Zastosowanie jednowarstwowego testu monocytowego monocytów do oceny fagocytozy za pośrednictwem receptora Fcγ

Ogólnym celem tego testu funkcjonalnego in vitro jest ocena różnych aspektów fagocytozy za pośrednictwem FC. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie immunohematologii i medycyny transfuzjologii krwi, takie jak znaczenie kliniczne auto- i alloprzeciwciał przeciwko czerwonym krwinkom. Technika ta zapewnia funkcjonalny test biologiczny, który można przeprowadzić in vitro w celu przewidywania wyniku transfuzji u pacjentów z wstępnie uformowanymi przeciwciałami przeciwko czerwonym krwinkom.

Procedurę zademonstruje Cindy Tong, doktorantka z mojego laboratorium. Nie zapominaj, że praca z ludzką krwią może być niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie fartuchów i rękawiczek ochronnych. Po uzyskaniu od jednej do dwóch 10-mililitrowych próbek krwi pełnej od zdrowego dawcy w probówkach próżniowych zawierających dekstrozę z kwaśnym cytrynianem przez nakłucie dożylne, probówki umieszcza się w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II, a krew rozcieńcza się w stosunku jeden do jednego w ciepłym, kompletnym podłożu.

Następnie powoli odpipetuj komórki krwi po bokach probówki wirówkowej do gradientu gęstości w temperaturze pokojowej, uważając, aby nie pomieszać warstw. Oddziel komórki przez odwirowanie. Następnie odrzuć górną warstwę plazmy i użyj szklanej pipety Pasteura, aby przenieść PBMC zawierający kożuchową powłokę do nowej 15-mililitrowej probówki.

Umyj wyizolowane PBMC trzykrotnie w PBS, ponownie zawieszając komórki w trzech do siedmiu mililitrach pożywki po trzecim odwirowaniu. Po zliczeniu rozcieńczyć komórki do 1,75 razy 10 do szóstego stężenia komórek na mililitr w kompletnym pożywce i wysiać 400 mikrolitrów komórek do każdej studzienki ośmiokomorowego szkiełka na godzinną inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 przy pełnej wilgotności. Aby opsonizować czerwone krwinki R2R2, najpierw umyj czerwone krwinki trzy razy w PBS.

Rozcieńczyć osad R2R2 po trzecim odwirowaniu w stosunku jeden do jednego poliklonalnymi przeciwciałami anty-D z ludzkiej surowicy przez jedną godzinę inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza z przerywanym mieszaniem. Pod koniec opsonizacji wyjmij komórki z inkubatora, a następnie umyj je jeszcze trzy razy w PBS, jak właśnie pokazano. Ponownie zawiesić granulkę do 1.25% objętości do objętości w pełnym podłożu RPMI.

Następnie zastąp supernatant z każdej studzienki ośmiokomorowego szkiełka 400 mikrolitrami opsonizowanych komórek R2R2 przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji użyj adapterów szkiełkowych, aby wyjąć komory, wcierając nadmiar R2R2 ręcznikiem papierowym. Teraz napełnij 100-mililitrową zlewkę PBS i powoli zanurz każde szkiełko 30 do 40 razy w roztworze soli, aby usunąć większość niefagocytozowanego R2R2.

Po wysuszeniu zamocuj szkiełka w 100% metanolu na 45 sekund i pozwól komórkom wyschnąć przed zamontowaniem próbek za pomocą szkiełek nakrywkowych. Następnego dnia załaduj każde szkiełko do mikroskopu z kontrastem fazowym z soczewką obiektywową 40X i ręcznie policz co najmniej 200 monocytów i liczbę fagocytozowanych R2R2 w każdym monocytzie, używając jednego licznika w każdej ręce, aby jednocześnie określić ilościowo liczbę monocytów i liczbę fagocytozowanych komórek R2R2 w próbce. Dożylna immunoglobulina wiąże się i blokuje receptory FC hamujące fagocytozę w sposób zależny od dawki, z prawie 100% hamowaniem obserwowanym od 200 mikrogramów stężenia immunoglobuliny podawanej dożylnie na mililitr i prawie bez hamowania obserwowanego przy stężeniach poniżej 0,5 mikrograma inhibitora.

Gdy indeksy fagocytarne zostaną znormalizowane do kontroli pozytywnej R2R2 jako 0% inhibicji, można wyznaczyć krzywą inhibicji z IC 50 wynoszącym trzy mikrogramy na mililitr. Dzięki doświadczeniu mikroskopia z kontrastem fazowym może być stosowana do odróżniania monocytów od zanieczyszczających czerwonych krwinek i wakuoli od fagocytozowanych czerwonych krwinek. Podczas oznaczania ilościowego należy unikać gęstych skupisk komórek i szczątków, a także nadmiernej opsonizacji czerwonych krwinek R2R2, co może prowadzić do zwiększonej fagocytozy, która przepełnia wnętrze monocytów i zakłóca dokładną analizę fagocytarną.

Po opanowaniu tej techniki można ją ukończyć w ciągu sześciu do ośmiu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak immunocytochemia lub immunofluorescencja przy użyciu mikroskopii konfokalnej, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące ekspresji białek fagocytarnych, interakcji czerwonych krwinek i kompartmentalizacji. Dzięki początkowemu rozwojowi i dalszej optymalizacji, technika ta będzie informować o sposobie, w jaki naukowcy zajmujący się medycyną transfuzjologiczną i biologią komórki badają systemy opsonizacji.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać test monocytów monocytów, aby ocenić rodzaje interakcji przeciwciał, które wywołują fagocytozę.