Inżynieria rozpoznawania molekularnego za pomocą polimerów biomimetycznych na jednościennych nanorurkach węglowych

Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie fluorescencyjnych jednościennych nanorurek węglowych w bliskiej podczerwieni do detekcji molekularnej, które zostały sfunkcjonalizowane przy użyciu polimerów biomimetycznych. Te nanoczujniki mogą umożliwić obrazowanie z rozdzielczością czasową w żywej tkance. Na przykład mogą być używane do wykrywania dopaminy w mózgu.

Główną zaletą tych czujników jest ich nieodłączna fluorescencja w bliskiej podczerwieni, która umożliwia obrazowanie w głębszych warstwach. Czujniki syntetyczne umożliwiają wykrywanie cząsteczek bez naturalnych elementów rozpoznawania molekularnego, co sprawia, że ta ogólna metoda opracowywania czujników jest szczególnie przydatna do wykrywania małych cząsteczek. Aby przygotować zawiesinę kwasów nukleinowych SWNT, najpierw rozpuść kwasy nukleinowe w 0,1 molowym chlorku sodu do stężenia 100 miligramów na mililitr.

W dygestorium usuń elektryczność statyczną z jednorazowej szpatułki, probówek do mikrowirówek i kolby SWMT za pomocą pistoletu antystatycznego. Następnie dodaj 20 mikrolitrów roztworu kwasu nukleinowego do 980 mikrolitrów 0,1-molowego chlorku sodu. Następnie dodaj 1 miligram przemytych SWNT do powstałego roztworu kwasu nukleinowego przed sonikacją mieszaniny.

Ustawienie końcówki sondy podczas sonikacji ma kluczowe znaczenie. Jeśli wystąpi pienienie, zmień położenie końcówki sondy i spróbuj zmniejszyć amplitudę. Alternatywnie można spróbować impulsów sonikacji lub sonikacji w kąpieli, jeśli zawiesina pozostaje słaba.

Za pomocą ultrasonografu z końcówką o średnicy 3 milimetrów, sonikować roztwór przez 10 minut przy amplitudzie 40% w łaźni lodowej. Odwirować roztwór DNA SWNT dwukrotnie przez 90 minut przy 16, 100 xg. Zebrać i przechowywać supernatant, uważając, aby nie naruszyć osadu zawierającego wiązki i agregaty nanorurek węglowych.

Granulki należy wyrzucić zgodnie z instytucjonalnymi procedurami dotyczącymi odpadów niebezpiecznych, właściwymi dla nanomateriałów. Zmierzyć absorbancję roztworu przy 632 nanometrach za pomocą spektrofotometru UV-vis w celu określenia przybliżonego stężenia zawieszonych SWNT, zgodnie z prawem Lamberta-Beera, oraz odpowiedniego współczynnika rozcieńczenia. W przypadku amfifilowych zawiesin polimerowych należy najpierw usunąć elektryczność statyczną z jednorazowej szpatułki, probówek do mikrowirówek i materiału SWNT.

W dygestorium dodaj pięć miligramów SWNT do pięciu mililitrów 2% roztworu cholanu sodu. Używając ultrasonografu z końcówką o średnicy sześciu milimetrów, sonikuj roztwór przez godzinę przy amplitudzie 40% w łaźni lodowej. Odwirować próbkę o stężeniu 150 000 xg przez cztery godziny za pomocą ultrawirówki, a następnie ostrożnie zebrać supernatant.

Następnie rozpuść 1% masy polimeru amfifilowego w roztworze scSWNT. Następnie dializuj roztwór polimeru scSWNT za pomocą membrany dializacyjnej o mocy 3,5 kilodaltona w jednym litrze dejonizowanej wody lub buforu przez pięć dni. Wymień wodę lub bufor o drugiej godzinie i o czwartej godzinie.

Zmierzyć absorbancję roztworu przy 632 nanometrach za pomocą spektrofotometru UV-Vis w celu określenia przybliżonego stężenia zawieszonych SWNT. Aby przygotować szkiełka podstawowe pokryte biotyną BSA, wyczyść szkiełko mikroskopowe i szkło nakrywkowe o średnicy 0,17 milimetra wodą dejonizowaną, a następnie metanolem, acetonem i na koniec spłucz wodą dejonizowaną. Utwórz kanały, umieszczając kilka kawałków taśmy dwustronnej w odległości około pięciu milimetrów od siebie na czystym szkiełku mikroskopowym.

Uszczelnij kanały, biorąc długą szklaną szkiełko nakrywkowe i dociskając ją do górnej części taśmy dwustronnej. Pamiętaj, aby wyśrodkować go na szkiełku mikroskopowym, tak aby krawędzie szkiełka nakrywkowego i szkiełka nie były zlicowane. Następnie dodaj 100 mikrolitrów roztworu podstawowego BSA-biotyny do 900 mikrolitrów 1x buforu Tris do końcowego stężenia jednego miligrama na mililitr.

Wlać 50 mikrolitrów roztworu BSA-biotyny do kanału, pipetując roztwór na jeden koniec i odprowadzając roztwór na drugim końcu za pomocą chusteczki. Po inkubacji roztworu przez pięć minut wykonaj trzy do pięciu płukań 50 mikrolitrami 0,1-molowego chlorku sodu. Następnie rozcieńczyć 40 mikrolitrów po pięć miligramów na mililitr roztworu podstawowego NAV w 960 mikrolitrach 1x buforu Tris, do końcowego stężenia 0,2 miligrama na mililitr.

Wlać 50 mikrolitrów roztworu NAV do kanału, pipetując roztwór na jeden koniec i odprowadzając roztwór na drugim końcu za pomocą chusteczki. Po inkubacji szkiełka przez dwie do pięciu minut wykonaj od trzech do pięciu płukań 50 mikrolitrami 0,1-molowego chlorku sodu. Następnie rozcieńczyć roztwory podstawowe zawieszonych SWNT i buforu obrazowania do stężenia od 1 do 10 miligramów na litr.

Wlej 50 mikrolitrów tego roztworu do kanału i inkubuj przez pięć minut. Delikatnie spłucz nadmiar SWNT za pomocą 50 mikrolitrów buforu do obrazowania. Aby zmierzyć odwracalną odpowiedź DNA-SWNT GT15 na dopaminę, najpierw zamontuj kanały pokryte czujnikiem na stoliku mikroskopu fluorescencyjnego.

Ustaw ostrość kanałów za pomocą obiektywu olejowego 100X i kamery z arsenku indu i galu. Następnie dodaj 50 mikrolitrów 100 mikromolowego roztworu dopaminy w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami do kanału przepływowego i zarejestruj zmianę intensywności fluorescencji. Wypłukać roztwór dopaminy za pomocą soli fizjologicznej buforowanej fosforanami i obserwować zmianę fluorescencji poszczególnych czujników SWNT.

Aby przeprowadzić badanie przesiewowe płytki studzienkowej pod kątem reakcji analitu biomimetycznych polimerowych SWNT, należy pipetować równe objętości zawieszonego czujnika SWNT do każdej studzienki. Użyj wystarczającej objętości, aby równomiernie pokryć dno studni. Następnie pipetować anality z biblioteki przesiewowej do płytek dołkowych.

Przygotować każdy analit w trzech egzemplarzach, aby uwzględnić potencjalne wahania i wahania intensywności wzbudzenia lub temperatury. Podnieś cel podczas monitorowania widm emisji za pomocą spektrometru i matrycy arsenku indu i galu. Optymalna pozycja obiektywu sprawi, że płaszczyzna ogniskowej znajdzie się mniej więcej w środku objętości próbki w studzience, co powinno odpowiadać maksimum zmierzonej intensywności.

Dla każdej studzienki próbki zapisz ekspozycję od jednej do 10 sekund, aby zebrać widmo. Porównaj widma emisji dla każdej studzienki z kontrolą zawierającą tylko SWNT bez dodatkowego analitu, aby określić ilościowo odpowiedź fluorescencyjną. Widmo absorbancji czujników nanorurek DNA GT15 wykazuje wiele pików odpowiadających dobrze zdyspergowanym nanorurkom węglowym o różnej chiralności.

Pokazano fluorescencję w bliskiej podczerwieni czujników nanorurek DNA GT15. Co ciekawe, intensywność fluorescencji w przybliżeniu podwaja się w odpowiedzi na dopaminę. Na tym rysunku mikroskopia fluorescencyjna w bliskiej podczerwieni ujawnia pojedyncze czujniki nanorurek DNA GT15 unieruchomione na powierzchni szklanego szkiełka nakrywkowego.

Idąc dalej, ważne jest, aby przetestować czujnik pod kątem stosowania in vivo, na przykład rozszerzając bibliotekę analitów o konkurentów molekularnych, badając liniowość odpowiedzi w biologicznie istotnym reżimie stężeń, a także testując odwracalność. Po opanowaniu podejście to można wykorzystać do stworzenia biblioteki różnych syntetycznych czujników z cząsteczek bez znanych elementów rozpoznawania molekularnego.