Name: Model inwazji okołonerwowej w raku płaskonabłonkowym głowy i szyi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Poznaj metodę oceny inwazji okołonerwowej w raku płaskonabłonkowym głowy i szyi z wykorzystaniem ganglionów korzeniowych myszy. Technika umożliwia szybkie i reprodukowalne przeprowadzanie wielu testów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była w całości wspierana przez finansowanie z NIH poprzez grant R21, "Mechanizmy inwazji okołonerwowej w raku głowy i szyi" oraz grant szkoleniowy NCI T32, "Post-Doctoral Research Training in Head and Neck Oncology (2T32CA060397-21)." Dziękuję dr n. med. Richardowi Steimanowi i personelowi laboratorium.

1. Przygotowanie podłoża hodowlanego i potraw (10 min)
<ol>
	<li>Dodaj 100 μl zmodyfikowanego podłoża Dulbecco's Eagle Medium (DMEM) z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) do dołków 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V.</li>
	<li>Wyjąć wstępnie porcjowaną fiolkę zawierającą około 100 μl półstałej matrycy z zamrażarki w temperaturze 20 °C i umieścić ją bezpośrednio na lodzie. 
	UWAGA: Należy to zrobić przed zbiorem zwoju korzenia grzbietowego (DRG), ponieważ półstała matryca potrzebuje około 30 minut, aby osiągnąć stan ciekły na lodzie, który jest niezbędny do kolejnych etapów. Nieutrzymywanie półstałej matrycy na lodzie przez cały czas spowoduje niską jakość kropli matrycy.</li>
	<li>Oznacz płytki kultur ze szklanym dnem trwałym atramentem, tworząc unikalne identyfikatory w każdym z czterech rogów na spodniej powierzchni płytki. Umieść talerze prawą stroną do góry na lodzie, aby schłodzić powierzchnię talerza. 
	UWAGA: Każda mysz daje 32 - 40 DRG, więc oznacz je od 1 do 40. Nie ma potrzeby wstępnego schładzania końcówek pipet, ponieważ schłodzone końcówki nagrzewają się w trakcie umieszczania kropelek matrycy, co może powodować różnice w konsystencji matrycy.</li>
</ol>
2. Sekcja mysiego DRG (45 min)
<ol>
	<li>Poddaj eutanazji nagą mysz zgodnie z określonymi protokołami laboratoryjnymi, takimi jak użycie komory CO2 i torakotomii.</li>
	<li>Ustaw obszar sekcji i mikroskop. Używaj czystego, wysterylizowanego i płaskiego spodu pojemników polistyrenowych do probówek stożkowych o pojemności 15 lub 50 ml. 
	UWAGA: Dodatkowo nadają się do stosowania jako powierzchnia preparacyjna, ponieważ są niedrogie, jednorazowe i pozwalają na unieruchomienie kręgosłupa za pomocą szpilek lub igieł. Używaj wyłącznie wysterylizowanych narzędzi i igieł.</li>
	<li>W naturalnym widzeniu wykonaj podłużne nacięcie wzdłuż kręgosłupa od nasady ogona do głowy myszy za pomocą prostych lub zakrzywionych cienkich nożyczek.</li>
	<li>Użyj tych samych nożyczek, aby podzielić poprzecznie poniżej kręgosłupa krzyżowego. Wypreparuj obie strony kręgosłupa aż do podstawy czaszki za pomocą nożyczek. W tym momencie upewnij się, że kręgosłup szyjny jest przecięty czaszką tak daleko, jak to możliwe, nożyczkami.</li>
	<li>Obserwuj szyjny koniec kręgosłupa pod mikroskopem operacyjnym przy małej mocy. Biały rdzeń kręgowy jest widoczny w środku pierścienia kostnego, który jest otoczony zmienną ilością mięśni przykręgosłupowych i tkanek miękkich.</li>
	<li>Podziel grzbietową lub górną część pierwszych 2-3 trzonów kręgów za pomocą mikroskopijnych nożyczek sprężynowych. Używając sprężynowego działania nożyczek, otwórz to początkowe cięcie kostne, aby upewnić się, że rozwarstwienie trzonu kręgu nastąpiło w linii środkowej. Kontynuuj małymi krokami w kierunku kręgosłupa krzyżowego, a następnie przetnij kręgosłup na pół, wykonując identyczne nacięcia na brzusznej lub dolnej stronie trzonów kręgów. 
	UWAGA: Niezapewnienie rozwarstwienia linii środkowej kostnego kręgosłupa spowoduje niższą wydajność DRG.</li>
	<li>W tym momencie kręgosłup jest podzielony na dwie połowy. Odłóż jeden kręgosłup połowiczny na bok, z rdzeniem kręgowym na miejscu i skierowany w dół na sterylnej płytce. 
	UWAGA: Pozostawienie rdzenia kręgowego na miejscu zapobiegnie wysychaniu DRG, ponieważ DRG znajdują się głęboko w rdzeniu kręgowym.</li>
	<li>Zabezpiecz oba końce drugiego grzbietu półgrzbietu dwiema igłami o rozmiarze 18 na polistyrenowej platformie sekcyjnej. Zaczynając od końca szyjnego (co jest widoczne, ponieważ kręgosłup jest węższy, DRG są bliżej siebie i są przyczepy żeber), delikatnie oderwij rdzeń kręgowy od około 4 poziomów kręgów.</li>
	<li>Obserwuj nerwy czuciowe (zwykle dwa) łączące DRG. W obszarze, w którym nerwy wprowadzają się do DRG, delikatnie chwyć otaczającą powięź mikroskopijnymi kleszkami. Wypreparuj i przytnij tę powięź i inną tkankę nerwową za pomocą mikroskopijnych nożyczek sprężynowych, aby zwolnić DRG. Delikatne wycofanie spowoduje, że DRG przesunie się z jego pozycji w kostnym kręgosłupie. 
	UWAGA: Zwiększenie mocy mikroskopu na tym etapie jest korzystne. Zmiażdżenie DRG znacznie ograniczy wzrost neurytów. Można tego uniknąć, nigdy nie chwytając DRG bezpośrednio, ale raczej chwytając otaczającą powięź.</li>
	<li>Przetnij nerw obwodowy (DRG ma na ogół jeden nerw obwodowy, który jest głęboki w stosunku do widoku preparacyjnego) mikroskopijnymi nożyczkami sprężynowymi, aby uwolnić DRG. 
	UWAGA: Najłatwiej jest ustalić, gdzie kończy się nerw, a zaczyna DRG podczas napięcia, więc idealnie jest wykonać to cięcie jak najbliżej DRG w tym momencie. Po przecięciu tej dystalnej gałęzi przycinane są również gałęzie proksymalne.</li>
	<li>Przytnij DRG z wszelkich zabłąkanych włókien nerwowych lub przyczepów powięziowych za pomocą mikroskopijnych nożyczek sprężynowych. Po odpowiedniej izolacji umieścić DRG w podłożu o temperaturze pokojowej w 96-dołkowej płytce dolnej w kształcie litery V. 
	UWAGA: Umieszczenie ciemnego tła pod płytą ułatwia wizualizację białych DRG poniżej mm. Umieść tylko jeden DRG w każdej studzience; W ten sposób można je łatwiej rozliczyć w kolejnych krokach.</li>
	<li>Powtórz ten proces aż do jednego grzbietu połowicznego, a następnie do drugiego. Każda strona daje 16 - 20 DRG, co daje w sumie 32 - 40, 
	UWAGA: Jeśli DRG jest mniej niż ten, sekcja kręgosłupa musi być przeprowadzona dalej głowo, i/lub doogonowo. DRG stają się coraz mniej zdefiniowane w miarę postępu doogonowego.</li>
</ol>
3. Przygotowanie półstałych kropelek matrycy (< 1 min na płytkę)
<ol>
	<li>Wyjmij jedną szklaną płytkę dna studzienki z lodu i umieść ją na bloku lodu pod mikroskopem operacyjnym. Upewnij się, że podwielokrotność matrycy pozostaje przez cały czas na lodzie.</li>
	<li>Umieścić kroplę matrycy o pojemności 1,5 μl w każdym z czterech rogów płytki ze szklanym dnem za pomocą mikropipetera o pojemności 2 μl lub 10 μl, pozostawiając odległość co najmniej równą samej kropli od krawędzi szklanej studzienki.
	<ol>
		<li>Umieść końcówkę pipety bezpośrednio na szkle pod kątem 45 stopni. Powoli pipetować matrycę. Powoli odsuń się od szklanego dna po zaciśnięciu matrycy na płycie. 
		UWAGA: Napięcie powierzchniowe między matrycą a szkłem powinno za każdym razem tworzyć idealną półkulę.</li>
		<li>Należy przerwać pipetowanie tuż przed opróżnieniem końcówki, ponieważ przypadkowe wstrzyknięcie powietrza do kropli matrycy powoduje znacznie większą średnicę kropli matrycy i jest trudne do usunięcia. 
		UWAGA: Użycie drugiej wskazówki do ustabilizowania wskazówki pipetującej ułatwia dokładniejsze umieszczenie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Wprowadzanie DRG do półstałych kropel matrycy (< 2 min na płytkę)
<ol>
	<li>Płytkę z kropelkami matrycy pozostawić na krótko w temperaturze pokojowej (~ 1 min). To nieznacznie usztywnia matrycę, ułatwiając precyzyjne umieszczenie DRG.</li>
	<li>Delikatnie zgarnij (nie chwytaj) DRG za pomocą zamkniętych mikroskopijnych kleszczy w lewej ręce. Ponownie ciemne tło na małym, białym DRG ułatwia wizualizację. Przenieś DRG na końcówkę igły o rozmiarze 21 w prawej ręce. Ten transfer pozostawi resztki pożywki na kleszczach.</li>
	<li>Delikatnie wprowadzić DRG do środka kropli matrycy za pomocą igły o rozmiarze 21 (Rysunek 1). W większości przypadków DRG łatwo uwalnia się do matrycy, a następnie można go ustawić centralnie za pomocą igły.
	<ol>
		<li>Jeśli DRG przyklei się do igły, użyj mikroskopijnych kleszczyków, aby zepchnąć DRG z igły do kropli matrycy. Usuń nadmiar pożywki z mikroskopijnych kleszczyków za pomocą chusteczki laboratoryjnej. 
		UWAGA: Wprowadzenie pożywki do matrycy zmieni średnicę, objętość i konsystencję testu. Blok lodu z kolorowym lub kolorowym napisem zapewnia kontrast tła, co ułatwia wizualizację tego delikatnego procesu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po tym, jak płytka ma wszystkie cztery DRG, przeprowadź końcową kontrolę, aby upewnić się, że DRG znajduje się w środku kropli matrycy. Dokonaj regulacji w razie potrzeby za pomocą igły 21-gwarowej.</li>
	<li>Przenieść gotową płytkę do inkubatora o temperaturze 37 °C. Spowoduje to zestalenie półstałej matrycy i utrwalenie DRG na miejscu.</li>
	<li>Powtórzyć ten proces dla wszystkich DRG. Umieścić puste kropelki matrycy bez DRG jako kontrolę ujemną.</li>
	<li>Dodać 4 ml DMEM z 10% pożywką FBS do każdej płytki ze szklanym dnem po wypełnieniu wszystkich płytek i wystawieniu ich na działanie inkubatora w temperaturze 37 °C przez co najmniej 3 minuty. Umieścić płytkę pod niewielkim kątem i powoli dodawać pożywkę, tak aby stopniowo stykała się z jednostkami matrycy-DRG. 
	UWAGA: Jeśli pożywka zostanie dodana zbyt szybko lub energicznie, matryca i/lub DRG mogą ulec przemieszczeniu.</li>
	<li>Przechowywać testy w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez następne 48 - 72 h. 
	UWAGA: Okresowe badanie testów wykaże obwodowy rozrost neurytów w kierunku krawędzi macierzy (ryc. 2). Gdy neuryty znajdują się na więcej niż trzech czwartych drogi do macierzy, właściwe jest płytki komórek.</li>
</ol>
5. Przygotowanie komórek raka głowy i szyi
UWAGA: Linie komórkowe inne niż komórki raka płaskonabłonkowego głowy i szyi mogą być użyte w tym eksperymentalnym projekcie.
<ol>
	<li>Utrzymuj linie komórkowe raka płaskonabłonkowego w DMEM z 10% FBS w preferowanych kolbach lub szalkach hodowlanych w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Aby przygotować komórki do eksperymentów, należy odessać całą pożywkę z kolby hodowlanej lub naczynia i umyć je dwukrotnie PBS. Zawieś komórki, dodając odpowiednią ilość 0,025% trypsyny na 5 minut, a następnie DMEM z 10% FBS. Odpipetować 4 ml mieszaniny komórek i pożywki do 6 ml szalek hodowlanych. 
	UWAGA: Płytka hodowlana o pojemności 6 ml zapewnia więcej niż wystarczającą ilość komórek, nawet jeśli zlewa się mniej niż 50%.</li>
	<li>Wystaw linie komórkowe HNSCC na różne warunki 24 godziny przed barwieniem i posiewem w teście DRG. Ponownie dozuj warunek po posianiu komórek, aby utrzymać spójne środowisko. 
	UWAGA: Dodaj przeciwciała, czynniki wzrostu, cytokiny lub inne cząsteczki do szalek z kulturą komórkową 1 - 2 dni po rosekcji myszy i wszczepieniu DRG do matrycy.</li>
	<li>Dodać fluorescencyjne barwienie komórek na 1 godzinę przed posiewem komórek (2 - 3 dni po pobraniu DRG i implantacji do matrycy). 
	UWAGA: Poszczególne zastosowane tutaj barwniki swobodnie przechodzą przez błonę komórkową; Jednak po reakcji z wewnątrzkomórkowymi grupami tiolowymi barwnik pozostaje w komórce i jest przekazywany do komórek potomnych. Barwienie znacznie ułatwia wizualizację w testach. Te tymczasowe plamy są idealne do tych testów, ponieważ fluorescencja jest obecna przez 2-3 dni, co jest ramą czasową tych eksperymentów. Pozwala również na użycie wielu różnych kolorów i eliminuje potrzebę tworzenia linii komórkowych transfekowanych białkami fluorescencyjnymi.
	<ol>
		<li>Przygotuj 10 μM roztworu barwnika, mieszając 2 μL 10 mM barwników komórek podstawowych w 2 ml DMEM bez surowicy dla każdego stanu komórek. Podgrzej go do 37 °C przed dodaniem do komórek.</li>
		<li>Usunąć pożywkę hodowlaną z płytki o pojemności 6 ml, pozostawiając przylegające komórki HNSCC na płytce. Dodać 2 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i usunąć 2 ml barwnika 10 μM komórek/DMEM bez surowicy dodanego do każdej płytki</li>
		<li>Umieścić 6 ml płytki hodowlanej z barwnikiem komórkowym do inkubatora o temperaturze 37 °C na 40 minut.</li>
		<li>Po 40 minutach odessać pożywkę. Dodaj 2 ml PBS, a następnie odessać. Dodać 1 ml 0,025% trypsyny do każdej płytki i umieścić je w inkubatorze w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Po 3 - 5 minutach dodaj 2 ml DMEM z 10% FBS i przenieś zawieszone komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Zakręć komórki i ponownie zawiesij je w 1 ml DMEM z 10% FBS.</li>
		<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek, a następnie dodaj DMEM z 10% FBS, aby uzyskać końcowe stężenie komórek 300 000 komórek na ml.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Posiewanie komórek rakowych głowy i szyi
<ol>
	<li>Wyjąć z inkubatora płytki ze szklanym dnem z testami matrycowymi-DRG. 
	UWAGA: Ponownie, są one odpowiednie, gdy neuryty znajdują się co najmniej 75% drogi do krawędzi macierzy, co zwykle następuje po 2-3 dniach. Najlepiej widać to przy użyciu obiektywu o powiększeniu co najmniej 10x.</li>
	<li>Zassać pożywkę do płytki ze szklanym dnem. Całkowicie zassać pożywkę w szklanej studzience bez wyjmowania jednostek matrycy-DRG.</li>
	<li>Pobrać 200 μl z 300 000 komórek/ml pożywki za pomocą pipety o pojemności 200 μl. Umieść dwie krople komórek na każdym teście matrycowym-DRG. Wykonaj ten krok dla każdej kropli matrycy, tworząc cztery powtórzenia każdego warunku komórki na jednej płytce. 
	UWAGA: Półkulisty kształt matrycy pozwala komórkom osiąść w pierścieniu wzdłuż obwodu testu (Rysunek 3a, Rysunek 3b). Znalezienie pipety z płynnie działającym spustem znacznie ułatwia umieszczanie jednolitych kropli.</li>
	<li>Potwierdź podobną liczbę komórek i rozkład różnych warunków komórkowych pod mikroskopią 4X.</li>
	<li>Umieścić płytki ze szklanym dnem w inkubatorze o temperaturze 37 °C na około 60 minut. UWAGA: Chociaż jest tylko niewielka objętość komórek i pożywki (~ 150 μL), testy nie wysychają, dopóki nie upłynie kilka godzin czasu inkubatora.</li>
	<li>Po 60 minutach delikatnie dodaj 4 ml DMEM z 10% FBS wzdłuż bocznej ścianki szklanej płytki. 
	UWAGA: Z biegiem czasu komórki częściowo przylegają do dna płytki, a sposób dodawania pożywki nie narusza komórek. Różne typy ogniw sprawiają, że potrzeba mniej lub więcej czasu, aby zacząć przylegać do płytki ze szklanym dnem.</li>
	<li>W tym czasie należy wymienić wszelkie leki egzogenne lub czynniki wzrostu, aby utrzymać poprzednie poziomy stężenia.</li>
	<li>Umieścić próbki z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C, z wyjątkiem sytuacji, gdy są one badane pod mikroskopem. Określ ilościowo wyniki tego testu za pomocą obrazowania mikroskopowego. Pokrótce policz pasma inwazji okołonerwowej w czterech kwadrantach, korzystając z 4-krotnego obrazu mikroskopowego. 
	UWAGA: Mikroskop z obiektywem 4X i możliwościami fluorescencji jest wystarczający do fotograficznego dokumentowania testów. Rozmiar testów dobrze mieści się w polu obiektywu 4X, który jest wystarczająco szczegółowy, aby uchwycić poszczególne obszary inwazji okołonerwowej. Inwazja okołonerwowa staje się widoczna w ciągu 24 godzin, ale po 48 godzinach integralność testów zaczyna słabnąć, ponieważ komórki nowotworowe dzielą się wzdłuż obwodu macierzy i atakują. Po upływie 48 godzin dochodzi również do znacznego wypływu fibroblastów z DRG, co zasłania wizualizację za pomocą mikroskopii jasnego pola. Dlatego zaleca się fotodokumentowanie wyników za pomocą mikroskopu 4X co najmniej dwa razy w tym oknie (np. po 24 i 48 godzinach od posiewu komórek nowotworowych). Należy pamiętać, że są to testy trójwymiarowe i trudno jest w pełni zobrazować cały test. Większość inwazji okołonerwowej zachodzi w płaszczyźnie od dołu płytki, gdzie komórki są osadzone w macierzy nieco powyżej dna płytki. Ponieważ płaszczyzna ta jest zbliżona do poziomej, zdecydowana większość neurytów z komórkami nowotworowymi jest rejestrowana na jednopoziomowym obrazie przy 4X.</li>
</ol>

<ol><li>Jemal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%2C+2006%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics, 2006.</a> CA Cancer J Clin. 56 (2), 106-130 (2006).</li>
<li>Hinerman, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postoperative+irradiation+for+squamous+cell+carcinoma+of+the+oral+cavity%3A+35-year+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Head+Neck%22%5BJournal%5D)">Postoperative irradiation for squamous cell carcinoma of the oral cavity: 35-year experience.</a> Head Neck. 26 (11), 984-994 (2004).</li>
<li>Rahima, B., Shingaki, S., Nagata, M., Saito, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+significance+of+perineural+invasion+in+oral+and+oropharyngeal+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Surg+Oral+Med+Oral+Pathol+Oral+Radiol+Endod%22%5BJournal%5D)">Prognostic significance of perineural invasion in oral and oropharyngeal carcinoma.</a> Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 97 (4), 423-431 (2004).</li>
<li>Woolgar, J. A., Scott, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+cervical+lymph+node+metastasis+in+squamous+cell+carcinoma+of+the+tongue%2Ffloor+of+mouth%5BTitle%5D)+AND+%22Head+Neck%22%5BJournal%5D)">Prediction of cervical lymph node metastasis in squamous cell carcinoma of the tongue/floor of mouth.</a> Head Neck. 17 (6), 463-472 (1995).</li>
<li>Tai, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+for+T1-2+oral+squamous+cell+carcinoma+with+or+without+perineural+invasion%3A+neck+dissection+and+postoperative+adjuvant+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg+Oncol%22%5BJournal%5D)">Treatment for T1-2 oral squamous cell carcinoma with or without perineural invasion: neck dissection and postoperative adjuvant therapy.</a> Ann Surg Oncol. 19 (6), 1995-2002 (2012).</li>
<li>George, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nosocomial+sinusitis+in+patients+in+the+medical+intensive+care+unit%3A+a+prospective+epidemiological+study%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Nosocomial sinusitis in patients in the medical intensive care unit: a prospective epidemiological study.</a> Clin Infect Dis. 27 (3), 463-470 (1998).</li>
<li>Fagan, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perineural+invasion+in+squamous+cell+carcinoma+of+the+head+and+neck%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Otolaryngol+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">Perineural invasion in squamous cell carcinoma of the head and neck.</a> Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 124 (6), 637-640 (1998).</li>
<li>Soo, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+implications+of+perineural+spread+in+squamous+carcinomas+of+the+head+and+neck%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">Prognostic implications of perineural spread in squamous carcinomas of the head and neck.</a> Laryngoscope. 96 (10), 1145-1148 (1986).</li>
<li>Parsons, J. T., Mendenhall, W. M., Stringer, S. P., Cassisi, N. J., Million, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analysis+of+factors+influencing+the+outcome+of+postoperative+irradiation+for+squamous+cell+carcinoma+of+the+oral+cavity%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Oncol+Biol+Phys%22%5BJournal%5D)">An analysis of factors influencing the outcome of postoperative irradiation for squamous cell carcinoma of the oral cavity.</a> Int J Radiat Oncol Biol Phys. 39 (1), 137-148 (1997).</li>
<li>Liao, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+adjuvant+radiation+therapy+improve+outcomes+in+pT1-3N0+oral+cavity+cancer+with+tumor-free+margins+and+perineural+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Oncol+Biol+Phys%22%5BJournal%5D)">Does adjuvant radiation therapy improve outcomes in pT1-3N0 oral cavity cancer with tumor-free margins and perineural invasion.</a> Int J Radiat Oncol Biol Phys. 71 (2), 371-376 (2008).</li>
<li>Fan, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+results+of+postoperative+radiotherapy+on+squamous+cell+carcinoma+of+the+oral+cavity%3A+coexistence+of+multiple+minor+risk+factors+results+in+higher+recurrence+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Oncol+Biol+Phys%22%5BJournal%5D)">Treatment results of postoperative radiotherapy on squamous cell carcinoma of the oral cavity: coexistence of multiple minor risk factors results in higher recurrence rates.</a> Int J Radiat Oncol Biol Phys. 77 (4), 1024-1029 (2010).</li>
<li>Dai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+survival+in+perineural+invasion+of+pancreatic+cancer%3A+an+in+vitro+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Pathol%22%5BJournal%5D)">Enhanced survival in perineural invasion of pancreatic cancer: an in vitro approach.</a> Hum Pathol. 38 (2), 299-307 (2007).</li>
<li>Ceyhan, G. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+invasion+in+pancreatic+cancer%3A+a+mutual+tropism+between+neurons+and+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Neural invasion in pancreatic cancer: a mutual tropism between neurons and cancer cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 374 (3), 442-447 (2008).</li>
<li>Gil, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+regulation+of+pancreatic+cancer+cell+invasion+by+peripheral+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Paracrine regulation of pancreatic cancer cell invasion by peripheral nerves.</a> J Natl Cancer Inst. 102 (2), 107-118 (2010).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFRalpha1+released+by+nerves+enhances+cancer+cell+perineural+invasion+through+GDNF-RET+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">GFRalpha1 released by nerves enhances cancer cell perineural invasion through GDNF-RET signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (19), 2008-2017 (2014).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemokine+%28CCL2-CCR2%29+signaling+axis+mediates+perineural+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The chemokine (CCL2-CCR2) signaling axis mediates perineural invasion.</a> Mol Cancer Res. 13 (2), 380-390 (2015).</li>
<li>Bakst, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+impairs+perineural+invasion+by+modulating+the+nerve+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Radiation impairs perineural invasion by modulating the nerve microenvironment.</a> PLoS One. 7 (6), 39925(2012).</li>
<li>Ayala, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+dorsal+root+ganglia+and+human+prostate+cell+line+interaction%3A+redefining+perineural+invasion+in+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">In vitro dorsal root ganglia and human prostate cell line interaction: redefining perineural invasion in prostate cancer.</a> Prostate. 49 (3), 213-223 (2001).</li>
<li>Na'ara, S., Gil, Z., Amit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Modeling+of+Cancerous+Neural+Invasion%3A+The+Dorsal+Root+Ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion.</a> J Vis Exp. (110), (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Kluczowe kroki w ramach protokołu
Najważniejszymi krokami w ramach tego protokołu są precyzyjne wypreparowanie i ekstrakcja zwojów korzenia grzbietowego. Właściwa transsekcja kręgosłupa i podział linii środkowej i podłużnej na dwa półkolce mają kluczowe znaczenie dla uzyskania dużej liczby DRG. Podczas preparacji poszczególnych DRG nigdy nie należy dotykać zwoju bezpośrednio, ale raczej należy chwycić otaczającą go powięź za pomocą mikroskopijnych kleszczy. Niezastosowanie się...

Rak płaskonabłonkowy głowy i szyi (HNSCC) jest szóstym najczęściej występującym nowotworem w USA, z 10 000 zgonów rocznie w kraju i 300 000 zgonów rocznie na całym świecie1. Ogólne rokowanie dla HNSCC pozostaje niezmienione na poziomie 50% od kilku dekad. Inwazja okołonerwowa (PNI) jest jedną z najbardziej widocznych cech patologicznych, które zwiastują złe rokowanie u pacjentów z HNSCC. Niestety, PNI jest częstym zjawiskiem w HNSCC i można go znaleźć nawet u 40% pacjentów z HNSCC2,3. 
PNI to proces, w którym złośliwe komórki podążają wzdłuż nerwów do sąsiednich tkanek, co pozwala na wyższe tempo lokalnego i dalekiego rozprzestrzeniania się. W związku z tym guzy HNSCC PNI-dodatnie mają wyższe wskaźniki nawrotów lokoregionalnych i przerzutów odległych, co skutkuje niższym całkowitym przeżyciem w porównaniu z pacjentami z HNSCC bez PNI4-8.
Chociaż leczenie pacjentów z PNI jest zazwyczaj maksymalizowane poprzez zastosowanie chirurgii, radioterapii i chemioterapii, ogólne wskaźniki przeżycia tych pacjentów są nadal zmniejszone nawet o 40% w porównaniu do pacjentów bez PNI9-11. W związku z tym jasne jest, że obecne metody leczenia HNSCC są nieskuteczne w poprawie niekorzystnego rokowania związanego z PNI. Opracowanie terapii celowanej przeciwko PNI w HNSCC było utrudnione ze względu na słabe zrozumienie czynników regulujących ten proces. Jest to po części konsekwencja braku spójnego modelu in vitro do badania PNI w HNSCC. 
W ostatnich latach kilka grup wykorzystywało model in vitro do badania PNI w głównie rakach trzustki i prostaty12-19. Model ten wykorzystuje neuryty generowane z grzbietowych zwojów korzeniowych wyizolowanych od myszy lub szczurów jako substytut inwazji dużych nerwów. Zwoje korzenia grzbietowego są umocowane w półstałej matrycy zubożonej w czynnik, która jest rozpuszczoną mieszaniną białek błony podstawnej wydzielaną przez komórki mięsaka myszy Engelbreth-Holm-Swarm. Ta matryca pozwala na wzrost neurytów i śledzenie pojedynczych komórek rakowych wzdłuż tych neurytów. Opisano tutaj adaptację tego modelu do badania PNI w HNSCC.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F-12 50/50 Mieszanka z L-glutaminą i 15 mM HEPES</td><td>Corning Cellgro</td><td>10-090-CV</td><td>Manassas, VA</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Atlanta biologiczna</td><td>S11150</td><td>Flowery Branch, GA</td></tr><tr><td>0,25% Trypsyna-EDTA (1x)</td> <td>Life Technologies Corporation</td><td>25200056</td><td>Grand Island, Nowy Jork</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami 1x</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td>Manassas, VA</td></tr><tr><td>Matrigel hESC-Qualif Mouse</td><td>Corning Incorporated</td><td>354277</td><td>Bedford, MA</td></tr><tr><td>Napromieniowane gamma 35 mm szklane płytki hodowlane</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>Ashland, MA</td></tr><tr><td>SteREO Discovery.V8 Mikroskop operacyjny</td><td>Carl Zeiss</td><td>Microimaging 495015-0021-000&nbsp;</td><td>Thornwood, Nowy Jork</td></tr><tr><td>Źródło światła Schott ACE I</td><td>Schott</td><td>A20500</td><td>Niemcy</td></tr><tr><td>CellTracker&nbsp;</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>C2925</td><td>Carlsbad, CA</td></tr><tr><td>BD Igła PrecisionGlide 18 G i 21 G</td><td>BD</td><td>305195</td><td>Franklin Lakes, NJ</td></tr><tr><td>Pęseta do mikropreparacji premium</td><td>Aparat Harvard</td><td>60-3851</td><td>Holliston, MA</td></tr><tr><td>Standardowe nożyczki do precyzyjnej obsługi premium</td><td>Aparat Harvard</td><td>52-2789</td><td>Holliston, MA</td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe premium</td><td>Harvard Aparatura</td><td>60-3923</td><td>Holliston, MA</td></tr><tr><td>Kleszcze opatrunkowe</td><td>Aparatura Harvardu</td><td>72-8949</td><td>Holliston, MA</td></tr><tr><td>Atymiczne nagie myszy (002019)</td><td>Laboratorium Jacksona</td><td>002019</td><td>Bar Harbor, ME</td></tr></tbody></table>

model inwazji okołonerwowej w raku płaskonabłonkowym głowy i szyi

A Model for Perineural Invasion in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Inwazja okołonerwowa (PNI) występuje w około 40% raków płaskonabłonkowych głowy i szyi (HNSCC). Pomimo leczenia multimodalnego z chirurgią, radioterapią i chemioterapią, nawroty lokoregionalne i przerzuty odległe występują częściej, a całkowite przeżycie jest zmniejszone o 40% w porównaniu z HNSCC bez PNI. Badania in vitro szlaków zaangażowanych w HNSCC PNI były historycznie trudne ze względu na brak spójnego, powtarzalnego testu. Opisano tutaj adaptację testu zwoju korzenia grzbietowego (DRG) do badania PNI w HNSCC. W tym modelu DRG są zbierane z kręgosłupa złożonej w ofierze nagiej myszy i umieszczane w półstałej matrycy. W ciągu kolejnych dni generowane są neuryty, które rosną promieniście z ciał komórkowych DRG. Linie komórkowe HNSCC są następnie umieszczane obwodowo wokół macierzy i atakują preferencyjnie wzdłuż neurytów w kierunku DRG. Metoda ta pozwala na szybką ocenę wielu schorzeń leczenia, przy bardzo wysokich wskaźnikach powodzenia testu i odtwarzalności.

Po wypreparowaniu zwoju rdzeniowego (DRG) i umieszczeniu go w kropelce macierzy, wygląd testu powinien odpowiadać Rysunkowi 1. Należy zauważyć, że DRG nie jest idealnie okrągły, ale znajduje się w centrum kropelki macierzy. Pozwala to na wyrastanie neurytów we wszystkich kierunkach (360 stopni), co pokazano częściowo na Rysunku 2. Należy mieć na uwadze, że niektóre części DRG emitują neuryty szybciej i w większej liczbie niż inne, co zazwyczaj odpowiada m...

Inwazja okołonerwowa (PNI) jest powszechną cechą raka płaskonabłonkowego głowy i szyi (HNSCC), powodując niższe wskaźniki przeżycia. Jego mechanizmy są słabo poznane. Wykorzystując neuryty generowane z mysich zwojów korzenia grzbietowego ograniczonych do półstałej matrycy, można badać szlaki zaangażowane w PNI linii komórkowych HNSCC.

Model inwazji okołonerwowej w raku płaskonabłonkowym głowy i szyi

Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, ...

Ogólnym celem tego eksperymentalnego protokołu jest szybka ocena wielu warunków leczenia wpływających na inwazję okołonerwową w raku płaskonabłonkowym głowy i szyi z bardzo wysokimi wskaźnikami powodzenia testu i odtwarzalności. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu onkologii głowy i szyi, takie jak czynniki wpływające na inwazję okołonerwową komórek raka głowy i szyi. Główną zaletą tej techniki jest to, że dużą liczbę testów można szybko i powtarzalnie wykonać na jednej myszy w stosunkowo krótkim czasie.Przed rozpoczęciem procedury rozwarstwiania zwoju korzenia grzbietowego lub DRG należy dodać świeżą pożywkę o temperaturze pokojowej do co najmniej 40 dołków 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V. Następnie użyj cienkich nożyczek, aby wykonać podłużne nacięcie wzdłuż kręgosłupa od nasady ogona do głowy myszy. I poprzecznie podziel tkankę poniżej kręgosłupa krzyżowego, preparując obie strony kręgosłupa, aż do podstawy czaszki.Przenieś próbkę pod mikroskopem i obserwuj szyjny koniec kręgosłupa przy niskiej mocy. Biały rdzeń kręgowy jest widoczny w środku kostnego pierścienia, który jest otoczony zmienną ilością mięśni okołordzeniowych i tkanek miękk

a-model-for-perineural-invasion-head-neck-squamous-cell

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Przedstawiono kompleksowy przegląd technik wykorzystywanych w tworzeniu mysiego modelu raka jamy ustnej oraz ilościowego monitorowania inwazji nowotworowej w obrębie języka za pomocą mikroskopii wielofotonowej komórek znakowanych. System ten może służyć jako użyteczna platforma do oceny molekularnej oraz skuteczności leków w przypadku związków przeciwinwazyjnych.

Obrazowanie wielofotonowe inwazji komórek nowotworowych w ortotopowym modelu mysim dla raka płaskonabłonkowego jamy ustnej

W tym filmie opisujemy metodę wspólnego hodowania zwojów korzenia grzbietowego i komórek rakowych na błonie kosmówkowo-omoczniowej kurcząt lub CAM w celu zbadania inwazji okołonerwowej.

Błona kosmówkowo-omocznaniowa piskląt lub model guza CAM: metoda in ovo do symulacji okołonerwowej inwazji komórek nowotworowych

W tym filmie demonstrujemy procedurę tworzenia modelu inwazji komórek raka okołonerwowego in vitro poprzez wspólną hodowlę zwoju korzenia grzbietowego myszy i komórek raka neurotropowego. Model może być wykorzystany do przeprowadzania testów na raka, uzyskując szybkie i powtarzalne wyniki.

Ustanowienie trójwymiarowego modelu kohodowli mysich zwojów korzenia grzbietowego i komórek rakowych: model in vitro do badania inwazji okołonerwowych komórek rakowych

W tym filmie rozwijamy mysi model in vivo do inwazji okołonerwowej poprzez wstrzykiwanie komórek raka trzustki do nerwu kulszowego. Model ten pomaga określić ilościowo zakres inwazji i zbadać interakcje między komórkami rakowymi a nerwami.

Mysi model inwazji okołonerwowej: generowanie modelu in vivo do symulacji inwazji okołonerwowej w nerwie kulszowym myszy

W tym filmie opisujemy procedurę tworzenia mysiego modelu inwazji okołonerwowej poprzez wstrzykiwanie komórek rakowych do nerwu kulszowego. Model może pomóc w zrozumieniu skali inwazji nerwów w celu późniejszej oceny leków przeciwnowotworowych.

Mysi model inwazji nerwu kulszowego lub PNI: ekstrakcja i przetwarzanie nerwu kulszowego w celu zrozumienia inwazji komórek rakowych

Inwazja otaczających normalnych tkanek jest cechą charakterystyczną nowotworów złośliwych. Przedstawiamy tutaj prosty, półautomatyczny test mikropłytki inwazji do naturalnej biomatrycy 3D, który został zilustrowany za pomocą wielu modeli zaawansowanych nowotworów u ludzi.

Trójwymiarowy (3D) test inwazji sferoidów guza

Ten artykuł wideo pokazuje zastosowanie modelu zwojów korzenia grzbietowego (DRG)/komórek rakowych w gruczolakoraku przewodowym trzustki.

In vitro Modelowanie nowotworowej inwazji neuronalnej: model zwoju korzenia grzbietowego

Opisujemy in vivo mysi model inwazji okołonerwowej poprzez wstrzykiwanie syngenicznych komórek raka trzustki do nerwu kulszowego. Model pozwala na ilościowe określenie zakresu inwazji nerwów i wspiera badanie komórkowych i molekularnych mechanizmów inwazji okołonerwowej.

Mysi model nerwu kulszowego in vivo inwazji okołonerwowej

Opisujemy ewolucję trójwymiarowego modelu in vitro opartego na sferoidach, który umożliwia nam przetestowanie obecnego standardu eksperymentalnych schematów terapii raka płaskonabłonkowego głowy i szyi na liniach komórkowych, mając na celu ocenę podatności i odporności na terapię na pierwotnych komórkach z próbek ludzkich w przyszłości.

Testowanie terapii w sferoidalnym modelu hodowli komórkowej 3D raka płaskonabłonkowego głowy i szyi

Tutaj prezentujemy powtarzalną metodę tworzenia ortotopowego mysiego modelu raka płaskonabłonkowego głowy i szyi. Guzy wykazują klinicznie istotne cechy histopatologiczne choroby, w tym martwicę, słabe różnicowanie, przerzuty węzłowe i naciek immunologiczny. U myszy z guzem rozwijają klinicznie istotne objawy, w tym dysfagię, przemieszczenie szczęki i utratę wagi.

Dośluzówkowa inokulacja komórek raka płaskonabłonkowego u myszy w celu profilowania immunologicznego guza i oceny odpowiedzi na leczenie

Inwazja okołonerwowa jest agresywnym fenotypem dla raka płaskonabłonkowego głowy i szyi oraz innych nowotworów. Model błony kosmówkowo-omoczniowej pisklęcia został wykorzystany do badania angiogenezy, inwazji raka i przerzutów. Tutaj pokazujemy, w jaki sposób ten model można wykorzystać do oceny inwazji okołonerwowej in vivo.

Błona naczyniówkowo-omocznaniowa piskląt w modelu in vivo do oceny inwazji okołonerwowej w raku głowy i szyi

Poznaj metodę oceny inwazji okołonerwowej w raku płaskonabłonkowym głowy i szyi z wykorzystaniem ganglionów korzeniowych myszy. Technika umożliwia szybkie i reprodukowalne przeprowadzanie wielu testów.

Model inwazji okołonerwowej w raku płaskonabłonkowym głowy i szyi

Przeglądaj więcej filmów