Model inwazji okołonerwowej w raku płaskonabłonkowym głowy i szyi

Ogólnym celem tego eksperymentalnego protokołu jest szybka ocena wielu warunków leczenia wpływających na inwazję okołonerwową w raku płaskonabłonkowym głowy i szyi z bardzo wysokimi wskaźnikami powodzenia testu i odtwarzalności. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu onkologii głowy i szyi, takie jak czynniki wpływające na inwazję okołonerwową komórek raka głowy i szyi. Główną zaletą tej techniki jest to, że dużą liczbę testów można szybko i powtarzalnie wykonać na jednej myszy w stosunkowo krótkim czasie.

Przed rozpoczęciem procedury rozwarstwiania zwoju korzenia grzbietowego lub DRG należy dodać świeżą pożywkę o temperaturze pokojowej do co najmniej 40 dołków 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V. Następnie użyj cienkich nożyczek, aby wykonać podłużne nacięcie wzdłuż kręgosłupa od nasady ogona do głowy myszy. I poprzecznie podziel tkankę poniżej kręgosłupa krzyżowego, preparując obie strony kręgosłupa, aż do podstawy czaszki.

Przenieś próbkę pod mikroskopem i obserwuj szyjny koniec kręgosłupa przy niskiej mocy. Biały rdzeń kręgowy jest widoczny w środku kostnego pierścienia, który jest otoczony zmienną ilością mięśni okołordzeniowych i tkanek miękkich. Za pomocą mikroskopijnych nożyczek sprężynowych podziel grzbiet lub górny aspekt pierwszych dwóch do trzech trzonów kręgów.

Następnie użyj sprężynowego działania nożyczek, aby otworzyć to początkowe nacięcie kostne, aby upewnić się, że rozwarstwienie trzonu kręgu następuje w linii środkowej. Kontynuuj małymi krokami w kierunku kręgosłupa krzyżowego, przecinając kręgosłup na pół z identycznymi cięciami na brzusznej lub dolnej stronie trzonów kręgów. Odkładając jedną półkulę na bok, przenieś drugą połowę kręgosłupa twarzą w dół na sterylną płytkę z rdzeniem kręgowym na miejscu.

I użyj dwóch igieł o rozmiarze 18, aby przymocować oba końce półpinezki do polistyrenowej platformy preparcyjnej. Następnie, zaczynając od węższego, szyjnego końca, delikatnie oderwij rdzeń kręgowy od około czterech poziomów kręgów. W obszarze, w którym nerwy czuciowe wprowadzają się do DRG, delikatnie chwyć otaczającą powięź mikroskopijnymi kleszczami i użyj mikroskopijnych nożyczek sprężynowych, aby przyciąć tę powięź i inną tkankę nerwową, aby uwolnić DRG.

Pod zwiększonym powiększeniem użyj nożyczek sprężynowych, aby przeciąć nerw obwodowy jak najbliżej DRG, aby uwolnić tkankę i przyciąć gałęzie proksymalne. Następnie przyciąć DRG z wszelkich zabłąkanych włókien nerwowych lub przyczepów powięziowych i umieścić izolowaną tkankę w jednym dołku 96-dołkowej płytki dna w kształcie litery V. Aby przygotować półstałe kropelki matrycy, należy przenieść jedną szklaną płytkę dna z lodu na blok lodu pod mikroskopem operacyjnym.

Umieść końcówkę pipety o pojemności nie większej niż 10 mikrolitrów bezpośrednio na szkle pod kątem 45 stopni i ostrożnie dozuj kroplę matrycy o pojemności 1,5 mikrolitra na szkło. Powoli odsuń końcówkę pipety od szklanki, gdy matryca zazębi się z płytką. Umieść jedną kroplę matrycy na każdym z czterech rogów płytki i przenieś płytkę na powierzchnię o temperaturze pokojowej na około jedną minutę.

Gdy matryca lekko zesztywnieje, włóż płytkę z powrotem do bloku lodu i za pomocą zamkniętych mikroskopijnych kleszczyków delikatnie nabierz DRG lewą ręką. Prawą ręką ostrożnie przenieś tkankę nerwową na końcówkę igły o rozmiarze 21 i użyj igły, aby delikatnie wprowadzić DRG do środka kropli matrycy. DRG powinien łatwo uwalniać się do matrycy w celu centralnego pozycjonowania za pomocą igły.

Po włożeniu kawałka DRG do każdej z czterech kropel, umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na trzy minuty. Po osadzeniu wszystkich DRG należy trzymać płytki pojedynczo pod niewielkim kątem i powoli dodawać do płytek cztery mililitry DMEM uzupełnionego 10% FBS, tak aby pożywka tylko stopniowo stykała się z jednostkami DRG matrycy. Umieść płytki z powrotem w inkubatorze na kolejne 48 do 72 godzin.

Gdy neuryty osiągną co najmniej 75% drogi do krawędzi matrycy, należy odessać pożywkę z dołków bez usuwania jednostek DRG matrycy. Następnie, za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów, z płynnym spustem, umieść dwie krople po trzy razy od 10 do piątej komórki na mililitr pożywki w każdym teście matrycowym DRG. I włóż płytki z powrotem do inkubatora.

Po godzinie delikatnie dodaj cztery mililitry DMEM z 10% FBS wzdłuż bocznej ścianki szklanej płytki dolnej i włóż płytki z powrotem do inkubatora do czasu ich następnej oceny mikroskopowej. Po ich rozbiorzeniu i umieszczeniu w kropelkach matrycy, wygląd testu powinien przypominać pokazany tutaj DRG osadzony w matrycy. Zauważ, że DRG nie jest idealnie okrągły, ale jest wyśrodkowany w kropli matrycy, co pozwala na wzrost neurytów w 360 stopniach.

Bezpośrednio po posianiu komórki raka płaskonabłonkowego głowy i szyi tworzą obwodowy pierścień wokół macierzy, rozszerzając się wzdłuż neurytów w ciągu następnych dwóch do trzech dni. Komórki posiane na ślepych kropelkach kontrolnych zawierających samą matrycę aktywnie dzielą się wokół macierzy, ale nie wchodzą ani nie rozciągają się nad nimi. W celu ilościowego określenia inwazji okołonerwowej komórek nowotworowych, obrazy testów są dzielone na cztery ćwiartki za pomocą jednej linii pionowej i jednej poziomej.

Następnie zdobywa się serię punktów dla każdego rozszerzenia inwazji okołonerwowej obserwowanego w każdym kwadrancie, co pozwala na porównanie wrastania komórek rakowych wzdłuż neurytów między różnymi liniami komórek rakowych. Po opanowaniu technika izolacji zwojów korzenia grzbietowego może zostać zakończona w mniej niż dwie godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby zminimalizować nadmierne obchodzenie się ze zwojami korzenia grzbietowego, ponieważ uraz zmiażdżenia jest najczęstszą przyczyną niepowodzenia testu.

Po tej procedurze można badać mechanizmy inwazji okołonerwowej, co może prowadzić do opracowania terapii celowanych przeciwko temu typowi inwazji tkanek miękkich. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyciąć zwoje korzenia grzbietowego myszy i skonfigurować test do badania inwazji okołonerwowej.