Tworzenie proliferacyjnych komórek tetraploidalnych z nietransformowanych ludzkich fibroblastów

Ogólnym celem tej procedury jest ustanowienie proliferacyjnych komórek tetraploidalnych, wolnych od populacji diploidalnej, z normalnych ludzkich fibroblastów. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad kancerogenezą, takie jak to, w jaki sposób komórki aneuploidalne rozwijają się we wczesnych stadiach kancerogenezy. Główną zaletą tej techniki jest to, że proliferacyjne komórki tetraploidalne, wolne od populacji diploidalnej, można ustalić za pomocą stosunkowo prostych procedur.

Podczas gdy niektóre szczepy stają się całkowicie tetraploidalne przez proste leczenie trucizną wrzecionową, demekolcyną, większość z nich musi być obsługiwana metodą strząsania podczas tego zabiegu, aby naśladować populację diploidalną. Aby rozpocząć indukcję tetraploidii bez metody wstrząsania, należy przejść około pięć razy 10 do 1/5 hodowanych komórek do 100-milimetrowego naczynia. Inkubuj danie w atmosferze 5% dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny.

Następnie potraktuj wykładniczo rosnące komórki pożywką zawierającą 0,1 mikrograma na mililitr DC. Inkubuj w atmosferze 5% dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery dni. Następnie zastąp pożywkę zawierającą prąd stały pożywką wolną od leków. Inkubować w 5% dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż do wznowienia proliferacji.

Aby wywołać tetraploidię metodą wytrząsania, należy przenieść wyhodowane komórki do kolb T-75, upewniając się, że każda kolba zawiera co najmniej jeden razy 10 do 1/6 komórek. Kolby inkubować w atmosferze 5% dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Następnego dnia potraktuj komórki pożywką zawierającą prąd stały przez 16 do 18 godzin, aby zatrzymać je w mitozie, jak opisano w protokole tekstowym.

Po inkubacji sprawdzić komórki w kolbie pod mikroskopem kontrastowym z odwróconymi fazami. A następnie delikatnie potrząśnij każdą kolbą, aby rozpocząć zbieranie luźno przylegających komórek mitotycznych. Należy unikać nieostrożnego obchodzenia się z kolbą, takiego jak gwałtowne potrząsanie lub dotykanie powierzchni kolby końcówką pipety.

Nie zanieczyszczaj komórek mitotycznych przylegającymi komórkami interfejsu. Delikatnie umyć kolby ciepłym medium i przenieść komórki do probówek wirówkowych. Wykorzystaj licznik komórek atomowych, aby policzyć liczbę komórek.

Po zliczeniu komórek odwirować w temperaturze 300 razy g przez pięć minut. Ponownie zasiej zebrane komórki mitotyczne do 16-milimetrowych szalek hodowlanych. Następnie potraktuj posiane komórki pożywką zawierającą 0,1 mikrograma na mililitr DC. Inkubuj w 5% dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy dni.

Następnie zastąp pożywkę zawierającą prąd stały pożywką wolną od leków. Inkubować w atmosferze 5% dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż do wznowienia proliferacji. W celu analizy ploidalności DNA należy przemyć komórki PBS.

Następnie dodaj do komórek roztwór zawierający 0,05% trypsyny i 0,02% EDTA. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie przenieś zawiesinę komórkową do probówki wirówkowej.

I zneutralizuj trypsynę, dodając pożywkę zawierającą 10% płodowej surowicy bydlęcej. Odwirować komórki w pożywce w temperaturze 300 razy g przez pięć minut. Ponownie zawieś komórki w pięciu mililitrach PBS.

Następnie ponownie odwirować w temperaturze 300 razy g przez pięć minut. Następnie ponownie zawieś komórki w jednym mililitrze PBS. Dodaj kroplami cztery mililitry 100% etanolu z mieszaniem.

Pozostaw zawiesinę w temperaturze pokojowej na 30 minut, aby utrwalić komórki. Następnie odwirować komórki w roztworze utrwalającym 300 razy g przez pięć minut. I ponownie zawieś ogniwa w pięciu mililitrach PBS.

Odwirować zawiesinę w ilości 300 g przez pięć minut. Następnie potraktuj komórki 475 mikrolitrami 0,5 miligrama na mililitr roztworu RNA. Dodaj 25 mikrolitrów jednego miligrama na mililitr roztworu jodu propidyny, aby zabarwić komórki.

A potem wymieszaj. Pozostawić zawiesinę do odpoczynku w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie użyj cytometru przepływowego z laserem 488 nm i filtrem emisyjnym z czerwonym kanałem, aby przeanalizować zawartość DNA w komórkach.

Przeanalizuj również próbkę referencyjną przygotowaną z prawdziwych komórek diploidalnych, aby ocenić ploidalność komórek docelowych. Na początek potraktuj wykładniczo rosnące komórki pożywką zawierającą 0,1 mikrograma na mililitr prądu stałego przez cztery godziny, aby zatrzymać komórki w metafazie. Następnie zbierz co najmniej pięć razy 10 do 1/5 komórek przez trypsynizację.

Zawiesić pobrane komórki na pożywce zawierającej FBS. Odwirować zawiesinę w ilości 300 g przez pięć minut. Następnie dodaj pięć mililitrów 0,075 molowego roztworu chlorku potasu.

Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Po zakończeniu inkubacji odwirować zawiesinę o stężeniu 300 razy g przez pięć minut. Ponownie zawiesić komórki w pięciu mililitrach utrwalacza Carnoya.

A następnie odwirować zawiesinę w ilości 300 razy g przez pięć minut. Następnie odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 0,5 mililitra utrwalacza Carnoya. Upuść 30 mikrolitrów zawiesiny ogniw na szklane szkiełko.

Na koniec wybarwić i przeanalizować komórki za pomocą liczby chromosomów lub analizy kariotypu. W tym badaniu proliferacyjne komórki tetraploidalne, wolne od populacji diploidalnej, są hodowane z normalnych ludzkich fibroblastów. Chociaż niektóre szczepy komórkowe mogą stać się całkowicie tetraploidalne w wyniku ciągłego leczenia DC, większość komórek musi być traktowana metodą wstrząsania w trakcie leczenia DC w celu wyeliminowania populacji diploidalnej.

Reprezentatywne wyniki indukcji tetraploidii w trzech szczepach fibroblastów przedstawiono tutaj. Szczep TIG-1 staje się prawie całkowicie tetraploidalny poprzez proste, ciągłe leczenie prądem stałym. Jednak to leczenie powoduje, że szczepy BJ i TIG-hT stają się mieszaniną populacji diploidalnych i czworonogów. Dlatego podczas procesu leczenia konieczna jest izolacja komórek mitotycznych metodą wytrząsania.

W ustalonych komórkach tetraploidalnych przeprowadza się zliczanie chromosomów. Jak widać, modalna liczba chromosomów wynosi 92 zarówno dla komórek TIG-1, jak i BJ oraz 91 dla komórek TIG-hT. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch tygodni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o delikatnym potrząśnięciu kolbami na etapie strząsania, aby nie spowodować zanieczyszczenia komórek mitotycznych przez przylegające komórki interfejsu.