Pierwotna hodowla neuronów hipokampa o niskiej gęstości

Protokół ten został pierwotnie opublikowany przez dr. Gary’ego bunkera i jego współpracowników; pozwala on na uzyskanie kultur embrionalnych neuronów hipokampa o niskiej gęstości i wysokiej czystości poprzez zawieszenie neuronów nad warstwą filtrującą z gleju. Wynik ten jest zgodny z naszymi pozostałymi kluczowymi wynikami dotyczącymi hipokampa, ponieważ umożliwia on wzrost neuronów przy niskiej gęstości, z niewielką liczbą zanieczyszczających komórek glejowych. Jest to zatem rozwiązanie idealne do obrazowania o wysokiej rozdzielczości oraz analizy funkcjonalnej morfologii i dojrzałych neuronów w kulturze.

Etap po dojrzewaniu w tym protokole powinien przyspieszyć adaptację nowych kultur, ponieważ w trakcie procedury występuje kilka kluczowych stanów, które są trudne do opisania, dlatego instrukcja prowadzi użytkownika krok po kroku. Protokół ten składa się z trzech niezależnych populacji niezbędnych do hodowli wysokiej jakości pierwotnych neuronów. Procesy te obejmują hodowlę komórek glejowych, przygotowanie i powlekanie szkiełek podstawowych oraz preparowanie komórek nerwowych hipokampa.

Na początek należy pozyskać tkankę kory mózgowej szczura w okresie wczesnego etapu postnatalnego, zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Choć nie jest to tutaj bezpośrednio pokazane, należy zauważyć, że etap sekcji przedstawiony później w niniejszym protokole jest niemal identyczny z etapem stosowanym podczas sekcji kory. Z tego powodu odpowiednie kroki zostaną wyróżnione podczas procedury sekcji hipokampa pokazanej w dalszej części tego filmu.

Zaczynając od kroku szóstego protokołu pisemnego, usunąć HBSS z pobranej tkanki korowej, a następnie rozdrobnić tkankę nożyczkami tak drobno, jak to możliwe. Dodać do posiekanej tkanki odpowiednią ilość HBSS, aby przenieść fragmenty tkanki do probówki stożkowej o pojemności 50 mililitrów, a następnie uzupełnić objętość całkowitą do 12 mililitrów, dodając HBSS. Dodać po 1,5 mililitra 2,5% trypsyny oraz roztworu DNA o stężeniu 10 milligram per milliliter, wymieszać przez odwrócenie probówki, a następnie inkubować otrzymaną mieszaninę w łaźni wodnej o temperaturze 37 degree Celsius przez 12 minut.

Utrzyj tkankę od 10 do 15 razy za pomocą szklanej pipety Pasteura, a następnie inkubuj ją w kąpieli wodnej przez kolejne trzy minuty. Upewnij się, że wszystkie fragmenty tkanki opadły na dno probówki, następnie przefiltruj nadsącz do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów zawierającej 5 mililitrów BGS. Do probówki z pozostałymi fragmentami niestrawionej tkanki dodaj 13,5 mililitra HBSS oraz 1,5 mililitra 2,5&trypsin, odwróć probówkę w celu wymieszania, a następnie inkubuj w kąpieli wodnej przez dodatkowe 10 minut.

Po inkubacji utrzyć pozostałą tkankę od 10 do 15 razy, a następnie przefiltrować ją do probówki zawierającej początkowy filtrat. Następnie przepłukać filtr, przepuszczając przez niego dodatkowe 3 ml BGS. Na tym etapie filtrat można podzielić na kilka probówek, aby ułatwić zarówno wirowanie, jak i ponowne zawieszenie osadu komórkowego.

Wirować zawiesiny przez sześć minut przy 130 G. Po wirowaniu należy zauważyć, że dno osadu ma lekko czerwonawy odcień ze względu na obecność składników krwi. Usunąć nadsącz, a następnie dodać 1 mililitr pożywki dla gleju do każdej probówki, uważając, aby nie naruszyć osadu. Przenieść części każdego osadu, które nie mają czerwonawego wyglądu, do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 mililitrów.

Do zawiesiny z połączonych tkanek dodać do 2 mililitrów pożywki dla gleju na każdego szczeniaka, a następnie każdą 2-mililitrową porcję zawiesiny przenieść do 18 mililitrów uprzednio ogrzanej pożywki dla gleju w kolbie hodowlanej o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych. Kolbę inkubować w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i przy 5% CO2. Dzień po wysianiu komórek wymienić pożywkę w każdej kolbie na świeżą pożywkę dla gleju.

Należy pamiętać, że na tym etapie hodowla będzie stanowiła mieszaninę astrocytów i innych niecelowych typów komórek. Aby usunąć typy komórek innych niż astrocyty, kolby należy poddać silnemu wstrząsaniu około cztery dni po wysianiu. W tym celu należy przepłukać kolby roztworem HBSS, a następnie dodać 10 mililitrów świeżego HBSS do każdej kolby i energicznie wstrząsnąć każdą z nich od 5 do 10 razy.

Odssać HBSS i przemyć dwukrotnie HBSS. Następnie dodać 20 ml pożywki dla gleju i ponownie umieścić kolby w inkubatorze, tak jak wcześniej. Należy zauważyć, że mimo intensywności tego procesu, astrocyty przeznaczone do hodowli pozostaną silnie przylegające do powierzchni kolby.

Aby utrzymać kultury astrocytów, należy wymieniać pożywkę na świeżą pożywkę glialną dwa razy w tygodniu, aż do osiągnięcia konfluencji. Po osiągnięciu konfluencji komórki można zamrozić do późniejszego wykorzystania, zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Glię należy wysiać do naczyń co najmniej 14 dni przed rozpoczęciem hodowli neuronów, zgodnie z opisem w protokole pisemnym.

Zanurz szkiełka nakrywkowe w stężonym kwasie azotowym i poddaj je sonikacji przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Należy zachować ostrożność, ponieważ stężony kwas azotowy jest substancją silnie żrącą. Należy również zauważyć, że w niektórych laboratoriach preferuje się moczenie szkiełek nakrywkowych w kwasie azotowym przez noc z wykorzystaniem ceramicznych statywów do barwienia.

Kwas azotowy należy ostrożnie zutylizować w dygestorium zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi, a następnie trzykrotnie przepłukać szkiełka nakrywkowe wodą dejonizowaną. Szkiełka nakrywkowe należy zanurzyć w wodzie i ponownie poddać sonikacji przez 30 minut. Następnie należy odlać wodę i ponownie trzykrotnie przepłukać szkiełka nakrywkowe.

Zanurz szkiełka nakrywki w 50 mililitrach wody, a następnie poddaj je autoklawowaniu. W sterylnym dygestorium z laminarnym przepływem powietrza odlej wodę i dodaj 20 do 30 mililitrów etanolu w celu wypłukania. Dodaj kolejne 20 do 30 mililitrów etanolu, a następnie przenieś szkiełka nakrywki wraz z etanolem do szalki Petriego o średnicy 100 milimetrów.

Za pomocą tępych pęset przenieść preparaty barwione do szalek Petriego o pojemności 60 ml, po cztery lub pięć na szalkę, a następnie pozostawić je do wyschnięcia na powietrzu, opierając szkiełka nakrywkowe o krawędź szalki. Po odparowaniu etanolu ułożyć szkiełka nakrywkowe w pozycji poziomej. Roztopić 10 g parafiny w szklanej butelce odpornej na ciepło i utrzymywać ją w temperaturze od około 150 do 200 °C.

Optymalna temperatura może wymagać pewnej kalibracji, a niewłaściwe temperatury mogą utrudnić uzyskanie parafiny o odpowiedniej wielkości. Zanurz pipetę Pasteura w parafinie, a następnie szybko dotknij nią trzech miejsc w pobliżu krawędzi każdego szkiełka nakrywnego. Krople parafiny zastygną w postaci kuleczek o wysokości około 3 do 5 mm i średnicy 1 do 2 mm, co stworzy przestrzeń między neuronami na szkiełku nakrywnym a znajdującą się poniżej monowarstwą glejową.

Należy przygotować szalki zawierające wcześniej przygotowane szkiełka nakrywkowe z parafinowymi nóżkami. Na powierzchnię każdego szkiełka nakrywkowego należy nanieść 200 µl poli-L-lizyny i buforu boranowego, a następnie pozostawić roztwór na szkiełkach na noc, w przykryciu, w temperaturze pokojowej. Powierzchnia poddawana powlekaniu powinna być tą samą, na której znajdują się kuleczki parafinowe.

Jeśli szkiełka podstawowe zostały odpowiednio oczyszczone, poli-L-lizyna powinna łatwo rozprzestrzenić się, pokrywając ich powierzchnię. Następnego dnia rano należy dwukrotnie przemyć szkiełka, namaczając je w sterylnej wodzie po dwie godziny za każdym razem. Po ostatnim płukaniu wodę należy zastąpić 4 mililitrami medium hodowlanego na każdą szalkę.

Należy pamiętać, że powierzchnia szkiełek podstawkowych nie może wyschnąć po pokryciu ich poli-L-lizyną. Umieść naczynia ze szkiełkami w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Pokryte szkiełka powinny być inkubowane przez co najmniej 24 godziny przed rozpoczęciem hodowli neuronów.

Należy pozyskać ciężarną szczurzycę w 18. lub 19. dniu embrionalnym i poddać ją eutanazji zatwierdzoną metodą. Spód ciała szczuricy należy spryskać 70% etanolem, a następnie wykonać nacięcie wzdłuż linii środkowej od okolicy łonowej do końca jamy brzusznej. Aby uniknąć kontaminacji, na tym etapie należy uważać, aby przeciąć wyłącznie skórę.

Sterylizujemy narzędzia sekcyjne za pomocą 70% etanolu, a następnie przecinamy ścianę brzuszną, aby odsłonić macicę. Usuwamy dwa rogi macicy i umieszczamy je w sterylnym naczyniu. W sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza usuwamy błony maciczne otaczające płody, następnie odcinamy ich głowy i umieszczamy je w 100 milimetrowej płytce Petri zawierającej 20 mililitrów HBSS.

Wypreparuj mózgi i natychmiast umieść je w 60 milimetrowej szalce Petriego zawierającej 2 mililitry HBSS w lodzie. Zbieraj tylko od dwóch do trzech mózgów na szalkę, aby zapewnić wystarczającą przestrzeń do następnego etapu. Pod mikroskopem stereotypowym usuń oponami mózgowymi od strony linii środkowej półkul mózgowia.

Następnie wypreparuj hipokampy. Należy zauważyć, że hipokamp można rozpoznać jako strukturę w kształcie półksiężyca na powierzchni przyśrodkowej półkuli korowej; jest on łatwy do usunięcia, ponieważ od strony bocznej graniczy z komorą mózgu. Po uwolnieniu umieść hipokampy w 60 mm szalce Petriego zawierającej 4,5 ml HBSS i przechowuj w lodzie.

Należy zauważyć, że kroki podjęte do tego momentu mają zastosowanie również do sekcji kory mózgowej, z wyjątkiem tego, że zachowuje się korę zamiast hipokampów. W przypadku sekcji kory kolejnym krokiem byłoby oddzielenie kory od reszty mózgu, jak pokazano tutaj, a następnie zebranie kory i HBSS w sposób opisany wcześniej. Po zebraniu całej tkanki hipokampa w HBSS, należy przenieść ją do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów.

Dodaj 5 ml 2,5% trypsyny, a następnie inkubuj w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Ostrożnie usuń roztwór trypsyny za pomocą pipety Pasteura, nie naruszając tkanki hipokampa znajdującej się na dnie probówki. Przemyj tkankę dwukrotnie, delikatnie dodając 5 ml HBSS, inkubując w temperaturze 37 °C przez pięć minut, a następnie ponownie usuwając płyn pipetą Pasteura, dbając o to, aby nie poruszyć tkanki na dnie.

Podczas oczekiwania na zakończenie wcześniej omówionego etapu inkubacji, należy przygotować dwa rodzaje wypalanych w płomieniu pipet do dysocjacji tkanki. W tym celu końcówkę szklanej pipety Pasteura należy krótko wystawić na działanie płomienia, a następnie sprawdzić jej stan. W przypadku pierwszego wariantu krok ten należy powtarzać do momentu, aż krawędzie końcówki pipety zostaną wygładzone, lecz jej średnica pozostanie bez zmian.

W przypadku drugiego powtórz czynności do momentu wygładzenia krawędzi i zmniejszenia średnicy końcówki o około połowę. Ważna jest praktyka w celu znalezienia idealnej średnicy, aby zapewnić dysocjację tkanki do pojedynczych komórek bez ich uszkadzania w tym procesie. Po drugim przemyciu uzupełnij całkowitą objętość do 5 milliliters, dodając do tkanki odpowiednią ilość HBSS.

Tkankę hipokampa utrzyturuj najpierw, przepuszczając ją około 10 razy przez pipetę o gładkich krawędziach, a następnie kolejnych pięć do 10 razy przez pipetę o mniejszej średnicy końcówki. Celem jest uzyskanie homogenicznego zawiesiny komórek bez grudek tkanki lub z ich minimalną ilością. Gęstość komórek należy oznaczyć za pomocą hemocytometru.

Typowe wydajności wynoszą od około 800 000 do jednego miliona komórek na szczenię. Przenieś odpowiednią objętość zawiesiny komórkowej do szalek zawierających szkiełka podstawowe pokryte poli-l-lizyną w 4 milliliters medium do wysiewu, aby uzyskać gęstość wysiewu od 100 000 do 500 000 komórek na szalkę 60 millimeter, w zależności od planowanego eksperymentu. Umieść szalki w inkubatorze 37 degree Celsius z 5%CO2.

Po trzech do czterech godzinach przenieś szkiełka podstawowe z przytwierdzonymi neuronami do naczyń zawierających komórki glejowe i pożywkę NBG. Należy to zrobić w taki sposób, aby strona, na której wysiano neurony, była skierowana w dół, w stronę warstwy komórek glejowych. Do każdego naczynia z glejem dodaj łącznie od czterech do pięciu szkiełek podstawowych.

Dwa lub trzy dni po wysianiu, należy dodać roztwór aerocele do stężenia końcowego 5 µM na płytkę, aby zahamować wzrost komórek glejowych. Komórki należy dokarmiać raz w tygodniu, zastępując 2 ml starej pożywki 2,5 ml świeżej pożywki podczas każdego dokarmiania. Dodatkowa ilość pożywki ma na celu zrekompensowanie odparowania w czasie.

Wymienia się jedynie część pożywki, aby zapewnić spójne kondycjonowanie medium przez komórki glejowe. Takie hodowle pozostają zazwyczaj zdrowe przez co najmniej miesiąc. Neurony utrwalono 4% paraformaldehydem, a następnie inkubowano z przeciwciałami pierwszorzędowymi w celu obrazowania fluorescencyjnego.

Jak pokazują barwienia immunocytochemiczne na Tau i MAP2, neurony te wykształcają rozległą arboryzację z dobrze rozwiniętymi aksonami i dendrytami. Dojrzałe neurony rozwijają również kolce synaptyczne, zidentyfikowane dzięki selektywnej lokalizacji Drebrin One, które znajdują się w bliskim sąsiedztwie specjalizacji presynaptycznych, zidentyfikowanych za pomocą barwienia na synapse in one. Te pierwotne neurony są odpowiednie do funkcjonalnych i strukturalnych badań neuronów oraz synaps, w tym m.in. do badań nad transdukcją sygnału, polarnością neuronalną, transportem wewnątrzkomórkowym oraz rozwojem i plastycznością synaps.

Niniejszy film powinien pomóc w zrozumieniu i dokładnym wykonaniu kilku kluczowych etapów tego protokołu. Prawidłowe przestrzeganie opisanego sposobu postępowania powinno pozwolić na uzyskanie zdrowych kultur neuronów o wysokiej gęstości, z rozbudowanym rozgałęzieniem oraz morfologicznie i funkcjonalnie dobrze rozwiniętymi synapsami.