Kolekcja pożywki kondycjonowanej komórkami macierzystymi myszy bez surowicy i karmy dla podejścia bezkomórkowego

Ogólnym celem tego protokołu jest zebranie kondycjonowanej pożywki z embrionalnych komórek macierzystych myszy w warunkach hodowli wolnej od surowicy i karmy oraz scharakteryzowanie funkcji biologicznych tej pożywki. Procedura ta dostarcza informacji na temat aktywności przeciwstarzeniowej rozpuszczalnych czynników wydzielanych z embrionalnych komórek macierzystych myszy w celu opracowania bezpiecznego i bezkomórkowego podejścia terapeutycznego w chorobach związanych z wiekiem. Tę procedurę zademonstruje dr Yun-Ui Bae, profesor naukowy mojego laboratorium.

W kapturze bezpieczeństwa biologicznego potraktuj fibroblasty embrionalne myszy lub hodowlę komórkową MEF za pomocą 20 mililitrów pożywki MEF uzupełnionej mitomycyną C w 15-centymetrowym naczyniu do hodowli komórkowej przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Pod koniec inkubacji umyj komórki trzykrotnie PBS i odłącz je trzema mililitrami trypsyny EDTA na trzy minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Neutralizacja trypsyny za pomocą sześciu mililitrów świeżej pożywki MEF, gdy komórki uniosą się z dna płytki.

Po zebraniu komórek przez odwirowanie, ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach pożywki MEF i płytkę dwa razy od 10 do szóstego inaktywowanego MEF na 10-centymetrową pożywkę hodowlaną w świeżej pożywce MEF. Hoduj komórki karmiciela przez 24 godziny. Następnie zastąp pożywkę MEF pożywką z embrionalnych komórek macierzystych myszy i wysiewaj dwa razy 10 do szóstych embrionalnych komórek macierzystych myszy na karmnikach przez co najmniej 48 godzin wspólnej hodowli.

W kapturze bezpieczeństwa biologicznego przepłucz płytkę z embrionalnymi komórkami macierzystymi myszy pięcioma mililitrami PBS i odłącz komórki trypsyną i EDTA, jak właśnie pokazano. Po zebraniu komórek przez odwirowanie, ponownie zawiesić osad komórek macierzystych w pięciu mililitrach świeżej pożywki z komórek macierzystych i poszczepić jeden mililitr komórek na naczyniu w świeżej pożywce z embrionalnych komórek macierzystych na pięciu pokrytych żelatyną szalkach do hodowli komórkowych. Umieść komórki z powrotem w inkubatorze, aż kultury osiągną 80-85% zbieżności.

Następnie przepłukać komórki w co najmniej ośmiu mililitrach PBS na płytkę przez trzy 10-minutowe płukania, a następnie 24-godzinną inkubację w zredukowanej pożywce surowicy. Po nie więcej niż 24 godzinach przenieść supernatant do 50-mililitrowej stożkowej probówki w celu odwirowania. Następnie następuje filtracja przez sitko o średnicy 0,2 mikrometra.

Aby przetestować działanie pożywki kondycjonowanej embrionalnymi komórkami macierzystymi za pomocą testu beta galaktozydazy związanej ze starzeniem, należy wysiać ludzkie fibroblasty skóry na sześciodołkowej płytce w ludzkim pożywce z fibroblastami skóry. Po całonocnej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, zastąp połowę pożywki świeżą pożywką kondycjonowaną embrionalnymi komórkami macierzystymi myszy na kolejną 72-godzinną hodowlę. W trzecim dniu hodowli przepłucz komórki w dwóch mililitrach PBS na studzienkę przez dwa 30-sekundowe płukania.

Następnie utrwal komórki w 3,7% paraformaldehydzie przez pięć minut w temperaturze pokojowej w dygestorium. Po utrwaleniu umyj komórki dwa razy dwoma mililitrami PBS, jak właśnie pokazano, i oznacz komórki jednym do dwóch mililitrów roztworu SA beta gal przez 17 i pół godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza bez dwutlenku węgla. Pod koniec okresu barwienia przemyj komórki dwa razy PBS, jak właśnie pokazano.

Następnie przeciwplamić Eosenem przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po kolejnym zestawie płukania PBS zobrazuj komórki w 100-krotnym powiększeniu za pomocą mikroskopii świetlnej. Do analizy cyklu komórkowego wysiewaj osiem razy 10 do czwartego ludzkiego fibroblastu skórnego na studzienkę w sześciocentymetrowym naczyniu do hodowli komórkowej w świeżej ludzkiej pożywce z fibroblastów skórnych do nocnej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Następnego ranka zastąp połowę pożywki pożywką kondycjonowaną mysimi embrionalnymi komórkami macierzystymi i włóż komórki z powrotem do inkubatora. Po 24 godzinach zbierz komórki przez dysocjację trypsyny EDTA, a następnie dwa przemycia w jednym mililitrze roztworu PBS. Po drugim praniu ponownie zawiesić granulat w 100 mikrolitrach zimnego roztworu PBS.

Następnie utrwal komórki za pomocą kropli w 200 mikrolitrach zimnego etanolu podczas wirowania. Przechowuj komórki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez co najmniej godzinę. Następnie umyj je w świeżym roztworze PBS.

Po drugim odwirowaniu potraktuj osad 250 mikrolitrami buforu cytrynianu sodu uzupełnionego RNazą przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza bez dwutlenku węgla. Pod koniec inkubacji oznaczyć komórki 250 mikrolitrami buforu cytrynianu sodu zawierającego jodek propidyny przez 20 minut. Następnie oceń etapy cyklu komórkowego każdej próbki za pomocą cytometrii przepływowej.

Do ilościowej analizy PCR z odwrotną transkryptazą należy użyć zestawu do ekstrakcji RNA, aby wyizolować całkowite RNA z ludzkich fibroblastów skóry poddanych działaniu embrionalnych komórek macierzystych myszy zgodnie z protokołem producenta. Użyj spektrofotometru, aby określić ilościowo całkowity wyekstrahowany RNA. Następnie sformułować mieszaninę reakcyjną zawierającą startery oligo deoksytymidyny i odwrotną transkryptazę M-MLV zgodnie z protokołem producenta.

Następnie dodać jeden mikrogram całkowitego RNA do probówki PCR zawierającej mieszaninę reakcyjną. Na koniec zmierz amplifikację CDNA za pomocą maszyny do PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu zielonej mieszanki głównej PCR i odpowiednich starterów genowych. Embrionalne komórki macierzyste myszy wyhodowane w normalnych warunkach hodowli embrionalnych komórek macierzystych myszy na warstwie komórek zasilających MEF mają owalny kształt i błyszczący wygląd.

Podczas gdy embrionalne komórki macierzyste myszy hodowane w warunkach hodowli wolnej od surowicy i karmnika wykazują spłaszczoną i nieregularną morfologię. Leczenie starzejącego się ludzkiego fibroblastu skóry pożywką kondycjonowaną mysimi embrionalnymi komórkami macierzystymi zmniejsza liczbę komórek betagalaktozydazy związanych ze starzeniem się. Co więcej, analiza cyklu komórkowego tych komórek ujawnia, że leczenie pożywką kondycjonowaną embrionalnymi komórkami macierzystymi myszy radykalnie zwiększa liczbę komórek w fazach S i G2/M, jednocześnie zmniejszając liczbę komórek w fazie G0/G1.

Ponadto leczenie pożywką kondycjonowaną embrionalnymi komórkami macierzystymi myszy zmniejsza ekspresję genów związanych ze starzeniem się i cytokin sekretarskich związanych z fenotypem starzenia. Podejmując tę procedurę, bardzo ważne jest, aby pamiętać o zebraniu surowicy i pożywki wolnej od pożywki po 24 godzinach, ponieważ długa inkubacja zwiększa możliwość autolizy lub apoptozy komórek przez zagłodzenie. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zbierać surowicę i pożywkę kondycjonowaną embrionalnymi komórkami macierzystymi myszy bez karmy, aby uzyskać podejście wolne od komórek.

Nie zapominaj, że praca z odczynnikiem, takim jak paraformaldehyd, może być bardzo niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak obchodzenie się z tym odczynnikiem w dygestorium.