Obrazowanie metali w tkance mózgowej metodą ablacji laserowej - Plazma sprzężona indukcyjnie - Spektrometria mas (LA-ICP-MS)
22 stycznia 2017
Ilościowe mapowanie metali w tkance za pomocą ablacji laserowej - plazma sprzężona indukcyjnie - spektrometria mas (LA-ICP-MS) to czuła technika analityczna, która może dostarczyć nowego wglądu w to, jak metale uczestniczą w normalnych funkcjach i procesach chorobowych. W tym miejscu opisujemy protokół ilościowego obrazowania metali w cienkich odcinkach tkanki neurologicznej myszy.
Ogólnym celem tej metody jest ilościowe określenie rozkładu przestrzennego metali w przekrojach tkanek przy użyciu spektrometrii mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie po ablacji laserowej. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania zarówno z zakresu biologii podstawowej, jak i badań nad chorobami, szczególnie w przypadku schorzeń, w których biochemia metali bierze udział w patologii choroby. Główną zaletą tej techniki jest zachowanie informacji przestrzennej o metalach, która jest tradycyjnie tracona podczas stosowania standardowych technik analizy metali.
Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię i diagnostykę chorób neurodegeneracyjnych, ponieważ pozwala ona monitorować zmiany poziomu metali w obszarach mózgu wykazujących obumieranie komórek. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotykać trudności podczas przygotowywania tych długich i złożonych eksperymentów. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ projektowanie eksperymentu i analiza danych mogą być wymagające, gdyż każdy etap musi zostać wykonany w określonej kolejności.
W pierwszej kolejności umieść próbkę tkanki mózgowej oraz wszystkie standardy tkankowe dopasowane macierzyście w komorze ablacji laserowej. Upewnij się, że próbki znajdują się w głębi ostrości kamery LACCD. Zamknij drzwi komory i dokręć śruby palcami.
Następnie w oprogramowaniu ICPMS otwórz zawór gazu nośnego i ustaw natężenie przepływu na 1,2 liters per minute. W oprogramowaniu LA przeprowadź 30-minutowe płukanie komory ablacji gazem nośnym. W przypadku komory ablacji o objętości dwóch jednostek, co dziesięć minut przesuń stolik z próbką w każdy narożnik komory, aby zmniejszyć ilość pozostałego w niej powietrza.
Włącz urządzenie ICPMS i pozostaw je do rozgrzania przez dwie godziny. Podczas rozgrzewania instrumentu, w oprogramowaniu do ablacji laserowej wyznacz linię ablacji o długości około trzech milimetrów na powierzchni pierwszego standardu tkankowego. Kliknij linię ablacji i ustaw domyślną średnicę wiązki, prędkość skanowania oraz fluencję promieniowania.
Powtórz linię sześć razy, zachowując odstępy między liniami równe średnicy wiązki. Powtórz ten proces dla każdego wzorca. Następnie, używając narzędzia do rysowania linii, wyznacz obszar ablacji na próbce, zaczynając od górnego lewego rogu i przechodząc przez najszerszy punkt próbki, stosując te same parametry, co w przypadku wzorców.
Powtórz linię w razie potrzeby, aby zapewnić pełne pokrycie próbki, zachowując te same odstępy, co w przypadku standardów. Następnie wyznacz zestaw linii do okresowego skanowania standardów, nie później niż po 20 godzinach skanowania próbki lub pomiędzy każdą próbką. Dodaj skan standardów na koniec eksperymentu.
Na podstawie długości linii i prędkości skanowania określ czas analizy dla linii próbki i standardu. Następnie utwórz nową partię w oprogramowaniu ICPMS i wybierz analizę rozdzieloną w czasie. Wybierz interesujące wartości stosunku masy do ładunku i ustaw czasy całkowania dla każdego stosunku tak, aby całkowity czas całkowania dla jednego cyklu wynosił 0,25 s.
Zapisz partię. W przypadku standardowej partii wprowadź czas analizy dla każdej linii, dodając 15 sekund buforu w celu uwzględnienia czasu rozgrzewania lasera i czasu płukania. Ustaw listę przebiegów próbek z akwizycją dla każdej linii standardu.
W przypadku partii próbek należy powielić partię standardów i odpowiednio dostosować czasy oraz liczbę akwizycji do wzoru ablacji próbek. Po rozgrzaniu spektrometru ICPMS należy dodać pierwszą partię do kolejki i upewnić się, że oprogramowanie oczekuje na sygnał wyzwalający z urządzenia LA. Następnie w oprogramowaniu LA należy włączyć zasilacz lasera oraz ustawić czasy rozgrzewania i płukania lasera.
Uruchom sekwencję lasera i sprawdź, czy ICPMS prawidłowo rozpoczyna zbieranie danych po ablacji. Po zebraniu danych wyodrębnij wartości dla wzorców z plików CSV. Wykonaj korektę linii bazowej i wyeliminuj sygnał tła.
Zidentyfikuj spadki sygnału spowodowane dziurami w standardach tkankowych. Zamaskuj te obszary o niskim sygnale, a następnie wyeksportuj dane do arkusza kalkulacyjnego. Oblicz współczynnik konwersji z CPS na PPM dla każdego zidentyfikowanego pierwiastka.
Powtórz ten proces dla każdego standardu. Następnie uruchom oprogramowanie do ilościowej analizy obrazu i zaimportuj dane próbek z plików CSV. Wybierz kilka obszarów tła, aby zastosować korekcję tła.
Wybierz narzędzie do edycji wykresów, kliknij prawym przyciskiem myszy na obraz i wybierz opcję modyfikacji wyglądu obrazu (modify image appearance). Zmień pierwszy kolor przy Z na dużą wartość ujemną i kliknij „gotowe” (done), aby wzmocnić sygnał tła. Następnie w karcie standardów (standards tab) wprowadź współczynniki korekcji CPS PPM dla każdego standardu i kliknij „start” (go).
Otwórz przeglądarkę danych w karcie danych, kliknij prawym przyciskiem myszy na poprawiony plik obrazu i wybierz opcję nowego obrazu. Otwórz okno modyfikacji wyglądu obrazu i ustaw tabelę kolorów oraz skalę. Użyj narzędzia dodawania adnotacji, aby umieścić skalę kolorów na obrazie.
Dostosuj skalę kolorów w oknie skali kolorów. Po pokolorowaniu i opisaniu obrazu skopiuj i wklej go do innego programu lub wyeksportuj go z oprogramowania do tworzenia obrazów. Aby aktywować narzędzia ROI, wybierz przetwarzanie obrazu z pakietów analizy i wybierz obraz.
W karcie obrazu kliknij ROI i rozpocznij rysowanie ROI. Wybierz obszar zainteresowania, a następnie kliknij finish ROI. W karcie obrazu kliknij stats, aby uzyskać dane ROI.
Skopiuj i wklej dane do arkusza kalkulacyjnego, pamiętając o zapisywaniu zmian po dodaniu każdego ROI. Powtarzaj ten proces w razie potrzeby. Przy użyciu tej techniki zbadano zawartość i rozkład metali w mózgu myszy typu dzikiego.
Poniżej przedstawiono rozkłady węgla, magnezu i fosforu w przeliczeniu na liczbę zliczeń na sekundę. Przedstawiono obrazy ilościowe dla manganu, miedzi, żelaza i cynku. Rozkład węgla posłużył jako standard wewnętrzny.
Żelazo występowało w największym stężeniu w śródmózgowiu oraz w zakręcie zębatym. Cynk występował w największym stężeniu w obszarach korowych. Informacje z tych obrazów mogą następnie służyć do śledzenia ekspresji i funkcjonalności białek wiążących metale. Po opanowaniu techniki, prawidłowo przygotowany eksperyment trwający kilka dni można zestawić w ciągu godziny.
Podczas wykonywania tej procedury ważne jest zsynchronizowanie linii ablacji oraz plików danych z ICPMS. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić dodatkowe metody, takie jak barwienie histologiczne sąsiednich przekrojów, aby uzyskać dodatkowe informacje, np. o kolokalizacji metali z określonymi białkami. Pomysł na tę metodę pojawił się u nas podczas chęci zbadania, w jaki sposób zmieniają się poziomy metali w modelach laboratoryjnych choroby Parkinsona.
Choć metodę tę można wykorzystać do uzyskania wglądu w procesy neurodegeneracji, może ona być również stosowana dla różnych typów tkanek i stanów chorobowych, w tym dla tkanek ludzkich oraz szerokiego zakresu matryc biologicznych. Po opracowaniu ta technika utorowała drogę badaczom z dziedziny neuronauki do badania zmian poziomów metali zarówno w próbkach ludzkich, jak i w zwierzęcych modelach chorób. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dokładne wyobrażenie o tym, jak przygotować eksperyment z wykorzystaniem ablacji laserowej ICPMS.
Należy pamiętać, że praca z materiałem biologicznym może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak stosowanie odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół ilościowego mapowania metali w tkance neurologicznej myszy z wykorzystaniem spektrometrii mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie i ablacją laserową (LA-ICP-MS). Ta czuła technika pozwala na uzyskanie wglądu w rozkład metali związany z normalnym funkcjonowaniem oraz procesami chorobowymi.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Chemia analityczna
- Metalomika
Wstęp
- LA-ICP-MS zachowuje informacje przestrzenne dotyczące metali, w przeciwieństwie do metod tradycyjnych.
- Zrozumienie biochemii metali jest kluczowe dla badań nad chorobami.
- Technika ta może pomóc w monitorowaniu chorób neurodegeneracyjnych.
- Demonstracje wizualne są niezbędne dla skutecznego wykonania protokołu.
Cel badania
- Ilościowe określenie rozmieszczenia przestrzennego metali w przekrojach tkanek.
- Odpowiedź na kluczowe pytania biologiczne dotyczące udziału metali w chorobach.
- Pogłębienie wiedzy na temat białek wiążących metale w mózgu.
Zastosowane metody
- Przygotowanie próbek tkanki mózgowej i wzorców w komorze ablacji laserowej.
- Konfiguracja oprogramowania ICPMS do gromadzenia danych.
- Przeprowadzenie ablacji laserowej i ekstrakcja danych z plików CSV.
- Wykorzystanie oprogramowania do ilościowej rekonstrukcji obrazu w celu analizy danych.
Główne wyniki
- Rozkład metali, takich jak żelazo i cynk, został zmapowany w obszarach mózgu myszy.
- Żelazo występowało w największym stężeniu w śródmózgowiu i zakręcie zębatym.
- Koncentracja cynku była najwyższa w obszarach korowych.
- Obrazy ilościowe dostarczyły informacji na temat funkcjonalności białek wiążących metale.
Wnioski
- LA-ICP-MS jest cennym narzędziem do badania rozkładu metali w tkankach neurologicznych.
- Dzięki praktyce proces przygotowania układu eksperymentalnego można przeprowadzić w sposób wydajny.
- Metoda ta ma istotne znaczenie dla zrozumienia chorób neurodegeneracyjnych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla sektora przemysłowego
Technika LA-ICP-MS umożliwia ilościowe oznaczenie metali z rozdzielczością przestrzenną w tkance mózgowej, wypełniając istotną lukę w badaniach nad chorobami neurodegeneracyjnymi, w których zaburzenia homeostazy metali występują w anatomicznie ściśle określonych regionach. Możliwość ta wspomaga walidację celów terapeutycznych poprzez powiązanie rozkładu metali ze ścieżkami istotnymi dla przebiegu choroby oraz ekspresją białek, co zwiększa pewność prognostyczną w modelach przedklinicznych. Metoda ta dostarcza ilościowych danych o wysokiej rozdzielczości, które pozwalają na mechanistyczną minimalizację ryzyka oraz priorytetyzację portfela terapeutyków modulujących poziom metali.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikuje hipotezy terapeutyczne poprzez mapowanie rozkładu metali w regionach neuroanatomicznych związanych z patologią choroby.
- Wartość operacyjna: Umożliwia walidację funkcjonalną celów poprzez korelację poziomu metali z ekspresją i aktywnością białek wiążących metale.
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez identyfikację specyficznej dla regionu dysregulacji metali jako biomarkera wczesnych stadiów choroby.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane układy biologiczne do późniejszych analiz przesiewowych poprzez ustalenie podstawowego rozkładu metali w tkance typu dzikiego.
- Wartość operacyjna: Dostarcza zestandaryzowane, powtarzalne wyniki ilościowe (PPM), niezbędne do normalizacji analizy i przygotowania do przesiewu związków.
- Wartość naukowa: Umożliwia wiarygodną ocenę związków poprzez wykrywanie zmian w homeostazie metali, które wskazują na zaangażowanie mechanizmu ukierunkowanego na cel.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wykazuje korelację systemową istotną dla przebiegu choroby poprzez śledzenie zmian poziomu metali w modelach neurodegeneracji, takich jak choroba Parkinsona.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość translacyjną od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej dzięki spójnej kwantyfikacji metali w sekcjach tkankowych.
- Wartość naukowa: Wspiera decyzje o rozwoju projektu z uwzględnieniem ryzyka poprzez identyfikację patofizjologicznych sygnatur opartych na metalach przed badaniami skuteczności in vivo.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum odkryć – od testowania hipotez dotyczących punktów uchwycenia, przez identyfikację związków wiodących, aż po walidację przedkliniczną – dostarczając rozdzielczo przestrzennych danych o metalach, które pozwalają zrozumieć mechanizmy biologiczne oraz działanie związków.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez ujawnianie wzbogacenia w metale w takich obszarach jak śródmózgowie i zakręt zębaty w przypadku żelaza oraz obszary korowe w przypadku cynku.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowe do analizy wyniki ilościowe z rozdzielczością rzędu niskich mikrometrów, umożliwiając powtarzalne mapowanie metali w zestawach próbek.
- Analityka: Generuje rozdzielone w czasie dane CPS konwertowane na PPM za pomocą standardów, zapewniając odczyty statystyczne do porównań międzygrupowych i określania wielkości efektu.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną, umożliwiając podłużne śledzenie zmian zawartości metali w modelach chorób, co wspiera dopasowanie biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Funkcjonuje jako wielorazowa platforma do obrazowania metali w różnych typach tkanek i stanach chorobowych, ograniczając powielanie prac nad opracowywaniem metod.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w szlakach zależnych od metali dzięki bezpośredniej korelacji przestrzennej.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność poprzez zastosowanie standardów dopasowanych macierzą oraz spójnych parametrów ablacji laserowej.
- Wartość strategiczna: Poprawia decyzje typu go/no-go, umożliwiając wczesne wykrycie zaburzeń homeostazy metali, co redukuje ryzyko biologiczne na późnych etapach programów badawczych nad OUN.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez ilościowe określenie zaangażowania celu w strategiach modulujących metale w istotnych dla danej choroby obszarach mózgu.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej w zakresie parametrów ablacji laserowej, optymalizacji ICPMS oraz interpretacji danych metalomicznych.
- Zależy od aparatury LA-ICP-MS, kontroli gazu nośnego oraz oprogramowania do konstrukcji obrazów ilościowych służącego konwersji CPS na PPM.
- Wymaga standaryzacji przygotowania próbek, wzorów ablacji oraz protokołów korekcji tła pomiędzy zespołami.
- Wymaga uwzględnienia adaptacji do różnej grubości tkanek, składu pierwiastkowego i efektów matrycowych w zależności od gatunku lub stanu chorobowego.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak maskowanie spadku sygnału ze względu na heterogeniczność tkanek oraz konieczność stosowania sekwencyjnych cykli ablacji standard-próbka-standard w celu zachowania dokładności ilościowej.
