Name: Inżynieria rozpoznawania molekularnego za pomocą polimerów biomimetycznych na jednościennych nanorurkach węglowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Poznaj inżynierię nanoczujników fluorescencyjnych z wykorzystaniem jednościennych nanorurek węglowych funkcjonalizowanych polimerami biomimetycznymi. Ta metoda umożliwia wykrywanie dopaminy w tkankach żywych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Burroughs Wellcome Fund Career Award at the Scientific Interface (CASI), grant Fundacji Simonsa oraz grant dla młodych badaczy Fundacji Brain and Behavior Research.

Uwaga: Przed użyciem proszę zapoznać się ze wszystkimi odpowiednimi kartami charakterystyki substancji niebezpiecznej (SDS). Nanomateriały mogą stwarzać dodatkowe zagrożenia w porównaniu z ich odpowiednikami produkowanymi w materiałach sypkich. Stosuj wszystkie odpowiednie praktyki bezpieczeństwa, w tym kontrole inżynieryjne (wyciąg, osłona akustyczna) i środki ochrony osobistej (okulary ochronne, gogle, fartuch laboratoryjny, długie spodnie, buty z zakrytymi palcami).
1. Przygotowanie roztworów, środków powierzchniowo czynnych i polimerów
<ol>
	<li>Przygotowanie 100 mM roztworu NaCl
	<ol>
		<li>Rozpuść 584 mg NaCl w 80 ml wody dejonizowanej. Dodaj wodę dejonizowaną, aby uzyskać całkowitą objętość do 100 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie 3% roztworu dodecylosiarczanu sodu (SDS)
	<ol>
		<li>Rozpuść 3 g SDS w 80 ml wody dejonizowanej. Dodaj wodę dejonizowaną, aby uzyskać całkowitą objętość do 100 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie 2% roztworu cholanu sodu (SC)
	<ol>
		<li>Rozpuść 2 g wodzianu cholanu sodu w 80 ml wody dejonizowanej. Dodaj wodę dejonizowaną, aby uzyskać całkowitą objętość do 100 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie bufora obrazowania (1x Tris: 20 mM Tris, 100 mM NaCl)
	<ol>
		<li>Rozpuść 22,23 g zasady Tris i 58,44 g NaCl w 500 ml wody dejonizowanej za pomocą mieszadła magnetycznego i płytki.</li>
		<li>Ostrożnie dodawać skoncentrowany HCl, aż do osiągnięcia pH 8,1.</li>
		<li>Dodaj wodę dejonizowaną, aby osiągnąć końcową objętość 1 l.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Synteza polimeru RITC-PEG-RITC
	<ol>
		<li>Rozpuścić difunkcjonalizowany aminy glikol polietylenowy (PEG) (5 kDa lub 20 kDa, 0,1 mol/l) i izotiocyjanian rodaminy (RITC, 0,2 mol/l) w 1 ml mieszaniny dichlorometanu i dimetyloformamidu (DMF) w stosunku 1:1.</li>
		<li>Dodać 0,2 mol/l N,N-diizopropyloetyloaminy (DIEA).</li>
		<li>Po 3 godzinach wytrącić osad z 10-krotną objętością eteru dietylowego, a następnie przeprowadzić filtrację próżniową.</li>
		<li>Ponownie rozpuścić w DMF i powtórzyć wytrącanie eteru, a następnie filtrację próżniową. 
		UWAGA: Inne cząsteczki modyfikowane izotiocyjanianami (np. izotiocyjanian fluoresceiny, FITC) mogą być przyłączane do PEG lub innych polimerów modyfikowanych aminami przy użyciu podobnej metody.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Otrzymywanie pegylowanego DNA (PEG-DNA)
	<ol>
		<li>Połączyć 100 μl roztworu chlorowodorku tris(2-karboksyetylo)fosfiny (TCEP) (0,5 M, pH 7,0) z 44,9 μl DNA modyfikowanego 5'-tiolem (1 mg/10 μl w 0,1 M NaCl) i dodać do 4,855 ml wody dejonizowanej.</li>
		<li>Mieszaj przez 1 godzinę.</li>
		<li>Rozpuścić 500 mg maleimidu glikolu metoksypolietylenowego w 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem.</li>
		<li>Połącz roztwory DNA i PEG (łącznie 10 ml) i mieszaj przez 24 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie jednościennych zawiesin z nanorurek węglowych (SWNT)
<ol>
	<li>Przemycie SWNT w celu usunięcia katalizatora i zanieczyszczeń.
	<ol>
		<li>Dodaj 200-300 mg niemytych SWNT do plastikowej probówki wirówkowej zawierającej 45 ml wody dejonizowanej.</li>
		<li>Wirować roztwór przez 2 minuty i sonikować za pomocą sonikatora kąpielowego przez 5 minut. Należy pamiętać, że ustawienia sonikatora różnią się w zależności od instrumentu, więc sprawdź, czy gęstość optyczna roztworu SWNT wzrasta (tj. zmienia kolor na), aby upewnić się, że SWNT są rozproszone.</li>
		<li>Odwirowywać roztwór przez 20 minut przy 16 100 x g i odrzucić supernatant.</li>
		<li>Dodaj około 45 ml świeżej wody dejonizowanej.</li>
		<li>Powtórz kroki 2.1.2-2.1.4 do 8 razy.</li>
		<li>Usuń jak najwięcej wody, uważając, aby nie przeszkadzać granulowanym SWNT i pozwól granulkom SWNT wyschnąć na powietrzu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zawiesiny kwasów nukleinowych SWNT
	<ol>
		<li>Rozpuścić kwasy nukleinowe (NA) w 0,1 M NaCl do stężenia 100 mg/ml.</li>
		<li>Usuń elektryczność statyczną z jednorazowej szpatułki, probówek do mikrowirówek i materiału SWNT za pomocą pistoletu antystatycznego. W dygestorium dodać 20 μl roztworu NA do 980 μl 0,1 M NaCl, a następnie dodać 1 mg SWNT.</li>
		<li>Za pomocą ultrasonografu z końcówką o średnicy 3 mm należy sonikować roztwór przez 10 minut przy 40% amplitudzie w łaźni lodowej.</li>
		<li>Odwirować roztwór DNA-SWNT DWUKROTNIE przez 90 minut przy 16 100 x g. W przypadku stosowania PEG-DNA należy oczyścić nadmiar i nieprzereagowane DNA oraz PEG za pomocą filtra spinowego o sile 100 kDa. Dodaj tyle PBS, aby napełnić filtr wirowy i wirować z prędkością 9 300 x g przez 1,5 minuty, powtórz ten krok prania 3 razy.</li>
		<li>Zebrać i przechowywać supernatant, uważając, aby nie naruszyć osadu zawierającego wiązki CNT i agregaty. Granulki należy wyrzucić zgodnie z instytucjonalnymi procedurami dotyczącymi odpadów niebezpiecznych, właściwymi dla nanomateriałów.</li>
		<li>Zmierzyć absorbancję roztworu przy 632 nm za pomocą spektrofotometru UV/Vis w celu określenia przybliżonego stężenia zawieszonych SWNT przy użyciu ε=0,036 L/cm·mg zgodnie z prawem Lamberta-Beera i odpowiednim współczynnikiem rozcieńczenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Amfifilowe zawiesiny polimerowe SWNT
	<ol>
		<li>Usuń elektryczność statyczną z jednorazowej szpatułki, mikroprobówek wirówkowych i zapasów SWNT. W dygestorium dodać 5 mg SWNT do 5 ml 2% roztworu SC (alternatywnie można użyć roztworu SDS).</li>
		<li>Za pomocą ultrasonografu z końcówką o średnicy 6 mm sonikować roztwór przez 1 godzinę przy amplitudzie 40% w łaźni lodowej.</li>
		<li>Odwirować próbkę o masie 150 000 x g przez 4 godziny za pomocą ultrawirówki i ostrożnie zebrać supernatant.</li>
		<li>Rozpuścić 1% wag. polimeru amfifilowego (np. RITC-PEG-RITC) w roztworze SC-SWNT.</li>
		<li>Roztwór polimeru SC-SWNT należy dializować za pomocą membrany dializacyjnej o sile 3,5 kDa w stosunku do 1 litra wody dejonizowanej lub buforu przez 5 dni. Wymień wodę lub bufor po godzinie 2 i godzinie 4. Można zastosować większą membranę do dializy, o ile pozwala ona na usunięcie wybranego środka powierzchniowo czynnego, ale zachowanie zarówno SWNT, jak i polimeru amfifilowego.</li>
		<li>Zmierzyć absorbancję roztworu przy 632 nm za pomocą spektrofotometru UV/Vis w celu określenia przybliżonego stężenia zawieszonych SWNT przy użyciu ε=0,036 l/cm*mg zgodnie z prawem Lamberta-Beera i odpowiednim współczynnikiem rozcieńczenia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie powierzchniowo unieruchomionych czujników SWNT
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworów podstawowych BSA-biotyny i NeutrAwidyny
	<ol>
		<li>Rozpuścić 10 mg liofilizowanej biotyny BSA w 1 ml wody dejonizowanej do sporządzenia roztworu podstawowego o stężeniu 10 mg/ml i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Rozpuścić 10 mg białka neutrawidyny (NAV, deglikozylowane białko awidyny) w 2 ml wody dejonizowanej, aby uzyskać roztwór podstawowy o stężeniu 5 mg/ml. Podwielokrotności należy przechowywać w temperaturze -20 °C. Rozmrożone porcje można przechowywać przez kilka dni w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie szkiełek mikroskopowych pokrytych BSA-Biotyną
	<ol>
		<li>Wyczyść szkiełko mikroskopowe i szkło nakrywkowe o średnicy 0,17 mm (lub odpowiednio do obiektywu mikroskopu) wodą dejonizowaną, a następnie metanolem, acetonem i ostatnim płukaniem wodą dejonizowaną.</li>
		<li>Utwórz kanały, umieszczając kilka kawałków taśmy dwustronnej w odległości około 5 mm od siebie na czystym szkiełku mikroskopowym. Uszczelnij kanały, biorąc długie szklane szkiełko nakrywkowe i dociskając je do górnej części taśmy dwustronnej. Upewnij się, że jest wyśrodkowany na szkiełku mikroskopu, tak aby krawędzie szkiełka nakrywkowego i szkiełka nie były zlicowane.</li>
		<li>Dodać 100 μl roztworu podstawowego BSA-Biotyny do 900 μl 1x buforu Tris do końcowego stężenia 1 mg/ml.</li>
		<li>Wlać 50 μl roztworu biotyny BSA do kanału, pipetując roztwór na jeden koniec i odprowadzając roztwór z drugiej za pomocą chusteczki. Inkubować przez 5 minut, a następnie 3-5 rzutów z 50 μl 0,1 M NaCl.</li>
		<li>Rozcieńczyć 40 μl 5 mg/ml NAV w 960 μL 1x bufor Tris do końcowego stężenia 0,2 mg/ml.</li>
		<li>Wlać 50 μl roztworu NAV do kanału, pipetując roztwór na jeden koniec i odprowadzając roztwór z drugiej za pomocą chusteczki. Inkubować przez 2-5 minut, a następnie 3-5 rzutów 50 μl 0,1 M NaCl.</li>
		<li>Rozcieńczyć roztwory podstawowe zawieszonych SWNT w buforze obrazowania do stężenia 1-10 mg/l i wprowadzić 50 μl roztworu do kanału i inkubować przez 5 minut.</li>
		<li>Delikatnie spłucz nadmiar SWNT za pomocą 50 μl buforu do obrazowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie silanizowanych szkiełek mikroskopowych APTES 
	UWAGA: Silanizowane szkiełka APTES umożliwiają unieruchomienie ujemnie naładowanych SWNT owiniętych DNA na powierzchni szklanego podłoża.
	<ol>
		<li>Przygotować 10% roztwór (3-aminopropylo)trietoksysilanu (APTES) w etanolu.</li>
		<li>Korzystając z kanałów wykonanych zgodnie z krokami opisanymi w 3.2.2, przelej 100 μL 1x buforu Tris.</li>
		<li>Przepłukać kanał roztworem APTES i inkubować przez 5 minut. Przemyć 1x buforem Tris.</li>
		<li>Rozcieńczyć roztwory podstawowe zawieszonych DNA-SWNT w buforze do obrazowania do stężenia 1-10 mg/ląd, wprowadzić 50 μl roztworu do kanału i inkubować przez 5 minut.</li>
		<li>Delikatnie spłucz nadmiar SWNT za pomocą 50 μl buforu do obrazowania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Spektroskopia fluorescencyjna i mikroskopia czujników SWNT
<ol>
	<li>Mikroskopia fluorescencyjna nIR
	<ol>
		<li>Wykonaj obrazowanie unieruchomionych powierzchniowo SWNT za pomocą wzbudzenia laserowego i mikroskopu odwróconego wyposażonego w matrycę czujników InGaAs do obrazowania.</li>
		<li>Skieruj wiązkę lasera tak, aby weszła do tylnego portu oświetlenia odwróconego mikroskopu za pomocą luster na regulowanych mocowaniach kinematycznych i pary przysłon zamontowanych na słupku ustawionych na wysokości portu. Upewnij się, że wiązka jest wypoziomowana i prosta, potwierdzając, że przechodzi przez obie tęczówki po umieszczeniu między kolejnymi lustrami i przed wejściem do portu oświetlenia. W razie potrzeby wyreguluj wysokość belki za pomocą zespołu peryskopowego. Usuń wszelkie krótkoprzepustowe filtry ciepła z portu oświetlenia, które tłumiłyby wiązkę.</li>
		<li>Włóż odpowiednią kostkę filtracyjną do mikroskopu, aby odbić światło wzbudzenia do obiektywu i zebrać światło emisyjne. Zazwyczaj składa się on z dichroicznego filtra długoprzepustowego z odcięciem powyżej długości fali wzbudzenia (np. 750 LP) i filtra długoprzepustowego emisji (np. 850 LP), aby jeszcze bardziej zminimalizować rozproszone światło wzbudzenia przed uderzeniem w czujnik. Dodatkowo filtr emisyjny można wybrać tak, aby był selektywny dla emisji SWNT o określonej chiralności.</li>
		<li>Dokonaj precyzyjnej regulacji wyrównania wiązki, wkładając odpowiednią kostkę wyrównującą, zastępując obiektyw dwoma przesuniętymi, matowymi tarczami zawierającymi otwory o średnicy 1 mm. Wyrównaj belkę do środka zarówno dolnej, jak i górnej tarczy wyrównowania.</li>
		<li>Podłącz matrycę czujników 2D InGaAs do bocznego portu obrazowania mikroskopu za pomocą odpowiedniego adaptera i obiektywu 0,5x, jeśli to konieczne, aby dostosować się do rozmiaru czujnika.</li>
		<li>Używając obiektywu zanurzeniowego 100X (1,4 NA), nałóż bezfluorescencyjny olejek immersyjny i umieść unieruchomioną próbkę SWNT na stoliku mikroskopu.</li>
		<li>Podnieś obiektyw, aż olej zetknie się z dolną częścią szkła nakrywkowego (#1.5, grubość 170 μm). W razie potrzeby dokonaj regulacji kołnierza obiektywu ze względu na warunki obrazowania, np. temperaturę, grubość szkła itp.</li>
		<li>Powoli podnieś obiektyw z włączonym źródłem wzbudzenia i monitoruj sygnał fluorescencji kamery InGaAs. Intensywność fluorescencji powinna stopniowo wzrastać w miarę zbliżania się płaszczyzny ogniskowej do powierzchni i ustawiania ostrości przez unieruchomione czujniki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Spektroskopia fluorescencyjna nIR 
	UWAGA: Spektroskopię fluorescencyjną można przeprowadzić przy użyciu tej samej konfiguracji mikroskopu, ale poprzez skierowanie zebranego światła z korpusu mikroskopu do spektrometru i detektora liniowego InGaAs.
	<ol>
		<li>Korzystając z mocowań kinematycznych i zwierciadeł przystosowanych do pomiaru podczerwieni, skieruj ścieżkę światła w kierunku szczeliny wejściowej spektrometru. Skoncentruj światło w dół do punktu na szczelinie wejściowej za pomocą soczewki skupiającej (np. płasko-wypukłej, f = 150 mm). To wyrównanie odbywa się poprzez osłabienie mocy lasera do <1 mW i zastąpienie obiektywu mikroskopu lustrem 1" oraz użycie kostki filtrującej rozdzielającej wiązkę 50/50. Światło wzbudzenia opuści następnie korpus mikroskopu przez port wyjściowy i może być użyte do regulacji luster i soczewki, aby skupić wiązkę na szczelinie wejściowej.</li>
		<li>Po wymianie obiektywu mikroskopu i filtra długoprzepustowego umieść płytkę dołka na stoliku i zarejestruj widma próbki w ostrości za pomocą spektrometru i układu InGaAs.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiar odwracalnej odpowiedzi (GT)15 DNA-SWNT na dopaminę
	<ol>
		<li>Zamontuj kanały pokryte czujnikiem na stoliku mikroskopu i ustaw ostrość za pomocą obiektywu olejowego 100X i kamery InGaAs. Dodać 50 μl 100 μM roztworu dopaminy w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do kanału przepływowego i zarejestrować zmianę intensywności fluorescencji.</li>
		<li>Wypłukać roztwór dopaminy za pomocą soli fizjologicznej buforowanej fosforanami i obserwować zmianę fluorescencji poszczególnych czujników SWNT.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Badanie przesiewowe na studzience pod kątem reakcji analitu czujników SWNTs 
	UWAGA: Badania przesiewowe różnych analitów można przeprowadzić za pomocą przezroczystej płytki studzienkowej sterowanej za pomocą zmotoryzowanego stolika. Idealna płyta studzienkowa jest przezroczysta dla widzialnego i podczerwonego oraz ma czarne ścianki boczne, aby zminimalizować przesłuchy między studzienkami.
	<ol>
		<li>Odpipetować równe objętości zawieszonego czujnika SWNT (np. stężenie 5 mg/l) do każdego dołka, wystarczające do równomiernego pokrycia dna studzienki, zwykle >100 μl dla płytki 96-dołkowej i >30 μl dla płytki 384-dołkowej.</li>
		<li>Pipetować anality (np. 2 μl, 100 μM objętość końcowa) z biblioteki przesiewowej do płytek studzienkowych. Przygotuj każdy analit w trzech egzemplarzach, aby uwzględnić potencjalne wahania między studniami, wahania intensywności wzbudzenia lub temperaturę.</li>
		<li>Podnieś obiektyw (np. 20X achroplan, 0,45 NA) podczas monitorowania widm emisyjnych za pomocą spektrometru i macierzy InGaAs. Optymalna pozycja obiektywu sprawi, że płaszczyzna ogniskowej znajdzie się mniej więcej w środku objętości próbki w studzience, co powinno odpowiadać maksimum zmierzonej intensywności.</li>
		<li>Dla każdej studzienki próbki zapisz ekspozycję 1-10 s, aby zebrać widmo.</li>
		<li>Porównaj widma emisyjne dla każdej studzienki z kontrolą zawierającą tylko SWNT bez dodatkowego analitu, aby określić ilościowo odpowiedź fluorescencyjną.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Dresselhaus, M. S., Dresselhaus, G., Avouris, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDresselhaus%2C+MS+%22Carbon+Nanotubes%22">Carbon Nanotubes</a>. 80, Springer. Berlin Heidelberg: Berlin, Heidelberg. (2001).</li>
<li>O'Connell, M. J., Bachilo, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Band+gap+fluorescence+from+individual+single-walled+carbon+nanotubes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Band gap fluorescence from individual single-walled carbon nanotubes.</a> Science. 297 (5581), 593-596 (2002).</li>
<li>Wang, F., Dukovic, G., Brus, L. E., Heinz, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Optical+Resonances+in+Carbon+Nanotubes+Arise+from+Excitons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Optical Resonances in Carbon Nanotubes Arise from Excitons.</a> Science. 308 (5723), (2005).</li>
<li>Heller, D. A., Baik, S., Eurell, T. E., Strano, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Walled+Carbon+Nanotube+Spectroscopy+in+Live+Cells%3A+Towards+Long-Term+Labels+and+Optical+Sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mat%22%5BJournal%5D)">Single-Walled Carbon Nanotube Spectroscopy in Live Cells: Towards Long-Term Labels and Optical Sensors.</a> Adv Mat. 17 (23), 2793-2799 (2005).</li>
<li>Boghossian, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-Infrared+Fluorescent+Sensors+based+on+Single-Walled+Carbon+Nanotubes+for+Life+Sciences+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Sus+Chem%22%5BJournal%5D)">Near-Infrared Fluorescent Sensors based on Single-Walled Carbon Nanotubes for Life Sciences Applications.</a> Chem Sus Chem. 4 (7), 848-863 (2011).</li>
<li>Kruss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+nanotubes+as+optical+biomedical+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Del+Rev%22%5BJournal%5D)">Carbon nanotubes as optical biomedical sensors.</a> Adv Drug Del Rev. 65 (15), 1933-1950 (2013).</li>
<li>Girifalco, L. A., Hodak, M., Lee, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+nanotubes%2C+buckyballs%2C+ropes%2C+and+a+universal+graphitic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+B%22%5BJournal%5D)">Carbon nanotubes, buckyballs, ropes, and a universal graphitic potential.</a> Phys Rev B. 62 (19), 13104-13110 (2000).</li>
<li>Baughman, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+nanotubes--the+route+toward+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Carbon nanotubes--the route toward applications.</a> Science. 297 (5582), 787-792 (2002).</li>
<li>Zheng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-assisted+dispersion+and+separation+of+carbon+nanotubes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">DNA-assisted dispersion and separation of carbon nanotubes.</a> Nature Materials. 2 (5), 338-342 (2003).</li>
<li>Banerjee, S., Hemraj-Benny, T., Wong, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent+Surface+Chemistry+of+Single-Walled+Carbon+Nanotubes%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mat%22%5BJournal%5D)">Covalent Surface Chemistry of Single-Walled Carbon Nanotubes.</a> Adv Mat. 17 (1), 17-29 (2005).</li>
<li>Moore, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individually+Suspended+Single-Walled+Carbon+Nanotubes+in+Various+Surfactants%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Individually Suspended Single-Walled Carbon Nanotubes in Various Surfactants.</a> Nano Letters. 3 (10), 1379-1382 (2003).</li>
<li>Tu, X., Zheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA-based+approach+to+the+carbon+nanotube+sorting+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Research%22%5BJournal%5D)">A DNA-based approach to the carbon nanotube sorting problem.</a> Nano Research. 1 (3), 185-194 (2008).</li>
<li>Mangalum, A., Rahman, M., Norton, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-Specific+Immobilization+of+Single-Walled+Carbon+Nanotubes+onto+Single+and+One-Dimensional+DNA+Origami%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Site-Specific Immobilization of Single-Walled Carbon Nanotubes onto Single and One-Dimensional DNA Origami.</a> J Am Chem Soc. 135 (7), 2451-2454 (2013).</li>
<li>Monopoli, M. P., Åberg, C., Salvati, A., Dawson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomolecular+coronas+provide+the+biological+identity+of+nanosized+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nano%22%5BJournal%5D)">Biomolecular coronas provide the biological identity of nanosized materials.</a> Nature Nano. 7 (12), 779-786 (2012).</li>
<li>Jeng, E. S., Moll, A. E., Roy, A. C., Gastala, J. B., Strano, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+DNA+Hybridization+Using+the+Near-Infrared+Band-Gap+Fluorescence+of+Single-Walled+Carbon+Nanotubes%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Detection of DNA Hybridization Using the Near-Infrared Band-Gap Fluorescence of Single-Walled Carbon Nanotubes.</a> Nano Letters. 6 (3), 371-375 (2006).</li>
<li>Yang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+Nanotube-Quenched+Fluorescent+Oligonucleotides%3A+Probes+that+Fluoresce+upon+Hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Carbon Nanotube-Quenched Fluorescent Oligonucleotides: Probes that Fluoresce upon Hybridization.</a> J Am Chem Soc. 130 (26), 8351-8358 (2008).</li>
<li>Yum, K., Ahn, J., McNicholas, T., Barone, P., Mu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Boronic+acid+library+for+selective%2C+reversible+near-infrared+fluorescence+quenching+of+surfactant+suspended+single-walled+carbon+nanotubes+in+response+to+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22Acs+Nano%22%5BJournal%5D)">Boronic acid library for selective, reversible near-infrared fluorescence quenching of surfactant suspended single-walled carbon nanotubes in response to glucose.</a> Acs Nano. 6 (1), 819-830 (2011).</li>
<li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Luciferase%2FSingle-Walled+Carbon+Nanotube+Conjugate+for+Near-Infrared+Fluorescent+Detection+of+Cellular+ATP%5BTitle%5D)+AND+%22Ange+Chem+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">A Luciferase/Single-Walled Carbon Nanotube Conjugate for Near-Infrared Fluorescent Detection of Cellular ATP.</a> Ange Chem Int Ed. 49 (8), 1456-1459 (2010).</li>
<li>Jin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+single-molecule+H2O2+signalling+from+epidermal+growth+factor+receptor+using+fluorescent+single-walled+carbon+nanotubes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nano%22%5BJournal%5D)">Detection of single-molecule H2O2 signalling from epidermal growth factor receptor using fluorescent single-walled carbon nanotubes.</a> Nat Nano. 5 (4), 302-309 (2010).</li>
<li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rational+design+of+nitric+oxide+selectivity+in+single-walled+carbon+nanotube+near-infrared+fluorescence+sensors+for+biological+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem%22%5BJournal%5D)">The rational design of nitric oxide selectivity in single-walled carbon nanotube near-infrared fluorescence sensors for biological detection.</a> Nat Chem. 1 (6), 473-481 (2009).</li>
<li>Giraldo, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+nanobionics+approach+to+augment+photosynthesis+and+biochemical+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mat%22%5BJournal%5D)">Plant nanobionics approach to augment photosynthesis and biochemical sensing.</a> Nat Mat. 13 (4), 400-408 (2014).</li>
<li>Samanta, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjugated+Polymer-Assisted+Dispersion+of+Single-Wall+Carbon+Nanotubes%3A+The+Power+of+Polymer+Wrapping%5BTitle%5D)+AND+%22Acc+Chem+Res%22%5BJournal%5D)">Conjugated Polymer-Assisted Dispersion of Single-Wall Carbon Nanotubes: The Power of Polymer Wrapping.</a> Acc Chem Res. 47 (8), 2446-2456 (2014).</li>
<li>Zou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dispersion+of+Pristine+Carbon+Nanotubes+Using+Conjugated+Block+Copolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mat%22%5BJournal%5D)">Dispersion of Pristine Carbon Nanotubes Using Conjugated Block Copolymers.</a> Adv Mat. 20 (11), 2055-2060 (2008).</li>
<li>Zheng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-Based+Carbon+Nanotube+Sorting+by+Sequence-Dependent+DNA+Assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure-Based Carbon Nanotube Sorting by Sequence-Dependent DNA Assembly.</a> Science. 302 (5650), (2003).</li>
<li>Strano, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+Nature+of+the+DNA-Assisted+Separation+of+Single-Walled+Carbon+Nanotubes+Using+Fluorescence+and+Raman+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Understanding the Nature of the DNA-Assisted Separation of Single-Walled Carbon Nanotubes Using Fluorescence and Raman Spectroscopy.</a> Nano Lett. 4 (4), 543-550 (2004).</li>
<li>Bisker, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-targeted+corona+phase+molecular+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">Protein-targeted corona phase molecular recognition.</a> Nat Comm. 7, 10241(2016).</li>
<li>Nelson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+Immobilized+Protein+A+Binding+to+Immunoglobulin+G+on+Nanosensor+Array+Surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Mechanism of Immobilized Protein A Binding to Immunoglobulin G on Nanosensor Array Surfaces.</a> Anal Chem. 87 (16), 8186-8193 (2015).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+recognition+using+corona+phase+complexes+made+of+synthetic+polymers+adsorbed+on+carbon+nanotubes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Molecular recognition using corona phase complexes made of synthetic polymers adsorbed on carbon nanotubes.</a> Nat nanotechnol. 8 (12), 959-968 (2013).</li>
<li>Kruss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotransmitter+detection+using+corona+phase+molecular+recognition+on+fluorescent+single-walled+carbon+nanotube+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Neurotransmitter detection using corona phase molecular recognition on fluorescent single-walled carbon nanotube sensors.</a> J Am Chem Soc. 136 (2), 713-724 (2014).</li>
<li>Salem, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chirality+dependent+corona+phase+molecular+recognition+of+DNA-wrapped+carbon+nanotubes%5BTitle%5D)+AND+%22Carbon%22%5BJournal%5D)">Chirality dependent corona phase molecular recognition of DNA-wrapped carbon nanotubes.</a> Carbon. 97, 147-153 (2016).</li>
<li>Giraldo, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Ratiometric+Sensor+Using+Single+Chirality+Near-Infrared+Fluorescent+Carbon+Nanotubes%3A+Application+to+In+Vivo+Monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">A Ratiometric Sensor Using Single Chirality Near-Infrared Fluorescent Carbon Nanotubes: Application to In Vivo Monitoring.</a> Small. 11 (32), 3973-3984 (2015).</li>
<li>Karousis, N., Tagmatarchis, N., Tasis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+Progress+on+the+Chemical+Modification+of+Carbon+Nanotubes%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Current Progress on the Chemical Modification of Carbon Nanotubes.</a> Chem Rev. 110 (9), 5366-5397 (2010).</li>
<li>Movia, D., Del Canto, E., Giordani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purified+and+Oxidized+Single-Walled+Carbon+Nanotubes+as+Robust+Near-IR+Fluorescent+Probes+for+Molecular+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+C%22%5BJournal%5D)">Purified and Oxidized Single-Walled Carbon Nanotubes as Robust Near-IR Fluorescent Probes for Molecular Imaging.</a> J Phys Chem C. 114 (43), 18407-18413 (2010).</li>
<li>Cognet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+quenching+of+exciton+fluorescence+in+carbon+nanotubes+by+single-molecule+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stepwise quenching of exciton fluorescence in carbon nanotubes by single-molecule reactions.</a> Science. 316 (5830), 1465-1468 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

SWNT są łatwo zawieszane w roztworze wodnym poprzez bezpośrednią sonikację z SDS lub ssDNA, na co wskazuje wzrost gęstości optycznej zapewniony przez koloidalną dyspersję powstałej hybrydy SWNT-polimer. SDS i ssDNA dyspersjonują i rozpuszczają wiązki SWNT poprzez adsorpcję na powierzchni SWNT poprzez oddziaływania hydrofobowe lub pi-pi. Ponadto inne polimery, takie jak genomowe DNA, polimery amfifilowe, polimery sprzężone i lipidy, mogą być adsorbowane na powierzchni SWNT poprzez dializę próbek zawieszonych za pomocą SC ...

Jednościenne nanorurki węglowe (SWNT) to atomowo cienkie warstwy atomów węgla zwinięte w długie, cienkie cylindry, które wykazują unikalne właściwości elektroniczne i optyczne. 1 Do takich właściwości zalicza się przerwę energetyczną wytwarzającą emisję fluorescencji w bliskiej podczerwieni (nIR) poprzez rekombinację ekscytonów, która jest bardzo wrażliwa na lokalne środowisko. Emisja nIR SWNT mieści się w oknie bliskiej podczerwieni, w którym głębokość przenikania światła jest maksymalna dla tkanki biologicznej. 2,3 Dodatkowo, SWNT wykazują kilka unikalnych cech nietypowych w przeciwieństwie do fluoroforów organicznych: SWNT wykazują duże przesunięcie Stokesa, nie fotowybielają i nie mrugają. 4 Wykorzystanie tych cech doprowadziło do opracowania szeregu nowatorskich czujników molekularnych mających zastosowanie w biologii. 5,6 Niezmodyfikowane SWNT są jednak nierozpuszczalne w wodzie, a uzyskanie zawiesin poszczególnych SWNT może być wyzwaniem. 7,8 Wiązanie i agregacja SWNT w roztworze może zaciemnić ich fluorescencję pasma wzbronionego,2 czyniąc je nieodpowiednimi do zastosowań detekcyjnych.
Dyspersja pojedynczych nanorurek węglowych w roztworze wodnym wymaga modyfikacji ich powierzchni, aby zapobiec agregacji napędzanej hydrofobowością. 9 Podczas gdy modyfikacja kowalencyjna może sprawić, że SWNT staną się rozpuszczalne w wodzie,10 a także nadać specyficzną chemię wiązania, miejsca defektów w sieci SWNT zmniejszają lub zmniejszają ich emisję fluorescencji. Zamiast tego funkcjonalizację SWNT można osiągnąć za pomocą środków powierzchniowo czynnych, lipidów, polimerów i DNA9,11-13, które adsorbują się na powierzchni nanorurek poprzez oddziaływania hydrofobowe i układanie pi-pi. Powstałe w ten sposób środowisko chemiczne otaczające funkcjonalizowane powierzchniowo SWNT określa się mianem fazy koronowej. Zaburzenia w fazie koronowej mogą mieć duży wpływ na ekscytony przemieszczające się po powierzchni nanorurek, powodując modulacje emisji fluorescencji SWNT. To właśnie ten wrażliwy związek między fazą koronową a fluorescencją SWNT może być wykorzystany do opracowania nowych czujników molekularnych poprzez włączenie specyficznych modalności wiązania do dużej powierzchni SWNT. Zaburzenia w fazie korony SWNT po związaniu analitu mogą prowadzić do zmian w lokalnym środowisku dielektrycznym, przenoszenia ładunku lub wprowadzania defektów sieciowych, z których wszystkie mogą modulować emisję fluorescencji SWNT, aby służyć jako mechanizm transdukcji sygnału. 14 Podejście to jest wykorzystywane do opracowywania nowych czujników fluorescencyjnych do wykrywania wielu różnych klas cząsteczek, w tym DNA15,16,glukozy17 i małych cząsteczek, takich jak ATP,18, reaktywne formytlenu19 i tlenek azotu. 20,21 Podejścia te są jednak ograniczone, ponieważ opierają się na istnieniu znanej metody wiązania dla docelowego analitu.
Ostatnio opracowano bardziej ogólne podejście do projektowania czujników fluorescencyjnych przy użyciu SWNT niekowalencyjnie funkcjonalizowanych amfifilowymi heteropolimerami, fosfolipidami i kwasami polinukleinowymi. Cząsteczki te adsorbują się na powierzchniach nanorurek węglowych, wytwarzając wysoce stabilne zawiesiny poszczególnych SWNT22-25 z unikalnymi fazami koronowymi, które mogą specyficznie wiązać białka26,27 lub małe cząsteczki, w tym neuroprzekaźnik dopaminę. 28-30 Inżynieria fazy koronowej w celu rozproszenia SWNT i specyficznego wiązania docelowych analitów jest określana jako rozpoznawanie molekularne fazy koronowej (CoPhMoRe). 28 Niewielkie rozmiary, niska toksyczność, wysoka stabilność i niebielejąca fluorescencja nIR czujników CoPhMoRe SWNT sprawiają, że są one doskonałymi kandydatami do wykrywania in vivo w przypadku dłuższych pomiarów z rozdzielczością czasową. 6 Niedawne prace wykazały ich zastosowanie w tkankach roślinnych do optycznego wykrywania reaktywnych form azotu i tlenu. 31 Szczególnie ekscytującym zastosowaniem czujników SWNT CoPhMoRe jest możliwość bezznacznikowego wykrywania neuroprzekaźników, takich jak dopamina in vivo, podczas gdy inne techniki, takie jak wykrywanie elektrochemiczne lub immunohistochemia, cierpią z powodu braku rozdzielczości przestrzennej, czasowej i swoistości.
Projektowanie i odkrywanie czujników SWNT CoPhMoRe było do tej pory ograniczone przez rozmiar i różnorodność chemiczną biblioteki dyspergatorów, co ograniczało prawdopodobieństwo znalezienia czujnika dla konkretnego celu. Do tej pory naukowcy jedynie zarysowali powierzchnię dostępnych polimerów sprzężonych, koblokowych, biologicznych i biomimetycznych, które mogłyby służyć jako funkcjonalnie aktywne dyspergatory dla czujników SWNT. W tym miejscu przedstawiamy różne metody zarówno dyspergowania SWNT, jak i charakteryzowania ich fluorescencji w celu przeprowadzenia wysokoprzepustowych badań przesiewowych oraz analizy za pomocą pojedynczego czujnika SWNT. W szczególności przedstawiamy procedurę powlekania SWNT oligomerami kwasu polinukleinowego za pomocą bezpośredniej sonikacji, a także sposób funkcjonalizacji SWNT polimerami amfifilowymi poprzez wymianę środków powierzchniowo czynnych przez dializę. Jako przykłady używamy (GT)15-DNA i glikolu polietylenowego funkcjonalizowanego izotiocyjanianem rodaminy (RITC-PEG-RITC). Demonstrujemy zastosowanie (GT)15-DNA SWNT jako czujnika CoPhMoRe do wykrywania dopaminy. Na koniec przedstawiamy procedury wykonywania pomiarów za pomocą czujników jednocząsteczkowych, które można wykorzystać do charakteryzacji lub wykrywania pojedynczych cząsteczek.

<table><tbody><tr><td>chlorek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>dodecylosiarczan sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L6026</td><td></td></tr><tr><td>hydrat cholanu sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6445</td><td></td></tr><tr><td>zasada tris (zasada Trizma)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93362</td><td></td></tr><tr><td>kwas solny</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-212</td><td></td></tr><tr><td>Amina-PEG-amina,NH2-PEG-NH2</td><td>Nanocs Inc</td><td>PG2-AM-5k</td><td></td></tr><tr><td>rodamina B izotiocyjanian</td><td>Sigma Aldrich</td><td>283924</td><td></td></tr><tr><td>izotiocyjanian fluoresceiny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7250</td><td></td></tr><tr><td>dichlorometan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>676853</td><td></td></tr><tr><td>dimetyloformamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4551</td><td></td></tr><tr><td>N,N-diizopropyloetyloamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D125806</td><td></td></tr><tr><td>eter dietylowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>673811</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek tris(2-karboksetylo)fosfiny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4706&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DNA modyfikowane 5'-tiolem&nbsp;</td><td>Zintegrowane technologie DNA Maleimid</td><td></td><td></td></tr><tr><td>glikolu metoksypolietylenowego</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63187</td><td></td></tr><tr><td>100 kDa filtry spinowe</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HiPCO Super oczyszczone jednościenne nanorurki węglowe</td><td>Integris</td><td>HiPco SuperPurified</td><td></td></tr> sól fizjologiczna <tr><td>buforowana fosforanem</td><td>Pistolet antystatyczny Sigma Aldrich</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Wirówka Milty</td><td>Milty Zerostat 3</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5415 D</td><td></td></tr><tr><td>ultrasonograf</td><td>Cole Parmer</td><td>CV18</td><td></td></tr><tr><td>kasety dializacyjne</td><td>Thermo scientific</td><td>Slide-A-Lyzer G2 87722</td><td></td></tr><tr><td>BSA-biotyna</td><td>Thermo scientific</td><td>29130</td><td></td></tr><tr><td>Białko neutrawidyny</td><td>Thermo scientific</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>(3-Aminopropylo)trietoksysilan (APTES)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>440140</td><td></td></tr> mikroskop <tr><td>odwrócony</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer.Z1</td><td></td></tr><tr><td>lustra kinematyczne</td><td>ThorLabs</td><td>KM200-E03</td><td></td></tr><tr><td>peryskop</td><td>ThorLabs</td><td>RS99</td><td></td></tr><tr><td>olejek immersyjny</td><td>Zeiss</td><td>Obiektyw Immersol 518f</td><td></td></tr><tr><td>100X</td><td>Zeiss</td><td>Planapochromatyczny 100X olej, 1.4NA, PH3, 420791-9911-000</td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw 20X</td><td>Zeiss</td><td>N-Achroplan 0.45 NA, 420953-9901-000&nbsp;</td><td></td></tr><tr>szkło <td>nakrywkowe</td><td>Healthrow Scientific</td><td>HS159879H</td><td></td></tr><tr><td>chlorowodorek dopaminy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8502&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>kamera na podczerwień 2D</td> Princeton <td>Instruments</td><td>NIRvana matryca czujników</td><td></td></tr><tr><td>podczerwieni 1D</td> Princeton <td>Instruments</td><td>Spektrograf PyLoN IR</td><td></td></tr><tr><td>nIR</td><td>Princeton Instruments</td><td>SCT-320</td><td></td></tr><tr><td>soczewka planowypukła</td><td>ThorLabs</td><td>LA1384</td><td></td></tr><tr><td>płytki dołkowe (szklane dno)</td><td>Corning</td><td>4580</td><td></td></tr></tbody></table>

inżynieria rozpoznawania molekularnego za pomocą polimerów biomimetycznych na jednościennych nanorurkach węglowych

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

Semiconducting single-wall carbon nanotube (SWNTs) to klasa optycznie aktywnych nanomateriałów, które fluoryzują w bliskiej podczerwieni, zbiegając się z oknem optycznym, gdzie próbki biologiczne są najbardziej przezroczyste. W tym miejscu przedstawiamy techniki adsorpcji polimerów amfifilowych i kwasów polinukleinowych na powierzchni SWNT w celu inżynierii ich faz koronowych i stworzenia nowatorskich czujników molekularnych dla małych cząsteczek i białek. Te funkcjonalne czujniki SWNT są zarówno biokompatybilne, jak i stabilne. Polimery są adsorbowane na powierzchni nanorurek albo przez bezpośrednią sonikację SWNT i polimeru, albo przez zawieszenie SWNT za pomocą środka powierzchniowo czynnego, a następnie dializę polimerem. Emisja fluorescencji, stabilność i reakcja tych czujników na docelowe anality są potwierdzane za pomocą spektroskopii absorbancji i fluorescencji w bliskiej podczerwieni. Ponadto demonstrujemy unieruchomienie powierzchni czujników na szkiełkach podstawowych, aby umożliwić mikroskopię fluorescencyjną pojedynczych cząsteczek w celu scharakteryzowania kinetyki adsorpcji polimerów i wiązania analitu.

SWNT zostały zawieszone w roztworze wodnym z wykorzystaniem zarówno surfaktantów, jak i polimerów amfifilowych, poprzez bezpośrednią sonikację oraz wymianę dializacyjną. Rycina 1 przedstawia SWNT otrzymane metodą katalityczną z użyciem karbonylu żelaza (HiPCO), zawieszone przy użyciu SC, RITC-PEF20-RITC oraz (GT)15-DNA. Gęstość optyczna SWNT z SDS (lub polimerem) gwałtownie wzrasta po sonikacji i maleje po usunięciu agregatów i zanieczyszczeń w drodze oczyszcza...

Przedstawiamy protokół inżynierii fazy koronowej w bliskiej podczerwieni fluorescencyjnych jednościennych nanorurek węglowych (SWNT) przy użyciu amfifilowych polimerów i DNA do opracowania czujników dla celów molekularnych bez znanych elementów rozpoznających.

Inżynieria rozpoznawania molekularnego za pomocą polimerów biomimetycznych na jednościennych nanorurkach węglowych

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...

Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie fluorescencyjnych jednościennych nanorurek węglowych w bliskiej podczerwieni do detekcji molekularnej, które zostały sfunkcjonalizowane przy użyciu polimerów biomimetycznych. Te nanoczujniki mogą umożliwić obrazowanie z rozdzielczością czasową w żywej tkance. Na przykład mogą być używane do wykrywania dopaminy w mózgu.Główną zaletą tych czujników jest ich nieodłączna fluorescencja w bliskiej podczerwieni, która umożliwia obrazowanie w głębszych warstwach. Czujniki syntetyczne umożliwiają wykrywanie cząsteczek bez naturalnych elementów rozpoznawania molekularnego, co sprawia, że ta ogólna metoda opracowywania czujników jest szczególnie przydatna do wykrywania małych cząsteczek. Aby przygotować zawiesinę kwasów nukleinowych SWNT, najpierw rozpuść kwasy nukleinowe w 0,1 molowym chlorku sodu do stężenia 100 miligramów na mililitr.W dygestorium usuń elektryczność statyczną z jednorazowej szpatułki, probówek do mikrowirówek i kolby SWMT za pomocą pistoletu antystatycznego. Następnie dodaj 20 mikrolitrów roztworu kwasu nukleinowego do 980 mikrolitrów 0,1-molowego chlorku sodu. Następnie dodaj 1 miligram przemytych SWNT do powstałego roztworu kwasu nukleinowego przed sonikacją mieszaniny.Ustawienie końcówki sondy podczas sonikacji ma kluczowe znaczenie. Jeśli wystąpi pienienie, zmień położenie końcówki sondy i spróbuj zmniejszyć amplitudę. Alternatywnie można spróbować impulsów sonikacji lub sonikacji w kąpieli, jeśli zawiesina pozostaje słaba.Za pomocą ultrasonografu z końcówką o średnicy 3 milimetrów, sonikować roztwór przez 10 minut przy amplitudzie 40% w łaźni lodowej. Odwirować roztwór DNA SWNT dwukrotnie przez 90 minut przy 16, 100 xg. Zebrać i przechowywać supernatant, uważając, aby nie naruszyć osadu zawierającego wiązki i agregaty nanorurek węglowych.Granulki należy wyrzucić zgodnie z instytucjonalnymi procedurami dotyczącymi odpadów niebezpiecznych, właściwymi dla nanomateriałów. Zmierzyć absorbancję roztworu przy 632 nanometrach za pomocą spektrofotometru UV-vis w celu określenia przybliżonego stężenia zawieszonych SWNT, zgodnie z prawem Lamberta-Beera, oraz odpowiedniego współczynnika rozcieńczenia. W przypadku amfifilowych zawiesin polimerowych należy najpierw usunąć elektryczność statyczną z jednorazowej szpatułki, probówek do mikrowirówek i materiału SWNT.W dygestorium dodaj pięć miligramów SWNT do pięciu mililitrów 2% roztworu cholanu sodu. Używając ultrasonografu z końcówką o średnicy sześciu milimetrów, sonikuj roztwór przez godzinę przy amplitudzie 40% w łaźni lodowej. Odwirować próbkę o stężeniu 150 000 xg przez cztery godziny za pomocą ultrawirówki, a następnie ostrożnie zebrać supernatant.Następnie rozpuść 1% masy polimeru amfifilowego w roztworze scSWNT. Następnie dializuj roztwór polimeru scSWNT za pomocą membrany dializacyjnej o mocy 3,5 kilodaltona w jednym litrze dejonizowanej wody lub buforu przez pięć dni. Wymień wodę lub bufor o drugiej godzinie i o czwartej godzinie.Zmierzyć absorbancję roztworu przy 632 nanometrach za pomocą spektrofotometru UV-Vis w celu określenia przybliżonego stężenia zawieszonych SWNT. Aby przygotować szkiełka podstawowe pokryte biotyną BSA, wyczyść szkiełko mikroskopowe i szkło nakrywkowe o średnicy 0,17 milimetra wodą dejonizowaną, a następnie metanolem, acetonem i na koniec spłucz wodą dejonizowaną. Utwórz kanały, umieszczając kilka kawałków taśmy dwustronnej w odległości około pięciu milimetrów od siebie na czystym szkiełku mikroskopowym.Uszczelnij kanały, biorąc długą szklaną szkiełko nakrywkowe i dociskając ją do górnej części taśmy dwustronnej. Pamiętaj, aby wyśrodkować go na szkiełku mikroskopowym, tak aby krawędzie szkiełka nakrywkowego i szkiełka nie były zlicowane. Następnie dodaj 100 mikrolitrów roztworu podstawowego BSA-biotyny do 900 mikrolitrów 1x buforu Tris do końcowego stężenia jednego miligrama na mililitr.Wlać 50 mikrolitrów roztworu BSA-biotyny do kanału, pipetując roztwór na jeden koniec i odprowadzając roztwór na drugim końcu za pomocą chusteczki. Po inkubacji roztworu przez pięć minut wykonaj trzy do pięciu płukań 50 mikrolitrami 0,1-molowego chlorku sodu. Następnie rozcieńczyć 40 mikrolitrów po pięć miligramów na mililitr roztworu podstawowego NAV w 960 mikrolitrach 1x buforu Tris, do końcowego stężenia 0,2 miligrama na mililitr.Wlać 50 mikrolitrów roztworu NAV do kanału, pipetując roztwór na jeden koniec i odprowadzając roztwór na drugim końcu za pomocą chusteczki. Po inkubacji szkiełka przez dwie do pięciu minut wykonaj od trzech do pięciu płukań 50 mikrolitrami 0,1-molowego chlorku sodu. Następnie rozcieńczyć roztwory podstawowe zawieszonych SWNT i buforu obrazowania do stężenia od 1 do 10 miligramów na litr.Wlej 50 mikrolitrów tego roztworu do kanału i inkubuj przez pięć minut. Delikatnie spłucz nadmiar SWNT za pomocą 50 mikrolitrów buforu do obrazowania. Aby zmierzyć odwracalną odpowiedź DNA-SWNT GT15 na dopaminę, najpierw zamontuj kanały pokryte czujnikiem na stoliku mikroskopu fluorescencyjnego.Ustaw ostrość kanałów za pomocą obiektywu olejowego 100X i kamery z arsenku indu i galu. Następnie dodaj 50 mikrolitrów 100 mikromolowego roztworu dopaminy w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami do kanału przepływowego i zarejestruj zmianę intensywności fluorescencji. Wypłukać roztwór dopaminy za pomocą soli fizjologicznej buforowanej fosforanami i obserwować zmianę fluorescencji poszczególnych czujników SWNT.Aby przeprowadzić badanie przesiewowe płytki studzienkowej pod kątem reakcji analitu biomimetycznych polimerowych SWNT, należy pipetować równe objętości zawieszonego czujnika SWNT do każdej studzienki. Użyj wystarczającej objętości, aby równomiernie pokryć dno studni. Następnie pipetować anality z biblioteki przesiewowej do płytek dołkowych.Przygotować każdy analit w trzech egzemplarzach, aby uwzględnić potencjalne wahania i wahania intensywności wzbudzenia lub temperatury. Podnieś cel podczas monitorowania widm emisji za pomocą spektrometru i matrycy arsenku indu i galu. Optymalna pozycja obiektywu sprawi, że płaszczyzna ogniskowej znajdzie się mniej więcej w środku objętości próbki w studzience, co powinno odpowiadać maksimum zmierzonej intensywności.Dla każdej studzienki próbki zapisz ekspozycję od jednej do 10 sekund, aby zebrać widmo. Porównaj widma emisji dla każdej studzienki z kontrolą zawierającą tylko SWNT bez dodatkowego analitu, aby określić ilościowo odpowiedź fluorescencyjną. Widmo absorbancji czujników nanorurek DNA GT15 wykazuje wiele pików odpowiadających dobrze zdyspergowanym nanorurkom węglowym o różnej chiralności.Pokazano fluorescencję w bliskiej podczerwieni czujników nanorurek DNA GT15. Co ciekawe, intensywność fluorescencji w przybliżeniu podwaja się w odpowiedzi na dopaminę. Na tym rysunku mikroskopia fluorescencyjna w bliskiej podczerwieni ujawnia pojedyncze czujniki nanorurek DNA GT15 unieruchomione na powierzchni szklanego szkiełka nakrywkowego.Idąc dalej, ważne jest, aby przetestować czujnik pod kątem stosowania in vivo, na przykład rozszerzając bibliotekę analitów o konkurentów molekularnych, badając liniowość odpowiedzi w biologicznie istotnym reżimie stężeń, a także testując odwracalność. Po opanowaniu podejście to można wykorzystać do stworzenia biblioteki różnych syntetycznych czujników z cząsteczek bez znanych elementów rozpoznawania molekularnego.

engineering-molecular-recognition-with-bio-mimetic-polymers-on-single

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opis tworzenia polimerowej mikrosieci przy użyciu techniki fotopolimeryzacji na chipie. Opisano również wysokoprzepustową charakterystykę powierzchni z wykorzystaniem mikroskopii sił atomowych, pomiarów kąta zwilżania wodą, rentgenowskiej spektroskopii fotoelektronowej, spektrometrii mas jonów wtórnych czasu przelotu oraz testu adhezji komórek.

Polimerowe mikromacierze do wysokoprzepustowego odkrywania biomateriałów

Opisujemy protokół produkcji i pomiaru urządzeń dla biosensorów wysokiej częstotliwości opartych na nanorurkach węglowych. Technika wykrywania wysokiej częstotliwości łagodzi podstawowy efekt ekranowania jonowego (Debye) i umożliwia pracę biosensora z nanorurkami w roztworach o wysokiej sile jonowej, w których zawodzą konwencjonalne bioczujniki elektroniczne. Nasza technologia stanowi unikalną platformę dla elektronicznych bioczujników przyłóżkowych (POC) działających w warunkach fizjologicznie...

Wytwarzanie nanoelektronicznego biosensora wysokiej częstotliwości z nanorurek węglowych do wykrywania w roztworach o wysokiej sile jonowej

Opisujemy wytwarzanie i charakterystykę systemów nanobiologicznych łączących nanostrukturalne podłoża z unieruchomionymi białkami i aptamerami. Przedstawiono odpowiednie etapy eksperymentalne obejmujące litograficzną produkcję substratów nanostrukturalnych, biofunkcjonalizację i charakterystykę spektroskopii Ramana wzmocnionej powierzchniowo (SERS). Wykazano detekcję SERS białek unieruchomionych powierzchniowo oraz sondowanie wiązania białko-ligand i aptamer-ligand.

Powierzchniowo wzmocniona spektroskopia Ramana wykrywanie biomolekuł przy użyciu nanostrukturalnych substratów wytworzonych przez EBL

Przedstawiono metodę funkcjonalizacji nanorurek węglowych z polimerowymi warstwami enkapsulacyjnymi o zmiennej strukturze oraz charakterystyki strukturalnej za pomocą rozpraszania neutronów pod małym kątem.

Funkcjonalizacja jednościennych nanorurek węglowych z termoodwracalnymi kopolimerami blokowymi i charakterystyka za pomocą rozpraszania neutronów pod małym kątem

Kwasy nukleinowe są powszechnymi analitami do oceny systemów biologicznych; jednak stronniczość wynikająca z manipulacji enzymatycznych może budzić niepokój. W tym miejscu opisano metodę bezznacznikowego wykrywania kwasów nukleinowych za pomocą polianiliny. Ta czuła, ekonomiczna technologia czujników może rozróżniać różnice między pojedynczymi nukleotydami między cząsteczkami.

Czujnik kwasów nukleinowych na bazie polianiliny

Tutaj prezentujemy protokół do przygotowania i wizualizacji struktur drugorzędnych (np. włókien, architektur toroidalnych i nanosfer) pochodzących z polikarmidów spiralnych. Wykazano, że morfologia charakteryzująca się zarówno mikroskopią sił atomowych (AFM), jak i skaningową mikroskopią elektronową (SEM) zależy od struktury molekularnej, stężenia i wybranego rozpuszczalnika.

Samoorganizujące się morfologie otrzymane z helikalnych kopolimerów polikarbodimidu i ich pochodnych triazolowych

Półelastyczne polimery wykazują unikalne właściwości mechaniczne, które są szeroko stosowane przez żywe systemy. Jednak systematyczne badania nad biopolimerami są ograniczone, ponieważ właściwości takie jak sztywność polimeru są niedostępne. Niniejszy manuskrypt opisuje, w jaki sposób to ograniczenie jest obchodzone przez programowalne nanorurki DNA, umożliwiając eksperymentalne badania wpływu sztywności włókien.

Nanorurki DNA jako wszechstronne narzędzie do badania polimerów półelastycznych

Przedstawiono procedurę syntezy wielościennych nanorurek węglowych szczepionych polistyrenem przy użyciu kolejnych etapów modyfikacji chemicznej w celu selektywnego wprowadzania łańcuchów polimerowych do ścian bocznych i ich samoorganizacji poprzez anizotropową niejednolitość.

Szczepienie wielościennych nanorurek węglowych polistyrenem w celu umożliwienia samoorganizacji i niejednolitości anizotropowej

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania i kwantyfikacji nisko obfitych cząsteczek w złożonych roztworach za pomocą imprintingu molekularnego w połączeniu z biosensorem pojemnościowym.

Ultraczułe wykrywanie biomarkerów za pomocą biosensora pojemnościowego opartego na imprintingu molekularnym

W tej pracy dostarczamy protokół do biofunkcjonalizacji magnetycznych nanomateriałów z przeciwciałami do określonego celowania w komórki. Na przykład wykorzystujemy nanodruty żelaza do celowania w komórki rakowe.

Biofunkcjonalizacja nanomateriałów magnetycznych

Nanomaszyny oparte na DNAzyme mogą być używane do wysoce selektywnego i czułego wykrywania kwasów nukleinowych. W artykule opisano szczegółowy protokół projektowania nanomaszyn opartych na DNAzyme z rdzeniem 10-23 przy użyciu wolnego oprogramowania i ich zastosowania w wykrywaniu fragmentu wirusa Epsteina-Barr jako przykładu.

DNAzyme 10-23 - Nanomaszyny do rozpoznawania kwasów nukleinowych

Poznaj inżynierię nanoczujników fluorescencyjnych z wykorzystaniem jednościennych nanorurek węglowych funkcjonalizowanych polimerami biomimetycznymi. Ta metoda umożliwia wykrywanie dopaminy w tkankach żywych.

Inżynieria rozpoznawania molekularnego za pomocą polimerów biomimetycznych na jednościennych nanorurkach węglowych

Przeglądaj więcej filmów