Badanie inwazyjnej zdolności naczyniowej komórek nowotworowych u danio pręgowanego (Danio rerio)

Ogólnym celem tej procedury jest ocena złośliwego i inwazyjnego zachowania komórek rakowych w modelu zarodka danio pręgowanego. Metoda ta pomaga naukowcom określić, czy komórki rakowe mogą zaatakować z funkcjonalnego układu krążenia, modelując w ten sposób kluczowy etap kaskady przerzutowej. Główną zaletą tej techniki jest to, że model zarodka danio pręgowanego zapewnia taką ocenę i krótszy czas realizacji niż podobne eksperymenty często przeprowadzane na myszach.

Procedurę zademonstruje doktor Eric Glasgow, który prowadzi główny ośrodek hodowli danio pręgowanego na Uniwersytecie Georgetown. Po przygotowaniu komórek rakowych, odczynników i zarodków danio pręgowanego zgodnie z protokołem tekstowym, podłącz system dozowania mikroiniekcji do źródła powietrza pod ciśnieniem i włącz źródło zasilania. Sprawdź ciśnienie, wciskając pedał nożny.

Z uchwytu igły powinien wydostać się krótki impuls powietrza. Dodaj 20 mililitrów 2X roztworu trikainy do płytki iniekcyjnej i umieść płytkę na shakerze, aby ją zrównoważyć. Następnie powtórz równowagę z drugą porcją 2X Trikainy.

Następnie za pomocą plastikowej pipety przenieś grupę zarodków do małego naczynia zawierającego 2X roztwór trikainy. Za pomocą końcówki do nakładania żelu wypełnij igłę do mikroiniekcji komórkami rakowymi. Umieść igłę w słoiku do przechowywania elektrod spiczastym końcem skierowanym w dół, tak aby komórki osiadły w pobliżu końcówki.

Przenieś od 20 do 30 znieczulonych zarodków na płytkę iniekcyjną, zbierając zarodki z dużą ilością 2X Trikainy w plastikowej pipecie. Pozwól zarodkom osiąść na końcówce pipety, a następnie delikatnie wypchnij je do koryta płytki iniekcyjnej, rozprowadzając zarodki wzdłuż koryta. Ułóż zarodki z głowami skierowanymi do góry i brzuchami skierowanymi w stronę stromej ściany koryta.

Przymocuj igłę do uchwytu igły mikromanipulatora. Następnie umieść płytkę iniekcyjną pod stereoskopem ze ścianą 60 stopni w lewo i skup się na górnym zarodku w 25-krotnym powiększeniu. Ustawić mikromanipulator tak, aby po wysunięciu igła przebiła zarodek.

Następnie rozciągnij igłę za oko, aż prawie dotknie zarodka. Teraz, patrząc pod mikroskop, dopasuj igłę do zarodka. Aby wstrzyknąć komórki, przebij koryto zarodka przez woreczek żółtkowy.

Wciśnij pedał nożny, umieszczając końcówkę tylko w zatoce przedsercowej, ale nie w niej. Siła wstrzyknięcia wyrzuci komórki do zatoki sercowej. Alternatywnie, wstrzyknięcie komórek do woreczka żółtkowego pozwala na badanie różnych aspektów inwazji naczyniowej, jak opisano w manuskrypcie.

Prawą ręką wysuwać i wysuwać igłę do wstrzykiwań. Lewą ręką dokonaj precyzyjnych korekt, aby ustawić następny zarodek. Po wstrzyknięciu całej płytki należy umieścić igłę z powrotem w słoiku do przechowywania elektrody.

Aby przenieść zarodki do naczynia regeneracyjnego, przechylić płytkę do wstrzykiwań, aby wyciągnąć zarodki na dole, wypłukać zarodki z koryta i użyć plastikowej pipety do ich pobrania. Pozwól zarodkom ustabilizować się na dnie pipety, a następnie przenieś je do naczynia regeneracyjnego w minimalnej ilości trikainy. Inkubuj naczynie regeneracyjne w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez godzinę, a następnie oddziel zdolne do życia zarodki od martwych zarodków i szczątków.

Inkubuj naczynie w temperaturze 33 stopni Celsjusza, aż będzie gotowe do nacinania. Po znieczuleniu partii zarodków, które mają zostać ocenione, zgodnie z protokołem tekstowym, umieść znieczuloną larwę na szkiełku mikroskopowym depresji w kropli Trikainy. Ustaw larwy na boki, aby uzyskać optymalne obrazowanie okolicy ogonowej.

Umieść szkiełko na złożonym mikroskopie fluorescencyjnym z soczewką obiektywową 10X. Oceń larwy, licząc liczbę komórek rakowych, które z powodzeniem wydostały się z układu krwionośnego, skupiając się w górę iw dół przez obszar ogona, aby wyraźnie dostrzec nienaruszone komórki. Rozpuść 1,5% roztwór agarozy Trikainy i doprowadź do 37 stopni Celsjusza.

Po znieczuleniu zarodków, tak jak poprzednio, przenieś zarodek w kropli roztworu Trikainy na powierzchnię obrazowania. Użyj szklanej pipety, aby usunąć nadmiar roztworu trikainy, zatrzymując zarodek na powierzchni obrazowania. Następnie nałóż jedną kroplę stopionego roztworu agarozy na zarodek.

Pracując szybko, zanim agaroza spolimeryzuje się, użyj delikatnego narzędzia, takiego jak szczoteczka do rzęs, aby ustawić zarodek bocznie w celu obrazowania, zwracając szczególną uwagę, aby zarodek był spłaszczony wzdłuż powierzchni obrazowania. Gdy kropla agarozy spolimeryzuje się, zanurz ją w roztworze Trikainy. Na koniec poddaj żywy zarodek danio pręgowanego obrazowaniu mikroskopowemu.

Spośród siedmiu linii komórkowych raka piersi badanych pod kątem ich inwazyjnej zdolności naczyniowej w zarodkach danio pręgowanego, linia komórkowa MDA-MB-231 wykazywała największą liczbę wynaczynionych komórek rakowych na zarodek po 96 godzinach od wstrzyknięcia. Zaobserwowano również, że komórki BT-474 łatwo atakowały obszar ogonowy zarodków, podczas gdy inne linie komórkowe, takie jak komórki MCF-7, SK-BR-3 i T-47D, były minimalnie inwazyjne. W zmodyfikowanym badaniu, które wykorzystuje inne miejsce wstrzyknięcia, przeprowadzono eksperyment konkursowy, w którym dwie populacje komórek MDA-MB-231, różniące się inwazyjną zdolnością naczyniową, zostały jednocześnie wstrzyknięte do woreczka żółtkowego rozwijających się zarodków.

Po ocenie stwierdzono, że komórki MDA-MB-231 rozmnażały się w warunkach zlewania się hodowli przed wstrzyknięciem, wykazywały zmniejszenie wynaczynienia do krążenia, a zatem miały zmniejszoną obecność w okolicy ogonowej zarodków. Po opanowaniu, zastrzyki z zarodka danio pręgowanego można wykonać w ciągu czterech godzin, jeśli zostaną wykonane prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o stosowaniu rygorystycznych i spójnych kryteriów podczas oceny wynaczynienia komórek rakowych.

Po tej procedurze wyniki można dalej walidować w modelu mysim. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonywać zastrzyki i oceniać wynaczynienie, co pozwala przetestować inwazyjną zdolność komórek rakowych do naczyń krwionośnych w zarodkach danio pręgowanego.