Pierwotna hodowla neuronów hipokampa o niskiej gęstości

Protokół ten został pierwotnie opublikowany przez dr Gary'ego Bunkera i jego współpracowników i pozwala na dużą gęstość i wysoką czystość kultury embrionalnych neuronów hipokampa obciążających poprzez zawieszenie neuronów nad warstwą glejową. Wynik ten jest jednym z największych zagrożeń związanych z innymi kluczowymi wynikami hipokampa, ponieważ umożliwia neuronom wzrost przy niskiej gęstości z niewielką liczbą zanieczyszczających komórek glejowych. Wynik ten jest zatem idealny do obrazowania w wysokiej rozdzielczości i funkcjonalnego zasobu typografii i dojrzałych neuronów w hodowli.

Dojrzewanie tego protokołu po osiągnięciu dojrzałości powinno przyspieszyć adaptację do nowego życia, ponieważ podczas procedury występuje kilka kluczowych stanów, które są trudne do opisania, więc zabiera Cię ze sobą. Protokół ten składa się z trzech niezależnych populacji, które są wymagane do hodowli wysokiej jakości neuronów pierwotnych. Procesy te obejmują hodowlę komórek glejowych, tworzenie i powlekanie szkiełek nakrywkowych oraz przygotowanie komórek nerwowych hipokampa.

Na początek należy uzyskać wczesną pourodzeniową tkankę korową szczura zgodnie z opisem w pisemnym protokole. Chociaż nie jest to tutaj bezpośrednio pokazane, należy zauważyć, że etap sekcji pokazany w dalszej części tego protokołu jest prawie identyczny z tymi używanymi do sekcji kory mózgowej. Z tego powodu odpowiednie kroki zostaną podkreślone podczas procedury rozwarstwienia hipokampa pokazanej w dalszej części tego filmu.

Zaczynając od kroku szóstego pisemnego protokołu, usuń HBSS z pobranej tkanki korowej, a następnie zmiel tkankę tak drobno, jak to możliwe za pomocą nożyczek. Dodaj wystarczającą ilość HBSS do posiekanej tkanki, aby przenieść kawałki tkanki do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów, a następnie zwiększ całkowitą objętość do 12 mililitrów, dodając HBSS. Dodaj po 1,5 mililitra 2,5% trypsyny i 10 miligramów na mililitr roztworu DNA, odwróć do mieszania, a następnie inkubuj powstałą mieszaninę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 12 minut.

Rozcierać tkankę od 10 do 15 razy za pomocą szklanej pipety Pasteura, a następnie inkubować ją w łaźni wodnej przez kolejne trzy minuty. Upewnij się, że wszelkie kawałki tkanki osiadły na dnie probówki, a następnie przefiltruj supernatant do 50-mililitrowej stożkowej probówki zawierającej 5 mililitrów BGS. Dodaj 13,5 mililitra HBSS i 1,5 mililitra 2,5 trypsyny do probówki zawierającej pozostałe kawałki niestrawionej tkanki, odwróć do mieszania, a następnie inkubuj w łaźni wodnej przez dodatkowe 10 minut.

Po inkubacji należy rozcierać tkankę przemianującą nazwę 10 do 15 razy, a następnie przefiltrować ją do probówki zawierającej początkowy filtrat. Następnie przepłucz filtr, przepuszczając przez niego dodatkowe 3 mililitry BGS. W tym momencie filtrat można podzielić na wiele probówek, aby uprościć zarówno równoważenie, jak i ponowne zawieszanie komórek granulki.

Odwirowywać zawiesiny przez sześć minut w temperaturze 130 G. Po odwirowaniu należy zauważyć, że spód osadu wydaje się lekko czerwonawy ze względu na obecność składników krwi. Usuń supernatanty, a następnie dodaj 1 mililitr pożywki glejowej do każdej probówki, uważając, aby nie naruszyć osadu. Przenieś porcje każdej granulki, które nie mają tego czerwonawego wyglądu, do świeżej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów.

Dodaj do 2 mililitrów pożywki glejowej na szczenię, aby ponownie zawiesić połączoną tkankę i przenieś każde 2 mililitry zawiesiny do 18 mililitrów wstępnie podgrzanej pożywki glejowej w kolbie hodowlanej o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych. Kolbę należy inkubować w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2. Następnego dnia po wysianiu komórek zmień pożywkę w każdej kolbie na świeżą pożywkę glejową.

Należy pamiętać, że w tej chwili hodowla będzie mieszanką astrocytów i innych typów komórek niedocelowych. Aby usunąć typy komórek innych niż astrocyty, kolby muszą być mocno poruszone około czterech dni po wysianiu. Aby to zrobić, przepłucz kolby HBSS, a następnie dodaj 10 mililitrów świeżego HBSS do każdej kolby i energicznie potrząśnij każdą z nich pięć do 10 razy.

Odessać HBSS i spłukać jeszcze dwukrotnie HBSS. Następnie dodaj 20 mililitrów pożywki glejowej i włóż kolby z powrotem do inkubatora jak poprzednio. Należy zauważyć, że chociaż jest to energiczne, astrocyty pożądane do hodowli pozostaną silnie przylegające do powierzchni kolby.

Aby utrzymać kultury astrocytów, zmieniaj pożywkę na świeżą pożywkę glejową dwa razy w tygodniu, aż do zlewania się. Po zlaniu się komórki można zamrozić do wykorzystania w przyszłości, jak opisano w pisemnym protokole. Komórki glejowe należy umieścić w szalkach co najmniej 14 dni przed rozpoczęciem hodowli neuronów, jak opisano w pisemnym protokole.

Zanurz szkiełka nakrywkowe w stężonym kwasie azotowym i poddaj je sonikacji przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Bądź ostrożny, ponieważ stężony kwas azotowy jest wyjątkowo. Należy również pamiętać, że niektóre laboratoria wolą moczyć szkiełka nakrywkowe w kwasie azotowym przez noc za pomocą ceramicznych stojaków do barwienia.

Ostrożnie wyrzuć kwas azotowy z dygestorium chemicznego zgodnie z wytycznymi instytucji, a następnie trzykrotnie spłucz szkiełka nakrywkowe wodą dejonizowaną. Zanurz szkiełka nakrywkowe w wodzie i ponownie poddaj je sonikacji przez 30 minut. Następnie usuń wodę i spłucz szkiełka nakrywkowe jeszcze trzy razy.

Zanurz szkiełka nakrywkowe w 50 mililitrach wody, a następnie sterylizuj je w autoklawie. W sterylnym okapie z przepływem laminarnym usuń wodę i dodaj 20 do 30 mililitrów etanolu do spłukania. Dodaj kolejne 20 do 30 mililitrów etanolu, a następnie przenieś szkiełka nakrywkowe i etanol na 100-milimetrową szalkę Petriego.

Za pomocą pęsety przenieś kolorowe szkiełka na 60-mililitrowe szalki Petriego, po cztery do pięciu na naczynie, a następnie pozostaw je do wyschnięcia na powietrzu, opierając szkiełka nakrywkowe o krawędź naczynia. Po odparowaniu etanolu przywróć szkiełka nakrywkowe do pozycji poziomej. Rozpuść 10 gramów parafiny w żaroodpornej szklanej butelce i utrzymuj ją w temperaturze około 150 do 200 stopni Celsjusza.

Idealna temperatura może wymagać pewnych poprawek, a nieprawidłowe temperatury mogą prowadzić do trudności z wytworzeniem prawidłowego rozmiaru stóp parafinowych. Zanurz pipetę Pasteura w parafinie, a następnie szybko dotknij jej w trzech miejscach w pobliżu krawędzi każdego szkiełka nakrywkowego. Krople parafiny zestalą się w kulki o wysokości około 3 do 5 milimetrów i średnicy od 1 do 2 milimetrów i będą działać w celu zapewnienia przestrzeni między neuronami na szkiełku nakrywkowym a warstwą glejowo-monoizolacyjną poniżej.

Zaopatrz się w naczynia zawierające wcześniej przygotowane szkiełka nakrywkowe ze stopami parafinowymi. Dodaj 200 mikrolitrów poli-l-lizyny i buforu boranowego na powierzchnię każdego szkiełka nakrywkowego i pozostaw roztwór na szkiełkach nakrywkowych na noc, przykryty w temperaturze pokojowej. Powlekana powierzchnia powinna być tą samą, na której znajdują się kulki parafinowe.

Prawidłowo oczyszczona poli-l-lizyna powinna łatwo się rozprowadzać, pokrywając powierzchnię szkiełka nakrywkowego. Następnego ranka umyj szkiełka nakrywkowe dwukrotnie, mocząc je za każdym razem w sterylnej wodzie przez dwie godziny. Po ostatnim umyciu zastąp wodę 4 mililitrami środka galwanicznego na naczynie.

Należy zauważyć, że ważne jest, aby powierzchnia szkiełek nakrywkowych nie mogła wyschnąć po pokryciu poli-l-lizyną. Umieść płytki nakrywkowe w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Powlekane szkiełko nakrywkowe powinno być inkubowane przez co najmniej 24 godziny przed rozpoczęciem hodowli neuronów.

Uzyskaj zarodek ciężarnej szczura w 18 lub 19 dniu i poddaj się eutanazji zatwierdzoną metodą. Spryskaj spód szczura 70% etanolem, a następnie wykonaj nacięcie w linii środkowej od okolicy łonowej do końca jamy brzusznej. Aby uniknąć zanieczyszczenia, na tym etapie należy uważać, aby przeciąć tylko skórę.

Wysterylizuj narzędzia preparacyjne za pomocą 70% etanolu, a następnie przetnij ścianę brzucha, aby odsłonić macicę. Usuń dwa rogi macicy i umieść je w sterylnym naczyniu. W sterylnym kapturze z przepływem laminarnym usuń błony maciczne otaczające płody, a następnie odetnij im głowy i umieść głowy na 100-milimetrowej szalce Petriego zawierającej 20 mililitrów HBSS.

Wypreparuj mózgi i natychmiast umieść je na 60-milimetrowej szalce Petriego zawierającej 2 mililitry HBSS na lodzie. Zbierz tylko dwa do trzech mózgów na naczynie, aby zapewnić wystarczająco dużo miejsca na następny krok. Pod mikroskopem preparacyjnym usuń opony mózgowe z linii środkowej półkul mózgowych.

Następnie wypreparuj hipokampy. Należy zauważyć, że hipokamp można rozróżnić jako strukturę w kształcie półksiężyca na przyśrodkowej powierzchni półkuli korowej i jest łatwy do usunięcia, ponieważ jest otoczony bocznie komorą. Po uwolnieniu umieść hipokampy na 60-milimetrowej szalce Petriego zawierającej 4,5 mililitra HBSS i trzymaj na lodzie.

Należy zauważyć, że kroki podjęte do tego momentu dotyczą również rozwarstwienia kory mózgowej, z wyjątkiem tego, że kora jest zachowana w przeciwieństwie do hipokampów. W przypadku rozwarstwienia kory mózgowej następnym krokiem byłoby oddzielenie kory mózgowej od reszty mózgu, jak pokazano tutaj, a następnie zebranie kory i HBSS, jak pokazano wcześniej. Po zebraniu całej tkanki hipokampa w HBSS przenieś ją do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów.

Dodaj 5 mililitrów 2,5% trypsyny, a następnie inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Delikatnie usuń roztwór trypsyny za pomocą pipety Pasteura, pozostawiając nienaruszoną tkankę hipokampa na dnie probówki. Umyj chusteczkę dwukrotnie, delikatnie dodając 5 mililitrów HBSS, inkubując w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie wyjmując ją ponownie za pomocą pipety Pasteura, uważając, aby nie naruszyć tkanki na dnie.

W oczekiwaniu na pokazany wcześniej etap inkubacji przygotuj dwa warianty polerowanych płomieniowo pipet do dysocjacji tkanek. W tym celu należy na krótko wystawić końcówkę szklanej pipety Pasteura na działanie płomienia, a następnie zbadać końcówkę pipety. W przypadku pierwszego wariantu powtarzaj ten krok, aż krawędzie końcówki pipety zostaną wygładzone, ale średnica pozostanie niezmieniona.

Po drugie, powtarzaj, aż krawędzie zostaną wygładzone, a średnica końcówki zmniejszy się o około połowę. Ważne jest, aby ćwiczyć, aby znaleźć idealną średnicę, aby zapewnić, że tkanka zostanie zdysocjowana, aby uzyskać pojedyncze komórki bez uszkadzania tych komórek w tym procesie. Po drugim umyciu doprowadź całkowitą objętość do 5 mililitrów, dodając odpowiednią objętość HBSS do tkanki.

Najpierw przetrzeć tkankę hipokampa przez około 10 przejść przez normalną pipetę o gładkich krawędziach, a następnie przez kolejne pięć do 10 przejść przez pipetę o zmniejszonej średnicy końcówki. Celem jest uzyskanie jednorodnego roztworu komórek bez grudek tkanek lub z bardzo małą ich ilością. Określ gęstość komórek za pomocą hemocytometru.

Typowe plony wynoszą około 800 000 do miliona komórek na młode. Przenieść wystarczającą objętość zawiesiny komórek do szalek zawierających szkiełka nakrywkowe pokryte poli-l-lizyną w 4 mililitrach podłoża galwanowego, aby uzyskać gęstość posiewu między 100 000 a 500 000 komórek na 60 milimetrową szalkę, w zależności od zamierzonego doświadczenia. Umieść naczynia w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza 5% CO2.

Po trzech do czterech godzinach przenieś szkiełka nakrywkowe z neuronami przyczepionymi do szalek zawierających komórki glejowe i pożywkę NBG. Należy to zrobić tak, aby strona, po której zostały posiane neurony, była skierowana w dół w kierunku warstwy komórek glejowych. Dodaj w sumie cztery lub pięć szkiełek nakrywkowych na naczynie glejowe.

Dwa lub trzy dni po posiewie dodać roztwór aeroceli do końcowego stężenia pięciu mikromolów na szalkę, aby zatrzymać wzrost komórek glejowych. Karm komórki raz w tygodniu, zastępując 2 mililitry starej pożywki 2,5 mililitrami świeżej pożywki przy każdym karmieniu. Dodane dodatkowe podłoże ma na celu skompensowanie parowania w czasie.

I tylko część pożywki jest zmieniana, aby zapewnić spójne kondycjonowanie pożywki przez komórki glejowe. Kultury te są zazwyczaj zdrowe przez co najmniej jeden miesiąc. Neurony utrwalono za pomocą 4% paraformaldehydu, a następnie inkubowano w przeciwciałach pierwszorzędowych do obrazowania fluorescencyjnego.

Jak widać po barwieniu immunologicznym Tau i MAP2, neurony te rozwijają rozległą arboryzację z dobrze rozwiniętymi aksonami i dendrytami. Dojrzałe neurony rozwijają również kolce synaptyczne, które są identyfikowane przez selektywną lokalizację Drebrin One, które są ściśle przeciwstawne do specjalizacji presynaptycznych zidentyfikowanych przez synapsę w jednym badaniu immunologicznym. Te pierwotne neurony dobrze nadają się do funkcjonalnych i strukturalnych badań neuronów i synaps, w tym między innymi do badań nad transdukcją sygnału, polaryzacją neuronów, transportem subkomórkowym oraz rozwojem i plastycznością synaps.

Ten film powinien pomóc w zrozumieniu i dokładnym wykonaniu kilku kluczowych kroków związanych z tym protokołem. Właściwe stosowanie się do opisanej metody powinno skutkować zdrową, długogęstą hodowlą neuronów z rozległą arboryzacją oraz dobrze rozwiniętymi morfologicznie i funkcjonalnie synapsami.