Izolacja i analiza cytometryczna przepływowa ludzkich komórek T gamma Delta w obrębie szyjki macicy

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie i scharakteryzowanie niekonwencjonalnej populacji komórek T gamma delta komórek śródnabłonkowych z ludzkiej próbki szczoteczki wewnątrzszyjkowej. Metoda ta może pomóc w zrozumieniu kluczowych pytań dotyczących zdarzeń immunologicznych w obrębie śródnabłonkowego przedziału szyjki macicy, aby pomóc w projektowaniu skutecznych strategii zapobiegania infekcjom. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona potężne i skuteczne narzędzie do badania śródnabłonkowych limfocytów T gamma delta szyjki macicy in vitro.

Procedurę zademonstruje Laura Romero, starszy pracownik naukowy z mojego laboratorium. Natychmiast po pobraniu umieść probówkę zawierającą cytoszczarkę na lodzie. W ciągu godziny od pobrania należy wirować probówkę zawierającą cytoszczotę przez cztery impulsy po 10 sekund.

Następnie odwiruj probówkę i ostrożnie wyjmij szczotkę, nie naruszając palety. Następnie dodaj jeden mililitr pożywki IMDM do komórek i umieść probówkę na lodzie. Umieść cytoszczoteczkę na 100-milimetrowym sitku komórkowym w stożkowej tubie o pojemności 50 mililitrów i umyj pędzel 20 mililitrami świeżego IMDM.

Odwirować pranie. Ponowne zawieszenie palety w jednym mililitrze świeżego IMDM i połączenie z płukaniem z komórkami w oryginalnej probówce do pobierania cytoszczoteczek. Aby przeanalizować komórki szyjki macicy za pomocą cytometrii przepływowej, należy podać od jednej do trzech razy od 10 do piątej komórki w 100 mikrolitrach buforu faksowego na pięciomililitrową probówkę i oznaczyć komórki interesującymi przeciwciałami i barwnikiem żywotności przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności.

Pod koniec inkubacji umyć komórki w jednym mililitrze buforu zestawu. Po odwirowaniu komórek należy całkowicie zdekantować supernatant. Użyj kulek i odpowiednich przeciwciał kontrolnych IgG, aby ustawić kontrole kompensacji.

Następnie załaduj pierwszą rurkę i ustaw bramkę na całkowitej populacji komórek szyjki macicy na wykresie rozrzutu do przodu po bokach, a następnie z wykluczeniem dubletów komórkowych. Wyklucz martwe komórki zgodnie z ich żywotnością, ekspresją barwnika, bramkując na żywych komórkach CD45 dodatnich i CD3-dodatnich. Komórki gamma delta jeden i gamma delta dwa dodatnie są definiowane jako subpopulacje komórek CD3-dodatnich, które wyrażają TCR gamma delta.

Aby wyizolować limfocyty T gamma delta przez izolację kulek magnetycznych, ponownie zamieszaj do jednego razy 10 do siódmych świeżo zebranych komórek szyjki macicy w 40 mikrolitrach buforu TCR gamma delta MicroBead kit. Postępując zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi dwuetapowego protokołu barwienia, oznacz komórki przeciwciałem haptenowym anty-TCR gamma delta, a następnie anty-haptenowymi mikrokulkami sprzężonymi z FITC przez 15 minut w temperaturze od czterech do ośmiu stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji umyć komórki w jednym mililitrze buforu zestawu i całkowicie zdekantować supernatant.

Ponownie zawiesić ogniwa w 500 mikrolitrach buforu zestawu i nałożyć zawiesinę ogniw bezpośrednio na kolumnę z kulkami magnetycznymi umieszczoną w odpowiednim magnesie separatora, zbierając przepływ w nowej probówce. Gdy wszystkie komórki przejdą przez kolumnę, przemyj kolumnę trzykrotnie 500 mikrolitrami świeżego buforu i połącz popłuczyny z zebranymi komórkami. Aby zebrać limfocyty T gamma delta, przenieś kolumnę do stożkowej rurki i użyj tłoka kolumny, aby przepłukać komórki T z kolumny jednym mililitrem świeżego buforu.

Aby wyizolować limfocyty T gamma delta przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją, oznacz komórki barwnikiem żywotności w panelu przeciwciał, jak właśnie pokazano. Następnie posortuj komórki według ich żywotnego barwnika oraz dodatniego wyniku CD45, CD3 i gamma delta. Unikalna populacja limfocytów T wykazujących ekspresję gamma delta V1 może być łatwo wykryta w próbkach ludzkich komórek szyjki macicy.

Szczegółowa analiza fenotypowa bramkowanych komórek CD3 dodatnich gamma delta one ujawnia, że większość tych komórek jest CD4 i CD8 ujemna. Magnetyczne oddzielenie komórek szyjki macicy, jak właśnie wykazano, powoduje oczyszczenie prawie 98% czystej populacji tych komórek gamma delta TCR. Ten poziom czystości można również osiągnąć poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją, co potwierdza zastosowanie obu technik do izolacji komórek T gamma delta szyjki macicy.

Co ciekawe, analiza śródnabłonkowych komórek śródnabłonkowych szyjki macicy, limfocytów T gamma delta, pobranych od pacjentek zakażonych wirusem HIV i zdrowych dawców z grupy kontrolnej, wykazuje niewielkie zmniejszenie liczby i żywotności tych ważnych komórek u osób zakażonych wirusem HIV. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch do trzech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o szybkim przetworzeniu próbki i utrzymywaniu komórek na lodzie przez cały czas trwania procedury, aby utrzymać dobrą żywotność komórek.

Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak sortowanie pojedynczych komórek w połączeniu z multipleksowym PCR o wysokiej czułości, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące szlaków zapalnych i sygnałowych w śródnabłonkowym przedziale szyjki macicy. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się HIV i chorobami zakaźnymi do zbadania nowych markerów komórkowych wrażliwości błony śluzowej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować limfocyty śródnabłonkowe z próbki ludzkiej szczoteczki do szyjki macicy.