Name: Kolekcja pożywki kondycjonowanej komórkami macierzystymi myszy bez surowicy i karmy dla podejścia bezkomórkowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Poznaj metodę zbierania pożywki kondycjonowanej komórkami macierzystymi myszy bez surowicy i karmy. Technika ta pozwala badać przeciwstarzeniowe właściwości czynników rozpuszczalnych dla bezpiecznego podejścia terapeutycznego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Te badania były wspierane przez Program Badań Nauk Podstawowych (2013R1A1A2060930) oraz Program Centrum Badań Medycznych (2015R1A5A2009124) przez National Research Foundation of Korea (NRF), finansowane przez Ministerstwo Nauki, ICT, and Future Planning. Badania te są również wspierane przez Start-up Operating Grant ze Szpitala dla Chorych Dzieci (H. K. Sung). Chcielibyśmy podziękować Laurze Barwell i Sarah J. S. Kim za ich doskonałą pomoc w redagowaniu tego manuskryptu oraz dr Andrasowi Nagyowi za dostarczenie linii mESC G4.

UWAGA: Schemat protokołu pobierania CM bez surowicy i karmowicy pokazano na rysunku 1.
1. Materiały (Przygotowanie MEF-ów, Podłoża, Płytek i Roztworów)
<ol>
	<li>Przygotować 500 ml pożywki do hodowli MEF. Uzupełnij zmodyfikowaną pożywkę Dulbecco's Eagle's Medium (DMEM) w 10% FBS (jakość ESC), 50 jednostek/ml penicyliny i 50 mg/ml streptomycyny.</li>
	<li>Wyizolować MEF od zarodków zgodnie z ustalonym rutynowym protokołem13 i utrzymać je w pożywce MEF.</li>
	<li>Przygotować 500 ml pożywki do hodowli mESC. DMEM jest uzupełniony o 15% FBS i 2 mM L-glutaminę, 100 μM aminokwasów endogennych (NEAA), 100 μM β-merkaptoetanol, 100 jednostek/ml czynnika hamującego białaczkę (LIF), 50 jednostek/ml penicyliny i 50 mg/ml streptomycyny.</li>
	<li>Przygotować zżelowane płytki (5 płytek żelatynizowanych/1 płytka mESC), pokrywając 10 cm szalki do hodowli komórkowych 5 ml 0,1% roztworu żelatyny. Inkubować przez co najmniej 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotuj 500 ml zredukowanej pożywki surowicy, aby uzyskać stan wolny od surowicy. Uzupełnij zredukowaną pożywkę w surowicy 1,2 g wodorowęglanu sodu (pH 7,0). Przefiltruj przez filtr butelkowy 0,2 μm.</li>
	<li>Przygotować roztwór barwiący β-galaktozydazę (SA β-gal) związany ze starzeniem się do wykrywania komórek starczych: 1 mg/ml X-gal (rozpuszczony w dimetyloformamidzie, DMF), 40 mM bufor kwasu cytrynowego/fosforanu sodu (pH 6,0), 5 mM żelazocyjanku potasu, 5 mM żelazocyjanku potasu, 150 mM NaCl i 2 mM MgCl214, 
	UWAGA: (Niebezpieczne) DMF jest roztworem toksycznym i. Podczas pracy z roztworem należy nosić osobistą odzież ochronną (np. rękawice nitrylowe lub lateksowe, fartuch laboratoryjny i okulary ochronne). Użyj dygestorium.</li>
	<li>Przygotować 500 ml pożywki do hodowli ludzkich fibroblastów skóry (HDF, NHDF-Ad-Der-Fibroblast). Uzupełnij DMEM o 10% FBS i 100 jednostek/ml penicyliny oraz 100 mg/ml streptomycyny.</li>
</ol>
2. Hodowla embrionalnych komórek macierzystych myszy (Rysunek 1A i 2A)
UWAGA: Wykonaj wszystkie czynności w biologicznym kapturze bezpieczeństwa do hodowli komórkowej.
<ol>
	<li>Poddać MEF działaniu 20 ml pożywki MEF zawierającej 10 μg/ml mitomycyny C w naczyniu do hodowli komórkowych o średnicy 15 cm. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Zassać pożywkę z MEF-ów. Umyj komórki trzykrotnie PBS. Dodać 3 ml trypsyny-EDTA (TE, 1x) i inkubować przez 3 minuty w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Po 3 minutach zneutralizować TE 6 ml pożywki MEF i odwirowywać przez 3 minuty przy 300 x g.</li>
	<li>Zawiesić w 5 ml pożywki MEF. Określ liczbę komórek w powstałej zawiesinie komórek za pomocą barwienia błękitem trypanowym i hemocytometru. Płytka inaktywowana MEF (podajnik) o gęstości 2 x 106 komórek na 10-centymetrowe naczynie do hodowli komórkowej w pożywce MEF. Inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Wymień pożywkę MEF na pożywkę mESC 24 godziny po poszyciu podajnika (następnego dnia).</li>
	<li>Płytkę mESC (G4 F1 hybrid ES cell) o gęstości 2 x 106 komórek na pożywce mESC. Inkubować przez 48 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO2, 
	UWAGA: Działanie przeciwstarzeniowe mESC-CM jest prawdopodobnie silniejsze, gdy stosuje się mESC o niższej liczbie pasaży15-17. Zakupiono linię mESC G4 od dr Andrasa Nagya w Instytucie Badawczym Lunenfeld-Tanenbaum, Mount Sinai Hospital, 25 Orde Street, Toronto, ON, M5T 3H7, Kanada.</li>
	<li>Utrzymuj komórki w stosunkowo dużej gęstości i pasażu w stanie sub-konfluencji 70-80%. Codziennie zastępować pożywkę świeżą pożywką z mESC.</li>
</ol>
3. Zbiór pożywki kondycjonowanej bez surowicy i karmy (Rysunek 1B i 2B)
UWAGA: Wykonaj wszystkie czynności w biologicznym kapturze bezpieczeństwa do hodowli komórkowej.
<ol>
	<li>Przepłukać płytkę mESC 5 ml PBS. Dodać 1 ml TE (2,5x) i inkubować przez 3 minuty w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Po 3 minutach zneutralizować TE za pomocą 2 ml pożywki mESC i odwirować przez 3 minuty przy 300 x g.</li>
	<li>Zawiesić w 5 ml pożywki mESC i rozlać 1 ml do każdego naczynia hodowlanego pokrytego żelatyną (5 płytek żelatynizowanych/1 płytka mESC) w pożywce mESC. Hodowla w temperaturze 37 °C i 5% CO2 aż do osiągnięcia 80-85% konfluencji.</li>
	<li>Przemyć mESC wystarczającą ilością PBS, aby pokryć komórki (8 ml na płytkę o średnicy 10 cm) przez 10 minut na płukanie, w sumie trzy płukania. Inkubować w zredukowanym podłożu surowicy przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2, 
	UWAGA: Etap mycia jest ważny, aby zapobiec zanieczyszczeniu FBS. Ważne jest, aby przestrzegać czasu inkubacji18,19.</li>
	<li>Zebrać mESC-CM do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i odwirować przez 20 minut przy 2 500 x g. Zebrać roztwór sklarowanego osadu (CM) po odwirowaniu. Przefiltruj przez filtr butelkowy 0,2 μm.</li>
</ol>
4. Efekty działania pożywki kondycjonowanej komórkami macierzystymi embrionalnymi myszy (mESC-CM)
UWAGA: Efekty mESC-CM zwalidowano kilkoma metodami, takimi jak test SA β-gal, analiza cyklu komórkowego i qRT-PCR.
<ol>
	<li>Test SA β-gal (rysunek 3A)
	<ol>
		<li>Wysiewaj HDF o gęstości 2 x 104 komórki na basenie na płytkach 6-dołkowych w pożywce HDF. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
		<li>Po całonocnej inkubacji należy wyrzucić połowę pożywki HDF i dodać mESC-CM oraz pożywkę kontrolną. Inkubować przez 72 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Pożywka kontrolna jest otrzymywana z pożywki wolnej od surowicy (Reduced Serum Media) w naczyniu pokrytym żelatyną w przypadku braku mESC.</li>
		<li>Przemyć komórki wystarczającą ilością PBS, aby przykryć komórki (2 ml na płytkę 6-dołkową) przez 30 sekund na pranie, w sumie dwa przemycia. Dodaj 3,7% paraformaldehydu (PFA) do utrwalenia. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. 
		UWAGA: (Niebezpieczny) Paraformaldehyd jest roztworem toksycznym i. Podczas pracy z roztworem należy nosić osobistą odzież ochronną (np. rękawice nitrylowe lub lateksowe, fartuch laboratoryjny i okulary ochronne). Użyj dygestorium.</li>
		<li>Zassać roztwór utrwalający. Przemyć utrwalone komórki dwukrotnie PBS, jak opisano w kroku 4.1.3.</li>
		<li>Dodać roztwór barwiący SA β-gal (1-2 ml na studzienkę w płytce 6-dołkowej). Inkubować przez 17,5 godziny w temperaturze 37 °C. 
		UWAGA: Nie należy go inkubować w inkubatorze CO2 .</li>
		<li>Zassać roztwór barwiący SA β-gal i dwukrotnie przemyć komórki PBS, jak opisano w kroku 4.1.3.</li>
		<li>Dodaj roztwór Eozyny do barwienia przeciwdziałającego. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Umyć komórki dwukrotnie PBS, jak opisano w kroku 4.1.3.</li>
		<li>Obrazuj komórki w 100-krotnym powiększeniu za pomocą mikroskopu świetlnego i rejestruj obrazy za pomocą dołączonej kamery cyfrowej w celu późniejszej analizy. 
		UWAGA: Całkowitą liczbę komórek można policzyć w sposób ślepy i można obliczyć procent dodatnich niebieskich komórek SA β-gal.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza cyklu komórkowego (rysunek 3B)
	<ol>
		<li>Wysiewać HDF o gęstości 8 x 104 komórki na studzienkę w naczyniu do hodowli komórkowych o średnicy 6 cm w pożywce HDF. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
		<li>Po całonocnej inkubacji należy wyrzucić połowę pożywki HDF i dodać mESC-CM oraz pożywkę kontrolną. Inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
		<li>Trypsynizować komórki, jak opisano krok w ppkt 3.1, i odwirowywać przez 5 minut przy 300 x g. Przemyć komórki zimnym roztworem PBS (PBS z 0,5 mM CaCl2 i 2% FBS, 1 ml na probówkę 1,5 ml) dwa razy i wirować przez 3 minuty przy 2 500 x g. Zawiesić w 100 μl zimnego roztworu PBS.</li>
		<li>Napraw komórki, upuszczając 200 μl zimnego etanolu podczas wirowania. Przechowywać w temperaturze 4 °C przez co najmniej 1 godzinę.</li>
		<li>Przemyć komórki dwukrotnie zimnym roztworem PBS, jak opisano w kroku 4.2.3.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki w 250 μl buforu cytrynianu sodu (1,12%, pH 8,5) zawierającego 50 μg/ml RNazy. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Dodać 250 μl buforu cytrynianu sodu zawierającego 50 μg/ml jodku propidyny. Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Zmierz 10 000 komórek w każdej próbce za pomocą cytometrii przepływowej20.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>qRT-PCR (Figura 3C)
	<ol>
		<li>Zastąp HDF i dodaj mESC-CM, jak opisano w krokach 4.1.1 i 4.1.2.</li>
		<li>Wyizoluj całkowite RNA z HDF za pomocą zestawu do ekstrakcji RNA zgodnie z protokołem producenta. Określić ilościowo wyekstrahowany całkowity RNA za pomocą spektrofotometru21.</li>
		<li>Zsyntetyzować cDNA poprzez dodanie 1 μg całkowitego RNA do 20 μl mieszaniny reakcyjnej zawierającej startery oligo (dT) i odwrotną transkryptazę M-MLV, zgodnie z protokołem producenta20.</li>
		<li>Zmierz amplifikację cDNA za pomocą maszyny do PCR w czasie rzeczywistym, używając głównej mieszanki Green PCR i specyficznych starterów genów (tabela suplementu 1). Znormalizuj dane za pomocą wyrażenia GAPDH. Stosować następujący protokół PCR: wstępna denaturacja przez 10 minut w temperaturze 95 °C; 45 cykli przez 15 sekund w temperaturze 95 °C, 20 sekund w temperaturze 55 °C i 35 sekund w temperaturze 72 °C; i etap krzywej topnienia przez 15 sekund w temperaturze 95 °C, 1 minutę w temperaturze 60 °C, 30 sekund w temperaturze 95 °C i 5 sekund w temperaturze 60 °C15.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Lavasani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle-derived+stem%2Fprogenitor+cell+dysfunction+limits+healthspan+and+lifespan+in+a+murine+progeria+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Muscle-derived stem/progenitor cell dysfunction limits healthspan and lifespan in a murine progeria model.</a> Nat Commun. 3, 608(2012).</li>
<li>Woo, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+and+indirect+contribution+of+human+embryonic+stem+cell-derived+hepatocyte-like+cells+to+liver+repair+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Direct and indirect contribution of human embryonic stem cell-derived hepatocyte-like cells to liver repair in mice.</a> Gastroenterology. 142, 602-611 (2012).</li>
<li>Lee, A. S., Tang, C., Rao, M. S., Weissman, I. L., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumorigenicity+as+a+clinical+hurdle+for+pluripotent+stem+cell+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Tumorigenicity as a clinical hurdle for pluripotent stem cell therapies.</a> Nat Med. 19, 998-1004 (2013).</li>
<li>Moon, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+for+treating+ischemic+disease+using+human+embryonic+stem+cell-derived+endothelial+cells+without+direct+incorporation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A system for treating ischemic disease using human embryonic stem cell-derived endothelial cells without direct incorporation.</a> Biomaterials. 32, 6445-6455 (2011).</li>
<li>Tongers, J., Roncalli, J. G., Losordo, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+angiogenesis+for+critical+limb+ischemia%3A+microvascular+therapies+coming+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Therapeutic angiogenesis for critical limb ischemia: microvascular therapies coming of age.</a> Circulation. 118, 9-16 (2008).</li>
<li>Lazarous, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+fibroblast+growth+factor+in+patients+with+intermittent+claudication%3A+results+of+a+phase+I+trial%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Coll+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Basic fibroblast growth factor in patients with intermittent claudication: results of a phase I trial.</a> J Am Coll Cardiol. 36, 1239-1244 (2000).</li>
<li>Adams, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Healing+and+hurting%3A+molecular+mechanisms%2C+functions%2C+and+pathologies+of+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Healing and hurting: molecular mechanisms, functions, and pathologies of cellular senescence.</a> Mol Cell. 36, 2-14 (2009).</li>
<li>Harrison, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapamycin+fed+late+in+life+extends+lifespan+in+genetically+heterogeneous+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapamycin fed late in life extends lifespan in genetically heterogeneous mice.</a> Nature. 460, 392-395 (2009).</li>
<li>Baur, J. A., Ungvari, Z., Minor, R. K., Le Couteur, D. G., de Cabo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+sirtuins+viable+targets+for+improving+healthspan+and+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Are sirtuins viable targets for improving healthspan and lifespan.</a> Nat Rev Drug Discov. 11, 443-461 (2012).</li>
<li>Martin-Montalvo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metformin+improves+healthspan+and+lifespan+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Metformin improves healthspan and lifespan in mice.</a> Nat Commun. 4, 2192(2013).</li>
<li>Loffredo, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+differentiation+factor+11+is+a+circulating+factor+that+reverses+age-related+cardiac+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Growth differentiation factor 11 is a circulating factor that reverses age-related cardiac hypertrophy.</a> Cell. 153, 828-839 (2013).</li>
<li>Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+mouse+embryonic+fibroblast+cells+suitable+for+culturing+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+to+detect+senescence-associated+beta-galactosidase+%28SA-betagal%29+activity%2C+a+biomarker+of+senescent+cells+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo.</a> Nat Protoc. 4, 1798-1806 (2009).</li>
<li>Bae, Y. U., Choi, J. H., Nagy, A., Sung, H. K., Kim, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisenescence+effect+of+mouse+embryonic+stem+cell+conditioned+medium+through+a+PDGF%2FFGF+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Antisenescence effect of mouse embryonic stem cell conditioned medium through a PDGF/FGF pathway.</a> FASEB J. 30, 1276-1286 (2016).</li>
<li>Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+completely+cell+culture-derived+mice+from+early-passage+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90, 8424-8428 (1993).</li>
<li>Li, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passage+number+affects+the+pluripotency+of+mouse+embryonic+stem+cells+as+judged+by+tetraploid+embryo+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Passage number affects the pluripotency of mouse embryonic stem cells as judged by tetraploid embryo aggregation.</a> Cell Tissue Res. 327, 607-614 (2007).</li>
<li>Mbeunkui, F., Fodstad, O., Pannell, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretory+protein+enrichment+and+analysis%3A+an+optimized+approach+applied+on+cancer+cell+lines+using+2D+LC-MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Secretory protein enrichment and analysis: an optimized approach applied on cancer cell lines using 2D LC-MS/MS.</a> J Proteome Res. 5, 899-906 (2006).</li>
<li>Makridakis, M., Vlahou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretome+proteomics+for+discovery+of+cancer+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Secretome proteomics for discovery of cancer biomarkers.</a> J Proteomics. 73, 2291-2305 (2010).</li>
<li>Kim, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+replicative+senescence+by+insulin-like+growth+factor-binding+protein+3+in+human+umbilical+vein+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of replicative senescence by insulin-like growth factor-binding protein 3 in human umbilical vein endothelial cells.</a> Aging Cell. 6, 535-545 (2007).</li>
<li>Kim, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+cellular+senescence+by+insulin-like+growth+factor+binding+protein-5+through+a+p53-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of cellular senescence by insulin-like growth factor binding protein-5 through a p53-dependent mechanism.</a> Mol Biol Cell. 18, 4543-4552 (2007).</li>
<li>Eiselleova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+mouse+and+human+feeder+cells+for+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells.</a> Int J Dev Biol. 52, 353-363 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W celu pomyślnego zebrania mESC-CM wolnego od surowicy i karmowiska, należy wziąć pod uwagę następujące sugestie. Najbardziej krytycznym czynnikiem jest wykorzystanie mESC wczesnego pasażu do zbierania mESC-CM. Wcześniej wykazano, że mESC-CM z wczesnym pasażem ma lepsze działanie przeciwstarzeniowe w porównaniu z mESC z późnym pasażem. Doniesiono, że liczba pasaży mESC wpływa na ich potencjał rozwojowy16 i pluripotencję17.
Chociaż potrzebne są dodatkowe badania w celu prz...

Celem tego protokołu jest zebranie pożywki kondycjonowanej przez embrionalne komórki macierzyste myszy (mESC-CM) z hodowli wolnej od surowicy i karmy oraz scharakteryzowanie jej funkcji biologicznych.
Ogólnie rzecz biorąc, embrionalne komórki macierzyste (ESC) mają duży potencjał dla medycyny regeneracyjnej i terapii komórkowej ze względu na ich pluripotencję i zdolność do samoodnawiania1-3. Jednak bezpośredni przeszczep komórek macierzystych ma kilka ograniczeń, takich jak odrzucenie immunologiczne i powstawanie guza4,5. W związku z tym podejście bezkomórkowe może stanowić alternatywną strategię terapeutyczną dla medycyny regeneracyjnej i interwencji związanych ze starzeniemsię 6,7.
Starzenie się jest postrzegane jako komórkowy odpowiednik starzenia się tkanek i organów, charakteryzujący się ciągłym stanem zatrzymania wzrostu, zmienioną fizjologią komórki i zachowaniami. Starzenie się jest głównym czynnikiem ryzyka powszechnych chorób, w tym raka, chorób układu krążenia, cukrzycy typu 2 i neurodegeneracji8. Jedną z oczywistych cech starzenia się jest spadek potencjału regeneracyjnego tkanek, który jest spowodowany starzeniem się i wyczerpaniem komórek macierzystych9. Wiele znaczących badań wykazało, że cząsteczki farmakologiczne, takie jak rapamycyna9, resweratrol10 i metformina11, oraz czynniki ogólnoustrojowe przenoszone przez krew, a mianowicie GDF1112, mają zdolność konsekwentnego opóźniania starzenia się i wydłużania życia.
W obecnym badaniu, mESC-CM został pobrany bez warstwy surowicy (płodowa surowica bydlęca, FBS) i feedera (mysie fibroblasty embrionalne, MEF), aby wykluczyć zanieczyszczenie czynników surowicy i czynników wydzielniczych z MEF. Warunki te pozwoliły na uzyskanie CM wolnego od surowicy i karmy, co w konsekwencji umożliwiło dokładną identyfikację czynników wydzielniczych specyficznych dla mESC.
Ten proponowany protokół jest bardzo wydajny, stosunkowo opłacalny i łatwy w obsłudze. Technika ta zapewnia wgląd w charakterystykę rozpuszczalnych czynników pochodzących z mESC, które mogą pośredniczyć w efekcie przeciwstarzeniowym, co może być wykorzystane do opracowania bezpiecznego i potencjalnie korzystnego podejścia terapeutycznego bez komórek w kierunku interwencji w przypadku chorób związanych ze starzeniem się i innych zabiegów regeneracyjnych.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>#11960-044</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>#30044333</td><td>20%, jakość komórek ES</td></tr><tr><td>Penicylina i streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>#15140</td><td>50 jednostek/ml penicyliny i 50&nbsp; mg/ml streptomycyna</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>#25030</td><td>2&nbsp; mM</td></tr><tr><td>Aminokwasy endogenne (NEAA)</td><td>Invitrogen</td><td>#11140</td><td>100&nbsp; &mikro; M</td></tr><tr><td>&beta;-merkaptoetanol&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#M3148</td><td>100&nbsp; &mikro; </td></tr><tr><td>M Czynnik hamujący białaczkę&nbsp;</td><td>Milipore</td><td>#ESG1107</td><td>100 jednostek/ml</td></tr><tr><td>OPTI-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>#22600</td><td></td></tr><tr><td>X-gal&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#B4252</td><td>1 mg/ml</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>3,70%</td></tr><tr><td>Dimetyloformamid (DMF)</td><td>Sigma</td><td>#D4551</td><td></td></tr><tr><td>Żelazocyjanek potasu</td><td>Aldrich</td><td>#455946</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>żelazocyjanek potasu</td><td>Aldrich</td><td>#455989</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>#S7653</td><td>150 mM</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>#M2393</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>Mitomycyna C</td><td>Sigma</td><td>#M4287</td><td>10&nbsp; &mikro; g/ml</td></tr><tr><td>jodku propidyny&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#P4170</td><td>50&nbsp; &mikro; g/ml</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Ambion</td><td>#15596018</td><td></td></tr><tr><td>M-MLV odwrotna transkrypcja</td><td>Promega</td><td>#M170B</td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR Green PCR master mix&nbsp;</td><td>Biosystemy stosowane</td><td>#4367659</td><td></td></tr><tr><td>HDF, NHDF-Ad-Der-Fibroblast&nbsp;</td><td>LONZA</td><td>#CC-2511</td><td></td></tr><tr><td>Filtr butelkowy</td><td>Corning</td><td>#430513</td><td>0,2 &mu; mln</td></tr></tbody></table>

kolekcja pożywki kondycjonowanej komórkami macierzystymi myszy bez surowicy i karmy dla podejścia bezkomórkowego

Collection of Serum- and Feeder-free Mouse Embryonic Stem Cell-conditioned Medium for a Cell-free Approach

Zdolność embrionalnych komórek macierzystych (ESC) i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) do generowania różnych typów komórek otworzyła nowe możliwości w dziedzinie medycyny regeneracyjnej. Jednak pomimo korzyści, jakie płyną przeciwko nim, potencjał rakotwórczy ESC i iPSC od dawna stanowi barierę dla zastosowań klinicznych. Co ciekawe, wykazano, że ESC wytwarzają kilka rozpuszczalnych czynników, które mogą promować regenerację tkanek i opóźniać starzenie się komórek, co sugeruje, że ESC i iPSC mogą być również wykorzystywane jako metoda interwencji bezkomórkowej. W związku z tym istnieje duże zapotrzebowanie na metodę pobierania pożywki kondycjonowanej mysimi embrionalnymi komórkami macierzystymi (mESC) przy minimalnym zanieczyszczeniu składników surowicy (płodowa surowica bydlęca, FBS) i komórek żywicielskich (mysie fibroblasty zarodkowe, MEF). W tym miejscu niniejsze badanie demonstruje zoptymalizowaną metodę zbierania mESC-CM w warunkach wolnych od surowicy i karmowicy oraz charakterystyki mESC-CM przy użyciu wielokrotnych odczytów związanych ze starzeniem. Protokół ten zapewni metodę zbierania czystych czynników wydzielniczych specyficznych dla mESC bez zanieczyszczenia surowicy i karmowicy.

Pierwotnie mESC są utrzymywane na warstwie karmidła MEF w pożywce mESC z dodatkiem FBS i innych suplementów (Rysunki 1A i 2A). CM było zbierane z mESC w pożywce z obniżoną zawartością surowicy (Reduced Serum Media) bez warstwy karmidła, FBS lub innych suplementów (Rysunki 1B i 2B). Takie warunki hodowli pozwalają na zebranie specyficznej dla mESC pożywki warunkowanej bez potencjalnego zanieczyszczenia czynnikami pochodząc...

Ten protokół zapewnia metodę pobierania pożywki kondycjonowanej przez embrionalne komórki macierzyste myszy (mESC-CM) pochodzących z surowicy (płodowej surowicy bydlęcej, FBS) i karmowiska (mysie fibroblasty embrionalne, MEFs) dla podejścia wolnego od komórek. Może mieć zastosowanie w leczeniu starzenia się i chorób związanych ze starzeniem się.

Kolekcja pożywki kondycjonowanej komórkami macierzystymi myszy bez surowicy i karmy dla podejścia bezkomórkowego

The capacity of embryonic stem cells (ESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs) to generate various cell types has opened new avenues in the field ...

Ogólnym celem tego protokołu jest zebranie kondycjonowanej pożywki z embrionalnych komórek macierzystych myszy w warunkach hodowli wolnej od surowicy i karmy oraz scharakteryzowanie funkcji biologicznych tej pożywki. Procedura ta dostarcza informacji na temat aktywności przeciwstarzeniowej rozpuszczalnych czynników wydzielanych z embrionalnych komórek macierzystych myszy w celu opracowania bezpiecznego i bezkomórkowego podejścia terapeutycznego w chorobach związanych z wiekiem. Tę procedurę zademonstruje dr Yun-Ui Bae, profesor naukowy mojego laboratorium.W kapturze bezpieczeństwa biologicznego potraktuj fibroblasty embrionalne myszy lub hodowlę komórkową MEF za pomocą 20 mililitrów pożywki MEF uzupełnionej mitomycyną C w 15-centymetrowym naczyniu do hodowli komórkowej przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Pod koniec inkubacji umyj komórki trzykrotnie PBS i odłącz je trzema mililitrami trypsyny EDTA na trzy minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Neutralizacja trypsyny za pomocą sześciu mililitrów świeżej pożywki MEF, gdy komórki uniosą się z dna płytki.Po zebraniu komórek przez odwirowanie, ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach pożywki MEF i płytkę dwa razy od 10 do szóstego inaktywowanego MEF na 10-centymetrową pożywkę hodowlaną w świeżej pożywce MEF. Hoduj komórki karmiciela przez 24 godziny. Następnie zastąp pożywkę MEF pożywką z embrionalnych komórek macierzystych myszy i wysiewaj dwa razy 10 do szóstych embrionalnych komórek macierzystych myszy na karmnikach przez co najmniej 48 godzin wspólnej hodowli.W kapturze bezpieczeństwa biologicznego przepłucz płytkę z embrionalnymi komórkami macierzystymi myszy pięcioma mililitrami PBS i odłącz komórki trypsyną i EDTA, jak właśnie pokazano. Po zebraniu komórek przez odwirowanie, ponownie zawiesić osad komórek macierzystych w pięciu mililitrach świeżej pożywki z komórek macierzystych i poszczepić jeden mililitr komórek na naczyniu w świeżej pożywce z embrionalnych komórek macierzystych na pięciu pokrytych żelatyną szalkach do hodowli komórkowych. Umieść komórki z powrotem w inkubatorze, aż kultury osiągną 80-85% zbieżności.Następnie przepłukać komórki w co najmniej ośmiu mililitrach PBS na płytkę przez trzy 10-minutowe płukania, a następnie 24-godzinną inkubację w zredukowanej pożywce surowicy. Po nie więcej niż 24 godzinach przenieść supernatant do 50-mililitrowej stożkowej probówki w celu odwirowania. Następnie następuje filtracja przez sitko o średnicy 0,2 mikrometra.Aby przetestować działanie pożywki kondycjonowanej embrionalnymi komórkami macierzystymi za pomocą testu beta galaktozydazy związanej ze starzeniem, należy wysiać ludzkie fibroblasty skóry na sześciodołkowej płytce w ludzkim pożywce z fibroblastami skóry. Po całonocnej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, zastąp połowę pożywki świeżą pożywką kondycjonowaną embrionalnymi komórkami macierzystymi myszy na kolejną 72-godzinną hodowlę. W trzecim dniu hodowli przepłucz komórki w dwóch mililitrach PBS na studzienkę przez dwa 30-sekundowe płukania.Następnie utrwal komórki w 3,7% paraformaldehydzie przez pięć minut w temperaturze pokojowej w dygestorium. Po utrwaleniu umyj komórki dwa razy dwoma mililitrami PBS, jak właśnie pokazano, i oznacz komórki jednym do dwóch mililitrów roztworu SA beta gal przez 17 i pół godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza bez dwutlenku węgla. Pod koniec okresu barwienia przemyj komórki dwa razy PBS, jak właśnie pokazano.Następnie przeciwplamić Eosenem przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po kolejnym zestawie płukania PBS zobrazuj komórki w 100-krotnym powiększeniu za pomocą mikroskopii świetlnej. Do analizy cyklu komórkowego wysiewaj osiem razy 10 do czwartego ludzkiego fibroblastu skórnego na studzienkę w sześciocentymetrowym naczyniu do hodowli komórkowej w świeżej ludzkiej pożywce z fibroblastów skórnych do nocnej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.Następnego ranka zastąp połowę pożywki pożywką kondycjonowaną mysimi embrionalnymi komórkami macierzystymi i włóż komórki z powrotem do inkubatora. Po 24 godzinach zbierz komórki przez dysocjację trypsyny EDTA, a następnie dwa przemycia w jednym mililitrze roztworu PBS. Po drugim praniu ponownie zawiesić granulat w 100 mikrolitrach zimnego roztworu PBS.Następnie utrwal komórki za pomocą kropli w 200 mikrolitrach zimnego etanolu podczas wirowania. Przechowuj komórki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez co najmniej godzinę. Następnie umyj je w świeżym roztworze PBS.Po drugim odwirowaniu potraktuj osad 250 mikrolitrami buforu cytrynianu sodu uzupełnionego RNazą przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza bez dwutlenku węgla. Pod koniec inkubacji oznaczyć komórki 250 mikrolitrami buforu cytrynianu sodu zawierającego jodek propidyny przez 20 minut. Następnie oceń etapy cyklu komórkowego każdej próbki za pomocą cytometrii przepływowej.Do ilościowej analizy PCR z odwrotną transkryptazą należy użyć zestawu do ekstrakcji RNA, aby wyizolować całkowite RNA z ludzkich fibroblastów skóry poddanych działaniu embrionalnych komórek macierzystych myszy zgodnie z protokołem producenta. Użyj spektrofotometru, aby określić ilościowo całkowity wyekstrahowany RNA. Następnie sformułować mieszaninę reakcyjną zawierającą startery oligo deoksytymidyny i odwrotną transkryptazę M-MLV zgodnie z protokołem producenta.Następnie dodać jeden mikrogram całkowitego RNA do probówki PCR zawierającej mieszaninę reakcyjną. Na koniec zmierz amplifikację CDNA za pomocą maszyny do PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu zielonej mieszanki głównej PCR i odpowiednich starterów genowych. Embrionalne komórki macierzyste myszy wyhodowane w normalnych warunkach hodowli embrionalnych komórek macierzystych myszy na warstwie komórek zasilających MEF mają owalny kształt i błyszczący wygląd.Podczas gdy embrionalne komórki macierzyste myszy hodowane w warunkach hodowli wolnej od surowicy i karmnika wykazują spłaszczoną i nieregularną morfologię. Leczenie starzejącego się ludzkiego fibroblastu skóry pożywką kondycjonowaną mysimi embrionalnymi komórkami macierzystymi zmniejsza liczbę komórek betagalaktozydazy związanych ze starzeniem się. Co więcej, analiza cyklu komórkowego tych komórek ujawnia, że leczenie pożywką kondycjonowaną embrionalnymi komórkami macierzystymi myszy radykalnie zwiększa liczbę komórek w fazach S i G2/M, jednocześnie zmniejszając liczbę komórek w fazie G0/G1.Ponadto leczenie pożywką kondycjonowaną embrionalnymi komórkami macierzystymi myszy zmniejsza ekspresję genów związanych ze starzeniem się i cytokin sekretarskich związanych z fenotypem starzenia. Podejmując tę procedurę, bardzo ważne jest, aby pamiętać o zebraniu surowicy i pożywki wolnej od pożywki po 24 godzinach, ponieważ długa inkubacja zwiększa możliwość autolizy lub apoptozy komórek przez zagłodzenie. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zbierać surowicę i pożywkę kondycjonowaną embrionalnymi komórkami macierzystymi myszy bez karmy, aby uzyskać podejście wolne od komórek.Nie zapominaj, że praca z odczynnikiem, takim jak paraformaldehyd, może być bardzo niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak obchodzenie się z tym odczynnikiem w dygestorium.

collection-serum-feeder-free-mouse-embryonic-stem-cell-conditioned

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Jakość embrionalnych fibroblastów mysich (MEFs) zależy od wyboru odpowiedniego szczepu myszy, takiego jak CF-1. MEFs wspierające pluripotencję oraz pożywka warunkowana (CM) uzyskana z tych komórek powinny zawierać optymalne stężenia Activin A, Gremlin oraz Tgfβ1, które są niezbędne do współdziałania szlaków Activin/Nodal i FGF w celu utrzymania samoodnawiania i pluripotencji.

Przygotowanie komórek fibroblastów zarodkowych myszy odpowiednich do hodowli ludzkich embrionalnych i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten film przedstawia metodę generowania prekursorów interneuronów korowych z embrionalnych komórek macierzystych myszy. Protokół zakłada hodowlę komórek macierzystych w pożywkach zawierających specyficzne inhibitory małocząsteczkowe, które ułatwiają proliferację i agregację komórek macierzystych w ciała zarodkowe (EB). Następnie EB są dysocjowane z enzymami i siane na płytkach hodowlanych pokrytych białkami adhezyjnymi, aby promować ich różnicowanie w prekursory interneuronów korowych.

Generowanie prekursorów interneuronów korowych z embrionalnych komórek macierzystych myszy

Ten film demonstruje metodę generowania in vitro nerwowych komórek progenitorowych (NPC) z embrionalnych komórek macierzystych myszy (mESC). MESC są hodowane w zawiesinie w celu wytworzenia ciał embrionalnych (EB), które są następnie kierowane do różnicowania się w NPC poprzez traktowanie kwasem retinowym w kulturze adherentnej.

Technika generowania nerwowych komórek progenitorowych z embrionalnych komórek macierzystych myszy

Surowica stosowana w hodowlach embrionów zawiera nieznane składniki, które mogą wpływać na wynik eksperymentów, szczególnie w badaniach dotyczących interakcji sygnałowych. Tutaj wykorzystaliśmy system hodowli natlenionej bez surowicy i wykazaliśmy, że zarodki myszy w połowie ciąży hodowane przez 16-40 godzin wykazują rozwój morfologiczny porównywalny z zarodkami rozwijającymi się w macicy.

Rozwój embrionalny myszy w systemie hodowli całych zarodków bez surowicy

Mysie embrionalne komórki macierzyste mogą być różnicowane do limfocytów T in vitro za pomocą systemu kohodowli OP9-DL1. Powodzenie tej procedury wymaga zwrócenia szczególnej uwagi na konserwację odczynnika/ogniwa oraz kluczowych kroków wrażliwych na technikę. W tym miejscu omawiamy te krytyczne parametry i przedstawiamy szczegółowy protokół, aby zachęcić do przyjęcia tej technologii.

Wyprowadzanie limfocytów T in vitro z embrionalnych komórek macierzystych myszy

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę generowania neuronalnych komórek progenitorowych z embrionalnych komórek macierzystych przy użyciu metody monowarstwowej bez surowicy. Te progenitory mogą być wykorzystywane do uzyskiwania dojrzałych typów komórek nerwowych lub do badania procesu specyfikacji neuronalnej i są podatne na skalowanie w formacie wielodołkowym w celu przeprowadzenia badań przesiewowych związków.

Różnicowanie neuronalne embrionalnych komórek macierzystych myszy w hodowli jednowarstwowej bez surowicy

Białka często zawierają wiele domen, które mogą pełnić różne funkcje komórkowe. Nokauty genów (KO) nie uwzględniają tej różnorodności funkcjonalnej. W tym miejscu przedstawiamy podejście oparte na wymianie kasetowej za pośrednictwem rekombinacji (RMCE) oparte na strukturze i funkcji w embrionalnych komórkach macierzystych KO, które pozwala na molekularną sekcję różnych domen funkcjonalnych lub wariantów białka.

Badania strukturyczno-funkcjonalne w embrionalnych komórkach macierzystych myszy z wykorzystaniem wymiany kasetowej za pośrednictwem rekombinazy

Ten artykuł opisuje protokół efektywnego pozyskiwania i hodowli pluripotencjalnych linii komórek macierzystych z embrionów myszy w stadium blastocysty.

Pozyskiwanie linii komórek macierzystych z zarodków myszy przed implantacją

Ten protokół opisuje metodę generowania prekursorów interneuronów korowych i prekursorów interneuronów postmitotycznych z embrionalnych komórek macierzystych myszy przy użyciu zmodyfikowanej metody embrionalnej ciała do monowarstwy. Te progenitory/prekursory mogą być używane in vitro lub sortowane fluorescencyjnie i przeszczepiane do kory nowej noworodka w celu badania determinacji losu lub wykorzystywane w zastosowaniach terapeutycznych.

Różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych myszy w prekursory interneuronów korowych

Opisaliśmy szczegółowo dwa protokoły chemiczne do hodowli embrionalnych komórek macierzystych myszy. Ta nowa metoda wykorzystuje synergiczne mechanizmy promowania utleniania za pośrednictwem Tet (przez witaminę C) i tłumienia syntezy de novo 5-metylocytozyny (przez PD0325901) w celu utrzymania hipometylacji DNA i pluripotencji embrionalnych komórek macierzystych myszy.

Alternatywna metoda hodowli w celu utrzymania genomowej hipometylacji embrionalnych komórek macierzystych myszy przy użyciu inhibitora MEK PD0325901 i witaminy C

Tutaj opisujemy metody wykonywania ChIP-Seq i CARIP-Seq, w tym przygotowanie biblioteki do sekwencjonowania nowej generacji, do generowania globalnych epigenomicznych i związanych z chromatyną map RNA w komórkach ES.

CARIP-Seq i ChIP-Seq: Metody identyfikacji RNA związanych z chromatyną i interakcji białko-DNA w embrionalnych komórkach macierzystych

Poznaj metodę zbierania pożywki kondycjonowanej komórkami macierzystymi myszy bez surowicy i karmy. Technika ta pozwala badać przeciwstarzeniowe właściwości czynników rozpuszczalnych dla bezpiecznego podejścia terapeutycznego.

Kolekcja pożywki kondycjonowanej komórkami macierzystymi myszy bez surowicy i karmy dla podejścia bezkomórkowego

Przeglądaj więcej filmów