Metoda ChIP-exo: identyfikacja interakcji białko-DNA z precyzją bliską par zasad

Ogólnym celem tej funkcjonalnej technologii genomowej jest zidentyfikowanie dokładnych lokalizacji genomowych, które dane białko zajmuje w żywych komórkach. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie regulacji genów i epigenetyki, takie jak sposób, w jaki maszyneria transkrypcyjna składa się i działa w kontekście chromatyny. Główną zaletą tej techniki jest to, że ujawnia ona dokładną lokalizację genomową interakcji DNA białek w rozdzielczości wstępnej bliskiej podstawie przy wyjątkowo niskim tle.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ protokół jest złożony i wymaga dbałości o szczegóły przez cały czas. Aby sonikować lizaty jądrowe, zacznij od umieszczenia adapterów żywicy w 15-mililitrowych rurkach polistyrenowych zawierających ekstrakty jądrowe. Sonikuj lizaty w lodowatej kąpieli wodnej o średniej mocy przez 30 sekund włączenia i 30 sekund przerwy, w sumie dwie 15-minutowe sesje.

Aby sprawdzić wyniki sonikacji, przenieś dwie próbki o pojemności 10 mikrolitrów z każdej probówki do probówek o pojemności 1,5 mililitra. Następnie odwróć sieciowanie, łącząc pierwszą 10 mikrolitrów próbki z 10 mikrolitrami TE-RNazy A i 0,2 mikrolitra proteinazy K. Inkubuj probówkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie dodaj cztery mikrolitry 6-krotnego ksylenowego barwnika DNA.

Do drugiej próbki o wielkości 10 mikrolitrów zachowaj wiązania krzyżowe, dodając dwa mikrolitry 6-krotnego ksylenowego barwnika DNA. Obie próbki należy umieścić w 1,5% żelu agarozowym o napięciu 140 woltów przez około 30 do 45 minut, aż barwnik bromofenolowy w tym ostatnim znajdzie się w trzech czwartych w dół żelu. Jeśli sonikacja się powiodła, przenieś sonikowane lizaty do dwóch mililitrowych probówek zawierających 150 mikrolitrów 10% Triton X-100 i wiruj do wymieszania.

Rozpylić nierozpuszczalną chromatynę i zanieczyszczenia, obracając sonikowane lizaty pod ciśnieniem 20 000 razy g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie przenieś supernatanty do nowych dwumililitrowych probówek. Przechowuj próbki w temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza przez czas nieokreślony.

Dla każdej immunoprecypitacji chromatyny lub reakcji ChIP połącz 1,5 mililitra sonikowanych ekstraktów z koniugatami kulek przeciwciał w 1,5 mililitrowych probówkach. Inkubuj probówki na mini rotatorze rurkowym z prędkością dziewięciu w czterech stopniach Celsjusza przez noc. Po kilku minutach sprawdź, czy próbki nie przeciekają i prawidłowo się mieszają.

Następnego dnia bardzo krótko odkręć rurki, aby zebrać płyn do nakrętek i umieść probówki na stojaku magnetycznym na jedną minutę. Następnie odessać ekstrakt. Dodaj 0,75 mililitra buforu RIPA do każdej probówki.

Następnie wyjmij probówki ze stojaka magnetycznego i odwróć je kilka razy, aby wymieszać. Po krótkim zawirowaniu umieść rurki z powrotem na magnesie i odessaj supernatant. Po ostatnim praniu dodaj 0,75 mililitra 10-milimolowego Tris HCL do każdej probówki.

Wyjmij probówki ze stojaka magnetycznego i kilkakrotnie odwróć próbki, aby je wymieszać. Po krótkim zawirowaniu umieść probówki z powrotem na stojaku i odessaj supernatant. Po przeprowadzeniu reakcji polerowania i detalowania zgodnie z protokołem tekstowym, należy wypełnić obliczenia mieszanki głównej ligacji.

Następnie przygotuj mieszankę do podwiązywania w 1,5 mililitrowej probówce na lodzie i odpipetuj do wymieszania roztworu. Z probówkami na próbki na stojaku magnetycznym, dodaj 48 mikrolitrów głównej mieszanki ligacyjnej P7 i dwa mikrolitry o innym indeksie adaptera do każdej z żywic próbki. Próbki należy inkubować w mieszalniku ThermoMixer w temperaturze trzykrotności g w 25 stopniach Celsjusza przez dwie godziny.

Po umyciu próbek i przeprowadzeniu reakcji naprawy nacięć i kinazy Phy 29 zgodnie z protokołem tekstowym, wypełnij obliczenia głównej mieszanki egzonukleazy lambda i przygotuj mieszankę egzonukleazy lambda w 1,5-mililitrowej probówce na lodzie. Dodaj 50 mikrolitrów mieszanki egzonukleazy lambda do każdej próbki żywicy, gdy nadal znajduje się na stojaku magnetycznym. Następnie inkubować próbki w mieszalniku ThermoMixer w temperaturze trzykrotności g w 37 stopniach Celsjusza przez 30 minut.

Po zaessaniu ostatniego płukania zgodnie z opisem w protokole tekstowym, należy przeprowadzić reakcję nukleazy RecJf, wypełniając obliczenia głównej mieszanki RecJf i wykonując mieszaninę RecJf na lodzie. Dodaj 50 mikrolitrów mieszanki RecJf do każdej próbki żywicy na stojaku magnetycznym. Następnie inkubować próbki w mieszalniku ThermoMixer w temperaturze trzykrotności g w 37 stopniach Celsjusza przez 30 minut.

Po odessaniu ostatniego przemywania należy przygotować bufor elucyjny ChIP i główną mieszankę proteinazy K i dodać 200 mikrolitrów roztworu do każdej próbki żywicy. Inkubować próbki w mieszalniku ThermoMixer w temperaturze trzykrotności g w 65 stopniach Celsjusza przez noc pod podgrzewaną pokrywką, aby zapobiec kondensacji. Następnego dnia krótko odkręć próbki i umieść probówki na stojaku magnetycznym na jedną minutę.

Następnie przenieś 200 mikrolitrów supernatantu do nowej 1,5 mililitrowej probówki zawierającej 200 mikrolitrów buforu TE. Po ekstrakcji DNA, pierwotnym rozszerzeniu P7 i reakcjach ATL, wypełnij obliczenia głównego miksu w tabeli ligacji adaptera P5 i wykonaj główną mieszankę ligacji na lodzie. Dodać 20 mikrolitrów mieszanki do ligacji do każdej próbki i odpipetować do wymieszania.

Następnie inkubuj próbki w termocyklerze w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Przeprowadzić oczyszczanie i kwantyfikację DNA zgodnie z protokołem tekstowym. Jak pokazano tutaj, warto poświęcić czas na optymalizację warunków sonikacji, aby uzyskać wysokiej jakości ekstrakty chromatyny, które dają fragmenty DNA o długości od 100 do 500 par zasad.

Test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej służy do sprawdzenia, czy sonikowane ekstrakty zawierają nienaruszone wiązania krzyżowe DNA białek, widoczne jako super przesunięcie fragmentów DNA. Aby ocenić sygnał tła, rutynowo wykonuje się próbny ChIP bez przeciwciał w reakcji. Wysokiej jakości egzobiblioteka ChIP zapewni bardzo mało tła w próbce próbnej w porównaniu z przygotowaniem biblioteki ChIP-seq.

Poniżej przedstawiono ocenę biblioteki ChIP-exo za pomocą bioanalizatora. Analiza dokładnie zapewnia rozkład rozmiaru biblioteki i wykrywa zanieczyszczające dimery adaptera, które działają przy 125 parach podstawowych. Panel ten ilustruje płynny rozkład oddzielonego od nici znacznika ChIP-exo pięciu pierwszych N dla polimerazy II, TFIIB i TBP w ludzkim genie RPS12 w proliferujących komórkach K562.

Na tym rysunku pokazano średnie wzorce ChIP-exo w stosunku do transkrypcyjnych miejsc startowych genów kodujących białka. Główne lokalizacje pików TBP, TFIIB i polimerazy II na wykresie złożonym odzwierciedlają organizację genomu ludzkich kompleksów inicjujących transkrypcję. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu czterech dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się regulacją genów do zbadania szczegółów molekularnych struktury subjądrowej w asymetrii drożdży. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak profilowanie ekspresji RNazy, aby odpowiedzieć na pytania, takie jak to, czy dany czynnik wpływa na ekspresję pobliskiego genu. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o starannym wypełnieniu tabel mieszania wzorcowego dla wszystkich etapów enzymatycznych.

Nie zapominaj, że praca z czynnikami rakotwórczymi i innymi środkami może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie środków ochrony osobistej. Po tym obejrzeniu filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować wysokiej jakości bibliotekę ChIP-exo.