Name: Izolacja i analiza cytometryczna przepływowa ludzkich komórek T gamma Delta w obrębie szyjki macicy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-06T10:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Poznaj metodę izolacji i analizy cytometrycznej komórek T gamma delta z szyjki macicy. Technika umożliwia badanie odpowiedzi immunologicznej in vitro i wspiera projektowanie strategii zapobiegania infekcjom.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy uczestnikom badania WIHS w Miami za chęć udziału w tej pracy. Dane zawarte w tym manuskrypcie zostały zebrane przez Miami Women's Interagency HIV Study (WIHS). Wyłączną odpowiedzialność za treść tej publikacji ponoszą autorzy i nie reprezentują one oficjalnych poglądów National Institutes of Health (NIH). Prace te były wspierane przez National Institute of Allergy and Infectious Diseases oraz Women's Interagency HIV Infection Study (WIHS) [numer grantu U01 AI103397], National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health [numer grantu P30AI073961], National Center for Advancing Translational Sciences oraz National Institute on Minority Health and Health Disparities, National Institute of Health [numer grantu UL1TR000460 i 1KL2TR000461], oraz National Institute of Child Health and Human Development, National Institute of Health [ grant nr K23HD074489].

Zajęcia badawcze odbyły się w Jednostce Badawczej HIV Uniwersytetu w Miami we współpracy z Miami Women's HIV Interagency Study (WIHS) i Miami Center for AIDS Research (CFAR). Zgoda Institutional Review Board (University of Miami Miller School of Medicine) została uzyskana przed rekrutacją i wszelkimi procedurami związanymi z oceną lub badaniem.
1. Pobieranie próbek szczoteczki do szyjki macicy
UWAGA: Uczestniczki przeszły badanie pochwy wykonane przez przeszkolonego lekarza lub ginekologa, a pobranie limfocytów śródnabłonkowych zostało przeprowadzone pod kątem wziernika poprzez wprowadzenie cytoszczotki.
<ol>
	<li>Charakterystyka uczestników
	<ol>
		<li>Rekrutacja uczestniczek w wieku od 18 do 45 lat, aktywnych seksualnie, niebędących w ciąży i nieprzyjmujących leków antykoncepcyjnych lub z wkładką wewnątrzmaciczną.</li>
		<li>Przed badaniem dopochwowym poproś uczestniczki o pobranie 10 ml krwi w zielonych górnych wakutainerach heparyny do izolacji komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC). Służy jako kontrola do śródnabłonkowej analizy śródnabłonkowej szyjki macicy<klasa SUP="xref">9.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobieranie próbek z szyjki macicy
	<ol>
		<li>Włóż sterylny wziernik o odpowiedniej wielkości do pochwy bez smarowania. Użyj ciepłej wody, aby ułatwić wprowadzenie wziernika i sterylnej gazy, aby oczyścić śluz. Położenie wziernika pozwala na pełną wizualizację szyjki macicy i szyjki macicy.</li>
		<li>Włóż szczoteczkę do szyjki macicy do kanału szyjki macicy, aż widoczne będą tylko włosie znajdujące się najbliżej dłoni. Obróć szczotkę zgodnie z ruchem wskazówek zegara o 360°. Przenieś pędzel do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml pożywki IMDM.</li>
		<li>Natychmiast po pobraniu umieść probówkę zawierającą cytobrush na lodzie. Aby uzyskać wysoką żywotność pobranych komórek śródnabłonkowych, należy dostarczyć cytoszczotę do laboratorium i przetworzyć w ciągu 1 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przetwarzanie próbek cytoszczotek do szyjki macicy
<ol>
	<li>Rurka wirowa zawierająca cytoszczarkę do szyjki macicy, wykonując 4 krótkie (10 sekund) pociągnięcia.</li>
	<li>Odwirować probówkę zawierającą cytoszczotę przez 10 minut przy 250 x g.</li>
	<li>Ostrożnie wyjmij cytoszczotę z probówki (nie naruszaj osadu na dnie probówki) i dodaj 1 ml pożywki IMDM i umieść probówkę na lodzie.</li>
	<li>Umieść cytoszczotę na sitku o średnicy 100 mm na górze probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Umyj cytoszczoteczkę 20 ml IMDM.</li>
	<li>Probówka wirówkowa przez 10 minut przy 250 x g.</li>
	<li>Zdekantować supernatant i granulowane komórki ponownie zawiesić w 1 ml IMDM i połączyć z już ponownie zawieszonym osadem opisanym w ppkt 2.3.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek10 lub policz komórki za pomocą hemocytometru, łącząc 10 μl zawiesiny komórek z 10 μl barwnika błękitu trypanowego. Delikatnie pipetuj w górę i w dół dziesięć razy, aby wymieszać komórki i barwnik. Załadować 10 μl mieszaniny do otworu jednej z dwóch komór hemocytometru. Policz wszystkie komórki w pięciu obszarach siatki. Prowadź oddzielną liczbę komórek zdolnych do życia i niezdolnych do życia. Określ żywotność komórki, korzystając z następującego wzoru: % komórek żywotnych = komórki niezdolne do życia x 100/całkowita liczba komórek komórek. 
	Określ kolejne stężenie komórek na ml (i całkowitą liczbę komórek), korzystając z następujących obliczeń. Całkowita liczba komórek na ml = całkowita liczba zliczonych komórek x (współczynnik rozcieńczenia/ liczba zliczonych kwadratów) x 10 000 komórek/ml.</li>
	<li>Zamrażać izolowane komórki szyjki macicy za pomocą pożywki zamrażającej zawierającej 10% DMSO i 90% FBS.</li>
</ol>
3. Cytometria przepływowa
<ol>
	<li>Ponownie zawiesić 1-3 x 105 komórek szyjki macicy w 100 μl buforze FACS (PBS zawierający 1% albuminy surowicy bydlęcej</li>
	<li>Dodać 1 μL/106 LIVE/DEAD Zestaw do barwienia żółtych martwych komórek i przeciwciała dla markerów powierzchniowych w stężeniach opisanych w tabeli 1.</li>
	<li>Inkubować komórki przez 30 minut w temperaturze +4 °C, chronić przed światłem.</li>
	<li>Dodać 1 ml buforu FACS oraz komórki i probówki wirówkowe przez 5 minut przy 350 x g</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad komórkowy w 300 μl 1% paraformaldehydu.</li>
	<li>Przygotować kontrole kompensacyjne przy użyciu kulek i przeciwciał używanych do barwienia, dodając 100 μl buforu FACS i jedną kroplę kulek oraz takie samo stężenie przeciwciał użytych do barwienia próbki.</li>
	<li>Pobieraj barwione kulki i próbki na cytometrze przepływowym, wyposażonym w lasery o długości fali 405 nm, 488 nm i 635 nm.</li>
</ol>
4. Izolacja komórek T Gamma delta szyjki macicy
<ol>
	<li>Izolacja magnetyczna
	<ol>
		<li>Zawiesić ponownie osad komórek szyjki macicy (≤107 komórek ogółem), opisany w ppkt 2.6, w 40 μl buforu zawartego w zestawie mikrokulek gamma delta TCR, o którym mowa w Tabeli materiałów i odczynników.</li>
		<li>Postępuj zgodnie z instrukcjami zestawu dotyczącymi dwuetapowego protokołu barwienia: po pierwsze, za pomocą przeciwciała anty-TCR gamma delta Hapten-Antibody, a po drugie, za pomocą mikrokulek anty-haptenowych-FITC</li>
		<li>Po 15 minutach inkubacji w temperaturze 4-8 °C, przemyć komórki, dodając 1 ml buforu i odwirować przy 300 x g przez 10 minut. Zdekantować supernatant przez odwrócenie probówki i stuknąć do sucha za pomocą kartki papieru.</li>
		<li>Ponownie zawiesić osad komórkowy w 500 μl dostarczonego buforu i przygotować kolumnę magnetyczną, umieszczając ją w odpowiednim separatorze magnetycznym zgodnie z protokołem dostawcy.</li>
		<li>Nałożyć zawiesinę komórek na kolumnę i zebrać nieznakowane komórki, które przez nią przechodzą, a następnie przemyć kolumnę 3x odpowiednią ilością buforu (500 μL). Wykonaj kroki mycia, dodając bufor trzy razy, za każdym razem po opróżnieniu zbiornika kolumny. Zebrać ścieki całkowite. Jest to nieznakowana, ujemna frakcja komórkowa</li>
		<li>Wyjąć kolumnę z separatora magnetycznego i odpipetować 1 ml buforu na kolumnę i natychmiast wypłukać frakcję z magnetycznie znakowanymi komórkami, mocno naciskając tłok dostarczony z kolumną. 
		UWAGA: Izolowane limfocyty T gamma delta są już barwione fluorescencyjnie do analizy cytometrycznej przepływowej, ponieważ znakowane magnetycznie mikrogranulki anty-haptenowe są sprzężone z barwnikiem fluorescencyjnym FITC.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sortowanie komórek
	<ol>
		<li>W celu sortowania komórek oznacz komórki szyjki macicy matrycą żywotności i panelem przeciwciał, jak opisano w sekcji 3.</li>
		<li>Ustaw bramki elektroniczne na żywych, CD45+, CD3+ i komórkach gamma delta-dodatnich i wykonaj sortowanie komórek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Kaul, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genital+tract+immune+milieu%3A+an+important+determinant+of+HIV+susceptibility+and+secondary+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Immunol%22%5BJournal%5D)">The genital tract immune milieu: an important determinant of HIV susceptibility and secondary transmission.</a> J Reprod Immunol. 77, 32-40 (2008).</li>
<li>Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+early+infection+to+prevent+HIV-1+mucosal+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Targeting early infection to prevent HIV-1 mucosal transmission.</a> Nature. 464, 217-223 (2010).</li>
<li>Hayday, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gamma%5D%5Bdelta%5D+cells%3A+a+right+time+and+a+right+place+for+a+conserved+third+way+of+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">gamma][delta] cells: a right time and a right place for a conserved third way of protection.</a> Ann Rev Immunol. 18, 975-1026 (2000).</li>
<li>Nakasone, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+gamma%2Fdelta+T+cells+in+the+lungs+and+their+roles+in+neutrophil-mediated+host+defense+against+pneumococcal+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+infection+%2F+Institut+Pasteur%22%5BJournal%5D)">Accumulation of gamma/delta T cells in the lungs and their roles in neutrophil-mediated host defense against pneumococcal infection.</a> Microbes and infection / Institut Pasteur. 9, 251-258 (2007).</li>
<li>Autran, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor+gamma%2Fdelta%2B+lymphocyte+subsets+during+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">T cell receptor gamma/delta+ lymphocyte subsets during HIV infection.</a> Clin Exp Immunol. 75, 206-210 (1989).</li>
<li>Pauza, C. D., Poonia, B., Li, H., Cairo, C., Chaudhry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gammadelta+T+Cells+in+HIV+Disease%3A+Past%2C+Present%2C+and+Future%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">gammadelta T Cells in HIV Disease: Past, Present, and Future.</a> Front Immunol. 5, 687(2014).</li>
<li>Hayday, A. C., Spencer, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19446471">Barrier immunity.</a> Sem Immunol. 21, 99-100 (2009).</li>
<li>Cheroutre, H., Lambolez, F., Mucida, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+light+and+dark+sides+of+intestinal+intraepithelial+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The light and dark sides of intestinal intraepithelial lymphocytes.</a> Nature Rev Immunol. 11, 445-456 (2011).</li>
<li>Strbo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Intra-Epithelial+Endocervical+Gamma+Delta+%28GD%29+1+T+Cells+in+HIV-Infected+Women%5BTitle%5D)+AND+%22AJRI%22%5BJournal%5D)">Loss of Intra-Epithelial Endocervical Gamma Delta (GD) 1 T Cells in HIV-Infected Women.</a> AJRI. 75, 134-145 (2016).</li>
<li>Szabo, S. E., Monroe, S. L., Fiorino, S., Bitzan, J., Loper, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+an+automated+instrument+for+viability+and+concentration+measurements+of+cryopreserved+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Hematol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of an automated instrument for viability and concentration measurements of cryopreserved hematopoietic cells.</a> Lab Hematol. 10, 109-111 (2004).</li>
<li>Alcaide, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Vaginosis+Is+Associated+with+Loss+of+Gamma+Delta+T+Cells+in+the+Female+Reproductive+Tract+in+Women+in+the+Miami+Women+Interagency+HIV+Study+%28WIHS%29%3A+A+Cross+Sectional+Study%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Bacterial Vaginosis Is Associated with Loss of Gamma Delta T Cells in the Female Reproductive Tract in Women in the Miami Women Interagency HIV Study (WIHS): A Cross Sectional Study.</a> PloS one. 11, e0153045(2016).</li>
<li>Masson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+genital+tract+cytokine+signatures+of+sexually+transmitted+infections+and+bacterial+vaginosis+in+women+at+high+risk+of+HIV+infection%3A+a+cross-sectional+study%5BTitle%5D)+AND+%22Sex+Transm+Dis%22%5BJournal%5D)">Defining genital tract cytokine signatures of sexually transmitted infections and bacterial vaginosis in women at high risk of HIV infection: a cross-sectional study.</a> Sex Transm Dis. 90, 580-587 (2014).</li>
<li>Fichorova, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+%28IL%29-1%2C+IL-6%2C+and+IL-8+predict+mucosal+toxicity+of+vaginal+microbicidal+contraceptives%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Interleukin (IL)-1, IL-6, and IL-8 predict mucosal toxicity of vaginal microbicidal contraceptives.</a> Biol Reprod. 71, 761-769 (2004).</li>
<li>Juno, J. A., Boily-Larouche, G., Lajoie, J., Fowke, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collection%2C+isolation%2C+and+flow+cytometric+analysis+of+human+endocervical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Collection, isolation, and flow cytometric analysis of human endocervical samples.</a> JoVE. , (2014).</li>
<li>McKinnon, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+viable+leukocyte+sampling+from+the+female+genital+tract+for+clinical+trials%3A+an+international+multi-site+study%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Optimizing viable leukocyte sampling from the female genital tract for clinical trials: an international multi-site study.</a> PloS one. 9, e85675(2014).</li>
<li>Dominguez, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+multiplexed+quantitation+of+gene+expression+on+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly multiplexed quantitation of gene expression on single cells.</a> J Immunol Methods. 391, 133-145 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają powiązań komercyjnych ani innych, które mogłyby powodować konflikt interesów (np. posiadanie akcji farmaceutycznych, doradztwo, członkostwo w radzie doradczej, odpowiednie patenty lub finansowanie badań).

Ocena wrażliwości błony śluzowej dolnych dróg rodnych kobiet jest istotnym elementem badań klinicznych dotyczących ryzyka nabycia i przenoszenia wirusa HIV. Zazwyczaj podatność FGT na zakażenie wirusem HIV ocenia się poprzez pomiar rozpuszczalnych modulatorów immunologicznych w wydzielinie narządów płciowych (cytokiny, chemokiny i peptydy przeciwdrobnoustrojowe)12,13. Jednak te biomarkery wskazują jedynie na stan zapalny pochwy, wpływają na nie zdarzenia fizjolog...

Opracowaliśmy metodologię wykorzystania próbek szczoteczek endoszyjkowych do oceny śródnabłonkowych komórek T GD. Kanał szyjki macicy jest wyłożony pojedynczą warstwą nabłonka walcowatego. Limfocyty śródnabłonkowe reprezentują limfocyty pierwszej linii znajdujące się w warstwie nabłonka, które mogą szybko zainicjować odpowiedź immunologiczną w przypadku napotkania drobnoustrojów chorobotwórczych7,8. Zrozumienie zdarzeń immunologicznych wewnątrznabłonkowego przedziału szyjki macicy jest ważne dla opracowania skutecznych strategii zapobiegania zakażeniom, w tym HIV.
Nasza metoda może być stosowana do świeżo pobranych próbek ludzkich szyjek macicy, jak również zamrożonych komórek szyjki macicy, aby dalej badać rolę śródnabłonkowych limfocytów T GD u kobiet z zakażeniem HIV lub zagrożonych zakażeniem wirusem HIV. Głównym celem tego protokołu jest odkrycie nowych zdarzeń immunologicznych w śródnabłonkowym przedziale śródnabłonkowym szyjki macicy oraz ocena odpowiedzi komórek T GD jako markera wrażliwości błony śluzowej u kobiet z zakażeniem wirusem HIV.
Znaczne luki w wiedzy na temat odporności na FGT wynikają częściowo z trudności w pomyślnym pobraniu i przetworzeniu próbek błony śluzowej. Co więcej, złożona heterogeniczność komórek odpornościowych błony śluzowej i ich wzajemne powiązania są głównymi wyzwaniami w identyfikacji klinicznie istotnych pomiarów, które odzwierciedlają stan i możliwości układu odpornościowego. Opracowaliśmy metodę otrzymywania wysoce oczyszczonych śródnabłonkowych limfocytów T GD, które można dalej analizować przy użyciu wysoce multipleksowanych technologii jednokomórkowych, które mogą mieć kluczowe znaczenie dla identyfikacji mechanizmów leżących u podstaw odporności FRT.

<table><tbody><tr><td>Cytobrush Plus GT&nbsp;</td><td>(CareFusion, San Diego, Kalifornia, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IMDM, zmodyfikowany Dulbecco's Medium firmy Iscove&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12440061</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczny licznik komórek Beckman Coulter (Analizator żywotności komórek serii Vi-CELL</td><td>Beckman Coulter</td><td>496178</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, Dimetylosulfotlenek&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>FBS, Płodowa surowica bydlęca</td><td>Invitrogen, Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen, Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>Aldrich A-9647</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Zestaw do naprawy żółtych martwych komórek&nbsp;</td><td>Life</td> <td>Technologies,L349S9</td><td></td></tr><tr><td>1% paraformaldehyd</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>D6148</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy Fortessa&nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UltraComp eBeads</td><td>eBioscience</td><td>01-2222-42</td><td></td></tr><tr><td>ArC Aminowe reaktywne koraliki kompensacyjne (Life Technologies, Grand Island, NY, USA)</td><td>Life Technologies</td><td>A10346</td><td></td></tr><tr><td>anty-TCR gamma/delta MicroBead Kit&nbsp;</td><td>Milteny Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-050-701</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna</td><td></td> MS <td>103-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Separator</td><td></td> MACS <td>4124</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja i analiza cytometryczna przepływowa ludzkich komórek t gamma delta w obrębie szyjki macicy

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

Układ odpornościowy błony śluzowej żeńskiego układu rozrodczego (FRT) służy jako pierwsza linia obrony. Lepsza wiedza na temat błony śluzowej narządów płciowych jest zatem niezbędna do zrozumienia patogenności różnych patogenów, w tym HIV. Limfocyty T gamma delta (GD) są prototypem "niekonwencjonalnych" limfocytów T i reprezentują stosunkowo niewielki podzbiór limfocytów T zdefiniowany przez ekspresję heterodimerycznych receptorów limfocytów T (TCR) złożonych z łańcuchów gamma i delta. To odróżnia je od klasycznych i znacznie lepiej znanych limfocytów T pomocniczych CD4 + i cytotoksycznych limfocytów T CD8 +, które są definiowane przez TCR alfa-beta. Limfocyty T GD często wykazują lokalizację specyficzną dla tkanki i są wzbogacone w nabłonek. Limfocyty T GD koordynują odpowiedzi immunologiczne w stanach zapalnych, nadzorze nad nowotworami, chorobach zakaźnych i autoimmunizacji.
Tutaj prezentujemy metodę powtarzalnego izolowania i analizy ludzkich śródnabłonkowych limfocytów T GD w obrębie szyjki macicy. Użyliśmy próbek cytoszczoteczki do szyjki macicy od kobiet biorących udział w Women's Interagency HIV Infection Study (WIHS). Wiedza na temat interakcji limfocytów T GD w stanach, w których dochodzi do uszkodzenia błony śluzowej pochwy, może być zastosowana w każdym badaniu klinicznym, w którym zajęto się wrażliwością błony śluzowej, w tym rozwojem mikrobicydów pochwy. Ponadto wiedza na temat odpowiedzi komórek T GD w błonie śluzowej ma potencjał do zastosowania terapii immunologicznej opartej na limfocytach T GD w leczeniu chorób zakaźnych.

Niedawno przeanalizowaliśmy wewnątrznabłonkowe limfocyty T gamma delta z szyjki macicy i jako pierwsi zgłosiliśmy utratę tych komórek u kobiet zakażonych wirusem HIV9,11. W niniejszej pracy opisujemy protokół izolacji i analizy subpopulacji limfocytów T gamma delta z szyjki macicy. Jak pokazano na Rysunku 1, limfocyty T gamma delta można łatwo wykryć w ludzkich próbkach komórek z szyjki macicy.
<p class="jove_...

Opisujemy tutaj metodę izolacji w celu uzyskania ludzkich śródnabłonkowych limfocytów wewnątrzszyjkowych do analizy śródnabłonkowych limfocytów T gamma delta. Protokół ten można rozszerzyć o oczyszczanie komórek T gamma delta szyjki macicy za pomocą kulek magnetycznych lub sortowania komórek.

Izolacja i analiza cytometryczna przepływowa ludzkich komórek T gamma Delta w obrębie szyjki macicy

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie i charakterystyka niekonwencjonalnej populacji wewnątrznabłonkowych komórek T gamma delta z próbki pobranej szczoteczką z kanału szyjki macicy człowieka. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące zdarzeń immunologicznych w wewnątrznabłonkowym przedziale szyjki macicy, co wspomaga projektowanie skutecznych strategii zapobiegania infekcjom. Główną zaletą tej techniki jest to, że stanowi ona potężne i wydajne narzędzie do badania wewnątrznabłonkowych limfocytów T gamma delta z szyjki macicy in vitro.Procedurę zaprezentuje Laura Romero, starsza współpracowniczka badawcza z mojego laboratorium. Bezpośrednio po pobraniu umieść probówkę z cytoszczoteczką w lodzie. W ciągu godziny od pobrania poddaj probówkę z cytoszczoteczką mieszaniu w wortexie przez cztery cykle po 10 sekund.Następnie odwiruj probówkę i ostrożnie wyjmij szczoteczkę, nie naruszając osadu. Potem dodaj do komórek 1 ml medium IMDM i umieść probówkę w lodzie. Umieść cytoszczoteczkę na sitku do komórek o oczkach 100 µm w probówce stożkowej o pojemności 50 ml i przemyj szczoteczkę 20 ml świeżego medium IMDM.Odwiruj zawiesinę płukania. Resuspenduj osad w 1 mL świeżego medium IMDM, a następnie połącz go z płukaniem i komórkami znajdującymi się w pierwotnej probówce do pobierania cytobrush. Aby przeanalizować komórki endocervikalne metodą cytometrii przepływowej, odmierz od 1 do 3 × 10⁵ komórek w 100 µL buforu FACS do probówek o pojemności 5 mL, a następnie inkubuj komórki z odpowiednimi przeciwciałami i barwnikiem żywotności przez 30 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.Po zakończeniu inkubacji przemyć komórki jednym mililitrem buforu z zestawu. Po odwirowaniu komórek całkowicie odlej nadsącz. Użyj kulek oraz odpowiednich przeciwciał kontrolnych IgG w celu ustawienia kontroli kompensacji.Następnie należy załadować pierwszą probówkę i wyznaczyć bramkę dla całkowitej populacji komórek endocervikalnych na wykresie rozrzutu forward scatter vs side scatter, a następnie wykluczyć dublety komórkowe. Komórki martwe należy wykluczyć na podstawie ekspresji barwnika żywotności, wyznaczając bramkę na żywe komórki CD45 pozytywne i CD3 pozytywne. Komórki gamma delta one i gamma delta two pozytywne definiuje się jako subpopulacje komórek CD3 pozytywnych, które wykazują ekspresję gamma delta TCR.Aby wyizolować limfocyty T gamma delta za pomocą izolacji kuleczkami magnetycznymi, należy resuspender do 1×10⁷ świeżo pobranych komórek endocervikalnych w 40 µL buforu z zestawu TCR gamma delta MicroBead. Zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi dwuetapowego protokołu barwienia, należy oznakować komórki przeciwciałem anty-TCR gamma delta hapten, a następnie zastosować MicroBeads sprzężone z anty-hapten FITC przez 15 minut w temperaturze od 4 do 8 °C. Po zakończeniu inkubacji komórki należy przemyć 1 mL buforu z zestawu i całkowicie odlać nadsącz.Resuspenduj komórki w 500 µL buforu z zestawu, a następnie nanieś zawiesinę komórkową bezpośrednio na kolumnę z kuleczkami magnetycznymi umieszczoną w odpowiednim magnesie separacyjnym, zbierając frakcję przepływową do nowej probówki. Gdy wszystkie komórki przejdą przez kolumnę, przemyj ją trzykrotnie 500 µL świeżego buforu, a otrzymane płuczyny połącz z zebranymi komórkami. Aby zebrać limfocyty T gamma delta, przenieś kolumnę do probówki stożkowej i za pomocą tłoka kolumny wypłucz limfocyty T z kolumny, używając 1 mL świeżego buforu.Aby wyizolować limfocyty T gamma delta za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją, należy oznakować komórki barwnikiem żywotności, zgodnie z panelem przeciwciał zaprezentowanym przed chwilą. Następnie należy posortować komórki pod kątem barwnika żywotności oraz pozytywności dla markerów CD45, CD3 i gamma delta. Wyraźną populację limfocytów T wykazujących ekspresję gamma delta V1 można łatwo wykryć w ludzkich próbkach komórek z szyjki macicy.Szczegółowa analiza fenotypowa wyselekcjonowanych komórek CD3 dodatnich gamma delta jeden dodatnich wykazuje, że większość tych komórek jest CD4 i CD8 ujemna. Separacja magnetyczna koralek komórek endocervikalnych, zaprezentowana przed chwilą, pozwala na oczyszczenie populacji tych komórek TCR gamma delta z czystością wynoszącą niemal 98%. Taki poziom czystości można osiągnąć również za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS), co potwierdza zasadność stosowania obu technik do izolacji endocervikalnych limfocytów T gamma delta.Co ciekawe, analiza wewnątrznabłonkowych komórek szyjki macicy, tj. komórek T gamma delta, pobranych od kobiet zakażonych wirusem HIV oraz zdrowych dawców kontrolnych, wykazuje niewielki spadek liczby i żywotności tych istotnych komórek u osób zakażonych HIV. Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, można ją zrealizować w ciągu dwóch do trzech godzin. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby szybko przetworzyć próbkę oraz utrzymywać komórki w lodzie przez cały czas trwania procesu, aby zapewnić ich dobrą żywotność.Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak sortowanie pojedynczych komórek w połączeniu z wysokoczułą, wysokoprzepustową pleksową reakcją PCR, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące szlaków zapalnych i sygnalizacyjnych w obrębie wewnątrznabłonkowego przedziału szyjki macicy. Po opracowaniu ta technika utorowała drogę badaczom w dziedzinie HIV i chorób zakaźnych do poszukiwania nowych markerów komórkowych podatności błon śluzowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak przygotować limfocyty wewnątrznabłonkowe z próbki pobranej szczoteczką z szyjki macicy człowieka.

isolation-flow-cytometric-analysis-human-endocervical-gamma-delta-t

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisano metodę ekspansji limfocytów γδ T z mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMC). Limfocyty γδ T pochodzące z PBMC są stymulowane i namnażane przy użyciu zoledronianu oraz interleukiny-2 (IL-2). Wielkoskalowa ekspansja limfocytów γδ T może zostać zastosowana w autologicznej immunoterapii komórkowej nowotworów.

Ekspansja limfocytów T $\gamma\delta$ z ludzkiej krwi obwodowej przy użyciu zoledronianu

Ten film demonstruje protokół izolacji opartej na znakowaniu magnetycznym populacji limfocytów T CD4+Vδ1+γδ o niskim stężeniu z ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC). Wykorzystując kombinację przeciwciał anty-Vδ1 sprzężonych z FITC, magnetycznych mikrokulek anty-FITC i superparamagnetycznych kulek pokrytych przeciwciałem anty-CD4, limfocyty T CD4 + Vδ1 + można z powodzeniem oczyścić z populacji PBMC.

Selektywna izolacja limfocytów T CD4 + Vδ1 + γδ z ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej

Użycie pobierania próbek cytoszczotek do pobierania limfocytów i monocytów z szyjki macicy jest minimalnie inwazyjną techniką, która dostarcza próbek do analizy odporności żeńskich dróg rodnych. W tym protokole opisujemy pobieranie próbek cytoszczotek i izolację komórek odpornościowych do testów cytometrii przepływowej.

Pobieranie, izolacja i analiza cytometryczna przepływowa próbek z ludzkiej szyjki macicy

Tutaj zapewniamy zoptymalizowany protokół izolacji i klonowania rzadkiej jednostki limfocytów T obwodowych komórek T Vδ1+CD4+, która jest, jak wykazaliśmy ostatnio, pozatymicznym progenitorem limfocytów T αβ. Technika ta pozwala na ilościowe wyizolowanie, sklonowanie i efektywną ekspansję tych komórek w hodowli ex vivo.

Izolacja i hodowla ex vivo limfocytów T Vδ1+CD4+γδ, pozatymicznego progenitora komórek αβT

Przedstawiona tutaj jest prosta metoda izolacji i analizy metodą cytometrii przepływowej komórek jednojądrzastych krwi obwodowej naciekającej glejak, która dostarcza zależnych od czasu danych ilościowych na temat liczby i statusu aktywacji komórek odpornościowych wchodzących do wczesnego mikrośrodowiska guza mózgu.

Izolacja i analiza cytometryczna przepływowa jednojądrzastych komórek krwi obwodowej naciekających glejaka

Opisujemy tutaj metodę izolowania i oczyszczania komórek dendrytycznych z różnych anatomicznych przedziałów w ludzkim żeńskim układzie rozrodczym w celu oceny ich cech fenotypowych i funkcjonalnych. Metodę tę można dostosować do izolowania innych komórek odpornościowych lub komórek dendrytycznych z innych tkanek błony śluzowej.

Izolacja komórek dendrytycznych z ludzkiego żeńskiego układu rozrodczego do badań fenotypowych i funkcjonalnych

Tutaj opisany jest protokół izolacji i charakterystyki podzbiorów limfocytów T CD4+ z ludzkiej krwi obwodowej. Oczyszczone limfocyty T CD4 + są analizowane za pomocą cytometrii przepływowej w celu określenia proporcji podzbiorów komórek pomocniczych mieszków T.

Izolacja limfocytów T CD4 + i analiza podzbiorów komórek krążących komórek T-pęcherzyków obojętnych (cTfh) z krwi obwodowej przy użyciu 6-kolorowej cytometrii przepływowej

Ekspansja klonalna jest kluczową cechą odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla antygenu. Jednak cykl komórkowy limfocytów T reagujących na antygen został słabo zbadany, częściowo z powodu ograniczeń technicznych. Opisujemy metodę cytometrii przepływowej do analizy klonalnie rozszerzających się limfocytów T CD8 specyficznych dla antygenu w śledzionie i węzłach chłonnych szczepionych myszy.

Test cytometrii przepływowej oparty na DNA/Ki67 do analizy cyklu komórkowego specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8 u zaszczepionych myszy

To jest metoda izolowania komórek limfoidalnych macicy zarówno od ciężarnych, jak i nieciężarnych myszy. Metoda ta może być stosowana w wielu dalszych zastosowaniach, takich jak fenotypowanie FACS, sortowanie komórek, testy funkcjonalne, sekwencja RNA i proteomika. Protokół tutaj pokazuje, jak fenotypować wrodzone komórki limfoidalne macicy grupy 1 za pomocą cytometrii przepływowej.

Izolacja wrodzonych komórek limfatycznych macicy do analizy metodą cytometrii przepływowej

Napływ wapnia, miara sygnalizacji limfocytów T, jest skutecznym sposobem analizy reakcji na stymulację receptorów limfocytów T. Ten protokół multipleksowania Indo-1 z panelami przeciwciał skierowanymi na cząsteczki powierzchniowe komórki wykorzystuje wysoce elastyczne możliwości cytometrii przepływowej w pełnym spektrum.

Analiza indukowanego przez receptor limfocytów T napływu wapnia w pierwotnych mysich limfocytach T za pomocą cytometrii przepływowej pełnego spektrum

Obecny protokół opisuje eksperymentalny przebieg pracy, który pozwala na analizę ex vivo stymulacji ludzkich limfocytów T w allogenicznym systemie kohodowli z wcześniej leczonymi komórkami nowotworowymi.

Analiza aktywności ludzkich limfocytów T w allogenicznej kokulturze wstępnie leczonych komórek nowotworowych

Poznaj metodę izolacji i analizy cytometrycznej komórek T gamma delta z szyjki macicy. Technika umożliwia badanie odpowiedzi immunologicznej in vitro i wspiera projektowanie strategii zapobiegania infekcjom.

Izolacja i analiza cytometryczna przepływowa ludzkich komórek T gamma Delta w obrębie szyjki macicy

Przeglądaj więcej filmów