Name: In Situ Wykrywanie i kwantyfikacja pojedynczych komórek nanocząstek tlenków metali za pomocą analizy mikrosondy jądrowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 53 s
Description: Poznaj metodę wykrywania nanocząstek tlenków metali w pojedynczych komórkach ludzkich za pomocą analizy mikrosondy jądrowej. Technika umożliwia ilościową analizę pierwiastków chemicznych i badanie odpowiedzi metabolicznych komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Serge'owi Borderesowi za reżyserię i montaż filmu. Francuska Narodowa Agencja Badawcza wspiera program badawczy TITANIUMS (ANR CES 2010, nr CESA 009 01). CNRS i Wspólnota Europejska jako działalność integrująca zapewniły "Wsparcie badań publicznych i przemysłowych z wykorzystaniem technologii wiązki jonowej (SPIRIT)" w ramach umowy WE nr 227012. Prace te były wspierane przez działania Marie Curie - Sieci Szkolenia Początkowego (ITN) jako "Działanie integrujące badania podyplomowe ze stażami w przemyśle i doskonałością szkoleniową" (SPRITE, D1.3) w ramach umowy WE nr 317169. C'NANO Grand Sud Ouest i Region Akwitanii wspierają program badawczy TOX-NANO (nr 20111201003) oraz program badawczy POPRA (nr 14006636-034).

<ol><li>Krug, H. F., Wick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotoxicology%3A+An+Interdisciplinary+Challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Nanotoxicology: An Interdisciplinary Challenge.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 50 (6), 1260-1278 (2011).</li>
<li>Van Hove, M. A. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0920586105008783">From surface science to nanotechnology.</a> Catalysis Today. 113 (3-4), 133-140 (2006).</li>
<li>Le Trequesser, Q., Seznec, H., Delville, M. H. <a target="_blank" href="https://www.degruyter.com/view/j/ntrev.2013.2.issue-2/ntrev-2012-0080/ntrev-2012-0080.xml">Functionalized nanomaterials: their use as contrast agents in bioimaging: mono- and multimodal approaches.</a> Nanotox. Rev. 2 (2), 125-169 (2013).</li>
<li>Oberdorster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+assessment+for+nanotechnology+and+nanomedicine%3A+concepts+of+nanotoxicology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Int.+Med%22%5BJournal%5D)">Safety assessment for nanotechnology and nanomedicine: concepts of nanotoxicology.</a> J. Int. Med. , 89-105 (2009).</li>
<li>Savolainen, K., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0925753510000767">Nanotechnologies, engineered nanomaterials and occupational health and safety - A review.</a> Saf. Sci. 48 (8), 957-963 (2010).</li>
<li>Savolainen, K., Alenius, H., Norppa, H., Pylkkanen, L., Tuomi, T., Kasper, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+assessment+of+engineered+nanomaterials+and+nanotechnologies+-+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol%22%5BJournal%5D)">Risk assessment of engineered nanomaterials and nanotechnologies - A review.</a> Toxicol. 269 (2-3), 92-104 (2010).</li>
<li>Arora, S., Rajwade, J. M., Paknikar, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotoxicology+and+in+vitro+studies%3A+The+need+of+the+hour%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+.+Appl.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Nanotoxicology and in vitro studies: The need of the hour.</a> Toxicol. . Appl. Pharm. 258 (2), 151-165 (2012).</li>
<li>Donaldson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+the+nanoparticles+paradox%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Med%22%5BJournal%5D)">Resolving the nanoparticles paradox.</a> Future Med. 1 (2), 229-234 (2006).</li>
<li>Schaumann, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0048969714014739">Understanding the fate and biological effects of Ag- and TiO2-nanoparticles in the environment: The quest for advanced analytics and interdisciplinary concepts.</a> Sci Total Environ. 535, 3-19 (2014).</li>
<li>Olesik, J. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOlesik%2C+JW+%22Inductively+Coupled+Plasma+Mass+Spectrometers.+Treatise+on+Geochemistry%22">Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometers. Treatise on Geochemistry</a>. , Elsevier Ltd. (2014).</li>
<li>Krystek, P. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0026265X12000422">A review on approaches to bio-distribution studies about gold and silver engineered nanoparticles by inductively coupled plasma mass spectrometry.</a> Microchem. J. 105 (November 2011), 39-43 (2012).</li>
<li>Le Trequesser, Q., et al. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s12154-015-0133-5">Multimodal correlative microscopy for in situ detection and quantification of chemical elements in biological specimens. Applications to nanotoxicology.</a> J .Chem. Biol. 8 (4), 159-167 (2015).</li>
<li>Le Trequesser, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+in+situ+detection+and+quantification+of+metal+oxide+nanoparticles+using+multimodal+correlative+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Single cell in situ detection and quantification of metal oxide nanoparticles using multimodal correlative microscopy.</a> Anal. Chem. 86 (15), 7311-7319 (2014).</li>
<li>Ackermann, C. M., Lee, S., Chang, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+Methods+for+Imaging+Metals+in+Biology%3A+From+Transition+Metal+Metabolism+to+Transition+Metal+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Analytical Methods for Imaging Metals in Biology: From Transition Metal Metabolism to Transition Metal Signaling.</a> Anal. Chem. 89 (1), 22-41 (2017).</li>
<li>Legin, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2014/sc/c3sc53426j#!divAbstract">NanoSIMS combined with fluorescence microscopy as a tool for subcellular imaging of isotopically labeled platinum-based anticancer drugs.</a> Chem. Sci. 5, 3135(2014).</li>
<li>Lanni, E. J., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging+and+profiling+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging and profiling of single cells.</a> J. Proteomics. 75 (16), 5036-5051 (2012).</li>
<li>Waypa, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+triggers+subcellular+compartmental+redox+signaling+in+vascular+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Hypoxia triggers subcellular compartmental redox signaling in vascular smooth muscle cells.</a> Circ. Res. 106 (3), 526-535 (2010).</li>
<li>Dooley, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Dynamic+Redox+Changes+in+Mammalian+Cells+with+Green+Fluorescent+Protein+Indicators%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Imaging Dynamic Redox Changes in Mammalian Cells with Green Fluorescent Protein Indicators.</a> J. Biol. Chem. 279 (21), 22284-22293 (2004).</li>
<li>Hanson, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+Mitochondrial+Redox+Potential+with+Redox-sensitive+Green+Fluorescent+Protein+Indicators%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Investigating Mitochondrial Redox Potential with Redox-sensitive Green Fluorescent Protein Indicators.</a> J. Biol. Chem. 279 (13), 13044-13053 (2004).</li>
<li>Chen, X., Mao, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titanium+dioxide+nanomaterials%3A+Synthesis%2C+properties%2C+modifications+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Titanium dioxide nanomaterials: Synthesis, properties, modifications and applications.</a> Chem. Rev. 107 (7), 2891-2959 (2007).</li>
<li>Simon, M., Barberet, P., Delville, M. H., Moretto, P., Seznec, H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21425910">Titanium dioxide nanoparticles induced intracellular calcium homeostasis modi fi cation in primary human keratinocytes. Towards an in vitro explanation of titanium dioxide nanoparticles toxicity.</a> Nanotox. 5 (June), 125-139 (2011).</li>
<li>Sorieul, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168583X14002894">An ion beam facility for multidisciplinary research.</a> Nucl. Instr. Meth. Phys. Res., B. 332, 68-73 (2014).</li>
<li>Barberet, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168583X11002199">First results obtained using the CENBG nanobeam line: Performances and applications.</a> Nucl Instr Meth Phys Res B. 269 (20), 2163-2167 (2011).</li>
<li>Devès, G., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168583X15000373">An ImageJ plugin for ion beam imaging and data processing at AIFIRA facility.</a> Nucl. Instr. Meth. Phys. Res. B. 348, 62-67 (2015).</li>
<li>Mayer, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMayer%2C+M+%22SIMNRA+User%27s+Guide%2C+Report+IPP+9%2F113%22">SIMNRA User's Guide, Report IPP 9/113</a>. , Max-Planck-Institut für Plasmaphysik. Garching, Germany. (1997).</li>
<li>Campbell, J. L., Boyd, N. I., Grassi, N., Bonnick, P., Maxwell, J. A. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168583X10006452">The Guelph PIXE software package IV.</a> Nucl. Instr. Meth. Phys. Res. B. 268 (20), 3356-3363 (2010).</li>
<li>Yu, K., Chang, S., Park, S. J., Lim, J., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titanium+Dioxide+Nanoparticles+Induce+Endoplasmic+Reticulum+Stress-Mediated+Autophagic+Cell+Death+via+Mitochondria-+Associated+Endoplasmic+Reticulum+Membrane+Disruption+in+Normal+Lung+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Titanium Dioxide Nanoparticles Induce Endoplasmic Reticulum Stress-Mediated Autophagic Cell Death via Mitochondria- Associated Endoplasmic Reticulum Membrane Disruption in Normal Lung Cells.</a> PLoS ONE. , 1-17 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisujemy metodę dostarczającą użytecznych informacji wykraczających poza to, co jest możliwe w przypadku innych technik obrazowania, zwłaszcza na poziomie subkomórkowym. Oprócz możliwości obrazowania, analiza mikrosondą jądrową oferuje również możliwości ilościowego oznaczania pierwiastków chemicznych wchodzących w skład próbki biologicznej. W niniejszej pracy badaliśmy populacje komórek ludzkich i skupiliśmy się na analizie wybranego regionu zainteresowania na podstawie pojedynczej komórki wystawionej na działanie nano...

Homeostaza komórkowa jest determinowana przez kontrolę wychwytu, asymilację i wewnątrzkomórkową lokalizację różnych pierwiastków śladowych (jonów, metali, egzogennych związków nieorganicznych). Składniki te często występują w postaci śladów, niemniej jednak mogą mieć znaczący wpływ na fizjologię układu. Tak więc badanie biochemii komórki zarówno w sytuacjach normalnych, jak i patologicznych/stresowych jest kluczowym krokiem w kierunku ogólnego zrozumienia komórkowych mechanizmów metabolicznych. W związku z tym konieczny staje się rozwój technik obrazowania i analiz umożliwiających badanie wewnątrzkomórkowych obfitości chemicznych, organizacji strukturalnej i związanych z nimi funkcji metabolicznych. Bardzo niewiele metod jest w stanie dostarczyć ilościowych informacji in situ dotyczących ogólnego charakteru chemicznego danej próbki. Oprócz metod analizujących próbki w postaci masowej, analizy in situ uwzględniają próbki biologiczne pod względem ich integralności bez utraty informacji o masie i strukturze, zachowując w ten sposób ich składowe substancje chemiczne (pierwiastki śladowe i jony) oraz białka. Ponadto, wraz z dalszym rozwojem nanonauk, konieczne będzie udoskonalenie metod obrazowania i analiz do monitorowania środowiska na skali komórkowej w celu obserwacji i ilościowego określenia zachowań i interakcji nanoobiektów. 1
Nanocząstki (NPs) zostały zdefiniowane jako obiekty wykazujące co najmniej jeden wymiar twarzy w zakresie od 1 do 100 nm. 2 Ze względu na swoje szczególne właściwości fizykochemiczne, NP są szeroko stosowane w przemyśle. Nanocząsteczki są wykorzystywane w zastosowaniach biologicznych i w nanomedycynie. 3,4 Pomimo licznych właściwości fizykochemicznych nanocząsteczek, mogą one generować pewne ryzyko negatywnego wpływu na zdrowie ludzi i środowisko. Ryzyko to może być wywołane zarówno długotrwałym, jak i powtarzającym się narażeniem na różne poziomy stężeń, co nie zostało jeszcze jednoznacznie ustalone. 5,6,7,8 W szczególności los nanocząsteczek wewnątrz komórek i związane z nimi reakcje komórkowe nie są do tej pory w pełni opisane. Wynika to częściowo z niedoboru metod, które pozwalają na wykrywanie i kwantyfikację zinternalizowanych nanocząsteczek w pojedynczej komórce. 9
Klasycznymi narzędziami analitycznymi używanymi do szacowania dawki komórkowej nanocząstek są mikroskopy, spektrometria mas (MS), plazma indukcyjnie sprzężona MS (ICP-MS)10,11 i chromatografia cieczowa MS (LC-MS), ale dostarczają one tylko użytecznych informacji w skali makroskopowej. Żaden z nich nie jest w stanie zapewnić precyzyjnej oceny zawartości subkomórkowych nanocząsteczek ani rozmieszczenia nanocząsteczek bez zastosowania metod frakcjonowania. Systematyczna ocena dawka-odpowiedź jest zatem niemożliwa przy użyciu tych metod, w przeciwieństwie do metod opartych na spektroskopii atomowej, takich jak analiza mikrosondy jądrowej12,13, synchrotronowa mikroskopia fluorescencji rentgenowskiej14 i spektrometria mas jonów wtórnych (SIMS). 15,16 Metody te są szczególnie interesujące, ponieważ uzupełniają obserwacje wykonane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, zwłaszcza gdy NP nie mogą być znakowane cząsteczkami fluorescencyjnymi i dlatego są badane w swoim stanie naturalnym. Do pewnego stopnia, nawet gdy nanocząsteczki są szczepione fluoroforami, (i) kwantyfikacja pozostaje trudna, ponieważ poziom znakowania na NP jest nieznany oraz (ii) chemiczna modyfikacja powierzchni NP może modyfikować jej rozmieszczenie komórkowe.
W tym artykule skupiamy się na metodzie opartej na kombinacji technik mikrosond jądrowych, której celem jest zobrazowanie morfologii i składu pierwiastkowego próbek biologicznych w stężeniach głównych, mniejszych i śladowych.
Analiza mikrosondy jądrowej okazuje się szczególnie odpowiednia do pomiaru śladowych ilości pierwiastków chemicznych w tkankach biologicznych. Zarówno rozdzielczość poprzeczna wiązki (od 0,3 do 1 μm), jak i czułość w detekcji pierwiastków chemicznych (od 1 do 10 μg.g-1 s.m.) doskonale nadają się do badań na poziomie komórkowym. Techniki mikrosond jądrowych opierają się na wykrywaniu cząstek (fotonów, elektronów, jonów) emitowanych po tym, jak wiązka jonów (zwykle działająca z energią MeV) wchodzi w interakcję z atomami obecnymi w próbce. Oddziaływania zachodzące w komórkach to głównie: 1) wzbudzenie/jonizacja atomów, po której następuje emisja fotonów po powrocie atomów do stanu podstawowego; oraz 2) dyfuzja nadlatujących cząstek prowadząca do zmiany ich energii i kierunku. Pomiar energii emitowanych cząstek pozwala na identyfikację atomów biorących udział w oddziaływaniu. Aby wykonać mapowanie pierwiastków, mikrowiązka jonów jest wielokrotnie skanowana po powierzchni próbki, często na obszarze około 100 na 100μm2 zawierającym kilka komórek. Emitowane cząstki są wykrywane, a ich energia jest rejestrowana dla każdej pozycji wiązki. Sortowanie cząstek ze względu na położenie wiązki, a tym samym identyfikacja struktury odpowiedzialnej za emisję takich cząstek, jest celem przetwarzania danych. W tym miejscu dokładnie opisujemy podejście oparte na mikroskopii fluorescencyjnej i analizie mikrosondy jądrowej w celu wykrycia i ilościowego określenia egzogennych nanocząsteczek w skali komórkowej i subkomórkowej, w celu zbadania konsekwencji interakcji NP z żywymi organizmami. W szczególności skupimy się na możliwościach, jakie daje ta metoda w zakresie kwantyfikacji in situ agregatów nanocząstek dwutlenku tytanu (TiO2 NPs) na poziomie subkomórkowym.

<table><tbody><tr><td>Hodowla komórkowa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>U2OS</td><td>ATCC, STANDARDY LGC</td><td>ATCC HTB-96</td><td></td></tr><tr><td>Medium MCCOY 5A bez L-glutaminy</td><td>Dominique DUTSCHER</td><td>L0211-500</td><td></td></tr><tr><td>FBS 500 mL</td><td>Dominique DUTSCHER</td><td>500105U</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11548876</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; L-Glutamina 200 mM, 100 mL&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin,&nbsp; 20 ml</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10092772</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0,25% (v/v)&nbsp; 500 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11570626</td><td></td></tr><tr><td>Viromer Red</td><td>Lipocalyx</td><td>VR-01LB-01</td><td></td></tr><tr><td>Plazmid Matrix-roGFP</td><td>AddGene</td><td>#49437</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>H3570</td><td>Ostrożnie</td></tr> <tr><td>się obchodzić<silny>NPs przygotowanie</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TiO2 P25 AEROXIDE</td><td>Degussa/Evonik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Izotiocyjanian tetrametylorodaminy (TRITC)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T3163</td><td>Modyfikacja powierzchni NPs</td></tr><tr><td>Przygotowanie próbki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Folia poliwęglanowa</td><td>Goodfellow</td><td>CT301020</td><td></td></tr><tr><td>Polieteroeter Keton (PEEK)</td><td>Matechplast</td><td>A-239-4047</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, Absolut ACS</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>02860-6x1L</td><td></td></tr><tr><td>Chlorform, Bezwodny, 99%</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>372978-1L&nbsp;</td><td>Uwaga: toksyczny</td></tr><tr><td>Formvar 100 g</td><td>Agar Scientific</td><td>AGR1201</td><td>Szkodliwy. Stosować w stężeniu 10 &mikro; g na ml chloroformu</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S5881-500G</td><td></td></tr><tr><td>Utrwalanie próbki</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>proszek, 95% Paraformaldehyd</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>158127-500G</td><td>Uwaga toksyczny. Stosować jako 4% roztwór w PBS</td></tr><tr><td>PBS (pH 7,4, bez Ca2+ i Mg2+)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11503387</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold Odczynnik przeciw blaknięciu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>93443</td><td>Szkodliwy</td></tr><tr><td><silny>Kriofiksacja próbki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ciekły azot</td><td>w powietrzu Szkodliwy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>metylobutan >=99%</td> <td>SIGMA-ALDRICH</td><td>&nbsp; M32631-1L</td><td>Uwaga toksyczny</td></tr><tr><td>Aluminiowa płyta transferowa</td><td>Domowej roboty</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Woda destylowana i dejonizowana</td><td>Domowej roboty</td><td></td><td>Wyprodukowano w laboratorium przy użyciu systemu Barnstead Smart2Pure</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR</td><td>52858-000</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Barnstead Smart2Pure</td><td>ThermoFisher Stanowisko bezpieczeństwa biologicznego Scientific</td><td>50129870</td><td></td></tr><tr><td>, klasa II</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MSC-Advantage</td><td></td></tr><tr><td>TC20 automatyczny licznik komórek</td><td>Biorad</td><td>145-0102SP</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka zliczające 2 dołki</td><td>Detektor Biorad</td><td>1450016</td><td></td></tr><tr><td>PIPS, 25 mm2, rozdzielczość energetyczna 12 keV @5,5 MeV</td><td>Canberra&nbsp;</td><td>PD25-12-100AM</td><td></td></tr><tr><td>Detektor półprzewodnikowy Si (Li) o wysokiej rozdzielczości, rozdzielczość 145-eVenergy, @Mn-K&alpha;</td>Detektor elektronów wtórnych (SED) <td>typu Everhart-Thornley firmy Oxford Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Orsay Physics</td><td>1-SED</td><td></td></tr><tr><td>Wzorzec kalibracji XRF sód lub chlor jako mikromateria NaCl</td><td></td><td>34381</td><td></td></tr><tr><td>Wzorzec kalibracji XRF Magnez jako</td><td>mikromateria</td> MgF2 <td>34382</td><td></td></tr><tr><td>Standard kalibracji XRF Aluminium jako</td><td>mikromateria</td> metalu <td>34383</td><td></td></tr><tr><td>Wzorzec kalibracji XRF Krzem jako</td><td>mikromateria</td> SiO <td>34384</td><td></td></tr><tr><td>Wzorzec kalibracji XRF Siarka jako CuSx</td><td>Micromatter</td><td>34385</td><td></td></tr><tr><td>Standard kalibracji XRF Wapń jako CaF2</td><td>Micromatter</td><td>34387</td><td></td></tr><tr><td>Standard kalibracji XRF Tytan jako metal Ti</td><td>Mikromateria</td><td>34388</td><td></td></tr><tr><td>XRF Kalibracja Iron as Fe metal</td><td>Micromatter</td><td>34389</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator 750W</td><td>Sonics Materials</td><td>11743619</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosonda 3MM</td><td>Bioblock scientific</td><td>220-05</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizator w próżni</td><td>Elexience</td><td>EK3147</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop optyczny Zeiss AxioObserver Z1</td><td>Carl Zeiss MicroImaging, GmbH</td><td>431006-9901</td><td></td></tr><tr><td>Zmotoryzowany stolik xy</td><td>Carl Zeiss MicroImaging, GmbH</td><td>432031-9902</td><td></td></tr><tr><td>EC Plan-Neofluar 20X, NA 0,50 Ph2 M27 obiektyw</td><td>Carl Zeiss MicroImaging, GmbH</td><td>420351-9910</td><td></td></tr><tr><td>Plan-Apochromat 63X, NA 1,40 Obiektyw Ph3M27</td><td>Carl Zeiss MicroImaging, GmbH</td><td>420781-9910</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw filtrów Zeiss 02</td><td>Carl Zeiss MicroImaging, GmbH</td><td>488002-9901</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw filtrów Zeiss 38HE</td><td>Carl Zeiss MicroImaging, GmbH</td><td>489038-9901</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw filtrów Zeiss 31</td><td>Carl Zeiss MicroImaging, GmbH</td><td>000000-1031-350</td><td></td></tr><tr><td>Wyciąg chemiczny</td><td>Erlab</td><td>Captair SD321</td><td></td></tr><tr><td>Akcelerator cząstek</td><td>HVEE</td><td>singletron</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ oprogramowanie</td><td>National Institutes of health, USA</td><td>ImageJ 1.51</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie SimNRA</td><td>Max-Planck-Institut f&uuml; r Plasmaphysik, Niemcy</td><td>SIMNRA 6.06</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Gupix</td><td>Uniwersytet Guelph, Kanada</td><td>GUPIXWIN 2.2.4</td><td></td></tr></tbody></table>

in situ wykrywanie i kwantyfikacja pojedynczych komórek nanocząstek tlenków metali za pomocą analizy mikrosondy jądrowej

In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis

Techniki mikroanalityczne oparte na obrazowaniu pierwiastków chemicznych umożliwiają lokalizację i kwantyfikację składu chemicznego na poziomie komórkowym. Oferują one nowe możliwości charakterystyki żywych systemów i są szczególnie odpowiednie do wykrywania, lokalizacji i ilościowego określania obecności nanocząstek tlenków metali zarówno w próbkach biologicznych, jak i w środowisku. Rzeczywiście, wszystkie te techniki spełniają odpowiednie wymagania w zakresie (i) czułości (od 1 do 10 μg.g-1 suchej masy), (ii) rozdzielczości przestrzennej w zakresie mikrometrów oraz (iii) wykrywania wielopierwiastkowego. Biorąc pod uwagę te cechy, obrazowanie pierwiastków chemicznych mikrowiązką może stanowić doskonałe uzupełnienie rutynowych technik obrazowania, takich jak mikroskopia optyczna i fluorescencyjna. Protokół ten opisuje, w jaki sposób przeprowadzić analizę mikrosondą jądrową na hodowanych komórkach (U2OS) wystawionych na działanie nanocząstek dwutlenku tytanu. Komórki muszą rosnąć i być wystawione bezpośrednio w specjalnie zaprojektowanym uchwycie na próbkę używanym w mikroskopie optycznym i na etapach analizy mikrosondy jądrowej. Kriogeniczne utrwalanie próbek metodą wgłębnego zamrażania zachowuje zarówno organizację komórkową, jak i rozkład pierwiastków chemicznych. Jednoczesna analiza mikrosondy jądrowej (skaningowa transmisyjna mikroskopia jonowa, spektrometria wstecznego rozpraszania Rutherforda i emisja promieniowania rentgenowskiego indukowana cząstkami) wykonana na próbce dostarcza informacji o gęstości komórkowej, lokalnym rozmieszczeniu pierwiastków chemicznych, a także zawartości komórkowej nanocząstek. Istnieje rosnące zapotrzebowanie na takie narzędzia analityczne w biologii, zwłaszcza w rozwijającym się kontekście nanotoksykologii i nanomedycyny, w przypadku których konieczne jest pogłębienie naszego zrozumienia interakcji między nanocząstkami a próbkami biologicznymi. W szczególności, ponieważ analiza za pomocą mikrosondy jądrowej nie wymaga znakowania nanocząstek, obfitość nanocząstek jest mierzalna aż do poziomu pojedynczej komórki w populacji komórek, niezależnie od ich stanu powierzchniowego.

Hodowla komórkowa i obrazowanie fluorescencyjne nanocząsteczek TiO2 NP znakowanych fluorescencyjnie
Zaprojektowaliśmy uchwyt do próbek przystosowany do hodowli komórkowej, manipulacji komórkami oraz analiz multimodalnych. W szczególności istotne było, aby uchwyt umożliwiał rutynową mikroskopię optyczną, a także analizę i obrazowanie za pomocą mikrosondy jądrowej. Uchw...

Opisujemy procedurę wykrywania pierwiastków chemicznych obecnych in situ w komórkach ludzkich, jak również ich kwantyfikację in vitro. Metoda ta jest odpowiednia dla każdego typu komórek i jest szczególnie przydatna do ilościowych analiz chemicznych w pojedynczych komórkach po ekspozycji na nanocząstki tlenku metalu in vitro.

In Situ Wykrywanie i kwantyfikacja pojedynczych komórek nanocząstek tlenków metali za pomocą analizy mikrosondy jądrowej

Micro-analytical techniques based on chemical element imaging enable the localization and quantification of chemical composition at the cellular level. ...

Nanocząstki są coraz częściej wykorzystywane w przemyśle i medycynie ze względu na swoje unikalne właściwości fizykochemiczne. Niemniej jednak nadal istnieją obawy dotyczące zdrowia ludzi związane z długotrwałą ekspozycją na nanocząstki. Ryzyka te można określić ilościowo poprzez badanie zachowania nanocząstek wewnątrz komórek oraz indukowanych przez nie odpowiedzi metabolicznych komórek.Wynika to częściowo z braku metod pozwalających na detekcję i kwantyfikację zinternalizowanych nanocząsteczek w pojedynczej komórce. Chociaż do szacowania komórkowego poboru nanocząsteczek można wykorzystać liczne narzędzia analityczne, w tym mikroskopię i spektrometrię mas, dostarczają one jedynie informacji jakościowych na poziomie mikroskopowym. Z kolei metody in situ oparte na spektroskopii atomowej mogą ograniczyć liczbę artefaktów obrazowania powstających podczas przygotowania próbek i umożliwić bezpośrednią obserwację nanocząsteczek.Aby wykorzystać te możliwości, przedstawiamy podejście korelacyjne, które pozwala nam badać nanocząstki w stanie natywnym lub w podłożu laboratoryjnym z użyciem znacznika fluorescencyjnego. Opisujemy tutaj metodę opartą na połączeniu mikroskopii fluorescencyjnej

in-situ-detection-single-cell-quantification-metal-oxide

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Laserowa spektroskopia rozpadu przeprowadzona na cienkich narządach i tkankach nowotworowych skutecznie wykryła naturalne pierwiastki i sztucznie wstrzyknięty gadolin (Gd), emitowany z nanocząstek opartych na Gd. Obrazy pierwiastków chemicznych osiągnęły rozdzielczość 100 μm i czułość ilościową poniżej mM. Kompatybilność zestawu ze standardową mikroskopią optyczną podkreśla jego potencjał do dostarczania wielu obrazów tej samej tkanki biologicznej.

Spektroskopia rozpadu indukowanego laserem: nowe podejście do mapowania i kwantyfikacji nanocząstek w tkance narządowej

Obrazowanie spektroskopowe elektronów może obrazować i odróżniać kwas nukleinowy od białka z rozdzielczością nanometrów. Można go połączyć z systemem miniSOG, który jest w stanie specyficznie znakować znakowane białka w próbkach z transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Zastosowanie tych technologii ilustrujemy na przykładzie dwuniciowych ognisk naprawy pęknięć.

Wizualizacja białek naprawczych DNA oznaczonych tagami miniSOG w połączeniu z obrazowaniem spektroskopowym elektronów (ESI)

Ze względu na znaczenie i szerokie zastosowanie palladu, złota i kobaltu w sprzęcie high-tech, ich odzysk i recykling stanowią ważne wyzwanie przemysłowe. Opisany w niniejszym dokumencie system odzysku metali jest prostym, tanim sposobem na skuteczne wykrywanie, usuwanie i odzysk tych metali z kopalni miejskiej.

Wykrywanie i odzyskiwanie palladu, złota i metali kobaltowych z kopalni miejskiej przy użyciu nowatorskich czujników/adsorbentów oznaczonych nanoskalowymi porami w kształcie koła wagonowego

Ulepszona mikroskopia ciemnego pola i obrazowanie hiperspektralne z mapowaniem spektralnym umożliwiają badania, lokalizację i identyfikację materiałów w skali nano w próbkach histologicznych z większą szybkością i dokładnością w porównaniu z tradycyjnymi metodami. Celem niniejszej pracy jest przedstawienie metod obrazowania w ciemnym polu i mapowania hiperspektralnego nanocząstek tlenków metali w próbkach histologicznych.

Identyfikacja nanocząstek tlenków metali w próbkach histologicznych za pomocą ulepszonej mikroskopii ciemnego pola i mapowania hiperspektralnego

Izolowanie elektrycznych i termicznych efektów na elektrycznie wspomagane deformacje (EAD) jest bardzo trudne przy użyciu makroskopowych próbek. Opracowano mikro- i nanostruktury próbek metalicznych wraz z niestandardową procedurą testową w celu oceny wpływu przyłożonego prądu na powstawanie bez ogrzewania dżuli i ewolucję dyslokacji na tych próbkach.

Nowatorska metoda elektromechanicznej charakterystyki próbek w nanoskali in situ

Ten artykuł zawiera krótki przegląd trwających w Wojskowym Laboratorium Badawczym wysiłków nad przetwarzaniem masowych metali nanokrystalicznych, z naciskiem na metodologie stosowane do produkcji nowych proszków metali.

Przetwarzanie masowych metali nanokrystalicznych w Laboratorium Badawczym Armii Stanów Zjednoczonych

W tej pracy przedstawiono protokół wzmacniania sygnału biodetekcji opartej na nanosondach. Protokół opiera się na redukcji kwasu chloroaurowego na powierzchnię istniejących nanosond, które składają się z nanocząstek złota, srebra, krzemionki lub tlenku żelaza.

Szybkie wzmocnienie sygnału nanosondy poprzez syntezę nanocząstek złota in situ

Tutaj prezentujemy protokół do wykrywania dyskretnych klastrów tlenu metali, polioksometalanów (POM), na granicy pojedynczej cząsteczki za pomocą biologicznej platformy elektronicznej opartej na nanoporach. Metoda ta stanowi komplementarne podejście do tradycyjnych narzędzi chemii analitycznej stosowanych w badaniu tych cząsteczek.

Charakterystyka fizyczna pojedynczych nanocząstek metalicznych w wysokiej rozdzielczości

Prezentowany tutaj jest protokół hodowli komórek na membranach z azotku krzemu i zamrażania wgłębnego przed obrazowaniem fluorescencji rentgenowskiej za pomocą synchrotronowej kriogenicznej nanosondy rentgenowskiej. Gdy zapewniona jest tylko nanoanaliza w temperaturze pokojowej, zamrożone próbki można dalej liofilizować . Są to kluczowe kroki w celu uzyskania informacji na temat wewnątrzkomórkowego składu pierwiastków.

Hodowla komórkowa na membranach z azotku krzemu i kriopreparatyka do nanoanalizy synchrotronowej fluorescencji rentgenowskiej

Nanocząstki tlenku żelaza są syntetyzowane za pomocą niewodnego żelu zolowego i pokrywane anionowymi krótkimi cząsteczkami lub polimerem. Zastosowanie magnetometrii do monitorowania inkorporacji i biotransformacji nanocząstek magnetycznych wewnątrz ludzkich komórek macierzystych wykazano za pomocą magnetometru do próbek wibracyjnych (VSM).

Wykorzystanie magnetometrii do monitorowania inkorporacji komórkowej, a następnie biodegradacji chemicznie syntetyzowanych nanocząstek tlenku żelaza

Przedstawiamy ogólny zarys metod mikroanalizy ilościowej do szacowania zajętości zanieczyszczeń i ich stanów chemicznych, wykorzystując zjawiska kanalizacji elektronów w warunkach padającego kołysania wiązką elektronów, które niezawodnie wydobywają informacje o gatunkach mniejszościowych, pierwiastkach lekkich, wolnych miejscach tlenu i innych defektach punktowych/liniowych/płaskich.

Ilościowa analiza miejsc atomowych funkcjonalnych domieszek/defektów punktowych w materiałach krystalicznych za pomocą mikroanalizy wzmocnionej kanałem elektronowym

Poznaj metodę wykrywania nanocząstek tlenków metali w pojedynczych komórkach ludzkich za pomocą analizy mikrosondy jądrowej. Technika umożliwia ilościową analizę pierwiastków chemicznych i badanie odpowiedzi metabolicznych komórek.

In Situ Wykrywanie i kwantyfikacja pojedynczych komórek nanocząstek tlenków metali za pomocą analizy mikrosondy jądrowej

Przeglądaj więcej filmów