Name: Badanie inwazyjnej zdolności naczyniowej komórek nowotworowych u danio pręgowanego (Danio rerio) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: Poznaj metodę oceny inwazyjności komórek nowotworowych w modelu embriogenicznym Danio rerio. Technika mikroinjekcji fluorescencyjnych komórek nowotworowych umożliwia wizualizację inwazji naczyniowej i ekstrawazacji w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Peterowi Johnsonowi z Georgetown University Microscopy Core za pomoc w obrazowaniu zarodków danio pręgowanego. Wspólne zasoby mikroskopii i obrazowania oraz wspólne zasoby danio pręgowanego są częściowo wspierane przez grant NIH/NCI P30-CA051008. Prace te były również wspierane przez NIH/NCI CA71508 (AW) i CA177466 (AW).

Oświadczenie etyczne: Zarodki danio pręgowanego zostały wygenerowane zgodnie z zatwierdzonym protokołem IACUC. Eksperymenty te zostały przeprowadzone zgodnie z zaleceniami Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Georgetown.
1. Organizuj zarodki do wstrzykiwań i twórz roztwory podstawowe
<ol>
	<li>Wygeneruj wymagane larwy danio pręgowanego, aby ocenić inwazję naczyniową komórek rakowych.
	<ol>
		<li>Ustaw parowanie krzyżowe lub grupowe za pomocą Tg(kdrl:grcfp)zn1; MitfaB692; EDNRB1B140 Ryba. 
		UWAGA: Wygenerowaliśmy Tg(kdrl:grcfp)zn1; MitfaB692; ednrb1b140 grybo, krzyżując Tg(kdrl:grcfp)zn125, które wyrażają białko fluorescencyjne zielonego koralowca rafowego w komórkach śródbłonka, z linią, która nie ma komórek pigmentowych, mitfab692; ednrb1b140, opracowany w Międzynarodowym Centrum Zasobów Danio Pręgowanego.</li>
		<li>Następnego dnia zbierz jaja, oczyść i usuń niezapłodnione lub zdeformowane zarodki22.</li>
		<li>Inkubować zarodki w temperaturze 28,5 °C do momentu, gdy będą gotowe do wstrzyknięcia z komórkami rakowymi, co ma nastąpić, gdy zarodki danio pręgowanego są 2 dni po zapłodnieniu (2 dpf).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj płytki wtryskowe.
	<ol>
		<li>Rozpuść 25 ml 1,5% agarozy wdH2Ona każdą płytkę.</li>
		<li>Wlej 12 ml agarozy do szalki Petriego o wymiarach 100 mm x 15 mm i pozwól jej stwardnieć.</li>
		<li>Rozpuść ponownie, a następnie wlej pozostałą agarozę do talerza.</li>
		<li>Natychmiast ustaw wyciętą szklaną formę (3 mm x 7,2 cm szerokości x 7,5 cm długości) tak, aby była pod kątem 30 stopni do agarozy i umieszczona na środku płyty. 
		UWAGA: Spowoduje to powstanie stromej ściany o nachyleniu 60° i rampy nachylonej pod kątem 30°.</li>
		<li>Przyklej szklaną formę taśmą na miejscu i pozwól agarozie stwardnieć.</li>
		<li>Delikatnie wyjmij szklaną formę i uważaj, aby nie rozerwać agarozy. 
		UWAGA: Formy można przechowywać w dH2O w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyrównać płytkę iniekcyjną z wodą rybną (0,3 g/l soli morskiej).
	<ol>
		<li>Dwukrotnie opłucz płytkę wodą destylowaną.</li>
		<li>Wyrównaj płytkę, dodając do niej 10 ml wody rybnej i umieść na shakerze na 10 minut.</li>
		<li>Wyrównaj talerz po raz drugi z wodą rybną.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podziel zarodki 2 dni po zapłodnieniu (dpf) na grupy iniekcyjne, przenosząc je do naczyń zawierających wodę dla ryb22.</li>
	<li>Przygotuj naczynia regeneracyjne dla każdej grupy do wykorzystania po wstrzyknięciu. Upewnij się, że naczynie regeneracyjne zawiera 10 ml wody rybnej oraz penicylinę (25 μg/ml) i streptomycynę (50 μg/ml).</li>
	<li>Przygotować 2x roztwór tricainy, dodając 4 ml buforowanego bulionu tricainy (4 mg/ml, 10 mM Tris, pH 7) do 50 ml wody rybnej wraz z penicyliną i streptomycyną.</li>
	<li>Rozpuść 15 mg agarozy o niskiej temperaturze topnienia w 10 ml 2x roztworu tricainy, aby wytworzyć montażową pożywkę znieczulającą, która unieruchomi żywe zarodki do obrazowania. 
	UWAGA: Podłoże montażowe składa się z 1,5 % agarozy.</li>
	<li>Wyciągnąć igły do mikroiniekcji.
	<ol>
		<li>Umieść szklaną rurkę kapilarną w pionowym ściągaczu do pipet. Wyciągnij długie, stożkowe pipety za pomocą prądu 20 mAmp i elementu grzejnego z 2 cewkami.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Znakowanie komórek rakowych lipofilowym barwnikiem fluorescencyjnym
<ol>
	<li>Utrzymuj komórki rakowe w zalecanych warunkach hodowli. 
	UWAGA: Te linie były utrzymywane w DMEM + 10% FBS: BT-474, MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-468 i SK-BR-3. Linie te były utrzymywane w RPMI + 10% FBS: HCC 1806 i T-47D. Wszystkie linie komórkowe utrzymywano w temperaturze 37 oC i 5% CO2 podczas inkubacji.</li>
	<li>Wygeneruj zawiesinę pojedynczej komórki poprzez dysocjację przylegającej kultury komórek rakowych.
	<ol>
		<li>Najpierw umyj komórki PBS, a następnie potraktuj 0,05% roztworem trypsyny-EDTA. 
		UWAGA: Czas ekspozycji na trypsynę będzie zależał od linii komórkowej.</li>
		<li>Zneutralizować roztwór trypsyny pożywką do hodowli komórkowych zawierającą surowicę po odłączeniu komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórkową zneutralizowaną trypsyną przez 5 minut przy 200 x g, a następnie ponownie zawiesić osad komórkowy w świeżej pożywce hodowlanej w celu zliczenia komórek.</li>
	<li>Policz zawiesinę komórek za pomocą automatycznego licznika i przygotuj 1 milion komórek w 200 μl pożywki do hodowli komórkowych.
	<ol>
		<li>Sprawdź żywotność komórek za pomocą wykluczenia niebieskiego barwnika trypana przed wstrzyknięciem do zarodków danio pręgowanego. 
		UWAGA: Do zarodków danio pręgowanego należy wstrzykiwać tylko żywotne populacje komórek, ponieważ wstrzyknięcie martwych komórek nie odzwierciedla prawdziwej inwazji naczyniowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 2 μl czerwonego barwnika lipofilowego do zawiesiny komórek rakowych w rozcieńczeniu 1:100, dobrze wymieszać, a następnie inkubować mieszaninę w temperaturze 37 °C przez 20 min. 
	UWAGA: Stężenie barwnika i czas etykietowania mogą wymagać optymalizacji dla każdej linii komórkowej.</li>
	<li>Po inkubacji dodać 1 ml świeżej pożywki do probówki, a następnie odwirować przez 5 minut przy 200 x g.</li>
	<li>Zmyj resztki barwnika fluorescencyjnego z komórek rakowych.
	<ol>
		<li>Odessać supernatant z osadu komórkowego, zawiesić go ponownie w 1 ml świeżej pożywki hodowlanej i odwirować przez 5 minut przy 200 x g.</li>
		<li>Powtórzyć etap płukania po raz drugi: odessać supernatant, ponownie zawiesić osad komórek w 1 ml świeżej pożywki, a następnie ponownie odwirować przez 5 minut przy 200 x g.</li>
		<li>Powtórzyć etap płukania po raz trzeci: odessać supernatant, ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml świeżej pożywki, a następnie ponownie odwirować przez 5 minut przy 200 x g.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy zawierający 1 milion znakowanych komórek rakowych w 500 μl świeżej pożywki. 
	UWAGA: Do podłoża można dodać 0,5 mM EDTA, aby zapobiec zbrylaniu się komórek.</li>
</ol>
3. Wstrzykiwanie komórek rakowych do zatoki przedsercowej zarodków danio pręgowanego
<ol>
	<li>Podłącz system dozowania do mikroiniekcji do źródła powietrza pod ciśnieniem i włącz źródło zasilania systemu dozowania mikroiniekcji.
	<ol>
		<li>Sprawdzić ciśnienie, wciskając pedał nożny. Z uchwytu igły powinien wydostać się krótki impuls powietrza.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zrównoważyć płytki iniekcyjne dwukrotnie z 2x roztworem trikainy.
	<ol>
		<li>Na każdy etap równoważenia dodać 20 ml 2x roztworu trikainy do płytki iniekcyjnej i umieścić na wytrząsarce na 10 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj plastikowej pipety, aby przenieść grupę zarodków do małego naczynia zawierającego 2x roztwór tricainy.</li>
	<li>Wypełnić igłę do wstrzykiwań mikroiniekcyjnych komórkami rakowymi za pomocą końcówki pipety z żelem.
	<ol>
		<li>Umieść igłę w słoiku do przechowywania elektrod spiczastym końcem skierowanym w dół, tak aby komórki osiadły w pobliżu końcówki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieś 20 - 30 znieczulonych zarodków na płytkę iniekcyjną, zbierając zarodki z dużą ilością 2x trikainy w plastikowej pipecie.
	<ol style="margines po lewej: 40px;">
		<li>Pozwól zarodkom osiąść na końcówce pipety.</li>
		<li>Delikatnie wypchnąć zarodki do koryta płytki iniekcyjnej, rozprowadzając je wzdłuż koryta.</li>
		<li>Ułóż zarodki z głowami skierowanymi do góry, a brzuchami skierowanymi w stronę stromej ściany koryta. 
		UWAGA: Roztwór trikainy powinien pokrywać zarówno długość koryta, jak i płaską powierzchnię agarozy, przy czym zarodki powinny znajdować się tylko w korycie. Zarodki są teraz gotowe do wstrzyknięcia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wstrzyknąć 50 - 100 komórek rakowych (2 - 5 nl) do zatoki przedsercowej zarodków danio pręgowanego za pomocą systemu dozowania mikroiniekcji.
	<ol>
		<li>Przymocować igłę do uchwytu igły mikromanipulatora.</li>
		<li>Umieść płytkę iniekcyjną pod stereoskopem ze ścianką 60 stopni w lewo i skup się na górnym zarodku w 25-krotnym powiększeniu.</li>
		<li>Ustawić mikromanipulator w taki sposób, aby po wysunięciu igła przebiła zarodek.</li>
		<li>Przedłużyć igłę na oko, aż prawie dotknie zarodka.</li>
		<li>Patrząc pod mikroskop, ustaw igłę tak, aby przebiła zarodek po dalszym przedłużeniu.</li>
		<li>Przebij zarodek przez woreczek żółtkowy, umieszczając końcówkę tuż przy zatoce przedsercowej, ale nie w niej.</li>
		<li>Wstrzyknij komórki, naciskając pedał nożny. Siła iniekcji wypycha komórki do zatoki sercowej. Wycofać igłę.</li>
		<li>Prawą ręką wysuwać i wysuwać igłę do wstrzykiwań. Lewą ręką dokonaj precyzyjnych korekt, aby ustawić następny zarodek.</li>
		<li>Umieścić igłę z powrotem w słoiku do przechowywania elektrod podczas przygotowywania się do wstrzykiwania innej płytki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieść zarodki do naczynia regeneracyjnego po wstrzyknięciu całej płytki.
	<ol>
		<li>Przechylić płytkę do wstrzykiwań, aby zebrać zarodki na dnie, wypłukać pozostałe zarodki z koryta i zebrać je plastikową pipetą.</li>
		<li>Pozwól zarodkom osiąść na dnie pipety.</li>
		<li>Przenieść zarodki do naczynia regeneracyjnego w minimalnej objętości tricainy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować naczynie regeneracyjne w temperaturze 28 °C przez 1 godzinę.
	<ol>
		<li>Oddziel zdolne do życia zarodki danio pręgowanego od martwych zarodków i innych zanieczyszczeń.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować naczynie w temperaturze 33 °C, aż będzie gotowe do nacinania, zwykle 24 - 96 godz. 
	UWAGA: Temperatura ta jest określana jako kompromis między 37 °C, idealną temperaturą dla komórek rakowych, a 28,5 °C, idealną temperaturą dla danio pręgowanego.</li>
</ol>
4. Punktacja Wynaczynienie
<ol>
	<li>Znieczulić partię zarodków, które mają zostać ocenione, umieszczając je w naczyniu z roztworem trikainy.</li>
	<li>Umieść znieczuloną larwę na szkiełku mikroskopowym w kropli tricainy.
	<ol>
		<li>Ustaw larwy na boki, aby uzyskać optymalne obrazowanie okolicy ogonowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Policz liczbę komórek rakowych, które z powodzeniem wydostały się z układu krwionośnego, skupiając się w górę iw dół przez obszar ogona, aby wyraźnie dostrzec nienaruszone komórki. 
	UWAGA: Najlepiej, aby w proces ten zaangażowane były co najmniej dwie osoby, przy czym osoba oceniająca ryby jest ślepa na oceniane warunki doświadczalne.
	<ol>
		<li>Oceń larwy pod złożonym mikroskopem fluorescencyjnym z soczewką obiektywową 10x. Używaj obiektywu 20x do wszelkich trudnych połączeń.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Umieszczanie zarodków na szkiełkach i późniejsze obrazowanie fluorescencyjne
<ol>
	<li>Stopić 1,5% roztwór agarozy/trikainy i doprowadzić do temperatury 37 °C.</li>
	<li>Znieczulić zarodek, który ma być zobrazowany, umieszczając go w roztworze trikainy.</li>
	<li>Przenieść zarodek w kropli roztworu tricainy na powierzchnię obrazowania. Opcjonalnie użyj naczynia ze szklanym dnem lub szkiełka mikroskopowego.</li>
	<li>Za pomocą szklanej pipety usuń nadmiar roztworu tricainy, zatrzymując zarodek na powierzchni obrazowania.</li>
	<li>Nałóż jedną kroplę stopionego roztworu agarozy na zarodek.</li>
	<li>Szybko, zanim agaroza ulegnie polimeryzacji, użyj delikatnego narzędzia, takiego jak szczoteczka do rzęs, aby ustawić zarodek na boki w celu obrazowania, zwracając szczególną uwagę, aby upewnić się, że zarodek jest spłaszczony wzdłuż powierzchni obrazowania.</li>
	<li>Zanurz teraz spolimeryzowaną kroplę agarozy w roztworze trikainy.</li>
	<li>Poddaj żywy zarodek danio pręgowanego obrazowaniu mikroskopowemu.</li>
</ol>
6. Modyfikacja: wstrzykiwanie komórek rakowych do woreczka żółtkowego zarodków danio pręgowanego
<ol>
	<li>Należy przygotować system dozowania do mikroiniekcji i płytki iniekcyjne w sposób opisany wcześniej w sekcji (3) niniejszego protokołu.</li>
	<li>Oznacz dwie populacje komórek kontrastującymi barwnikami fluorescencyjnymi, jak opisano wcześniej w sekcji (2) niniejszego protokołu.</li>
	<li>Wstrzyknąć 5 - 10 nl 2 x 10^7 komórek/ml do woreczka żółtkowego. Utrzymuj stałą objętość wstrzyknięcia, aby wstrzyknąć identyczną liczbę komórek (100 - 200 komórek rakowych) z każdej populacji komórek 
	UWAGA: Do tego testu można użyć przezroczystych zarodków danio pręgowanego pozbawionych fluorescencyjnego układu naczyniowego. Bierne wnikanie cząstek do układu krwionośnego można kontrolować, wstrzykując kulki fluorescencyjne (< 10 μm) lub, alternatywnie, linię komórkową, która nie wchodzi w głąb naczynia.</li>
	<li>Odzyskać wstrzyknięte zarodki, jak opisano wcześniej w sekcji (3) niniejszego protokołu, a następnie przeprowadzić badania przesiewowe pod kątem udanych wstrzyknięć.
	<ol>
		<li>Użyj stereoskopu, aby przebadać i przenieść zdolne do życia zarodki, które zostały pomyślnie wstrzyknięte do nowego naczynia. 
		UWAGA: Wszystkie zarodki powinny mieć jednolitą masę komórek znajdujących się w żółtku. Zarodki są odrzucane, jeśli wielkość masy jest różna lub jeśli jakiekolwiek komórki znajdują się poza żółtkiem.</li>
		<li>Przenieś zdolne do życia zarodki do nowego naczynia, jeśli komórki rakowe są wyraźnie widoczne w woreczku żółtkowym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować naczynie w temperaturze 33 °C, aż będzie gotowe do nacięcia, zwykle 24 - 48 godz. 
	UWAGA: Temperatura ta jest określana jako kompromis między 37 °C, idealną temperaturą dla komórek rakowych, a 28,5 °C, idealną temperaturą dla danio pręgowanego.</li>
	<li>Aby ocenić stan wewnątrznaczyniowy, postępuj zgodnie z wytycznymi opisanymi w sekcji (4) niniejszego protokołu, ale zamiast tego policz liczbę komórek rakowych, które skutecznie zaatakowały naczynia krwionośne w okolicy ogonowej.</li>
</ol>

<ol><li>Cummings, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastatic+progression+of+breast+cancer%3A+insights+from+50+years+of+autopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Path%22%5BJournal%5D)">Metastatic progression of breast cancer: insights from 50 years of autopsies.</a> Am J Path. 232, 23-31 (2014).</li>
<li>Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massagué, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis%3A+from+dissemination+to+organ-specific+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization.</a> Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).</li>
<li>Reymond, N., d'Água, B. B., Ridley, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crossing+the+endothelial+barrier+during+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Crossing the endothelial barrier during metastasis.</a> Nat Rev Cancer. 13 (12), 858-870 (2013).</li>
<li>Quail, D. F., Joyce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+regulation+of+tumor+progression+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis.</a> Nat Med. 19 (11), 1423-1437 (2013).</li>
<li>Hooper, S., Marshall, J. F., Sahai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell+migration+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Method+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Tumor cell migration in three dimensions.</a> Method Enzymol. 409, 625-642 (2006).</li>
<li>Rahim, S., Üren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+real-time+electrical+impedance+based+technique+to+measure+invasion+of+endothelial+cell+monolayer+by+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A real-time electrical impedance based technique to measure invasion of endothelial cell monolayer by cancer cells.</a> J Vis Exp. (50), (2011).</li>
<li>Jeon, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+3D+vascularized+organotypic+microfluidic+assays+to+study+breast+cancer+cell+extravasation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 112 (1), 214-219 (2015).</li>
<li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+assay+for+simultaneous+culture+of+multiple+cell+types+on+surfaces+or+within+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels.</a> Nat Protoc. 7 (7), 1247-1259 (2012).</li>
<li>Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+breast+cancer%3A+one+size+does+not+fit+all%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Modelling breast cancer: one size does not fit all.</a> Nat Rev Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).</li>
<li>Mohanty, S., Xu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+metastasis+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Experimental metastasis assay.</a> J Vis Exp. (42), (2010).</li>
<li>Minn, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+that+mediate+breast+cancer+metastasis+to+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genes that mediate breast cancer metastasis to lung.</a> Nature. 436 (7050), 518-524 (2005).</li>
<li>Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+bone+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Models of bone metastasis.</a> J Vis Exp. (64), e4260(2012).</li>
<li>Arguello, F., Baggs, R. B., Frantz, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+experimental+metastasis+to+bone+and+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A murine model of experimental metastasis to bone and bone marrow.</a> Cancer Res. 48 (23), 6876-6881 (1988).</li>
<li>Minn, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+organ-specific+metastatic+potential+of+individual+breast+cancer+cells+and+primary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Distinct organ-specific metastatic potential of individual breast cancer cells and primary tumors.</a> J Clin Invest. 115 (1), 44-55 (2005).</li>
<li>Bos, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+that+mediate+breast+cancer+metastasis+to+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain.</a> Nature. 459 (7249), 1005-1009 (2009).</li>
<li>Soares, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+preclinical+murine+model+of+hepatic+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A preclinical murine model of hepatic metastases.</a> J Vis Exp. (91), e51677(2014).</li>
<li>Kienast, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+reveals+the+single+steps+of+brain+metastasis+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Med%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation.</a> Nature Med. 16 (1), 116-122 (2010).</li>
<li>Hasegawa, H., Ushio, Y., Hayakawa, T., Yamada, K., Mogami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+of+the+blood-brain+barrier+in+experimental+metastatic+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Changes of the blood-brain barrier in experimental metastatic brain tumors.</a> J Neurosurg. 59 (2), 304-310 (1983).</li>
<li>Amatruda, J. F., Shepard, J. L., Stern, H. M., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+cancer+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a cancer model system.</a> Cancer Cell. 1 (3), 229-231 (2002).</li>
<li>Feitsma, H., Cuppen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a cancer model.</a> Molecular Cancer Res. 6 (5), 685-694 (2008).</li>
<li>Stoletov, K., Klemke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catch+of+the+day%3A+zebrafish+as+a+human+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Catch of the day: zebrafish as a human cancer model.</a> Oncogene. 27 (33), 4509-4520 (2008).</li>
<li>Stoletov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+extravasation+dynamics+of+metastatic+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Visualizing extravasation dynamics of metastatic tumor cells.</a> J Cell Sci. 123 (13), 2332-2341 (2010).</li>
<li>Kanada, M., Zhang, J., Yan, L., Sakurai, T., Terakawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell-initiated+extravasation+of+cancer+cells+visualized+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell-initiated extravasation of cancer cells visualized in zebrafish.</a> PeerJ. , (2014).</li>
<li>Teng, Y., Xie, X., Walker, S., White, D. T., Mumm, J. S., Cowell, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+human+cancer+cell+metastasis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Evaluating human cancer cell metastasis in zebrafish.</a> BMC Cancer. 13 (453), (2013).</li>
<li>Cross, L. M., Cook, M. A., Lin, S., Chen, J. -N., Rubinstein, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+analysis+of+angiogenesis+drugs+in+a+live+fluorescent+zebrafish+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscl+Throm+Vas%22%5BJournal%5D)">Rapid analysis of angiogenesis drugs in a live fluorescent zebrafish assay.</a> Arterioscl Throm Vas. 23 (5), 911-912 (2003).</li>
<li>Sharif, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+growth+density+modulates+cancer+cell+vascular+invasion+via+Hippo+pathway+activity+and+CXCR2+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Cell growth density modulates cancer cell vascular invasion via Hippo pathway activity and CXCR2 signaling.</a> Oncogene. 34, 5879-5889 (2015).</li>
<li>Novoa, B., Figueras, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+model+for+the+study+of+inflammation+and+the+innate+immune+response+to+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: model for the study of inflammation and the innate immune response to infectious diseases.</a> Adv Exp Med Biol. 946, 253-275 (2012).</li>
<li>Kitamura, T., Qian, B. -Z., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell+promotion+of+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune cell promotion of metastasis.</a> Nature Rev Immunol. 15 (2), 73-86 (2015).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil-mediated+experimental+metastasis+is+enhanced+by+VEGFR+inhibition+in+a+zebrafish+xenograft+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model.</a> J Pathol. 227 (4), 431-445 (2012).</li>
<li>Tulotta, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+signaling+between+human+CXCR4+and+zebrafish+ligands+by+the+small+molecule+IT1t+impairs+the+formation+of+triple-negative+breast+cancer+early+metastases+in+a+zebrafish+xenograft+model%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Inhibition of signaling between human CXCR4 and zebrafish ligands by the small molecule IT1t impairs the formation of triple-negative breast cancer early metastases in a zebrafish xenograft model.</a> Dis Model Mech. 9 (2), 141-153 (2016).</li>
<li>Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M. I., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).</li>
<li>Berens, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratin-associated+protein+5-5+controls+cytoskeletal+function+and+cancer+cell+vascular+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Keratin-associated protein 5-5 controls cytoskeletal function and cancer cell vascular invasion.</a> Oncogene. , Epub ahead of print (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Technika ta wykorzystuje model danio pręgowanego do skutecznego testowania inwazyjnej zdolności naczyniowej komórek nowotworowych (patrz ryc. 1). W tym przypadku zastosowaliśmy tę technikę do panelu linii komórkowych raka piersi, aby zapewnić punkt odniesienia, na którym inni badacze mogą następnie zbudować własne badania (patrz Tabela 1; Rysunki 2 - 3). Obserwacja, że komórki MDA-MB-231 łatwo atakują obszar ogonowy zarodków danio pręgowanego, czyni tę linię komórkową id...

Choroba przerzutowa jest główną przyczyną śmiertelności z powodu raka, a wiele mechanizmów umożliwiających rozprzestrzenianie się komórek rakowych pozostaje do odkrycia1. Aby komórka rakowa mogła pomyślnie dać przerzuty, musi najpierw zaatakować przez zrąb otaczający guz pierwotny, wejść (wewnątrznaczyniowy) do układu krążenia, przetrwać w transporcie, wyjść (wynaczynić) z krążenia, a na koniec ustanowić żywotną kolonię w odległym miejscu narządu2. Wewnątrznaczyniowość i wynaczynienie są zatem kluczowymi etapami kaskady przerzutowej, ale nie każda komórka rakowa jest z natury biegła w zakłócaniu i migracji przez połączenia śródbłonka3. W rzeczywistości istnieje szereg unikalnych nacisków selekcyjnych, które otaczają inwazję naczyniową komórek rakowych, a na proces ten mogą dodatkowo wpływać różne czynniki endogenne i egzogenne4. Z tych powodów techniki, które badają agresywne zachowanie raka w zaawansowanym stadium, często koncentrują się na inwazyjnej zdolności naczyniowej jako sposobie przewidywania rozprzestrzeniania się przerzutów.
Istnieją różne systemy modelowe, które ułatwiają badanie inwazji naczyń krwionośnych komórek rakowych in vitro. Najczęściej stosowane testy in vitro obejmują systemy transwell do oceny migracji komórek nowotworowych przez barierę śródbłonkową5 lub technologię wykrywania impedancji impulsu elektrycznego podłoża komórkowego (ECIS) do monitorowania w czasie rzeczywistym rozerwania nienaruszonej monowarstwy śródbłonka przez komórki rakowe6. Testy te zazwyczaj nie uwzględniają dynamiki płynów i czynników zrębu, które w przeciwnym razie wpłynęłyby na przyczepienie się komórek rakowych do ściany śródbłonka. Problem ten jest nieco ominięty przez perfuzyjne sieci naczyniowe, które powstają w wyniku hodowli 3D śródbłonka z podtrzymującymi komórkami zrębu, a te trójwymiarowe systemy mikroprzepływowe reprezentują obecnie czołówkę obecnych opcji in vitro 7,8. Podejścia te pomijają jednak silne mikrośrodowisko funkcjonalnego układu krążenia, a zatem tylko częściowo zastępują modele in vivo.
Najbardziej rozpowszechnionym modelem inwazji naczyniowej in vivo jest mysz, u której często przeprowadza się eksperymentalne testy przerzutów, ponieważ występują one w stosunkowo krótkich skalach czasowych i zazwyczaj wskazują na zdolność do przerzutów9. Testy te polegają na bezpośrednim wstrzyknięciu komórek rakowych do krążenia, a zatem modelują końcowe etapy przerzutów, a mianowicie wynaczynienie i kolonizację narządów przez komórki rakowe. Eksperymentalne testy przerzutów różnią się w zależności od miejsca wstrzyknięcia komórki rakowej i ostatecznie analizowanych narządów. W pierwszym typie testu komórki rakowe są wstrzykiwane do żyły ogonowej myszy i monitorowane jest wysiewanie komórek rakowych w płucach10,11. Drugi test polega na wykonaniu iniekcji dosercowych w celu skierowania wysiewu przerzutów w kierunku mikrośrodowiska kości12-14, ale także mózgu15. W trzecim teście komórki rakowe są wstrzykiwane do śledziony, aby umożliwić kolonizację wątroby16, podczas gdy czwarta droga dostarczania do tętnicy szyjnej przenosi komórki rakowe do mózgu17,18. Niezależnie od metody dostarczania komórek rakowych, kolonizacja narządów jest akceptowanym eksperymentalnym punktem końcowym i jest zwykle określana za pomocą technik opartych na luminescencji, histologii lub PCR. Pomimo fizjologicznych korzyści płynących z przeprowadzania eksperymentalnych testów przerzutów w obrębie mysiego gospodarza, eksperymenty te nadal wymagają tygodni lub miesięcy, aby je ukończyć i przeanalizować.
Model danio pręgowanego (Danio rerio) pojawił się ostatnio jako nowy system do badania progresji raka19,20 i pozwala na ocenę inwazji naczyń krwionośnych komórek rakowych w funkcjonalnym układzie krążenia w znacznie krótszym czasie w porównaniu z myszami21-24. Metoda wykorzystuje przezroczysty szczep danio pręgowanego, którego śródbłonek jest oznaczony zielonym reporterem fluorescencyjnego białka koralowego rafy koralowej, napędzanym przez promotor kdrl, receptor danio pręgowanego dla czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego25. W teście komórki rakowe są znakowane czerwonym markerem fluorescencyjnym i wstrzykiwane do zatoki przedsercowej 2-dniowych zarodków. W dowolnym miejscu od 48 do 96 godzin po wstrzyknięciu komórki rakowe, które przedostały się z układu krwionośnego do obszaru ogonowego zarodków, można skutecznie ocenić pod mikroskopem fluorescencyjnym. Tutaj zastosujemy tę technikę do panelu powszechnie stosowanych linii komórkowych ludzkiego raka piersi, aby wykazać wyraźne różnice w ich inwazyjnej zdolności naczyniowej. Ponadto wykazaliśmy, że zmiana miejsca wstrzyknięcia na woreczek z żółtkiem zarodka pozwala na badanie heterogenicznych interakcji komórkowych, ponieważ populacje komórek rakowych mogą być różnie znakowane barwnikami fluorescencyjnymi i wstrzykiwane do zarodków danio pręgowanego pozbawionych fluorescencyjnego układu naczyniowego. W tym ostatnim teście komórki rakowe, które zaatakowały żółtko i przeniknęły do układu krwionośnego, są oceniane w okolicy ogonowej od 24 do 48 godzin po wstrzyknięciu. Ze względu na skuteczność i wygodę tego modelu, danio pręgowany jest coraz częściej wykorzystywany do szybkiego testowania inwazyjnej zdolności naczyniowej komórek rakowych w warunkach fizjologicznych.

<table><tbody><tr><td>0,05% Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Naczynia</td><td>Corning Incorporated</td><td>3160-100</td><td></td></tr><tr><td>5 3/4 "Jednorazowe pipety pasturskie, szkło borokrzemianowe</td><td>marki Fisher</td><td>13-678-20B</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Naczynie</td><td>Corning Incorporated</td><td>3160-60</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza, niskotopliwe</td><td>Fisher</td><td>BP165-25</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza, klasa molekularna</td><td>Bioline</td><td>BIO-41026</td><td></td></tr><tr><td>Szkło kapilarne, standardowe, 1.2 mm x 0.68 mm, 4"</td><td>A-M Systems, Inc</td><td>627000</td><td></td></tr><tr><td>David Kopf 700C Pionowy ściągacz do pipet</td><td>Hofstra Group</td><td>3600</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Słoik do przechowywania elektrod, 1,0 mm</td><td>World Precision Instruments, Inc</td><td>E210</td><td></td></tr><tr><td>Sól metanosulfonianu 3-aminobenzoesanu etylu (Trikaina, MS-222)</td><td>Fluka</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Szczoteczka do rzęs</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>113</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca, inaktywowana termicznie</td><td>Pipety transferowe Omega Scientific</td><td>FB-12</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki</td> <td>do pipet do ładowania żeluFisher Brand</td><td>02-707-181</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia ze szklanym dnem (12,0 mm)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>150680</td><td></td></tr><tr><td>Szklana prowadnica depresyjna</td><td>VWR</td><td>470005-634</td><td></td></tr><tr><td>Sól oceaniczna instant, sól morska</td><td>Żarówki</td> z gumy lateksowej Pentair <td>IS50</td><td></td></tr><tr><td>, 2 ml, zestaw 72 sztuk</td> Mikroskop konfokalny <td>Heathrow Scientific</td><td>HS20622B</td><td></td></tr><tr><td>SP8</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Narishige</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse E600</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-G Potas</td><td>Fisher Biotech</td><td>BP914-100</td><td></td></tr><tr><td>Płytki Petriego, 100 mm x 15 mm Marka</td><td>Fisher</td><td>&nbsp; </td><td></td>FB0875713</tr><tr><td>Picospritzer II</td><td>General Valve Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Średni&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan streptomycyny</td><td>Fisher Biotech</td><td>BP910-50</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant DiI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>V22885</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant DiO</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>V22886</td><td></td></tr><tr><td>Danio pręgowany&nbsp;</td><td>Georgetown Zebrafish Shared Resources</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Linie komórkowe utrzymywano w DMEM + 10% FBS, z oczekiwaniem komórek BT-474 i HCC18-6, które były utrzymywane w RPMI + 10% FBS.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

badanie inwazyjnej zdolności naczyniowej komórek nowotworowych u danio pręgowanego (danio rerio)

Testing the Vascular Invasive Ability of Cancer Cells in Zebrafish (Danio Rerio)

Inwazja naczyń krwionośnych komórek rakowych jest cechą charakterystyczną progresji przerzutów. Tradycyjne modele in vitro inwazji komórek rakowych na śródbłonek zazwyczaj nie mają dynamiki płynów, na którą atakujące komórki są narażone in vivo. Jednak systemy in vivo, takie jak modele mysie, choć bardziej istotne z fizjologicznego punktu widzenia, wymagają dłuższych ram czasowych eksperymentów i stanowią wyjątkowe wyzwania związane z monitorowaniem i analizą danych. W tym miejscu opisujemy test danio pręgowanego, który ma na celu wypełnienie tej luki technicznej, umożliwiając szybką ocenę inwazji naczyniowej i wynaczynienia komórek rakowych. Metoda polega na wstrzyknięciu fluorescencyjnych komórek nowotworowych do zatoki przedsercowej przezroczystych 2-dniowych zarodków danio pręgowanego, których unaczynienie jest zaznaczone kontrastowym fluorescencyjnym reporterem. Po wstrzyknięciu komórki rakowe muszą przetrwać w krążeniu, a następnie wynaczynić z naczyń do tkanek w okolicy ogonowej zarodka. Wynaczynione komórki nowotworowe są skutecznie identyfikowane i oceniane w żywych zarodkach za pomocą obrazowania fluorescencyjnego w ustalonym punkcie czasowym. Technikę tę można zmodyfikować w celu zbadania wynaczynienia i/lub konkurencji między heterogeniczną mieszaniną komórek nowotworowych poprzez zmianę miejsca wstrzyknięcia na woreczek żółtkowy. Razem metody te mogą ocenić charakterystyczne zachowanie komórek nowotworowych i pomóc w odkryciu mechanizmów wskazujących na złośliwą progresję do fenotypu przerzutowego.

W niniejszym badaniu przetestowano zdolność do naciekania naczyń powszechnie stosowanych linii komórkowych raka piersi w modelu zarodka rybki danio (Rysunek 1). Do oceny ekstrawazacji w przypadku tych różnych linii komórkowych zastosowano rygorystyczne kryteria, zgodnie z którymi zdarzenia dodatnie liczono tylko wtedy, gdy komórki nowotworowe ewidentnie przeszły do tkanek, co miało na celu przede wszystkim ograniczenie wyników fałszywie dodatnich, które mogłyby wynikać z ...

Ta metoda wykorzystuje embriony danio pręgowanego do skutecznego testowania inwazyjnej zdolności komórek rakowych do naczyń krwionośnych. Fluorescencyjne komórki rakowe są wstrzykiwane do zatoki przedsercowej lub woreczka żółtkowego rozwijających się zarodków. Inwazję naczyniową i wynaczynienie komórek rakowych ocenia się za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej obszaru ogonowego od 24 do 96 godzin później.

Badanie inwazyjnej zdolności naczyniowej komórek nowotworowych u danio pręgowanego (Danio rerio)

Cancer cell vascular invasion and extravasation is a hallmark of metastatic progression.  Traditional in vitro models of cancer cell invasion of ...

Ogólnym celem tej procedury jest ocena złośliwego i inwazyjnego zachowania komórek rakowych w modelu zarodka danio pręgowanego. Metoda ta pomaga naukowcom określić, czy komórki rakowe mogą zaatakować z funkcjonalnego układu krążenia, modelując w ten sposób kluczowy etap kaskady przerzutowej. Główną zaletą tej techniki jest to, że model zarodka danio pręgowanego zapewnia taką ocenę i krótszy czas realizacji niż podobne eksperymenty często przeprowadzane na myszach.Procedurę zademonstruje doktor Eric Glasgow, który prowadzi główny ośrodek hodowli danio pręgowanego na Uniwersytecie Georgetown. Po przygotowaniu komórek rakowych, odczynników i zarodków danio pręgowanego zgodnie z protokołem tekstowym, podłącz system dozowania mikroiniekcji do źródła powietrza pod ciśnieniem i włącz źródło zasilania. Sprawdź ciśnienie, wciskając pedał nożny.Z uchwytu igły powinien wydostać się krótki impuls powietrza. Dodaj 20 mililitrów 2X roztworu trikainy do płytki iniekcyjnej i umieść płytkę na shakerze, aby ją zrównoważyć. Następnie powtórz równowagę z drugą porcją 2X Trikainy.Następnie za pomocą plastikowej pipety przenieś grupę zarodków do małego naczynia zawierającego 2X roztwór trikainy. Za pomocą końcówki do nakładania żelu wypełnij igłę do mikroiniekcji komórkami rakowymi. Umieść igłę w słoiku do przechowywania elektrod spiczastym końcem skierowanym w dół, tak aby komórki osiadły w pobliżu końcówki.Przenieś od 20 do 30 znieczulonych zarodków na płytkę iniekcyjną, zbierając zarodki z dużą ilością 2X Trikainy w plastikowej pipecie. Pozwól zarodkom osiąść na końcówce pipety, a następnie delikatnie wypchnij je do koryta płytki iniekcyjnej, rozprowadzając zarodki wzdłuż koryta. Ułóż zarodki z głowami skierowanymi do góry i brzuchami skierowanymi w stronę stromej ściany koryta.Przymocuj igłę do uchwytu igły mikromanipulatora. Następnie umieść płytkę iniekcyjną pod stereoskopem ze ścianą 60 stopni w lewo i skup się na górnym zarodku w 25-krotnym powiększeniu. Ustawić mikromanipulator tak, aby po wysunięciu igła przebiła zarodek.Następnie rozciągnij igłę za oko, aż prawie dotknie zarodka. Teraz, patrząc pod mikroskop, dopasuj igłę do zarodka. Aby wstrzyknąć komórki, przebij koryto zarodka przez woreczek żółtkowy.Wciśnij pedał nożny, umieszczając końcówkę tylko w zatoce przedsercowej, ale nie w niej. Siła wstrzyknięcia wyrzuci komórki do zatoki sercowej. Alternatywnie, wstrzyknięcie komórek do woreczka żółtkowego pozwala na badanie różnych aspektów inwazji naczyniowej, jak opisano w manuskrypcie.Prawą ręką wysuwać i wysuwać igłę do wstrzykiwań. Lewą ręką dokonaj precyzyjnych korekt, aby ustawić następny zarodek. Po wstrzyknięciu całej płytki należy umieścić igłę z powrotem w słoiku do przechowywania elektrody.Aby przenieść zarodki do naczynia regeneracyjnego, przechylić płytkę do wstrzykiwań, aby wyciągnąć zarodki na dole, wypłukać zarodki z koryta i użyć plastikowej pipety do ich pobrania. Pozwól zarodkom ustabilizować się na dnie pipety, a następnie przenieś je do naczynia regeneracyjnego w minimalnej ilości trikainy. Inkubuj naczynie regeneracyjne w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez godzinę, a następnie oddziel zdolne do życia zarodki od martwych zarodków i szczątków.Inkubuj naczynie w temperaturze 33 stopni Celsjusza, aż będzie gotowe do nacinania. Po znieczuleniu partii zarodków, które mają zostać ocenione, zgodnie z protokołem tekstowym, umieść znieczuloną larwę na szkiełku mikroskopowym depresji w kropli Trikainy. Ustaw larwy na boki, aby uzyskać optymalne obrazowanie okolicy ogonowej.Umieść szkiełko na złożonym mikroskopie fluorescencyjnym z soczewką obiektywową 10X. Oceń larwy, licząc liczbę komórek rakowych, które z powodzeniem wydostały się z układu krwionośnego, skupiając się w górę iw dół przez obszar ogona, aby wyraźnie dostrzec nienaruszone komórki. Rozpuść 1,5% roztwór agarozy Trikainy i doprowadź do 37 stopni Celsjusza.Po znieczuleniu zarodków, tak jak poprzednio, przenieś zarodek w kropli roztworu Trikainy na powierzchnię obrazowania. Użyj szklanej pipety, aby usunąć nadmiar roztworu trikainy, zatrzymując zarodek na powierzchni obrazowania. Następnie nałóż jedną kroplę stopionego roztworu agarozy na zarodek.Pracując szybko, zanim agaroza spolimeryzuje się, użyj delikatnego narzędzia, takiego jak szczoteczka do rzęs, aby ustawić zarodek bocznie w celu obrazowania, zwracając szczególną uwagę, aby zarodek był spłaszczony wzdłuż powierzchni obrazowania. Gdy kropla agarozy spolimeryzuje się, zanurz ją w roztworze Trikainy. Na koniec poddaj żywy zarodek danio pręgowanego obrazowaniu mikroskopowemu.Spośród siedmiu linii komórkowych raka piersi badanych pod kątem ich inwazyjnej zdolności naczyniowej w zarodkach danio pręgowanego, linia komórkowa MDA-MB-231 wykazywała największą liczbę wynaczynionych komórek rakowych na zarodek po 96 godzinach od wstrzyknięcia. Zaobserwowano również, że komórki BT-474 łatwo atakowały obszar ogonowy zarodków, podczas gdy inne linie komórkowe, takie jak komórki MCF-7, SK-BR-3 i T-47D, były minimalnie inwazyjne. W zmodyfikowanym badaniu, które wykorzystuje inne miejsce wstrzyknięcia, przeprowadzono eksperyment konkursowy, w którym dwie populacje komórek MDA-MB-231, różniące się inwazyjną zdolnością naczyniową, zostały jednocześnie wstrzyknięte do woreczka żółtkowego rozwijających się zarodków.Po ocenie stwierdzono, że komórki MDA-MB-231 rozmnażały się w warunkach zlewania się hodowli przed wstrzyknięciem, wykazywały zmniejszenie wynaczynienia do krążenia, a zatem miały zmniejszoną obecność w okolicy ogonowej zarodków. Po opanowaniu, zastrzyki z zarodka danio pręgowanego można wykonać w ciągu czterech godzin, jeśli zostaną wykonane prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o stosowaniu rygorystycznych i spójnych kryteriów podczas oceny wynaczynienia komórek rakowych.Po tej procedurze wyniki można dalej walidować w modelu mysim. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonywać zastrzyki i oceniać wynaczynienie, co pozwala przetestować inwazyjną zdolność komórek rakowych do naczyń krwionośnych w zarodkach danio pręgowanego.

testing-vascular-invasive-ability-cancer-cells-zebrafish-danio

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten film opisuje metodę mikroiniekcji do dostarczania komórek raka piersi do przestrzeni okołobiałkowej transgenicznych embrionów danio pręgowanego. Po inkubacji wizualizujemy zarodek pod mikroskopem fluorescencyjnym, aby obserwować inwazję, rozprzestrzenianie się i przerzuty komórek rakowych.

Analiza inwazyjności zPDX: badanie inwazyjnego zachowania przerzutowych komórek rakowych w ksenoprzeszczepach zarodków danio pręgowanego

Ten film opisuje test ksenoprzeszczepu danio pręgowanego w celu oceny powstawania nowotworów in vivo i zbadania efektu środków terapeutycznych.

Test ksenoprzeszczepu danio pręgowanego: metoda oceny skuteczności przeciwnowotworowej leków na rakotwórczość u danio pręgowanego in vivo

Przedstawiono szybki sposób na badanie modyfikatorów czerniaka za pomocą autochtonicznego modelu guza danio pręgowanego. Wykorzystuje wektor miniCoopR, który pozwala na ekspresję genów kandydujących na czerniaka w melanocytach. Opisano metodę uzyskiwania krzywych przeżycia wolnych od czerniaka, test inwazji, protokół barwienia przeciwciałami melanocytów łuskowych oraz test przeszczepiania czerniaka.

Badania przesiewowe w kierunku modyfikatorów czerniaka przy użyciu autochtonicznego modelu guza danio pręgowanego

Tutaj opisujemy modele ksenoprzeszczepu danio pręgowanego za pomocą dwóch różnych miejsc iniekcji, tj. przestrzeni perivitelinowej i kanału Cuviera, aby zbadać inwazyjne zachowanie i ocenić potencjał wewnątrznaczyniowy i wynaczynieniowy ludzkich komórek raka piersi, odpowiednio.

Inwazyjne zachowanie ludzkich komórek raka piersi u embrionalnego danio pręgowanego

Przeszczepianie komórek nowotworowych jest ważnym narzędziem do identyfikacji mechanizmów nowotworowych i odpowiedzi terapeutycznych. Obecne techniki opierają się na zwierzętach niekompetentnych immunologicznie. W tym miejscu opisujemy metodę przeszczepiania komórek nowotworowych danio pręgowanego do zarodków kompetentnych immunologicznie w celu długoterminowej analizy zachowania komórek nowotworowych i odpowiedzi na leki in vivo.

Przeszczepianie pediatrycznych guzów mózgu danio pręgowanego do gospodarzy kompetentnych immunologicznie w celu długoterminowego badania zachowania komórek nowotworowych i odpowiedzi na leki

Celem tej metody jest wygenerowanie in vivo modelu angiogenezy guza poprzez ksenografowanie komórek nowotworowych ssaków do zarodka danio pręgowanego, który ma fluorescencyjnie znakowane naczynia krwionośne. Obrazując ksenoprzeszczep i związane z nim naczynia, można uzyskać ilościowy pomiar odpowiedzi angiogennej.

Obrazowanie in vivo i kwantyfikacja odpowiedzi angiogennej gospodarza w ksenoprzeszczepach guza danio pręgowanego

Modele ksenoprzeszczepów danio pręgowanego pozwalają na wysokoprzepustowe badania przesiewowe leków i obrazowanie fluorescencyjne ludzkich komórek nowotworowych w mikrośrodowisku in vivo. Opracowaliśmy przepływ pracy do zautomatyzowanych badań przesiewowych leków na dużą skalę na próbkach białaczki pobranych od pacjentów u danio pręgowanego przy użyciu zautomatyzowanego urządzenia do obrazowania wyposażonego w mikroskop fluorescencyjny.

Badania przesiewowe leków w ksenoprzeszczepach nowotworowych pochodzących od pacjenta pręgowanego

Opisana tutaj jest metoda wykorzystania embrionów danio pręgowanego do badania zdolności funkcjonalizowanych nanocząsteczek do celowania w ludzkie komórki rakowe in vivo. Metoda ta pozwala na ocenę i wybór optymalnych nanocząstek do przyszłych badań na dużych zwierzętach oraz w badaniach klinicznych.

Celowanie in vivo w ksenoprzeszczepowane ludzkie komórki rakowe za pomocą funkcjonalizowanych fluorescencyjnych nanocząstek krzemionki u danio pręgowanego

Tutaj udostępniamy protokół krok po kroku, z poradami dotyczącymi generowania ksenoprzeszczepów i wytycznymi do analizy zachowania guza, immunofluorescencji całego montażu i kwantyfikacji obrazowania konfokalnego.

Generowanie ksenoprzeszczepów larw danio pręgowanego i analiza zachowania guza

Opisujemy protokół ksenotransplantacji do żółtka przezroczystych zarodków danio pręgowanego, który jest zoptymalizowany za pomocą prostej, szybkiej metody oceny poziomu. Analizy po wstrzyknięciu obejmują przeżycie i ocenę obciążenia chorobowego ksenoprzeszczepionymi komórkami za pomocą cytometrii przepływowej.

Prosta, szybka i skuteczna metoda analizy ksenotransplantacji guza w przezroczystych zarodkach danio pręgowanego

Ten protokół zawiera instrukcje krok po kroku dotyczące generowania i rozwiązywania problemów z ludzkimi ksenoprzeszczepami ostrej białaczki limfoblastycznej (ALL) z linii komórkowych i świeżego materiału pacjenta w przejściowo immunosupresyjnych zarodkach danio pręgowanego, wraz z wytycznymi dotyczącymi oceny odpowiedzi na lek za pomocą cytometrii przepływowej. Rurociąg eksperymentalny może być również dostosowany do guzów litych.

Szybkie przewidywanie odpowiedzi na leki in vivo przy użyciu przeszczepów komórek białaczkowych w zarodkach danio pręgowanego

Poznaj metodę oceny inwazyjności komórek nowotworowych w modelu embriogenicznym Danio rerio. Technika mikroinjekcji fluorescencyjnych komórek nowotworowych umożliwia wizualizację inwazji naczyniowej i ekstrawazacji w czasie rzeczywistym.

Badanie inwazyjnej zdolności naczyniowej komórek nowotworowych u danio pręgowanego (Danio rerio)

Przeglądaj więcej filmów