In Situ Wykrywanie i kwantyfikacja pojedynczych komórek nanocząstek tlenków metali za pomocą analizy mikrosondy jądrowej

Nanocząstki są coraz częściej stosowane w przemyśle i medycynie ze względu na swoje unikalne właściwości fizykochemiczne. Utrzymują się jednak obawy o zdrowie ludzi związane z długotrwałym narażeniem na nanocząstki. Zagrożenia te można określić ilościowo, badając zachowanie nanocząstek wewnątrz komórek i indukowane reakcje metaboliczne komórek na nanocząstki.

Wynika to częściowo z braku metod, które pozwalają na wykrycie i kwantyfikację zinternalizowanych nanocząstek w komórce sinkulowej. Chociaż wiele narzędzi analitycznych, w tym mikroskopia i spektrometria mas, może być wykorzystywanych do szacowania absorpcji komórkowych nanocząstek, dostarczają one informacji jakościowych tylko na poziomie mikroskopowym. Wręcz przeciwnie, metody in situ oparte na spektroskopii atomowej mogą zmniejszyć ilość artefaktów obrazowania, które powstają w wyniku przygotowania próbki i mogą umożliwić bezpośrednią obserwację nanocząstek.

Aby to wykorzystać, przedstawiamy podejście korelacyjne, które pozwala nam badać nanocząstki zarówno w stanie natywnym, jak i na łożu laboratoryjnym ze znacznikiem fluorescencyjnym. W tym miejscu opisujemy metodę opartą na połączeniu mikroskopii fluorescencyjnej i analizy mikrosondą jądrową. Zapewnia to obrazy gęstości komórkowej, specjalnego rozkładu pierwiastków chemicznych i ilości nanocząstek w komórce.

W ramach demonstracji będziemy badać komórki wystawione na działanie nanocząstek dwutlenku tytanu przez 24 godziny, używając zarówno mikroskopii fluorescencyjnej, jak i analizy mikrosondą jądrową. Do tego protokołu potrzebny jest niestandardowy uchwyt na próbkę wykonany z polimeru PEEK. Musi być przystosowany do hodowli komórkowych i obserwacji in vitro.

Przykryj uchwyt folią poliwęglanową o grubości dwóch mikronów. Folię poliwęglanową przykleja się do naczynia PEEK cienką warstwą roztworu Formvaru. Po zamontowaniu uchwyt na próbkę należy go wysterylizować.

Wiele sterylnych uchwytów na próbki może być przechowywanych, po jednym na studzienkę, na sterylnej płytce dwunastodołkowej do czasu, gdy będą potrzebne do użycia. Komórki transfekowane plazmidami GFP rzędu macierzy są sprawdzane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, aby upewnić się, że transfekcja zakończyła się powodzeniem i że wyrażają białko fluorescencyjne. Zbierz komórki z trypsyną i inkubuj je przez trzy minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Zatrzymaj działanie trypsyny, dodając świeżą pożywkę hodowlaną. Granulować komórki przez wirowanie przez pięć minut przy 1200 obrotach na minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usunąć sklarowany osad i dodać odpowiednią ilość świeżej pożywki hodowlanej.

Policz komórki i wykonaj rozcieńczenie świeżą i termostatyczną kompletną pożywką hodowlaną, aby uzyskać zawiesinę komórek 500 komórek na mikrolitr. Umieść kroplę o pojemności 40 mikrolitrów na środku folii poliwęglanowej. Ostrożnie umieścić próbkę w inkubatorze komórkowym na dwie godziny.

Delikatnie dodaj dwa mililitry świeżej pożywki hodowlanej i pozostaw na 24 godziny. Zaprojektowano, zsyntetyzowano i przeszczepiono fluorescencyjne dwucząsteczki tlenku tytanu za pomocą powszechnie stosowanych fluoroforów w celu wykrywania, śledzenia i lokalizowania nanocząstek in vitro. Na tym etapie powinna być już przygotowana zawiesina nanocząstek dwutlenku tytanu w ultraczystej wodzie o stężeniu jednego miligrama na mililitr.

Rozproszyć nanocząstki za pomocą jednominutowych intensywnych impulsów dźwiękowych w temperaturze pokojowej. Rozcieńczyć nanocząstki w odpowiednim pożywce hodowlanej, aby uzyskać zawiesinę ekspozycyjną w ilości czterech mikrogramów na centymetr kwadratowy. Zmień poprzednią pożywkę do hodowli komórkowych na nową pożywkę zawierającą nanocząstki i delikatnie wymieszaj, aby uzyskać jednorodny rozkład nanocząstek.

Przygotować zestaw komórek kontrolnych w ten sam sposób, bez dodatku nanocząstek ditlenku tytanu. Inkubuj populacje komórek przez 24 godziny. Za pomocą paraformaldehydu próbki te można utrwalić i przetworzyć do obrazowania in situ i pojedynczych komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Kriogeniczne utrwalenie fizyczne zachowuje jednak ultrastrukturę komórki i integralność biochemiczną. Utrwalanie przez zamrażanie wgłębne szybko zatrzymuje aktywność komórkową w ciągu milisekund i pozwala uniknąć stosowania związków utrwalających. Aby kriogenicznie utrwalić komórki, wykonujemy następujące czynności.

Przygotuj aluminiową płytę transferową, schładzając ją w ciekłym azocie. Przechowuj płytkę w pudełku wypełnionym ciekłym azotem, utrzymując powierzchnię płytki nad cieczą w zimnej parze azotu. Schłodzić odpowiednią ilość 2-metylobutanu do 150 stopni Celsjusza.

Przygotuj jednego 50-mililitrowego Sokoła z pożywką hodowlaną i dwa Sokoła z ultraczystą wodą. Upewnij się, że w pobliżu znajduje się papier chłonny, aby wysuszyć próbkę przed jej zamrożeniem. Opłucz komórki raz w pożywce hodowlanej, a następnie jeszcze dwa razy w sterylnej, ultraczystej wodzie, aby usunąć nadmiar soli pozostałych w pożywce.

Szybko wysuszyć próbkę na bilecie chłonnym. Zanurz komórki w schłodzonym 2-metylobutanie na 30 sekund i umieść je na schłodzonej aluminiowej płycie transferowej. Bardzo ważne jest, aby skrzynka była jak najbardziej zamknięta, aby zapobiec kondensacji pary wodnej na zimnej powierzchni płyty.

Po zamrożeniu wszystkich próbek liofilizację przeprowadza się następującą metodą w celu sublimacji wody. Najpierw wykonaj wstępne suszenie przez 12 do 24 godzin pod niskim ciśnieniem i w niskiej temperaturze. Następnie, utrzymując niskie ciśnienie, wykonaj wtórną fazę osuszania przez co najmniej 24 godziny przy temperaturze płyty podwyższonej do 40 stopni Celsjusza.

Po kriofiksacji próbki można przechowywać w temperaturze pokojowej przez kilka dni w sterylnych i suchych warunkach, chronionych przed kurzem i wilgocią. Analizę za pomocą mikrosondy jądrowej przeprowadzono w zakładzie Ifera w Bordeaux we Francji. Akcelerator cząstek singletronowych o mocy 3,5 megawolta wytwarza wiązkę jonów świetlnych w zakresie energii megaelektronowoltów.

Obrazowanie pierwiastków chemicznych przeprowadzono na linii badawczej mikrosondy z wykorzystaniem uzupełniających technik analitycznych wiązki jonów. Techniki stosowane poprzez mikro-PIXE, emisję promieniowania rentgenowskiego indukowaną cząstkami, STIM, skaningową mikroskopię jonów transmisyjnych oraz mikro-RBS, spektrometrię rozpraszania wstecznego Rutherforda. Próbki są umieszczane w komorze analitycznej i naświetlane w próżni różnymi cząstkami w celu przeprowadzenia różnych analiz wiązką jonów.

STIM służy do rejestrowania lotniczych map gęstości komórek w oparciu o luźne cząstki energii przechodzące przez obszary komórek o różnej gęstości. Analiza Micro-PIXE i micro-RBS zapewnia przestrzenny rozkład i kwantyfikację pierwiastków chemicznych na poziomie pojedynczej komórki. Mikrowiązka protonów o natężeniu 1,5 megaelektronowolta jest skupiana do średnicy około 1 mikrometra i skanowana przez interesujące nas komórki, identyfikowane przez STIM.

Promienie rentgenowskie emitowane przez atomy obecne w próbce, od sodu do tytanu, pozwalają na określenie stężeń pierwiastków. Rozproszone wstecznie rozproszone protony są zbierane w celu zmierzenia całkowitej liczby przychodzących cząstek wymaganych do normalizacji intensywności promieniowania rentgenowskiego. Bardzo ważne jest, aby posiadać certyfikowane wzorce kalibracyjne do ilościowego oznaczania stężeń pierwiastków w celu kalibracji odpowiedzi detektora promieniowania rentgenowskiego.

W celu analizy danych wiązki jonów opracowaliśmy nową wtyczkę do ImageJ. W pierwszej kolejności obliczono mapy zagęszczenia STIM. Kontrast w obrazach z transmisyjnej mikroskopii skaningowej wynika z lokalnych różnic w gęstości i umożliwia wykrycie struktur komórkowych, takich jak jądro i cytoplazma.

Jednocześnie można przetwarzać kilka map. Każda mapa odpowiada ośrodkowi przesyłanemu energii od nadlatujących cząstek. Drugi krok w analizie danych polega na obliczeniu widm poszczególnych komórek.

Analiza emisji promieniowania rentgenowskiego indukowana cząstkami pozwala uzyskać zarówno skład chemiczny próbki, jak i mapy pierwiastkowe pierwiastków chemicznych. Mapy pierwiastków chemicznych są obliczane po posortowaniu fotonów według położenia wiązki w momencie rejestracji i wybraniu okna energetycznego wyśrodkowanego wokół określonego pierwiastka. Mapy zazwyczaj reprezentują liczbę wykrytych zdarzeń w pozycji wiązki i zawierają dane ilościowe.

Obliczany jest stos map chemicznych, po jednej dla każdego wybranego pierwiastka. Obszary zainteresowania dla każdej komórki są znajdowane przy użyciu danych PIXE dla fosforu. Widma odpowiadające każdej całej komórce są następnie obliczane poprzez zsumowanie indywidualnych widm w obszarze zainteresowania każdej komórki.

Stąd można uzyskać dane ilościowe o obfitości chemicznej w każdej komórce za pomocą dedykowanego oprogramowania do analizy PIXE i IBS. Tutaj pokazujemy obrazy fluorescencyjne komórek po utrwaleniu paraformaldehydu. Górny rząd pokazuje komórki, które nie zostały wystawione na działanie nanocząstek dwutlenku tytanu, podczas gdy dolny rząd był.

Niebieski kanał pokazuje jądro komórkowe, zielony kanał pokazuje mitochondria, a czerwony kanał pokazuje tytan. Wyraźnie widać, że w kontrolach nie ma dwutlenku tytanu. Z połączonego kanału po prawej stronie widać, że nanocząstki znajdują się wyłącznie w cytoplazmie i są wykluczone z mitochondriów.

Brakuje jednak w tej metodzie informacji ilościowych na temat stężenia nanocząstek. Analiza za pomocą mikrosond jądrowych może mieć nadzieję, że to zapewni. Wszystkie te obrazy zostały wykonane przy użyciu różnych technik analizy mikrosondą.

Ponownie górny rząd pokazuje komórki kontrolne, a dolny rząd pokazuje komórki zawierające nanocząstki tytanu. Skrajny lewy obraz przedstawia pomiary STIM gęstości komórek utrwalonych kriogenicznie. Poniższe trzy panele pokazują obfitość potasu, fosforu i tytanu obecnych w komórkach uzyskanych za pomocą PIXE.

Ponownie, ani w kontrolach, ani w jądrach komórkowych nie ma śladu tytanu. Aby określić ilościowo, komórka po komórce, absorpcję tytanu, definiujemy obszary zainteresowania na podstawie granic komórek pokazanych w skrajnym prawym panelu i mierzymy obfitość pierwiastków w tych regionach. Na podstawie tych pomiarów PIXE wykreśliliśmy rozkład obfitości pierwiastków na poziomie pojedynczej komórki dla populacji kontrolnych i narażonych.

Populacja kontrolna jest wykreślona w kolorze białym, a populacja narażona jest wykreślona w kolorze żółtym. Mediana zawartości obecnego tutaj tytanu jest dość niska w porównaniu z dawką ekspozycyjną wynoszącą cztery mikrogramy na centymetr kwadratowy. Zakres wchłaniania tytanu wykazuje duże zróżnicowanie w całej populacji, od 0,2 mikrograma na centymetr kwadratowy do 1,8 mikrograma na centymetr kwadratowy.

Zauważyliśmy również wzrost wolnych jonów wewnątrzkomórkowych, takich jak potas i wapń, w próbkach wystawionych na działanie nanocząstek, co sugeruje zmianę homeostazy komórkowej wywołaną obecnością nanocząstek dwutlenku tytanu. Analiza mikrosondy jądrowej może dostarczyć użytecznych informacji na poziomie subkomórkowym i zapewnić ilościowe określenie pierwiastków chemicznych składających się na próbkę biologiczną. Techniki te mają wiele zalet.

Jeden, w przygotowaniu próbki, która nie wymaga chemicznego utrwalania. Po drugie, możliwość badania większych obszarów z możliwością skupienia się na dodatkowych obszarach zainteresowania. Po trzecie, oznaczanie ilościowe pierwiastków chemicznych z czułością kilku mikrogramów na gram.

I po czwarte, identyfikacja przedziałów komórkowych, takich jak jądro, jąderko i cytoplazma. Dokładne ich oznaczenie podczas badania internalizacji nanocząstek w pojedynczych komórkach ma zasadnicze znaczenie dla ilościowej toksykologii nanocząstek. Jak wykazano w badanych tutaj przypadkach, możliwość obserwacji i ilościowego oznaczania nanocząstek w poszczególnych komórkach pozwala nam lepiej zrozumieć akumulację wartości endogennych i egzogennych pierwiastków chemicznych, takich jak nanocząstki tlenków metali.

Protokół ten podkreśla przydatność analizy mikrosondą jądrową dla przyszłych badań interakcji nanocząstek z żywymi komórkami. Podejście ilościowe dostarcza informacji o wpływie tych nanocząstek pod względem wykrywania, identyfikacji, lokalizacji i kwantyfikacji, a także na poziomie pojedynczej komórki zarówno dla nanocząstek natywnych, jak i modyfikowanych chemicznie.