z nienowotworowym biorcą w celu rozwoju raka trzustki. Ortotopowo wszczepiony PDAC może dokładniej uchwycić mikrośrodowisko tkanek ludzkiego raka trzustki niż konwencjonalne modele podskórne (SC).

Ortotopowy przeszczep guza homograftu: technika generowania mysich modeli guza trzustki

W tym filmie opisujemy procedurę wprowadzania komórek wysp trzustkowych do żyły wrotnej wątroby, a następnie aplikacji pianki żelowej, aby skutecznie zapobiec krwawieniu. Krwawienie pooperacyjne jest częstą przyczyną wysokiej śmiertelności podczas przeszczepu wysp trzustkowych.

Mysi model przeszczepu wysp trzustkowych: chirurgiczna metoda wprowadzania wysp trzustkowych do żyły wrotnej i zapobiegania krwawieniu pooperacyjnemu

Ten protokół opisuje model uszkodzenia polegający na chirurgicznym podwiązaniu przewodu trzustkowego dorosłej myszy, co skutkuje poważnym urazem, który tworzy środowisko umożliwiające neogenezę i proliferację komórek beta. Model ten może być wykorzystany jako narzędzie do badania mechanizmów zaangażowanych w tworzenie komórek beta.

Chirurgiczne uszkodzenie trzustki myszy poprzez podwiązanie przewodu trzustkowego jako model przeprogramowania i proliferacji endokrynologicznej i zewnątrzwydzielniczej

Ten protokół demonstruje izolację mysich wysepek i zasiewanie ich na rusztowaniu zdecelularycznym. Wyspy trzustkowe wsparte na rusztowaniach przeszczepiono do poduszeczki tłuszczowej najądrza myszy z cukrzycą indukowaną streptozotocyną (STZ). Wyspy trzustkowe przetrwały w miejscu przeszczepu i odwróciły stan hiperglikemii.

Wspomagany rusztowaniem przeszczep wysp trzustkowych w poduszce tłuszczowej najądrza myszy z cukrzycą

Przeszczep wysp trzustkowych jest sposobem na osiągnięcie normoglikemii w cukrzycy typu 1. Ten artykuł koncentruje się na technice przeszczepiania drogą wewnątrzwrotną w celu utrzymania prawidłowego poziomu glukozy u myszy z cukrzycą.

Wewnątrzportalowy przeszczep wysp trzustkowych w modelu mysim

W kontekście klinicznym, pacjenci z zlokalizowanym rakiem trzustki zostaną poddani pankreatektomii, a następnie leczeniu uzupełniającemu. Przedstawiony tutaj protokół ma na celu ustanowienie bezpiecznej i skutecznej metody modelowania tego scenariusza klinicznego u nagich myszy, poprzez ortotopową implantację raka trzustki, a następnie dystalną pankreatektomię i splenektomię.

Ortotopowy resekcyjny mysi model raka trzustki

W obecnym protokole, model przeszczepu serca myszy jest używany do badania mechanizmu odrzucania przeszczepu alloprzeszczepu serca. W tym heterotopowym modelu przeszczepu serca poprawia się efektywność operacji, a przeżycie przeszczepów serca jest zapewnione dzięki zespoleniu implantacji serca w szyjce macicy od końca do końca przy użyciu zmodyfikowanej techniki Cuff.

Zmodyfikowana technika mankietowa dla heterotopowego modelu przeszczepu szyjki macicy serca u myszy

Syngeneic mysie ortotopowe alloprzeszczepy gruczolakoraka przewodowego trzustki (PDAC) podsumowują biologię, fenotypy i reakcje terapeutyczne podtypów choroby. Ze względu na szybką, powtarzalną progresję nowotworu są szeroko stosowane w badaniach przedklinicznych. Tutaj pokazujemy powszechne praktyki generowania tych modeli, wstrzykiwania syngenicznych mysich kultur PDAC do trzustki.

Syngeniczne ortotopowe alloprzeszczepy myszy do modelowania raka trzustki

Poznaj zmodyfikowaną technikę mankietową do przeszczepu trzustki u myszy. Model ten umożliwia badanie uszkodzeń przeszczepu związanych z niedokrwieniem i reperfuzją oraz ocenę wczesnej funkcji endokrynnej.

Mysi model do przeszczepu trzustki przy użyciu zmodyfikowanej techniki mankietowej

Przeglądaj więcej filmów