Obrazowanie na żywo w celu zbadania dynamicznej niestabilności mikrotubul w raku piersi opornym na taksany

Ogólnym celem tego eksperymentu jest pomiar dynamicznej niestabilności mikrotubul w komórkach raka piersi opornych na docetaksel. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii komórki dotyczące dynamicznej niestabilności mikrotubul w warunkach fizjologicznych i po różnych terapiach farmakologicznych. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że zapewnia prosty, niezawodny i fizjologicznie możliwy do zastosowania protokół do badania dynamiki mikrotubul w żywych komórkach.

Przed rozpoczęciem zabiegu należy wyhodować komórki raka piersi w kompletnej pożywce hodowlanej w 10-centymetrowych szalkach hodowlanych w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla do odpowiedniego stopnia zrębowości. Dzień przed eksperymentem spłucz 24-milimetrowe szkiełka nakrywkowe pokryte poli L-lizyną 70% alkoholem i wystawij szkiełka na działanie światła UV przez noc. Następnego ranka umieść po jednym szkiełku przykrywkowym w każdym dołku sześciodołkowej płytki.

Następnie umyj kultury PBS i odłącz komórki w każdym naczyniu za pomocą 0,5 mililitra trypsyny EDTA. Gdy komórki zaczną podnosić się z dna płytki, zneutralizuj trypsynę pięcioma mililitrami świeżej pożywki hodowlanej i policz komórki. Następnie dodać około 10 razy 10 piątych komórek do każdego szkiełka nakrywkowego, delikatnie wstrząsnąć płytką i umieścić komórki z powrotem w inkubatorze na co najmniej 36 godzin.

Aby oznaczyć dynamikę mikrotubul komórek, należy kilkakrotnie wymieszać roztwór podstawowy tubuliny alfa oznaczony przez GFP przez inwersję, aby zapewnić jednorodny roztwór bez wirowania. Następnie zastąp pożywkę hodowlaną w każdym dołku dwoma mililitrami świeżej pożywki zawierającej 40 mikrolitrów tubuliny znacznikowej. Delikatnie wstrząsnąć płytką, aby umożliwić całkowite wymieszanie markera z pożywką hodowlaną i umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze na kolejne 24 godziny.

Następnego dnia należy zastąpić pożywkę hodowlaną świeżą pożywką zawierającą docetaksel i umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze na 30 minut. Podczas hamowania komórek włącz odwrócony mikroskop fluorescencyjny i podgrzej uchwyt próbki do 37 stopni Celsjusza. Następnie wybierz soczewkę obiektywu olejowego 60X 1,42 NA i zamontuj pierwsze szkiełko nakrywkowe na uchwycie próbki.

Przykryj próbkę jednym mililitrem świeżej pożywki zawierającej docetaksel o temperaturze 37 stopni Celsjusza i zlokalizuj skupisko płaskich komórek wykazujących wysoką intensywność fluorescencji alfa-tubuliny znakowaną GFP z wyraźnie widocznymi strukturami mikrotubul. Ustaw ostrość na obszarze peryferyjnym jednej z komórek w klastrze i ustaw odpowiedni czas ekspozycji w częstotliwości akwizycji obrazu. Dokładnie 50 minut po dodaniu pierwszej porcji docetakselu rozpocznij rejestrację dynamiki mikrotubul przez dwie minuty, uzyskując zdjęcie co dwie sekundy.

Po uzyskaniu wszystkich obrazów, zobrazuj następną komórkę, jak właśnie pokazano, aż zostaną uchwycone obrazy dla pięciu komórek ze wszystkich trzech dołków o każdym stężeniu docetakselu. Gdy wszystkie obrazy zostaną uzyskane dla każdego stężenia inhibitora, otwórz program dekonwolucji w systemie mikroskopu i kliknij proces. Następnie wybierz opcję deconvolve i przeciągnij plik obrazu do okna wprowadzania.

Kliknij przycisk Do (Do ) aby zdekonwolucjonizować obraz i otwórz plik z obrazem w oprogramowaniu mikroskopu. Kliknij plik i zapisz jako film. Ustaw format filmu jako AV, a styl animacji jako przewinienie.

Ustaw jakość kompresji na 100%, a liczbę klatek na sekundę na pięć. Następnie zaznacz pole Animuj w czasie i kliknij zrób to, aby wygenerować wideo. W tym reprezentatywnym eksperymencie normalne i oporne na docetaksel komórki raka piersi traktowano docetakselem i obrazowano tak, jak właśnie wykazano, ale wpływ leczenia na wzrost i skracanie mikrotubul jest najbardziej widoczny w komórkach nieopornych na docetaksel.

Rzeczywiście, pomiar tempa wzrostu i skracania mikrotubul w warunkach leczenia docetakselem 0,5 mikromolowym ujawnia silne hamowanie dynamiki tubuliny w komórkach rodzicielskich, ale nie opornych na docetaksel. Po opanowaniu cały proces można zakończyć w ciągu 60 godzin, jeśli techniki są wykonywane prawidłowo. Podejmując tę procedurę, należy pamiętać o wybraniu płaskich komórek o wysokiej intensywności fluorescencji tubuliny GFP oraz o zmniejszeniu zarówno intensywności fluorescencji wzbudzenia, jak i czasu ekspozycji, aby uniknąć blaknięcia fluorescencji GFP.

Od momentu opracowania, technika ta utorowała drogę naukowcom z dziedziny biologii komórek i nowotworów do oceny wpływu różnych środków celujących w mikrotubule na normalne i nowotworowe komórki. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak mierzyć dynamiczną niestabilność mikrotubul w żywych komórkach w różnych warunkach.