Name: Metoda ChIP-exo: identyfikacja interakcji białko-DNA z precyzją bliską par zasad (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Poznaj metodę ChIP-exo do precyzyjnej identyfikacji interakcji białko-DNA z rozdzielczością bliską par zasad. Technika ta umożliwia badanie regulacji genów i epigenetyki z wyjątkowo niskim poziomem szumów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Venters Lab i członkom Wydziału Fizjologii Molekularnej i Biofizyki za pomocne dyskusje. Specjalne podziękowania dla Franka Pugha za jego wskazówki, mentoring i wiele wnikliwych dyskusji na temat niuansów ChIP-exo, kiedy byłem stażystą podoktoranckim w jego laboratorium.

<ol><li>Venters, B. J., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+eukaryotic+genes+are+transcribed%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">How eukaryotic genes are transcribed.</a> Crit Rev Biochem Mol Biol. 44, 117-141 (2009).</li>
<li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+genome-wide+protein-DNA+interactions+detected+at+single-nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution.</a> Cell. 147, 1408-1419 (2011).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+dynamics+of+enhanceosome+assembly+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-molecule dynamics of enhanceosome assembly in embryonic stem cells.</a> Cell. 156, 1274-1285 (2014).</li>
<li>Wales, S., Hashemi, S., Blais, A., McDermott, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+MEF2+target+gene+analysis+in+cardiac+and+skeletal+muscle+reveals+novel+regulation+of+DUSP6+by+p38MAPK-MEF2+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Global MEF2 target gene analysis in cardiac and skeletal muscle reveals novel regulation of DUSP6 by p38MAPK-MEF2 signaling.</a> Nucleic acids research. 42, 11349-11362 (2014).</li>
<li>Cho, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+architecture+of+ArgR-DNA+complexes+at+the+genome-scale+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The architecture of ArgR-DNA complexes at the genome-scale in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Res. 43, 3079-3088 (2015).</li>
<li>Katainen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTCF%2Fcohesin-binding+sites+are+frequently+mutated+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">CTCF/cohesin-binding sites are frequently mutated in cancer.</a> Nat Genet. 47, 818-821 (2015).</li>
<li>Murphy, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ancient+protein-DNA+interaction+underlying+metazoan+sex+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An ancient protein-DNA interaction underlying metazoan sex determination.</a> Nat Struct Mol Biol. 22, 442-451 (2015).</li>
<li>Zere, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+Targets+and+Features+of+BarA-UvrY+%28-SirA%29+Signal+Transduction+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genomic Targets and Features of BarA-UvrY (-SirA) Signal Transduction Systems.</a> PLoS One. 10, e0145035(2015).</li>
<li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+structure+and+organization+of+eukaryotic+pre-initiation+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes.</a> Nature. 483, 295-301 (2012).</li>
<li>Rhee, H. S., Bataille, A. R., Zhang, L., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subnucleosomal+structures+and+nucleosome+asymmetry+across+a+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Subnucleosomal structures and nucleosome asymmetry across a genome.</a> Cell. , 1377-1388 (2014).</li>
<li>Pugh, B. F., Venters, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+Organization+of+Human+Transcription+Initiation+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genomic Organization of Human Transcription Initiation Complexes.</a> PLoS One. 11, e0149339(2016).</li>
<li>Albert, I., Wachi, S., Jiang, C., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GeneTrack--a+genomic+data+processing+and+visualization+framework%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">GeneTrack--a genomic data processing and visualization framework.</a> Bioinformatics. 24, 1305-1306 (2008).</li>
<li>Guo, Y., Mahony, S., Gifford, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+genome+wide+binding+event+finding+and+motif+discovery+reveals+transcription+factor+spatial+binding+constraints%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+computational+biology%22%5BJournal%5D)">High resolution genome wide binding event finding and motif discovery reveals transcription factor spatial binding constraints.</a> PLoS computational biology. 8, e1002638(2012).</li>
<li>Bardet, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+transcription+factor+binding+sites+from+ChIP-seq+data+at+high+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Identification of transcription factor binding sites from ChIP-seq data at high resolution.</a> Bioinformatics. 29, 2705-2713 (2013).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MACE%3A+model+based+analysis+of+ChIP-exo%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">MACE: model based analysis of ChIP-exo.</a> Nucleic Acids Res. 42, e156(2014).</li>
<li>Bentley, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+whole+human+genome+sequencing+using+reversible+terminator+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry.</a> Nature. 456, 53-59 (2008).</li>
<li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-exo+method+for+identifying+genomic+location+of+DNA-binding+proteins+with+near-single-nucleotide+accuracy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">ChIP-exo method for identifying genomic location of DNA-binding proteins with near-single-nucleotide accuracy.</a> Curr Protoc Mol Biol. Chapter 21, Unit 21.24(2012).</li>
<li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Res. 22, 1813-1831 (2012).</li>
<li>Serandour, A. A., Brown, G. D., Cohen, J. D., Carroll, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+Illumina-based+ChIP-exonuclease+method+provides+insight+into+FoxA1-DNA+binding+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of an Illumina-based ChIP-exonuclease method provides insight into FoxA1-DNA binding properties.</a> Genome Biol. 14, R147(2013).</li>
<li>He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-nexus+enables+improved+detection+of+in+vivo+transcription+factor+binding+footprints%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints.</a> Nat Biotechnol. 33, 395-401 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiamy funkcjonalny protokół genomiczny w celu określenia dokładnego miejsca wiązania białek oddziałujących z chromatyną w bezstronny, obejmujący cały genom sposób w rozdzielczości bliskiej parom zasad. Najważniejszym krokiem do osiągnięcia rozdzielczości mapowania par bliskich parom zasad jest traktowanie egzonukleazą DNA wzbogaconego w ChIP, podczas gdy immunoprecypitat pozostaje na żywicy magnetycznej. Pozornie kompleksy białkowe mogą potencjalnie blokować ślad in vivo dowolnej podjednostki (np.</e...

Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) to skuteczna metoda badania mechanizmów regulacji genów poprzez selektywne wzbogacanie o fragmenty DNA, które oddziałują z danym białkiem w żywych komórkach. Metody wykrywania fragmentów DNA wzbogaconych w ChIP ewoluowały wraz z rozwojem technologii, od wykrywania pojedynczego locus (standard ChIP-qPCR) przez hybrydyzację na mikromacierzach oligonukleotydowych (chip ChIP) po sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości (ChIP-seq) 1. Chociaż ChIP-seq ma szerokie zastosowanie, heterogeniczność chromatyny i niespecyficzne interakcje DNA pogorszyły jakość danych, prowadząc do wyników fałszywie dodatnich i nieprecyzyjnego mapowania. Aby obejść te ograniczenia, dr Frank Pugh opracował metodę ChIP-exo 2. Istotną cechą ChIP-exo jest to, że zawiera egzonukleazę od 5 'do 3', skutecznie śladując miejsca wiązania czynnika transkrypcyjnego. W rezultacie, metodologia ChIP-exo osiąga wyższą rozdzielczość, większy zakres dynamiczny detekcji i niższy szum tła.
Chociaż ChIP-exo jest technicznie trudniejsze do opanowania niż ChIP-seq, jest szeroko stosowane, ponieważ badania mają na celu uzyskanie unikalnych spostrzeżeń w ultra wysokiej rozdzielczości przy użyciu różnych systemów biologicznych 3-8. Rzeczywiście, ChIP-exo został z powodzeniem zastosowany do bakterii, drożdży, myszy, szczurów i ludzkich systemów komórkowych. Jako dowód słuszności, ChIP-exo został pierwotnie użyty do identyfikacji precyzyjnego motywu wiązania dla kilku czynników transkrypcyjnych drożdży 2. Technika ta została również wykorzystana u drożdży do zbadania organizacji kompleksu transkrypcji przed inicjacją oraz do rozszyfrowania struktury subnukleosomalnej różnych histonów 9,10. Niedawno wykorzystaliśmy ChIP-exo do rozwiązania sąsiednich zdarzeń wiązania TFIIB i Pol II w ludzkich promotorach i wykazaliśmy, że rozległa rozbieżna transkrypcja wynika z odrębnych kompleksów inicjacyjnych 11.
Przedstawiony tutaj przepływ pracy jest zoptymalizowany i usprawniony dla ssaków ChIP-exo (Rysunek 1). Po pierwsze, żywe komórki pierwotne lub hodowle tkankowe są traktowane formaldehydem w celu zachowania interakcji białko-DNA in vivo poprzez kowalencyjne wiązanie krzyżowe. Komórki są poddawane lizie, a chromatyna jest ścinana do fragmentów o wielkości ~ 100 - 500 par zasad. Następnie ChIP selektywnie wzbogaca się o fragmenty DNA usieciowane z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. W tym momencie zwykle przygotowywane są biblioteki ChIP-seq, co z natury ogranicza rozdzielczość wykrywania do średniego rozmiaru fragmentu wynoszącego kilkaset par zasad. Jednak ChIP-exo pokonuje to ograniczenie, przycinając lewą i prawą granicę 5' DNA miejsca usieciowania białko-DNA za pomocą egzonukleazy lambda. Biblioteki sekwencjonowania są następnie konstruowane z DNA strawionego egzonukleazą, jak opisano poniżej. Powstałe zagnieżdżone granice 5' reprezentują ślad in vivo interakcji białko-DNA (Figura 1, krok 14) i są wykrywane przez sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości. Chociaż metodologia ChIP-exo jest bardziej złożona niż ChIP-seq, przejścia między większością etapów wymagają prostego mycia ściegów, co minimalizuje utratę próbki i zmienność eksperymentalną. Co ważne, ponieważ ChIP-exo jest udoskonaloną wersją ChIP-seq, każda próbka, która odniesie sukces z ChIP-seq, powinna również odnieść sukces z ChIP-exo.
Ślad in vivo interakcji białko-DNA z ChIP-exo daje zasadniczo odmienną strukturę danych od ChIP-seq. Chociaż typowe wywołania ChIP-seq mogą być stosowane do danych ChIP-exo, w celu uzyskania najbardziej precyzyjnych wywołań szczytowych zalecamy narzędzia bioinformatyczne zaprojektowane specjalnie z myślą o unikalnej strukturze danych ChIP-exo. Należą do nich Genetrack, GEM, MACE, Peakzilla i ExoProfiler 12-15.

<table><tbody><tr><td>37% formaldehydu, bez metanolu, 10 x 10 ml ampułki</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28908</td><td>Sekcja 3</td></tr><tr><td>Kompletny koktajl inhibitorów proteazy (CPI)</td><td>Roche Life Science</td><td>11873580001</td><td>Sekcje 4, 8</td></tr><tr><td>Sonikator Bioruptor</td><td>Diagenode</td><td>UCD200</td><td>Sekcja 5</td></tr><tr><td>Probówki polistyrenowe 15 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352095</td><td>Sekcja 5</td></tr><tr><td>Białko MagSepharose G Xtra koraliki</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9670-66</td><td>Sekcja 6</td></tr><tr><td>DynaMag-1,5 ml Boczny stojak magnetyczny</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>Sekcje 6-17, 22</td></tr><tr><td>Rotator mini-rurki</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-450-127</td><td>Sekcje 7, 22</td></tr><tr><td>Polimeraza DNA T4</td><td>New England BioLabs</td><td>M0203</td><td>Sekcja 9</td></tr><tr><td>Polimeraza DNA I, Klenow</td><td>New England BioLabs</td><td>M0210</td><td>Sekcja 9</td></tr><tr><td>10x NEBuffer 2 (10x Bufor reakcyjny 2)</td><td>New England BioLabs</td><td>B7002</td><td>Sekcje 9-11, 13, 15, 20</td></tr><tr><td>Thermomixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382</td><td>Sekcje 9-16</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Roche Life Science</td><td>010419979001</td><td>Sekcje 9, 11, 13</td></tr><tr><td>dNTP</td><td>New England BioLabs</td><td>N0447</td><td>Sekcje 9, 12, 19, 23</td></tr><tr><td>Kinaza polinukleotydowa T4</td><td>New England BioLabs</td><td>M0201</td><td>Sekcje 9, 13</td></tr><tr><td>dATP</td><td>New England BioLabs</td><td>N0440</td><td>Sekcje 10, 20</td></tr><tr><td>Klenow 3'-5' Exo Minus</td><td>New England BioLabs</td><td>M0212</td><td>Sekcje 10, 20</td></tr><tr><td>Ligaza DNA T4&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202</td><td>Sekcje 11, 21</td></tr><tr><td>&Phi;-29 Polimeraza DNA</td><td>New England BioLabs</td><td>M0269</td><td>Sekcje 12, 19</td></tr><tr><td>10x &Phi;-29 Bufor</td><td>New England BioLabs</td><td>B0269</td><td>Sekcje 12, 19</td></tr><tr><td>Egzonukleaza lambda</td><td>Nowa Anglia BioLabs</td><td>M0262</td><td>Sekcja 14</td></tr><tr><td>10x Bufor Lambda</td><td>New England BioLabs</td><td>B0262</td><td>Sekcja 14</td></tr><tr><td>RecJf Egzonukleaza</td><td>Nowa Anglia BioLabs</td><td>M0264</td><td>Sekcja 15</td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Roche Nauki przyrodnicze</td><td>03115828001</td><td>Sekcja 16</td></tr><tr><td>Glikogen</td><td>Roche Nauki przyrodnicze</td><td>010901393001</td><td>Sekcja 18</td></tr><tr><td>10x Bufor ligazy T4</td><td>Nowa Anglia BioLabs</td><td>B0202</td><td>Sekcja 21</td></tr><tr><td>Koraliki AMPure XP (czyszczenie)&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>Sekcja 22</td></tr><tr><td>Q5 Polimeraza DNA na gorąco&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>M0493</td><td>Sekcja 23</td></tr><tr><td>5x Bufor Q5 (5x Bufor PCR)</td><td>New England BioLabs</td><td>B9027</td><td>Sekcja 23</td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji żelu QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Section 25</td></tr><tr><td>Qubit Fluorometr</td><td>Invitrogen</td><td>Q33216</td><td>Sekcja 26</td></tr><tr><td>Optyczne przezroczyste rurki kubitowe&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>Q32856</td><td>Sekcja 26</td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania wysokiej czułości Qubit dsDNA</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851</td><td>Sekcja 26</td></tr></tbody></table>

metoda chip-exo: identyfikacja interakcji białko-dna z precyzją bliską par zasad

The ChIP-exo Method: Identifying Protein-DNA Interactions with Near Base Pair Precision

Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) jest niezbędnym narzędziem w dziedzinie epigenetyki i regulacji genów, które izoluje specyficzne interakcje białko-DNA. ChIP sprzężony z sekwencjonowaniem o wysokiej przepustowości (ChIP-seq) jest powszechnie stosowany do określania lokalizacji genomowej białek, które oddziałują z chromatyną. Jednak sekwencja ChIP jest utrudniona przez stosunkowo niską rozdzielczość mapowania wynoszącą kilkaset par zasad i wysoki sygnał tła. Metoda ChIP-exo to udoskonalona wersja ChIP-seq, która znacznie poprawia zarówno rozdzielczość, jak i szum. Kluczową różnicą w metodologii ChIP-exo jest włączenie trawienia egzonukleazą lambda do procesu przygotowania biblioteki, aby skutecznie śladować lewą i prawą granicę 5' DNA w miejscu usieciowania białko-DNA. Biblioteki ChIP-exo są następnie poddawane sekwencjonowaniu o wysokiej przepustowości. Uzyskane dane można wykorzystać do zapewnienia unikalnych i ultrawysokiej rozdzielczości wglądów w funkcjonalną organizację genomu. W tym miejscu opisujemy metodę ChIP-exo, którą zoptymalizowaliśmy i usprawniliśmy dla systemów ssaków i platformy sekwencjonowania przez syntezę nowej generacji.

Poniższe rysunki ilustrują reprezentatywne wyniki z przedstawionego tutaj protokołu ChIP-exo. W przeciwieństwie do tradycyjnych metodologii ChIP-seq z kilkoma etapami enzymatycznymi, ChIP-exo wymaga jedenastu sekwencyjnie zależnych reakcji enzymatycznych (ryc. 1). W związku z tym na każdym etapie należy zachować ostrożność, aby upewnić się, że każdy składnik reakcji jest dodawany do odpowiedniej wzorcowej mieszaniny reakcji. Zalecamy wygenerowanie arkusza kalkulacyjnego z...

Tutaj prezentujemy protokół pozwalający osiągnąć rozdzielczość oddziaływań białko-DNA w pobliżu par zasad. Uzyskuje się to poprzez traktowanie egzonukleazą fragmentów DNA selektywnie wzbogaconych przez immunoprecypitację chromatyny (ChIP-exo), a następnie sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości.

Metoda ChIP-exo: identyfikacja interakcji białko-DNA z precyzją bliską par zasad

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is an indispensable tool in the fields of epigenetics and gene regulation that isolates specific protein-DNA ...

Ogólnym celem tej funkcjonalnej technologii genomowej jest zidentyfikowanie dokładnych lokalizacji genomowych, które dane białko zajmuje w żywych komórkach. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie regulacji genów i epigenetyki, takie jak sposób, w jaki maszyneria transkrypcyjna składa się i działa w kontekście chromatyny. Główną zaletą tej techniki jest to, że ujawnia ona dokładną lokalizację genomową interakcji DNA białek w rozdzielczości wstępnej bliskiej podstawie przy wyjątkowo niskim tle.Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ protokół jest złożony i wymaga dbałości o szczegóły przez cały czas. Aby sonikować lizaty jądrowe, zacznij od umieszczenia adapterów żywicy w 15-mililitrowych rurkach polistyrenowych zawierających ekstrakty jądrowe. Sonikuj lizaty w lodowatej kąpieli wodnej o średniej mocy przez 30 sekund włączenia i 30 sekund przerwy, w sumie dwie 15-minutowe sesje.Aby sprawdzić wyniki sonikacji, przenieś dwie próbki o pojemności 10 mikrolitrów z każdej probówki do probówek o pojemności 1,5 mililitra. Następnie odwróć sieciowanie, łącząc pierwszą 10 mikrolitrów próbki z 10 mikrolitrami TE-RNazy A i 0,2 mikrolitra proteinazy K. Inkubuj probówkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie dodaj cztery mikrolitry 6-krotnego ksylenowego barwnika DNA.Do drugiej próbki o wielkości 10 mikrolitrów zachowaj wiązania krzyżowe, dodając dwa mikrolitry 6-krotnego ksylenowego barwnika DNA. Obie próbki należy umieścić w 1,5% żelu agarozowym o napięciu 140 woltów przez około 30 do 45 minut, aż barwnik bromofenolowy w tym ostatnim znajdzie się w trzech czwartych w dół żelu. Jeśli sonikacja się powiodła, przenieś sonikowane lizaty do dwóch mililitrowych probówek zawierających 150 mikrolitrów 10% Triton X-100 i wiruj do wymieszania.Rozpylić nierozpuszczalną chromatynę i zanieczyszczenia, obracając sonikowane lizaty pod ciśnieniem 20 000 razy g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie przenieś supernatanty do nowych dwumililitrowych probówek. Przechowuj próbki w temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza przez czas nieokreślony.Dla każdej immunoprecypitacji chromatyny lub reakcji ChIP połącz 1,5 mililitra sonikowanych ekstraktów z koniugatami kulek przeciwciał w 1,5 mililitrowych probówkach. Inkubuj probówki na mini rotatorze rurkowym z prędkością dziewięciu w czterech stopniach Celsjusza przez noc. Po kilku minutach sprawdź, czy próbki nie przeciekają i prawidłowo się mieszają.Następnego dnia bardzo krótko odkręć rurki, aby zebrać płyn do nakrętek i umieść probówki na stojaku magnetycznym na jedną minutę. Następnie odessać ekstrakt. Dodaj 0,75 mililitra buforu RIPA do każdej probówki.Następnie wyjmij probówki ze stojaka magnetycznego i odwróć je kilka razy, aby wymieszać. Po krótkim zawirowaniu umieść rurki z powrotem na magnesie i odessaj supernatant. Po ostatnim praniu dodaj 0,75 mililitra 10-milimolowego Tris HCL do każdej probówki.Wyjmij probówki ze stojaka magnetycznego i kilkakrotnie odwróć próbki, aby je wymieszać. Po krótkim zawirowaniu umieść probówki z powrotem na stojaku i odessaj supernatant. Po przeprowadzeniu reakcji polerowania i detalowania zgodnie z protokołem tekstowym, należy wypełnić obliczenia mieszanki głównej ligacji.Następnie przygotuj mieszankę do podwiązywania w 1,5 mililitrowej probówce na lodzie i odpipetuj do wymieszania roztworu. Z probówkami na próbki na stojaku magnetycznym, dodaj 48 mikrolitrów głównej mieszanki ligacyjnej P7 i dwa mikrolitry o innym indeksie adaptera do każdej z żywic próbki. Próbki należy inkubować w mieszalniku ThermoMixer w temperaturze trzykrotności g w 25 stopniach Celsjusza przez dwie godziny.Po umyciu próbek i przeprowadzeniu reakcji naprawy nacięć i kinazy Phy 29 zgodnie z protokołem tekstowym, wypełnij obliczenia głównej mieszanki egzonukleazy lambda i przygotuj mieszankę egzonukleazy lambda w 1,5-mililitrowej probówce na lodzie. Dodaj 50 mikrolitrów mieszanki egzonukleazy lambda do każdej próbki żywicy, gdy nadal znajduje się na stojaku magnetycznym. Następnie inkubować próbki w mieszalniku ThermoMixer w temperaturze trzykrotności g w 37 stopniach Celsjusza przez 30 minut.Po zaessaniu ostatniego płukania zgodnie z opisem w protokole tekstowym, należy przeprowadzić reakcję nukleazy RecJf, wypełniając obliczenia głównej mieszanki RecJf i wykonując mieszaninę RecJf na lodzie. Dodaj 50 mikrolitrów mieszanki RecJf do każdej próbki żywicy na stojaku magnetycznym. Następnie inkubować próbki w mieszalniku ThermoMixer w temperaturze trzykrotności g w 37 stopniach Celsjusza przez 30 minut.Po odessaniu ostatniego przemywania należy przygotować bufor elucyjny ChIP i główną mieszankę proteinazy K i dodać 200 mikrolitrów roztworu do każdej próbki żywicy. Inkubować próbki w mieszalniku ThermoMixer w temperaturze trzykrotności g w 65 stopniach Celsjusza przez noc pod podgrzewaną pokrywką, aby zapobiec kondensacji. Następnego dnia krótko odkręć próbki i umieść probówki na stojaku magnetycznym na jedną minutę.Następnie przenieś 200 mikrolitrów supernatantu do nowej 1,5 mililitrowej probówki zawierającej 200 mikrolitrów buforu TE. Po ekstrakcji DNA, pierwotnym rozszerzeniu P7 i reakcjach ATL, wypełnij obliczenia głównego miksu w tabeli ligacji adaptera P5 i wykonaj główną mieszankę ligacji na lodzie. Dodać 20 mikrolitrów mieszanki do ligacji do każdej próbki i odpipetować do wymieszania.Następnie inkubuj próbki w termocyklerze w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Przeprowadzić oczyszczanie i kwantyfikację DNA zgodnie z protokołem tekstowym. Jak pokazano tutaj, warto poświęcić czas na optymalizację warunków sonikacji, aby uzyskać wysokiej jakości ekstrakty chromatyny, które dają fragmenty DNA o długości od 100 do 500 par zasad.Test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej służy do sprawdzenia, czy sonikowane ekstrakty zawierają nienaruszone wiązania krzyżowe DNA białek, widoczne jako super przesunięcie fragmentów DNA. Aby ocenić sygnał tła, rutynowo wykonuje się próbny ChIP bez przeciwciał w reakcji. Wysokiej jakości egzobiblioteka ChIP zapewni bardzo mało tła w próbce próbnej w porównaniu z przygotowaniem biblioteki ChIP-seq.Poniżej przedstawiono ocenę biblioteki ChIP-exo za pomocą bioanalizatora. Analiza dokładnie zapewnia rozkład rozmiaru biblioteki i wykrywa zanieczyszczające dimery adaptera, które działają przy 125 parach podstawowych. Panel ten ilustruje płynny rozkład oddzielonego od nici znacznika ChIP-exo pięciu pierwszych N dla polimerazy II, TFIIB i TBP w ludzkim genie RPS12 w proliferujących komórkach K562.Na tym rysunku pokazano średnie wzorce ChIP-exo w stosunku do transkrypcyjnych miejsc startowych genów kodujących białka. Główne lokalizacje pików TBP, TFIIB i polimerazy II na wykresie złożonym odzwierciedlają organizację genomu ludzkich kompleksów inicjujących transkrypcję. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu czterech dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się regulacją genów do zbadania szczegółów molekularnych struktury subjądrowej w asymetrii drożdży. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak profilowanie ekspresji RNazy, aby odpowiedzieć na pytania, takie jak to, czy dany czynnik wpływa na ekspresję pobliskiego genu. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o starannym wypełnieniu tabel mieszania wzorcowego dla wszystkich etapów enzymatycznych.Nie zapominaj, że praca z czynnikami rakotwórczymi i innymi środkami może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie środków ochrony osobistej. Po tym obejrzeniu filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować wysokiej jakości bibliotekę ChIP-exo.

the-chip-exo-method-identifying-protein-dna-interactions-with-near

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Analiza oddziaływań chromatyny za pomocą sekwencjonowania parowanych końców (ChIA-PET) jest metodą detekcji oddziaływań chromatyny de novo, służącą lepszemu zrozumieniu kontroli transkrypcyjnej.

Analiza oddziaływań chromatyny z sekwencjonowaniem parowanych końców (ChIA-PET) w celu mapowania oddziaływań chromatyny i zrozumienia regulacji transkrypcji

W tym filmie demonstrujemy technikę immunoprecypitacji chromatyny w celu identyfikacji miejsc wiązania białek w określonych regionach genomowego DNA komórek prekursorowych oligodendrocytów poprzez selektywną immunoprecypitację fragmentów chromatyny związanych z białkiem. Metoda ta pomaga badać interakcje kilku białek regulatorowych, w tym czynników transkrypcyjnych zaangażowanych w regulację genów.

Immunoprecypitacja chromatyny w celu identyfikacji docelowych miejsc wiązania białek w genomowym DNA

Łącząc natywną i sieciującą immunoprecypitację chromatyny ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości, podejście ChroP umożliwia analizę złożonej architektury proteomicznej modyfikacji histonów, wariantów i białek niehistonicznych synergizujących się w funkcjonalnie odrębnych domenach chromatyny.

Podejście ChroP łączy ChIP i spektrometrię mas w celu zbadania specyficznych dla locus krajobrazów proteomicznych chromatyny

Ten artykuł wideo opisuje metodę opartą na mikromacierzy in vitro, która pozwala określić cele genów i miejsca wiązania dla regulatorów odpowiedzi systemu dwuskładnikowego.

Metoda DAP-chip oczyszczona z powinowactwa DNA do określania celów genowych dla dwuskładnikowych systemów regulacyjnych bakteryjnych

Sekwencyjna ekstrakcja soli białek związanych z chromatyną jest użytecznym narzędziem do określania właściwości wiązania dużych kompleksów białkowych. Metoda ta może być stosowana do oceny roli poszczególnych podjednostek lub domen w ogólnym powinowactwie kompleksu białkowego do chromatyny masowej.

Sekwencyjne ekstrakcje soli do analizy właściwości wiązania chromatyny luzem przez kompleksy modyfikujące chromatynę

Opisujemy endogenne rozszczepienie chromatyny połączone z sekwencjonowaniem wysokoprzepustowym (ChEC-seq), ortogonalną metodą immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) do mapowania miejsc wiązania białek w całym genomie za pomocą białek fuzyjnych nukleazy mikrokokowej (MNazy).

Mapowanie całego genomu interakcji białko-DNA z sekwencją ChEC u Saccharomyces cerevisiae

Precyzyjne określenie miejsc wiązania białek w całym genomie jest ważne dla zrozumienia regulacji genów. W tym miejscu opisujemy metodę mapowania genomu, która traktuje DNA immunoprecypitowane chromatyną za pomocą trawienia egzonukleazą (ChIP-exo), a następnie sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Metoda ta wykrywa interakcje białko-DNA z rozdzielczością mapowania par zasad bliską i wysokim stosunkiem sygnału do szumu w neuronach ssaków.

Mapowanie w wysokiej rozdzielczości interakcji białko-DNA w neuronach pochodzących z mysich komórek macierzystych przy użyciu immunoprecypitacji chromatyny i egzonukleazy (ChIP-Exo)

Ten artykuł przedstawia podstawowe etapy immunobarwienia i immunoprecypitacji chromatyny. Protokoły te są powszechnie stosowane do badania procesów komórkowych związanych z uszkodzeniem DNA oraz do wizualizacji i ilościowego określenia rekrutacji białek zaangażowanych w naprawę DNA.

Wizualizacja i ilościowe określanie uszkodzeń DNA specyficznych dla miejsca na podstawie endonukleazy

Interakcja zależnego od ATP czynnika remodelującego chromatynę z ligandem DNA jest opisana za pomocą spektroskopii CD. Indukowane zmiany konformacyjne na promotorze genu analizowane przez wygenerowane piki można wykorzystać do zrozumienia mechanizmu regulacji transkrypcji.

Spektroskopia CD do badania interakcji DNA-białko

CUT&amp;RUN i jego warianty mogą być używane do określania obecności białek na chromatynie. Protokół ten opisuje, w jaki sposób określić lokalizację białka na chromatynie za pomocą jednokomórkowego uliCUT&amp;RUN.

Lokalizacja czynnika jednokomórkowego na chromatynie przy użyciu ultra-niskiego rozszczepienia wejściowego pod celami i uwalniania za pomocą nukleazy

Metoda ChIRP oparta na UV do identyfikacji bezpośrednich interakcji lncRNA-białko.

Metoda ChIRP oparta na UV do zweryfikowanej identyfikacji białek, które bezpośrednio współpracują z LncRNA: Od hodowanych komórek do jąder mysich

Poznaj metodę ChIP-exo do precyzyjnej identyfikacji interakcji białko-DNA z rozdzielczością bliską par zasad. Technika ta umożliwia badanie regulacji genów i epigenetyki z wyjątkowo niskim poziomem szumów.

Metoda ChIP-exo: identyfikacja interakcji białko-DNA z precyzją bliską par zasad

Przeglądaj więcej filmów