Name: Pierwotna hodowla neuronów hipokampa o niskiej gęstości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 17 min 46 s
Description: Poznaj metodę hodowli pierwotnych neuronów hipokampa o niskiej gęstości na szkiełkach nad warstwą glejową. Technika ta umożliwia wysokiej rozdzielczości obrazowanie i badania funkcjonalne dojrzałych neuronów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez CIHR MOP-142209 dla TJS.

Wszystkie eksperymenty i protokoły z użyciem zwierząt laboratoryjnych zostały zatwierdzone przez komisję etyki zwierząt Uniwersytetu Manitoba i były zgodne z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami.
1. Przygotowanie instrumentów, i roztworów
<ol>
	<li>Sterylizuj przez autoklawowanie wszystkich urządzeń preparacyjnych, szklanych pipet Pasteura, końcówek do pipet, aparatury filtrującej i wody dejonizowanej.</li>
	<li>Przygotuj 20% (w/v; 1,1 M) podstawowy roztwór glukozy w wodzie dejonizowanej i sterylizuj filtrem. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować 100 mM roztwór pirogronianu sodu w wodzie dejonizowanej i wysterylizować z filtrem. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotuj wolny od wapnia i magnezu zrównoważony roztwór soli Hanka (CMF-HBSS), sporządzając roztwór 10% HBSS (10x), 10 mM HEPES i 100 U/ml penicyliny-streptomycyny w wodzie dejonizowanej. Przechowywać w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 1 do 2 miesięcy.</li>
	<li>Przygotować 10 mg/ml dezoksyrybonukleazy I (DNazy) w CMF-HBSS, a następnie wysterylizować metodą filtracyjną i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przygotować pożywkę glejową, sporządzając roztwór 30 mM glukozy (ze sterylnego roztworu), 95 U/ml penicyliny-streptomycyny i 10-15% surowicy wzrostu bydła (BGS) w pożywce minimum niezbędnej (MEM). 
	UWAGA: Jak wskazano w protokole, w razie potrzeby można użyć roztworu 5% BGS w celu spowolnienia proliferacji komórek. Zamiast BGS można stosować surowicę końską, ale należy pamiętać, że każda partia musi zostać przetestowana przed użyciem ze względu na różnice między partiami. Przygotowany roztwór przechowywać w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 1 do 2 miesięcy. Chociaż wiele laboratoriów korzysta z FBS, konsekwentnie zaobserwowaliśmy, że wzrost gleju w BGS jest tak samo silny jak w FBS. BGS pochodzi z płodowej surowicy cielęcej, która jest uzupełniona o chemicznie zdefiniowane składniki. Ponadto BGS jest znacznie bardziej ekonomiczny niż FBS.</li>
	<li>Przygotuj pożywkę do wzrostu i utrzymania neuronów (neurobasal-B27, NBG), sporządzając roztwór 1x suplementu B27 i 0,5 mM L-Glutaminy w 500 ml pożywki neurobazalnej. Przechowywać w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 1 do 2 miesięcy. L-Glutaminę można zastąpić GlutaMAX, który sugeruje się, że jest bardziej stabilny w pożywce wzrostowej.</li>
	<li>Przygotuj pożywkę do powlekania neuronów, sporządzając roztwór 30 mM glukozy (ze sterylnego roztworu), 1 mM pirogronianu sodu (ze sterylnego roztworu) i 10% BGS w MEM. Przechowywać w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 1 do 2 miesięcy.</li>
	<li>Przygotować roztwór 1 mM cytarabiny (Ara-C) i wysterylizować z filtrem. Porcjować na porcje o pojemności 1 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przygotować roztwór 100 mM APV w 100 mN wysterylizowanym filtrem NaOH. Przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Rozpuścić 1 mg/ml poli-L-lizyny w buforze boranowym o pH 8,5 (50 mM kwasu borowego i 12 mM boraksu) i wysterylizować filtrem. Podwielokrotność porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C. Zamiast poli-L-lizyny można użyć poli-L-ornityny, która może być mniej toksyczna dla komórek.</li>
</ol>
2. Przygotowanie kultur glejowych
<ol>
	<li>Przygotuj kulturę komórek astrogleju korowego
	<ol>
		<li>Pozyskać młode szczura w ciągu 24 godzin od urodzenia. Umieść szczenięta na lodzie, aby je znieczulić.</li>
		<li>Spryskaj szczenięta 70% etanolem i odetnij im głowy.</li>
		<li>Umieść głowy w naczyniu o średnicy 100 mm na lodzie zawierającym 15 ml CMF-HBSS.</li>
		<li>Wypreparuj każdy mózg, przecinając skórę głowy, otwierając czaszkę, przecinając pień mózgu, a następnie przenosząc mózg na 60-milimetrowe szalki Petriego na lodzie zawierającym 3 ml CMF-HBSS.</li>
		<li>Oddziel półkule mózgowe od hipokampów, a następnie usuń otaczające je opony mózgowe. Zachowaj odpowiednie środki ostrożności, aby zapewnić minimalne zanieczyszczenie fibroblastami opon mózgowych. Fibroblasty opon mózgowych w kulturze mogą konkurować z glejem o wzrost i być szkodliwe dla zdrowia neuronów. Zebrać wszystkie półkule mózgowe na 60-milimetrowej szalce Petriego na lodzie zawierającym 5 ml CMF-HBSS.</li>
		<li>Usuń CMF-HBSS, a następnie zmiel pobraną tkankę korową tak drobno, jak to możliwe, za pomocą nożyczek sprężynowych do mikropreparowania.</li>
		<li>Dodać wystarczającą ilość CMF-HBSS do posiekanej tkanki. Za pomocą szklanej pipety Pasteura przenieś kawałki tkanki do probówki o pojemności 15 ml. Doprowadzić całkowitą objętość do 12 ml, dodając CMF-HBSS.</li>
		<li>Dodaj po 1,5 ml 2,5% trypsyny i 10 mg/ml roztworu DNazy. Otrzymaną mieszaninę inkubować w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej przez 12 minut.</li>
		<li>Tkankę należy rozcierać 10-15 razy za pomocą szklanej pipety Pasteura, a następnie inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 3 minuty.</li>
		<li>Przefiltrować supernatant przez bibułę do soczewek lub siatkę filtracyjną do probówki o pojemności 50 ml zawierającej 5 ml BGS. Ma to na celu usunięcie kawałków niezdysocjowanej tkanki. Alternatywnie można użyć dostępnych na rynku filtrów siatkowych.</li>
		<li>Dodać 13,5 ml CMF-HBSS i 1,5 ml 2,5% trypsyny do probówki zawierającej pozostałe fragmenty tkanki i dalej inkubować w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej przez dodatkowe 10 minut.</li>
		<li>Pozostałą tkankę należy ponownie roztrzeć, a następnie ponownie przefiltrować zawiesinę do probówki o pojemności 50 ml zawierającej początkowy filtrat. Następnie opłucz papier do soczewek 3 ml BGS. Ostateczna objętość powinna wynosić około 38 ml.</li>
		<li>Odwirować zawiesinę zawierającą zdysocjowane komórki glejowe przez 6 minut przy sile 130 x g. Ostrożnie odwirować supernatant za pomocą szklanej pipety Pasteura. Upewnij się, że granulowane komórki na dole nie są naruszone. Dno osadu wydaje się lekko czerwonawe i zawiera składniki krwi.</li>
		<li>Przenieść komórki glejowe w 1 ml pożywki glejowej do świeżej probówki, uważając, aby nie naruszyć czerwonawej części osadu.</li>
		<li>Dodaj do 2 ml pożywki glejowej na szczenię, aby ponownie zawiesić połączone zdysocjowane komórki glejowe. Na przykład, jeśli użyto 10 szczeniąt, całkowita objętość rekompozycji wyniesie 20 ml.</li>
		<li>Przygotować jedną kolbę do hodowli komórkowych o średnicy 75cm2 na młode. Dodać 18 ml wstępnie ogrzanej pożywki glejowej do każdej kolby.</li>
		<li>Przenieść 2 ml zawiesiny komórkowej do każdej kolby i inkubować w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
		<li>Po jednym dniu zastąp 20 ml pożywki glejowej. Na tym etapie hodowla jest mieszanką komórek glejowych i innych niepożądanych typów komórek.</li>
		<li>Cztery dni po wysianiu komórek energicznie potrząśnij kolbami, aby usunąć komórki inne niż astrocyty. W tym celu należy przepłukać kolby raz za pomocą CMF-HBSS, a następnie dodać 10 ml świeżego CMF-HBSS do każdej kolby. Energicznie wstrząsnąć kolbami 5-10 razy, a następnie odessać CMF-HBSS. Przepłukać dwukrotnie CMF-HBSS, a następnie dodać 20 ml pożywki glejowej. 
		UWAGA: Ten krok ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia usunięcia typów komórek innych niż docelowe i nie powinien powodować utraty pożądanych astrocytów.</li>
		<li>Zastąp świeżą pożywką glejową dwa razy w tygodniu, aż komórki zaczną się zlewać (ryc. 1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zamrażanie gleju
	<ol>
		<li>Gdy kultury zlewają się, odessać pożywkę i przemyć monowarstwę komórek 10 ml CMF-HBSS.</li>
		<li>Dodać 10 ml 0,25% trypsyny/EDTA do każdej kolby i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 minuty.</li>
		<li>Delikatnie postukaj w kolby, aby usunąć komórki. Dodać 1 ml BGS do każdej kolby i przenieść zawiesiny komórek do probówek o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Odwirować probówki o sile 130 x g przez 6 minut. Powstały supernatant należy wyrzucić.</li>
		<li>Zawiesić osad komórkowy w 2 ml pożywki glejowej.</li>
		<li>Przygotować pożywkę do zamrażania glejowego (1 część sulfotlenku dimetylu i 4 części BGS). Dodać 0,5 ml tego roztworu do każdej z 4 fiolek kriogenicznych w kolbie.</li>
		<li>Przenieść 0,5 ml zawiesiny komórkowej do każdej fiolki, a następnie powoli zamrażać komórki, umieszczając fiolki w izolowanym pojemniku w zamrażarce o temperaturze -80 °C na noc. Po jednym dniu należy przenieść fiolki do zamrażarki z ciekłym azotem w celu długotrwałego przechowywania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Poszycie ożywiło glej
	<ol>
		<li>Glej płytkowy 1-2 tygodnie przed dniem hodowli neuronów.</li>
		<li>Przygotuj probówkę o pojemności 50 ml z 10 ml podgrzanej pożywki glejowej.</li>
		<li>Rozmrażać 1 zamrożoną fiolkę z glejem w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 2-3 minuty.</li>
		<li>Przenieść zawartość fiolki do probówki o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml pożywki glejowej.</li>
		<li>Odwirować probówkę przez 5 minut przy sile 130 x g i odessać sklarowany nad osadem.</li>
		<li>Zawiesić osad w 20 ml pożywki glejowej.</li>
		<li>Dodać 3 ml świeżej pożywki glejowej do każdej z szalek hodowlanych (60 mm), a następnie przenieść 1 ml zawiesiny komórkowej do każdej szalki. Inkubować kultury w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
		<li>Karm komórki dwa razy w tygodniu. Jeśli gęstość komórek osiągnie 50% konfluencji na długo przed dniem hodowli neuronów, zmień na pożywkę glejową zawierającą 5% BGS, aby spowolnić tempo wzrostu gleju. Pożądane zsumowanie monowarstwy glejowej dla hodowli neuronów wynosi 50% - 70%.</li>
		<li>Zastąp pożywkę glejową pożywką NBG (6 ml / talerz) 1-2 dni przed hodowlą neuronów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych
<ol>
	<li>Czyszczenie i przygotowanie kulek parafinowych
	<ol>
		<li>Zanurzyć szkiełka nakrywkowe w stężonym kwasie azotowym (70% wag./wag.; UWAGA: silnie) i sonikować je przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Inne laboratoria uznały, że korzystna jest inkubacja szkiełek nakrywkowych w 70% kwasie azotowym w ceramicznych stojakach przez 12-24 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Ostrożnie wyrzuć kwas azotowy do wyznaczonego dygestorium chemicznego zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Spłucz szkiełka nakrywkowe 3-5 razy wodą dejonizowaną.</li>
		<li>Zanurz szkiełka nakrywkowe w wodzie dejonizowanej i ponownie poddaj je sonikacji przez 30 minut (pomiń, jeśli stosujesz metodę alternatywną).</li>
		<li>Usuń wodę dejonizowaną i spłucz szkiełka nakrywkowe jeszcze trzy razy.</li>
		<li>Zanurz szkiełka nakrywkowe w 50 ml wody dejonizowanej i wysterylizuj je w autoklawie. Alternatywnie można sterylizować szkiełka nakrywkowe w temperaturze 225 °C w piekarniku przez 6 godzin. W przypadku korzystania z tego alternatywnego podejścia przejdź do kroku 3.1.9.</li>
		<li>Po sterylizacji w autoklawie przenieś szkiełka nakrywkowe do sterylnego okapu z przepływem laminarnym, aby wykonać następujące czynności.</li>
		<li>Usuń wodę dejonizowaną i spłucz 20-30 ml 100% etanolu.</li>
		<li>Dodać 20-30 ml 100% etanolu i przenieść szkiełka nakrywkowe i etanol na szalkę Petriego o średnicy 100 mm.</li>
		<li>Użyj pęsety, aby przenieść szkiełka nakrywkowe na szalki Petriego o średnicy 60 mm, 4-5 szkiełek nakrywkowych na naczynie, a następnie pozostaw je do wyschnięcia na powietrzu, opierając szkiełka nakrywkowe o krawędź naczynia. Po odparowaniu etanolu połóż szkiełka nakrywkowe płasko na powierzchni.</li>
		<li>Przenieś 10 g parafiny do odpowiedniej butelki ze szkła żaroodpornego. Rozpuść parafinę i utrzymuj ją w temperaturze około 150-200 °C na gorącej płycie przez co najmniej 1 godzinę. Idealna temperatura, do której należy podgrzać parafinę, może wymagać pewnych poprawek. Nieidealne temperatury mogą prowadzić do trudności w wytwarzaniu odpowiedniego rozmiaru kulek parafinowych. Okres oczekiwania po stopieniu pomaga zapewnić stałą temperaturę w całej cieczy.</li>
		<li>Zanurz pipetę Pasteura w parafinie, a następnie szybko przyłóż ją do trzech miejsc w pobliżu krawędzi każdego szkiełka nakrywkowego (każde miejsce jest oddalone od siebie o około 120°). Krople zestalą się w kulki o wysokości około 0,3-0,5 mm i średnicy 1,0-2,0 mm i będą działać w celu zapewnienia przestrzeni między neuronami na szkiełku nakrywkowym a monowarstwą glejową poniżej (ryc. 2).</li>
		<li>Naczynia sterylizujemy w świetle UV przez 30 min, a następnie przykrywamy folią aluminiową i przechowujemy w temperaturze pokojowej. Przygotowane szkiełka nakrywkowe można przechowywać i używać do jednego miesiąca. Kulki parafinowe powinny przylegać do szkiełek nakrywkowych przez co najmniej tydzień przed użyciem. Zapobiegnie to odklejaniu się parafiny podczas pozostałych etapów protokołu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powlekanie szkiełek nakrywkowych poli-L-lizyną
	<ol>
		<li>Otrzymać szalki Petriego zawierające wcześniej przygotowane szkiełka nakrywkowe z kulkami parafiny.</li>
		<li>Dodać 200 μl poli-L-lizyny w buforze boranowym na powierzchnię każdego szkiełka nakrywkowego i pozostawić roztwór na szkiełkach nakrywkowych na noc pod przykryciem w temperaturze pokojowej. Pokryj tę samą powierzchnię, na której znajdują się kulki parafinowe. Należy pamiętać, że przy prawidłowym oczyszczeniu poli-L-lizyna powinna łatwo się rozprowadzać, pokrywając powierzchnię szkiełka nakrywkowego.</li>
		<li>Po jednym dniu należy umyć szkiełka nakrywkowe dwukrotnie, mocząc je za każdym razem w sterylnej wodzie dejonizowanej przez 2 godziny. Po ostatnim umyciu zastąp wodę 4 ml pożywki do powlekania neuronów na naczynie. Należy pamiętać, że ważne jest, aby powierzchnia szkiełek nakrywkowych nie mogła wyschnąć po pokryciu poli-L-lizyną.</li>
		<li>Umieścić naczynia zawierające szkiełko nakrywkowe w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Powlekane szkiełka nakrywkowe należy inkubować przez co najmniej 24 godziny przed hodowlą neuronów. Ma to na celu przygotowanie pożywki do hodowli neuronów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Sekcja hipokampa i neuronów poszycia
<ol>
	<li>Uzyskaj ciężarną szczur (dzień embrionalny 18-19, mierzony od dnia odkrycia czopa dopochwowego) i poddaj się eutanazji przez dekapitację znieczuloną izofluranem lub inną zatwierdzoną metodę.</li>
	<li>Spryskaj spód szczura 70% etanolem, a następnie wykonaj nacięcie od okolicy łonowej do końca jamy brzusznej. Aby uniknąć zanieczyszczenia, na tym etapie należy uważać, aby przeciąć tylko skórę.</li>
	<li>Ponownie opłucz narzędzia preparacyjne 70% etanolem, a następnie przeciąć ścianę brzucha, aby odsłonić macicę. Usuń dwa rogi macicy i umieść je na sterylnej szalce Petriego o średnicy 100 mm.</li>
	<li>Pozostałe kroki wykonaj w okapie z przepływem laminarnym. Usuń błonę macicy otaczającą płody. Odetnij im głowy i umieść je na 100-milimetrowej szalce Petriego zawierającej 20 ml CMF-HBSS.</li>
	<li>Wypreparuj mózgi i natychmiast umieść je na szalce Petriego o średnicy 60 mm zawierającej 2 ml CMF-HBSS na lodzie. Zbierz tylko 2-3 mózgi na naczynie, aby zapewnić wystarczająco dużo miejsca na następny krok.</li>
	<li>Pod mikroskopem preparacyjnym usuń opony mózgowe z linii środkowej półkul mózgowych, a następnie wypreparuj hipokampy i umieść je na 60-milimetrowej szalce Petriego zawierającej 4,5 ml CMF-HBSS. Należy zauważyć, że hipokamp można rozróżnić jako strukturę w kształcie półksiężyca na przyśrodkowej powierzchni półkuli korowej i jest łatwy do usunięcia, ponieważ jest otoczony bocznie komorą.</li>
	<li>Przenieś pobraną tkankę hipokampa i CMF-HBSS do probówki o pojemności 15 ml. Dodać 0,5 ml 2,5% trypsyny, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Papaina może być stosowana zamiast trypsyny, ponieważ jest łagodniejsza i może zwiększyć wydajność.</li>
	<li>Delikatnie usuń roztwór trypsyny za pomocą pipety Pasteura, pozostawiając nienaruszoną tkankę hipokampa na dnie probówki.</li>
	<li>Delikatnie umyć tkankę dwukrotnie za pomocą 5 ml CMF-HBSS, inkubując ją w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Po drugim płukaniu doprowadzić całkowitą objętość do co najmniej 5 ml, dodając odpowiednią objętość CMF-HBSS do tkanki. Jeśli hipokampy pochodzą od więcej niż 10 młodych, można dodać do 8 ml CMF-HBSS.</li>
	<li>Przygotuj dwa warianty pipet polerowanych ogniowo do dysocjacji tkanek. Końcówka jednego z wariantów ma normalną średnicę pipety, ale z wygładzonymi krawędziami, polerowanymi na ogniowo. Drugi wariant to taki, w którym średnica końcówki jest zmniejszona o połowę. Na krótko wystawić końcówkę szklanej pipety Pasteura po przekątnej na źródło płomienia, a następnie zbadaj końcówki pipet.
	<ol>
		<li>Powtarzaj ten krok, aż krawędź końcówki zostanie wygładzona lub średnica zostanie zmniejszona. Ważne jest, aby ćwiczyć, aby znaleźć idealną średnicę, aby zapewnić, że tkanka zostanie zdysocjowana, aby uzyskać pojedyncze komórki bez uszkadzania tych komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Najpierw przetrzeć tkankę hipokampa przez około 10 przejść przez normalną szklaną pipetę Pasteura o gładkich krawędziach, a następnie kolejne 5 do 10 przejść przez pipetę o zmniejszonej średnicy. Celem jest uzyskanie jednorodnego roztworu komórek bez grudek tkanek lub z bardzo małą ich ilością.</li>
	<li>Określ gęstość komórek za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek. Zazwyczaj 0,8 do 1,0 miliona komórek na młode uzyskuje się po połączeniu hipokampów z dwóch półkul.</li>
	<li>Przenieść wystarczającą objętość zawiesiny komórek do szalek zawierających szkiełka nakrywkowe pokryte poli-L-lizyną w pożywce galwanicznej o pojemności 4 ml, aby uzyskać gęstość posiewu wynoszącą 300 000 komórek na szalkę o średnicy 60 mm. Gęstość komórek może wahać się od 100 000 do 500 000, w zależności od zamierzonego eksperymentu.</li>
	<li>Po 3-4 godzinach przenieś szkiełka nakrywkowe z neuronami przyłączonymi do szalek zawierających komórki glejowe w pożywce NBG. Należy to zrobić tak, aby strona, po której zostały posiane neurony, była skierowana w dół w kierunku warstwy komórek glejowych. Dodaj w sumie 4-5 szkiełek nakrywkowych na naczynie glia.</li>
	<li>Dwa lub trzy dni po posiewie dodać roztwór Ara-C do końcowego stężenia 5 μM na szalkę, aby zatrzymać wzrost gleju.</li>
	<li>Karm komórki raz w tygodniu, zastępując 2 ml starej pożywki 2,5 ml świeżej pożywki przy każdym karmieniu. Dodana dodatkowa pożywka ma na celu skompensowanie parowania w czasie, a tylko część pożywki jest zmieniana, aby zapewnić stałe kondycjonowanie pożywki przez komórki glejowe. Kultury te są zazwyczaj zdrowe przez co najmniej jeden miesiąc (ryc. 3). Przeżycie neuronów można poprawić, dodając APV do pożywki hodowlanej do końcowego stężenia 100 μM. APV jest antagonistą receptora NMDA i wspomaga przeżycie poprzez zmniejszenie ekscytotoksyczności glutaminianu.</li>
</ol>

<ol><li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> Brain Res. 126, 397-425 (1977).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li>
<li>Adamantidis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics%3A+10+years+after+ChR2+in+neurons--views+from+the+community%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optogenetics: 10 years after ChR2 in neurons--views from the community.</a> Nat Neurosci. 18, 1202-1212 (2015).</li>
<li>Ho, V. M., Lee, J. A., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The cell biology of synaptic plasticity.</a> Science. 334, 623-628 (2011).</li>
<li>Huganir, R. L., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPARs+and+synaptic+plasticity%3A+the+last+25+years%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">AMPARs and synaptic plasticity: the last 25 years.</a> Neuron. 80, 704-717 (2013).</li>
<li>Luscher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+AMPA+receptor+cycling+in+synaptic+transmission+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Role of AMPA receptor cycling in synaptic transmission and plasticity.</a> Neuron. 24, 649-658 (1999).</li>
<li>Varoqueaux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroligins+determine+synapse+maturation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neuroligins determine synapse maturation and function.</a> Neuron. 51, 741-754 (2006).</li>
<li>Huettner, J. E., Baughman, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+of+identified+neurons+from+the+visual+cortex+of+postnatal+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats.</a> J Neurosci. 6, 3044-3060 (1986).</li>
<li>Lester, R. A., Quarum, M. L., Parker, J. D., Weber, E., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+6-cyano-7-nitroquinoxaline-2%2C3-dione+with+the+N-methyl-D-aspartate+receptor-associated+glycine+binding+site%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Interaction of 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione with the N-methyl-D-aspartate receptor-associated glycine binding site.</a> Mol Pharmacol. 35, 565-570 (1989).</li>
<li>Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+survival+of+hippocampal+neurons+in+B27-supplemented+Neurobasal%2C+a+new+serum-free+medium+combination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination.</a> J Neurosci Res. 35, 567-576 (1993).</li>
<li>Banker, G., Goslin, K. Rat hippocampal neurons in low-density culture. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoslin%2C+K+%22Culturing+nerve+cells%22">Culturing nerve cells</a>. 2, 339-370 (1998).</li>
<li>Hanisch, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+as+a+source+and+target+of+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Microglia as a source and target of cytokines.</a> Glia. 40, 140-155 (2002).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podczas gdy metoda "kanapkowa" hodowli neuronów została dobrze opisana w innym miejscu2,11, w całym protokole jest kilka kroków, które są dość trudne do opisania w samym tekście, co może prowadzić do frustracji badaczy, którzy chcą ją przyjąć.
Metodę można podzielić na trzy szerokie przepływy pracy: hodowla glejowa, przygotowanie szkiełek nakrywkowych oraz hodowla i utrzymanie neuronów. Każdy z tych trzech preparatów ma kluczowe znacze...

Mózg jest zorganizowany w skomplikowane sieci neuronów. Udział poszczególnych neuronów w aktywności sieci i funkcjonowaniu mózgu można badać poprzez selektywną zmianę ich składu molekularnego i perurbancji ich właściwości fizjologicznych. Genetyczna i chemiczna manipulacja pojedynczymi neuronami jest prawdopodobnie łatwiejsza w hodowanych neuronach niż w nienaruszonej tkance mózgowej, nieobciążonej przez komórkową heterogeniczność i złożoność tej ostatniej. Neurony w kulturze rozwijają dobrze zdefiniowane altany aksonalne i dendrytyczne i tworzą ze sobą rozległe połączenia synaptyczne.
Chociaż hodowla neuronów od dorosłych zwierząt lub z innych regionów układu nerwowego jest możliwa, embrionalne kultury hipokampa są często preferowane ze względu na ich zdefiniowaną populację komórek piramidalnych i stosunkowo niską gęstość glejową 1,2. Neurony hipokampa hodowane w niskiej gęstości w kulturze są szczególnie podatne na badanie lokalizacji subkomórkowej, transportu białek, polaryzacji neuronów i rozwoju synaps. Neurony w kulturze są również szeroko wykorzystywane do badania procesów molekularnych w plastyczności synaptycznej 3,4,5,6. Preparaty do hodowli neuronów od myszy z globalnymi delecjami genetycznymi, które nie przeżywają po urodzeniu, były szczególnie przydatne w badaniu komórkowych i synaptycznych ról niektórych genów 7.
Podobnie jak w mózgu, hodowane neurony hipokampa są zależne od troficznego wsparcia ze strony komórek glejowych. To komplikuje ich kulturę i doprowadziło do opracowania kilku różnych metod, za pomocą których to wsparcie jest dostarczane. Jedna z powszechnie stosowanych metod polega na posiewaniu neuronów bezpośrednio na monowarstwie komórek glejowych 8, lub pozwalaniu na proliferację zanieczyszczonych komórek glejowych z nabytej tkanki hipokampa i tworzenie monowarstwy pod neuronami 9. Chociaż metoda ta odniosła pewien sukces, zanieczyszczenie powstałej kultury neuronalnej jest niekorzystne dla eksperymentów obrazowych. Inną powszechnie stosowaną metodą hodowli neuronów jest całkowite pominięcie warstwy zasilającej glej, a zamiast tego zapewnienie wsparcia troficznego w postaci zdefiniowanej pożywki wzrostowej 10.
Tutaj opisujemy metodę hodowli neuronów "kanapkową" lub "bankierską" 2,11. Metoda ta polega na posiewaniu neuronów hipokampa na szklanych szkiełkach nakrywkowych, które są następnie zawieszane na monowarstwie komórek glejowych oddzielonych kulkami wosku parafinowego. Ułatwia to długotrwałą hodowlę jednorodnej populacji neuronów bez zanieczyszczania gleju, a jednocześnie umożliwia troficzne wsparcie ze strony leżącej poniżej monowarstwy glejowej. Gdy neurony są w odpowiednim wieku lub na odpowiednim poziomie dojrzałości, szkiełka nakrywkowe neuronów można wyjąć z naczynia glejowego i wykorzystać w obrazowaniu lub testach funkcjonalnych.

<table><tbody><tr><td>Przyrządy do preparacji</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro Nożyczki preparacyjne</td><td>Roboz</td><td>RS-5910</td><td></td></tr><tr><td>Mikro nożyczki sprężynowe do preparowania</td><td>Roboz</td><td>RS-5650</td><td></td></tr><tr><td>Mikro nożyczki sprężynowe do preparowania</td><td>Roboz</td><td>RS-5605</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Kleszcze</td> <td>Roboz</td><td>RS-5045</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Kleszcze (#PP)</td><td>Roboz</td><td>RS-4950</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Preparat tkankowy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna (2,5%)</td><td>Gibco</td><td>15-090-046</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,25%)</td><td>Gibco</td><td>25-200-072</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt filtra Swinnex, 25&nbsp; mm</td><td>EMD Millipore</td><td>SX0002500</td><td>Używany jako sitko do komórek. Najpierw zmontuj z filtrem i autoklawem</td></tr><tr><td>Isoflorane</td><td>Pharmaceutical Partners of Canada Inc.</td><td></td><td></td>CP0406V2</tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>Hausser Scientific</td><td>1492</td><td></td></tr><tr><td>Grade 105 Chusteczka do czyszczenia soczewek</td><td>GE Healthcare</td><td>2105-841</td><td>Używany jako sitko do komórek. Zamontuj najpierw w uchwycie filtra i autoklawie</td></tr><tr><td>Szklane pipety Pasteura z filtrem bawełnianym</td><td>VWR</td><td>14672-412</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Gibco</td><td>15-630-080</td><td></td></tr><tr><td>Zbilansowany roztwór soli Hanka bez wapnia, magnezu, czerwieni fenolowej (HBSS, 10x)</td><td>Gibco</td><td>14-185-052</td><td></td></tr><tr><td>Szklane pipety Pasteura</td><td>VWR</td><td>14672-380</td><td></td></tr><tr><td>Deoksyrybonukleaza I z trzustki bydlęcej (Dnase)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25-100mg</td><td></td></tr><tr><td>Butan Bunsen Burner</td><td>Wall-Lenk Mfg. Co.</td><td>Wirówka model 65</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Kultura tkankowa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15-140-122</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego (100 mm)</td><td>Szalka</td> Petriego <td>FB0875712</td><td></td>Fishera</tr><tr><td>(60 mm)</td><td>Fisher</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Serum dla koni</td><td>Gibco</td><td>16050-122</td><td>Może być używana zamiast BGS, ale każda partia musi zostać przetestowana ze względu na różnice między partiami. Zalecana jest inaktywacja surowicy na gorąco.</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-1</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>Minimum niezbędne podłoże (MEM)</td><td>Gibco</td><td>11-095-080</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże neuropodstawowe</td><td>Gibco</td><td>21-103-049</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>25-030-081</td><td></td></tr><tr><td>Suplement GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>Może być stosowany zamiast L-glutaminy w pożywce NBG</td></tr><tr><td>Naczynie hodowlane (60 mm)</td><td>Corning, Inc</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>Kolby hodowlane (75 cm^2)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658170</td><td></td></tr><tr><td>Cytarabina (Ara-C)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3350000</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Bydlęca surowica wzrostu (BGS)</td><td>HyClone</td><td>SH3054103</td><td>Przed użyciem zaleca się inaktywację termiczną.</td></tr><tr><td>Suplement B27 (50x)</td><td>Gibco</td><td>17-504-044</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Fiolki kriogeniczne</td><td>VWR</td><td>89094-806</td><td></td></tr><tr><td>Kwas DL-2-amino-5-fosfonopentanowy (APV)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5282</td><td></td></tr><tr><td><silny>Nazwa</silny></td><td><silny>Firma</silny></td><td><silny>Numer katalogowy<</td><td>strong>Komentarze</td></tr><tr><td>Preparat do szkiełek nakrywkowych</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tetraboran sodu dekahydrat (boraks)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B9876-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Bromowodorek poli-L-lizyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>Histoplast Wosk parafinowy</td><td>Fisher</td><td>22-900-700</td><td></td></tr><tr><td>Grawitacyjny piec konwekcyjny</td><td>VWR</td><td>89511-404</td><td>Używany do alternatywnej metody czyszczenia szkiełek nakrywkowych omówionej w protokole</td></tr><tr><td>Kąpiel ultradźwiękowa (Sonicator)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>15337400</td><td></td></tr><tr><td>Kwasy azotowe</td><td>Anachemia</td><td>62786-460</td><td></td></tr><tr><td>Ceramiczne stojaki do barwienia</td><td>Thomas Scientific</td><td>8542E40</td><td>Używany do alternatywnej metody czyszczenia szkiełek nakrywkowych omówionej w protokole</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>Glaswarenfabrik Karl Hecht&nbsp; GmbH</td><td>1001/18</td><td>Producent jest bardzo ważny, ponieważ neurony nie przylegają dobrze do szkła o niższej jakości&nbsp;</td></tr><tr><td>Kwas borowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0252</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Różne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sterylne filtry strzykawkowe</td><td>VWR</td><td>28145-477</td><td>Używany ze strzykawką BD do strzykawka do sterylizacji filtra</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>BD</td><td>302832</td><td>Używany ze sterylnymi filtrami strzykawkowymi VWR do sterylizacji fliterami</td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-460-16Q</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Stożkowe sterylne probówki wirówkowe</td><td>ThermoScientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Stożkowe sterylne probówki wirówkowe</td><td>ThermoScientific</td><td>339652</td><td></td></tr></tbody></table>

pierwotna hodowla neuronów hipokampa o niskiej gęstości

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

Możliwość badania struktury i fizjologii poszczególnych komórek nerwowych w hodowli jest kluczowa dla badań neurobiologicznych i pozwala na elastyczność w genetycznym i chemicznym manipulowaniu pojedynczymi komórkami lub zdefiniowanymi sieciami. Taka łatwość manipulacji jest prostsza w systemie hodowli zredukowanej w porównaniu z nienaruszoną tkanką mózgową. Chociaż istnieje wiele metod izolacji i wzrostu tych pierwotnych neuronów, każda z nich ma swoje własne ograniczenia. Protokół ten opisuje metodę hodowli embrionalnych neuronów hipokampa gryzoni o niskiej gęstości i wysokiej czystości na szklanych szkiełkach nakrywkowych, które są następnie zawieszane na monowarstwie komórek glejowych. Ta "kultura warstwowa" pozwala na wyłączny, długoterminowy wzrost populacji neuronów, jednocześnie umożliwiając troficzne wsparcie ze strony leżącej poniżej monowarstwy glejowej. Gdy neurony są w odpowiednim wieku lub na odpowiednim poziomie dojrzałości, szkiełka nakrywkowe neuronów można wyjąć z naczynia glejowego i wykorzystać w obrazowaniu lub testach funkcjonalnych. Neurony wyhodowane tą metodą zazwyczaj przeżywają kilka tygodni i rozwijają rozległe altany, połączenia synaptyczne i właściwości sieci.

W tej „kanapkowej” metodzie pierwotnej hodowli komórek nerwowych, neurony hipokampa (Rysunek 3) rosną na warstwie komórek glejowych (Rysunek 1), oddzielonych kuleczkami parafinowymi (Rysunek 2). Zapewnia to selektywny wzrost neuronów na szkiełkach podstawkowych przy minimalnym zanieczyszczeniu komórkami glejowymi, przy jednoczesnym zapewnieniu odpowiedniego wsparcia troficznego ze strony gleju rosnącego na naczyniu hodowlanym. Zazwyczaj n...

Ten artykuł opisuje protokół hodowli pierwotnych neuronów hipokampa o niskiej gęstości rosnących na szklanych szkiełkach nakrywkowych odwróconych na monowarstwie glejowej. Warstwy neuronów i glejowe są oddzielone kulkami wosku parafinowego. Neurony wyhodowane tą metodą nadają się do obrazowania optycznego o wysokiej rozdzielczości i testów funkcjonalnych.

Pierwotna hodowla neuronów hipokampa o niskiej gęstości

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

Protokół ten został pierwotnie opublikowany przez dr. Gary’ego bunkera i jego współpracowników; pozwala on na uzyskanie kultur embrionalnych neuronów hipokampa o niskiej gęstości i wysokiej czystości poprzez zawieszenie neuronów nad warstwą filtrującą z gleju. Wynik ten jest zgodny z naszymi pozostałymi kluczowymi wynikami dotyczącymi hipokampa, ponieważ umożliwia on wzrost neuronów przy niskiej gęstości, z niewielką liczbą zanieczyszczających komórek glejowych. Jest to zatem rozwiązanie idealne do obrazowania o wysokiej rozdzielczości oraz analizy funkcjonalnej morfologii i dojrzałych neuronów w kulturze.Etap po dojrzewaniu w tym protokole powinien przyspieszyć adaptację nowych kultur, ponieważ w trakcie procedury występuje kilka kluczowych stanów, które są trudne do opisania, dlatego instrukcja prowadzi użytkownika krok po kroku. Protokół ten składa się z trzech niezależnych populacji niezbędnych do hodowli wysokiej jakości pierwotnych neuronów. Procesy te obejmują hodowlę komórek glejowych, przygotowanie i powlekanie szkiełek podstawowych oraz preparowanie komórek nerwowych hipokampa.Na początek należy pozyskać tkankę kory mózgowej szczura w okresie wczesnego etapu postnatalnego, zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Choć nie jest to tutaj bezpośrednio pokazane, należy zauważyć, że etap sekcji przedstawiony później w niniejszym protokole jest niemal identyczny z etapem stosowanym podczas sekcji kory. Z tego powodu odpowiednie kroki zostaną wyróżnione podczas procedury sekcji hipokampa pokazanej w dalszej części tego filmu.Zaczynając od kroku szóstego protokołu pisemnego, usunąć HBSS z pobranej tkanki korowej, a następnie rozdrobnić tkankę nożyczkami tak drobno, jak to możliwe. Dodać do posiekanej tkanki odpowiednią ilość HBSS, aby przenieść fragmenty tkanki do probówki stożkowej o pojemności 50 mililitrów, a następnie uzupełnić objętość całkowitą do 12 mililitrów, dodając HBSS. Dodać po 1,5 mililitra 2,5% trypsyny oraz roztworu DNA o stężeniu 10 milligram per milliliter, wymieszać przez odwrócenie probówki, a następnie inkubować otrzymaną mieszaninę w łaźni wodnej o temperaturze 37 degree Celsius przez 12 minut.Utrzyj tkankę od 10 do 15 razy za pomocą szklanej pipety Pasteura, a następnie inkubuj ją w kąpieli wodnej przez kolejne trzy minuty. Upewnij się, że wszystkie fragmenty tkanki opadły na dno probówki, następnie przefiltruj nadsącz do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów zawierającej 5 mililitrów BGS. Do probówki z pozostałymi fragmentami niestrawionej tkanki dodaj 13,5 mililitra HBSS oraz 1,5 mililitra 2,5&trypsin, odwróć probówkę w celu wymieszania, a następnie inkubuj w kąpieli wodnej przez dodatkowe 10 minut.Po inkubacji utrzyć pozostałą tkankę od 10 do 15 razy, a następnie przefiltrować ją do probówki zawierającej początkowy filtrat. Następnie przepłukać filtr, przepuszczając przez niego dodatkowe 3 ml BGS. Na tym etapie filtrat można podzielić na kilka probówek, aby ułatwić zarówno wirowanie, jak i ponowne zawieszenie osadu komórkowego.Wirować zawiesiny przez sześć minut przy 130 G. Po wirowaniu należy zauważyć, że dno osadu ma lekko czerwonawy odcień ze względu na obecność składników krwi. Usunąć nadsącz, a następnie dodać 1 mililitr pożywki dla gleju do każdej probówki, uważając, aby nie naruszyć osadu. Przenieść części każdego osadu, które nie mają czerwonawego wyglądu, do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 mililitrów.Do zawiesiny z połączonych tkanek dodać do 2 mililitrów pożywki dla gleju na każdego szczeniaka, a następnie każdą 2-mililitrową porcję zawiesiny przenieść do 18 mililitrów uprzednio ogrzanej pożywki dla gleju w kolbie hodowlanej o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych. Kolbę inkubować w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i przy 5% CO2. Dzień po wysianiu komórek wymienić pożywkę w każdej kolbie na świeżą pożywkę dla gleju.Należy pamiętać, że na tym etapie hodowla będzie stanowiła mieszaninę astrocytów i innych niecelowych typów komórek. Aby usunąć typy komórek innych niż astrocyty, kolby należy poddać silnemu wstrząsaniu około cztery dni po wysianiu. W tym celu należy przepłukać kolby roztworem HBSS, a następnie dodać 10 mililitrów świeżego HBSS do każdej kolby i energicznie wstrząsnąć każdą z nich od 5 do 10 razy.Odssać HBSS i przemyć dwukrotnie HBSS. Następnie dodać 20 ml pożywki dla gleju i ponownie umieścić kolby w inkubatorze, tak jak wcześniej. Należy zauważyć, że mimo intensywności tego procesu, astrocyty przeznaczone do hodowli pozostaną silnie przylegające do powierzchni kolby.Aby utrzymać kultury astrocytów, należy wymieniać pożywkę na świeżą pożywkę glialną dwa razy w tygodniu, aż do osiągnięcia konfluencji. Po osiągnięciu konfluencji komórki można zamrozić do późniejszego wykorzystania, zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Glię należy wysiać do naczyń co najmniej 14 dni przed rozpoczęciem hodowli neuronów, zgodnie z opisem w protokole pisemnym.Zanurz szkiełka nakrywkowe w stężonym kwasie azotowym i poddaj je sonikacji przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Należy zachować ostrożność, ponieważ stężony kwas azotowy jest substancją silnie żrącą. Należy również zauważyć, że w niektórych laboratoriach preferuje się moczenie szkiełek nakrywkowych w kwasie azotowym przez noc z wykorzystaniem ceramicznych statywów do barwienia.Kwas azotowy należy ostrożnie zutylizować w dygestorium zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi, a następnie trzykrotnie przepłukać szkiełka nakrywkowe wodą dejonizowaną. Szkiełka nakrywkowe należy zanurzyć w wodzie i ponownie poddać sonikacji przez 30 minut. Następnie należy odlać wodę i ponownie trzykrotnie przepłukać szkiełka nakrywkowe.Zanurz szkiełka nakrywki w 50 mililitrach wody, a następnie poddaj je autoklawowaniu. W sterylnym dygestorium z laminarnym przepływem powietrza odlej wodę i dodaj 20 do 30 mililitrów etanolu w celu wypłukania. Dodaj kolejne 20 do 30 mililitrów etanolu, a następnie przenieś szkiełka nakrywki wraz z etanolem do szalki Petriego o średnicy 100 milimetrów.Za pomocą tępych pęset przenieść preparaty barwione do szalek Petriego o pojemności 60 ml, po cztery lub pięć na szalkę, a następnie pozostawić je do wyschnięcia na powietrzu, opierając szkiełka nakrywkowe o krawędź szalki. Po odparowaniu etanolu ułożyć szkiełka nakrywkowe w pozycji poziomej. Roztopić 10 g parafiny w szklanej butelce odpornej na ciepło i utrzymywać ją w temperaturze od około 150 do 200 °C.Optymalna temperatura może wymagać pewnej kalibracji, a niewłaściwe temperatury mogą utrudnić uzyskanie parafiny o odpowiedniej wielkości. Zanurz pipetę Pasteura w parafinie, a następnie szybko dotknij nią trzech miejsc w pobliżu krawędzi każdego szkiełka nakrywnego. Krople parafiny zastygną w postaci kuleczek o wysokości około 3 do 5 mm i średnicy 1 do 2 mm, co stworzy przestrzeń między neuronami na szkiełku nakrywnym a znajdującą się poniżej monowarstwą glejową.Należy przygotować szalki zawierające wcześniej przygotowane szkiełka nakrywkowe z parafinowymi nóżkami. Na powierzchnię każdego szkiełka nakrywkowego należy nanieść 200 µl poli-L-lizyny i buforu boranowego, a następnie pozostawić roztwór na szkiełkach na noc, w przykryciu, w temperaturze pokojowej. Powierzchnia poddawana powlekaniu powinna być tą samą, na której znajdują się kuleczki parafinowe.Jeśli szkiełka podstawowe zostały odpowiednio oczyszczone, poli-L-lizyna powinna łatwo rozprzestrzenić się, pokrywając ich powierzchnię. Następnego dnia rano należy dwukrotnie przemyć szkiełka, namaczając je w sterylnej wodzie po dwie godziny za każdym razem. Po ostatnim płukaniu wodę należy zastąpić 4 mililitrami medium hodowlanego na każdą szalkę.Należy pamiętać, że powierzchnia szkiełek podstawkowych nie może wyschnąć po pokryciu ich poli-L-lizyną. Umieść naczynia ze szkiełkami w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Pokryte szkiełka powinny być inkubowane przez co najmniej 24 godziny przed rozpoczęciem hodowli neuronów.Należy pozyskać ciężarną szczurzycę w 18. lub 19. dniu embrionalnym i poddać ją eutanazji zatwierdzoną metodą. Spód ciała szczuricy należy spryskać 70% etanolem, a następnie wykonać nacięcie wzdłuż linii środkowej od okolicy łonowej do końca jamy brzusznej. Aby uniknąć kontaminacji, na tym etapie należy uważać, aby przeciąć wyłącznie skórę.Sterylizujemy narzędzia sekcyjne za pomocą 70% etanolu, a następnie przecinamy ścianę brzuszną, aby odsłonić macicę. Usuwamy dwa rogi macicy i umieszczamy je w sterylnym naczyniu. W sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza usuwamy błony maciczne otaczające płody, następnie odcinamy ich głowy i umieszczamy je w 100 milimetrowej płytce Petri zawierającej 20 mililitrów HBSS.Wypreparuj mózgi i natychmiast umieść je w 60 milimetrowej szalce Petriego zawierającej 2 mililitry HBSS w lodzie. Zbieraj tylko od dwóch do trzech mózgów na szalkę, aby zapewnić wystarczającą przestrzeń do następnego etapu. Pod mikroskopem stereotypowym usuń oponami mózgowymi od strony linii środkowej półkul mózgowia.Następnie wypreparuj hipokampy. Należy zauważyć, że hipokamp można rozpoznać jako strukturę w kształcie półksiężyca na powierzchni przyśrodkowej półkuli korowej; jest on łatwy do usunięcia, ponieważ od strony bocznej graniczy z komorą mózgu. Po uwolnieniu umieść hipokampy w 60 mm szalce Petriego zawierającej 4,5 ml HBSS i przechowuj w lodzie.Należy zauważyć, że kroki podjęte do tego momentu mają zastosowanie również do sekcji kory mózgowej, z wyjątkiem tego, że zachowuje się korę zamiast hipokampów. W przypadku sekcji kory kolejnym krokiem byłoby oddzielenie kory od reszty mózgu, jak pokazano tutaj, a następnie zebranie kory i HBSS w sposób opisany wcześniej. Po zebraniu całej tkanki hipokampa w HBSS, należy przenieść ją do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów.Dodaj 5 ml 2,5% trypsyny, a następnie inkubuj w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Ostrożnie usuń roztwór trypsyny za pomocą pipety Pasteura, nie naruszając tkanki hipokampa znajdującej się na dnie probówki. Przemyj tkankę dwukrotnie, delikatnie dodając 5 ml HBSS, inkubując w temperaturze 37 °C przez pięć minut, a następnie ponownie usuwając płyn pipetą Pasteura, dbając o to, aby nie poruszyć tkanki na dnie.Podczas oczekiwania na zakończenie wcześniej omówionego etapu inkubacji, należy przygotować dwa rodzaje wypalanych w płomieniu pipet do dysocjacji tkanki. W tym celu końcówkę szklanej pipety Pasteura należy krótko wystawić na działanie płomienia, a następnie sprawdzić jej stan. W przypadku pierwszego wariantu krok ten należy powtarzać do momentu, aż krawędzie końcówki pipety zostaną wygładzone, lecz jej średnica pozostanie bez zmian.W przypadku drugiego powtórz czynności do momentu wygładzenia krawędzi i zmniejszenia średnicy końcówki o około połowę. Ważna jest praktyka w celu znalezienia idealnej średnicy, aby zapewnić dysocjację tkanki do pojedynczych komórek bez ich uszkadzania w tym procesie. Po drugim przemyciu uzupełnij całkowitą objętość do 5 milliliters, dodając do tkanki odpowiednią ilość HBSS.Tkankę hipokampa utrzyturuj najpierw, przepuszczając ją około 10 razy przez pipetę o gładkich krawędziach, a następnie kolejnych pięć do 10 razy przez pipetę o mniejszej średnicy końcówki. Celem jest uzyskanie homogenicznego zawiesiny komórek bez grudek tkanki lub z ich minimalną ilością. Gęstość komórek należy oznaczyć za pomocą hemocytometru.Typowe wydajności wynoszą od około 800 000 do jednego miliona komórek na szczenię. Przenieś odpowiednią objętość zawiesiny komórkowej do szalek zawierających szkiełka podstawowe pokryte poli-l-lizyną w 4 milliliters medium do wysiewu, aby uzyskać gęstość wysiewu od 100 000 do 500 000 komórek na szalkę 60 millimeter, w zależności od planowanego eksperymentu. Umieść szalki w inkubatorze 37 degree Celsius z 5%CO2.Po trzech do czterech godzinach przenieś szkiełka podstawowe z przytwierdzonymi neuronami do naczyń zawierających komórki glejowe i pożywkę NBG. Należy to zrobić w taki sposób, aby strona, na której wysiano neurony, była skierowana w dół, w stronę warstwy komórek glejowych. Do każdego naczynia z glejem dodaj łącznie od czterech do pięciu szkiełek podstawowych.Dwa lub trzy dni po wysianiu, należy dodać roztwór aerocele do stężenia końcowego 5 µM na płytkę, aby zahamować wzrost komórek glejowych. Komórki należy dokarmiać raz w tygodniu, zastępując 2 ml starej pożywki 2,5 ml świeżej pożywki podczas każdego dokarmiania. Dodatkowa ilość pożywki ma na celu zrekompensowanie odparowania w czasie.Wymienia się jedynie część pożywki, aby zapewnić spójne kondycjonowanie medium przez komórki glejowe. Takie hodowle pozostają zazwyczaj zdrowe przez co najmniej miesiąc. Neurony utrwalono 4% paraformaldehydem, a następnie inkubowano z przeciwciałami pierwszorzędowymi w celu obrazowania fluorescencyjnego.Jak pokazują barwienia immunocytochemiczne na Tau i MAP2, neurony te wykształcają rozległą arboryzację z dobrze rozwiniętymi aksonami i dendrytami. Dojrzałe neurony rozwijają również kolce synaptyczne, zidentyfikowane dzięki selektywnej lokalizacji Drebrin One, które znajdują się w bliskim sąsiedztwie specjalizacji presynaptycznych, zidentyfikowanych za pomocą barwienia na synapse in one. Te pierwotne neurony są odpowiednie do funkcjonalnych i strukturalnych badań neuronów oraz synaps, w tym m.in. do badań nad transdukcją sygnału, polarnością neuronalną, transportem wewnątrzkomórkowym oraz rozwojem i plastycznością synaps.Niniejszy film powinien pomóc w zrozumieniu i dokładnym wykonaniu kilku kluczowych etapów tego protokołu. Prawidłowe przestrzeganie opisanego sposobu postępowania powinno pozwolić na uzyskanie zdrowych kultur neuronów o wysokiej gęstości, z rozbudowanym rozgałęzieniem oraz morfologicznie i funkcjonalnie dobrze rozwiniętymi synapsami.

low-density-primary-hippocampal-neuron-culture

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Wyizolowanie i hodowla komórek z konkretnego obszaru mózgu ułatwia badanie parametrów komórkowych i fizjologicznych. Opisujemy metodę pierwotnej hodowli komórek, która pozwala na uzyskanie kultur wzbogaconych w neurony w środowisku bezsurowiczym.

Hodowla pierwotna neuronów hipokampa z noworodków szczurów w dniu P0

Niniejszy protokół opisuje etapy niezbędne do wyizolowania, transfekcji metodą elektroporacji oraz hodowli neuronów hipokampa i kory mózgu myszy. Hodowle krótkoterminowe mogą być wykorzystywane do badań nad wzrostem i prowadzeniem aksonów, natomiast hodowle długoterminowe mogą służyć do badań nad synaptogenezą i analizy kolców dendrytycznych.

Nuklefekcja i hodowla pierwotna embrionalnych neuronów hipokampa i kory myszy

Przedstawiamy protokół hodowli wysoko oczyszczonych neuronów hipokampa z prenatalnych mózgów myszy bez użycia warstwy komórek glejowych jako komórek zasilających.

Izolacja i hodowla neuronów hipokampa z myszy prenatalnych

Film demonstruje metodę hodowli neuronów z mysich hipokampów. Początkowo hipokampy przechodzą trawienie enzymatyczne w celu rozbicia zewnątrzkomórkowej macierzy tkankowej. Następnie strawiona tkanka jest mechanicznie rozrywana w celu wyizolowania pojedynczych neuronów. Wreszcie, neurony te są hodowane na komórkach glejowych.

Technika hodowli neuronów hipokampa myszy

Ten film demonstruje metodę hodowli kriokonserwowanych neuronów embrionalnych, obejmującą kontrolowane rozmrażanie, rozcieńczanie pożywką neurobazalną i wysiewanie na płytkę pokrytą poli-L-lizyną. Późniejsza inkubacja wspomaga wzrost i utrzymanie połączeń neuronalnych.

Generowanie hodowli neuronów pierwotnych o niskiej gęstości z zamrożonych neuronów embrionalnych

Ten film demonstruje metodę hodowli neuronów o ultra niskiej gęstości w obecności warstwy zasilającej neurony o dużej gęstości. Ustanawia wspólną kulturę neuronów o różnej gęstości, zapewniając bliską bliskość fizyczną. Czynniki wzrostu wydzielane przez neurony o dużej gęstości pomagają w przetrwaniu i wzroście neuronów, utrzymując neurony o ultraniskiej gęstości przez dłuższy czas.

Generowanie kultury neuronalnej o ultraniskiej gęstości przy użyciu warstwy zasilającej neurony o dużej gęstości

Pierwotne odłączone embrionalne kultury neuronów hipokampa są przydatne do badania mechanizmów sygnalizacyjnych związanych ze śmiercią neuronów. Określenie płci zarodków przed izolacją i dysocjacją hipokampa pozwala na przygotowanie oddzielnych kultur męskich i żeńskich, co umożliwia badaczowi zidentyfikowanie i zbadanie sygnalizacji komórkowej specyficznej dla płci.

Stratyfikowane kultura neuronów według płci w celu zbadania szlaków śmierci komórek niedokrwiennych

Opisujemy procedury znakowania i genotypowania nowonarodzonych myszy oraz generowania z nich pierwotnych kultur neuronalnych. Genotypowanie jest szybkie, wydajne i niezawodne oraz pozwala na automatyczną ekstrakcję kwasów nukleinowych. Jest to szczególnie przydatne w przypadku myszy ze śmiertelnością noworodków i ich hodowli, które wymagają wcześniejszego zakończenia genotypowania.

Szybkie genotypowanie zwierząt, a następnie tworzenie pierwotnych kultur neuronów mózgowych

Kultury o niskiej gęstości pierwotnych neuronów hipokampa zazwyczaj wymagają warstwy zasilającej glej, aby dostarczyć czynników neurotroficznych i utrzymać długowieczność. Opisujemy tutaj uproszczoną metodę hodowli neuronów o ultra niskiej gęstości na szklanych szkiełkach nakrywkowych w obecności warstwy zasilającej neurony o dużej gęstości, co ułatwia badanie specyficznych mechanizmów neuronalno-autonomicznych.

Uproszczona metoda długoterminowej hodowli pierwotnych neuronów hipokampa o bardzo niskiej gęstości

Ten protokół pokazuje, jak wykorzystać mikroskopię superrozdzielczą do badania kolokalizacji białek w pierwotnych kulturach neuronalnych.

Obrazowanie superrozdzielcze w celu zbadania kolokalizacji białek i markerów synaptycznych w neuronach pierwotnych

Gotowy do użycia zamrożony zasób neuronów jest potężnym narzędziem do oceny funkcji synaptycznych. Tutaj wprowadzamy łatwą hodowlę pierwotną o niskiej gęstości z zamrożonego wywaru przy użyciu 96-dołkowej płytki.

Łatwa i powtarzalna hodowla pierwotna o niskiej gęstości przy użyciu zamrożonego materiału embrionalnych neuronów hipokampa

Poznaj metodę hodowli pierwotnych neuronów hipokampa o niskiej gęstości na szkiełkach nad warstwą glejową. Technika ta umożliwia wysokiej rozdzielczości obrazowanie i badania funkcjonalne dojrzałych neuronów.

Pierwotna hodowla neuronów hipokampa o niskiej gęstości

Przeglądaj więcej filmów