Mikroskopia fluorescencyjna arkusza świetlnego korzeni roślin rosnących na powierzchni żelu
18 stycznia 2017
Ten protokół pokazuje metodę przygotowania próbek roślinnych do mikroskopii świetlnej. Konfiguracja charakteryzuje się zamontowaniem rośliny pionowo na powierzchni żelu i pozwoleniem jej rosnąć w kontrolowanych jasnych warunkach. Pozwala to na długotrwałą obserwację rozwoju organów roślinnych w znormalizowanych warunkach.
Ogólnym celem tej procedury jest uzyskanie długoterminowych obserwacji systemu korzeniowego roślin za pomocą mikroskopii świetlnej. Aby to osiągnąć, niezbędna jest delikatna metoda przygotowania próbki, kontrolowane warunki wzrostu oraz technika obrazowania, która nie zmienia rozwoju roślin, taka jak mikroskopia świetlna. Na początek rośliny uprawia się na powierzchni dwumilimetrowej cienkiej warstwy żelu.
Żel z sadzonką Aribidopsis jest następnie wycinany, zbierany i przenoszony na uchwyt na próbkę mikroskopu. Wewnątrz mikroskopu roślina rośnie w swojej naturalnej pozycji pionowej. Korzenie rosną w płynnym podłożu, podczas gdy liście pozostają w powietrzu.
System oświetlenia oświetla tylko skrzydła. Powierzchnia wody jest przykryta, aby utrzymać korzenie w ciemności. Jedną z głównych zalet tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak osadzanie korzenia wewnątrz żelu, jest to, że jesteśmy przyzwyczajeni do uprawy roślin na powierzchni żelu.
Dlatego możemy trzymać się tego samego protokołu uprawy, co wcześniej. Po drugie, korzeń ma bezpośredni kontakt z płynnym podłożem, które można wymienić na przykład na leczenie farmakologiczne. Wlej 30 mililitrów świeżo autoklawizowanej pożywki MS o połowie mocy zawierającej 1,5 procent fitożelu na kwadratową szalkę Petriego, aby utworzyć warstwę o grubości około 2 milimetrów.
Sterylne nasiona należy sadzić obok siebie, zachowując co najmniej jeden centymetr odstępu między nimi. Następnie owiń płytkę taśmą z mikroporami. Uprawiaj płytkę w inkubatorze wzrostu pionowo przez okres do 10 dni.
W tym eksperymencie wykorzystujemy sześciodniowe rośliny do obserwacji rozwoju korzeni bocznych. Dostarczamy model do druku 3D uchwytu na próbkę. Przetestowaliśmy różne materiały.
Przezroczyste żywice były najbardziej odpowiednie pod względem sztywności i wodoodporności. Szczegółowy opis wymiarów do obróbki uchwytu próbki z materiału litego jest opisany w manuskrypcie. Pokrój żel wokół rośliny za pomocą skalpela.
Następnie zbierz blok żelu, na którym rośnie roślina, i ostrożnie przetrzyj go do uchwytu na próbkę. Rozpuść 1 procent aggros w temperaturze 80 stopni Celsjusza i ostudź do 33 stopni Celsjusza. Przyklej blok żelu do uchwytu na próbkę i ostrożnie przyklej roślinę do żelu.
Użyj mikroskopu stereoskopowego, aby sprawdzić położenie rośliny i upewnij się, że obszar zainteresowania nie jest pokryty żadnym żelem. Aby zapobiec wysychaniu rośliny, w miarę możliwości wsuń uchwyt na próbkę na końcówkę pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów. Umieść uchwyt na pudełku z pipetami i w razie potrzeby przygotuj więcej próbek.
Nasz mikroskop to klasyczny open-spin bez większych modyfikacji. Wdrożyliśmy system oświetlenia do hodowli roślin wewnątrz mikroskopu. Czerwone i niebieskie diody LED są ułożone w pierścień.
Pary diod LED można włączać i wyłączać indywidualnie w celu oświetlenia kierunkowego. Spektrum systemu oświetleniowego pasuje do tego, które znajduje się w naszych komorach uprawowych. Prawie całe oświetlenie pochodzące z diod LED jest blokowane przez filtr emisyjny dla GFP.
Nie udało nam się wykryć żadnego rozproszonego światła docierającego do kamery. Dzięki temu światło może być włączone podczas obrazowania. Natężenie światła można regulować w zakresie od 30 do 250 mikromoli na metr kwadratowy na sekundę.
Przykręć lub przyklej pierścień LED na dolnej stronie otwartego wirowania stage ramienia. Zamontuj go z powrotem do mikroskopu i podłącz przewody. Zmontuj system obfitości.
Podłącz probówki do komory na próbkę w układzie jednokierunkowym. Dostosuj prędkość do jednego mililitra na minutę. Dodaj trzy milimetry kwadratowe sterylnej czarnej folii plastikowej i rozprowadź je na powierzchni wody.
Włóż próbkę do mikroskopu. Sprawdzić, czy do uchwytu na próbkę nie przyklejają się żadne plastikowe arkusze. Zamknij komorę dwiema pokrywami wykonanymi z czarnej folii aluminiowej.
Włącz światło i dostosuj natężenie światła. Wyłącz światło w pomieszczeniu i rozpocznij nagrywanie. Metoda ta pozwala na rejestrację wzrostu korzeni w ciągu kilku godzin do kilku dni, co jest tutaj prezentowane przez wzrost korzenia bocznego.
Obrazy stosu z pojedynczym punktem czasowym wykazują dobre właściwości przekroju optycznego. Uchwyciliśmy cały proces powstawania korzeni bocznych w 3D, co pozwala nam badać dynamikę tego procesu. Spojrzenie na pojedynczy wycinek tego nagrania pokazuje dobrą rozdzielczość, nawet głęboko w korzeniu.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć jasne zrozumienie metody przygotowania próbek roślin do mikroskopii świetlnej. Postępując zgodnie z tym protokołem, jesteśmy teraz w stanie przyjrzeć się wewnątrzkomórkowej lokalizacji białek lub wzorcom ekspresji genów podczas organogenezy, tropizmów roślinnych lub adaptacji roślin. Pomoże nam to zrozumieć przestrzenno-czasową regulację rozwoju roślin.
Przegląd
Niniejszy protokół przedstawia metodę przygotowania próbek roślinnych do mikroskopii arkusza światła, umożliwiającą długotrwałą obserwację rozwoju organów roślinnych. Układ polega na hodowli roślin na powierzchni żelu w kontrolowanych warunkach, co pozwala na szczegółowe obrazowanie bez wpływania na wzrost roślin.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia roślin
- Techniki mikroskopowe
- Biologia rozwoju
Wstęp
- Mikroskopia arkusza światła zapewnia nieinwazyjną technikę obrazowania.
- Tradycyjne metody mogą wpływać na rozwój roślin.
- Kontrolowane warunki są kluczowe dla dokładnych obserwacji.
- Siewki Arabidopsis są powszechnie wykorzystywane w tego typu badaniach.
Cel badania
- Uzyskanie długoterminowych obserwacji systemów korzeniowych roślin.
- Opracowanie delikatnej metody przygotowania próbek.
- Wykorzystanie technik obrazowania, które nie zakłócają wzrostu roślin.
Zastosowane metody
- Rośliny są hodowane na cienkiej warstwie żelu.
- Blok żelu zostaje przeniesiony do uchwytu na próbki mikroskopowe.
- Zastosowano system oświetlenia w celu zapewnienia optymalnych warunków wzrostu.
- Obrazowanie pozwala na rejestrację dynamiki wzrostu korzeni w czasie.
Główne wyniki
- Skuteczne obrazowanie powstawania korzeni bocznych w 3D.
- Dobre właściwości optyczne zaobserwowane w obrazach z serii z-stack.
- Metoda umożliwia badanie procesów wewnątrzkomórkowych.
- Ułatwia zrozumienie regulacji czasowo-przestrzennej u roślin.
Wnioski
- Metoda ta zwiększa możliwość obserwacji rozwoju roślin.
- Wspiera ona badania nad ekspresją genów i lokalizacją białek.
- Zapewnia ustandaryzowane podejście dla przyszłych badań.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia długoterminowe obrazowanie systemów korzeniowych roślin w wysokiej rozdzielczości w kontrolowanych warunkach, wspierając mechanistyczne badania organogenezy i dynamiki rozwojowej. Dzięki zachowaniu naturalnego wzrostu przy jednoczesnej możliwości wymiany pożywki ciekłej, ułatwia on screening związków oraz walidację celów w modelowych systemach roślinnych. Podejście to zwiększa pewność predykcyjną we wczesnej fazie odkryć, łącząc fenotypy komórkowe z odpowiedziami na poziomie tkankowym w powtarzalnym i skalowalnym formacie.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez bezpośrednią obserwację dynamiki komórkowej podczas organogenezy.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez wizualizację oddziaływania z celem w nienaruszonych, rozwijających się tkankach.
- Wartość predykcyjna: Łączy perturbacje molekularne z efektami fenotypowymi w kontekście fizjologicznie istotnym.
Przesiewy i rozwój testów
- Gotowość do analizy: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do późniejszej oceny związków z możliwością wymiany medium ciekłego.
- Wyniki ilościowe: Generuje czasowe zbiory danych 3D, umożliwiając precyzyjny pomiar zmian strukturalnych i funkcjonalnych.
- Ponowne wykorzystanie platformy: Standaryzowana konstrukcja uchwytu na próbki pozwala na skalowalność w ramach wielu kampanii eksperymentalnych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla badań chorób: Zapewnia system istotny z punktu widzenia patologii do badania tropizmów korzeni oraz adaptacyjnych odpowiedzi na bodźce środowiskowe.
- Ciągłość translacyjna: Łączy obrazowanie w fazie odkryć z walidacją przedkliniczną poprzez spójne, nieinwazyjne odczyty.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Redukuje niejednoznaczność w walidacji celu poprzez korelację zmian molekularnych z rozwojem strukturalnym.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania, od testowania hipotez po identyfikację wiodących związków, umożliwiając iteracyjne doprecyzowanie celów biologicznych w oparciu o dynamiczne dane fenotypowe.
- Biologia odkrywcza: Wspiera wyjaśnianie szlaków poprzez wizualizację procesów komórkowych w czasie rzeczywistym w obrębie natywnej architektury tkankowej.
- Screening: Umożliwia niezawodną ocenę związków dzięki standaryzowanemu montażowi i perfuzji w medium ciekłym.
- Analityka: Dostarcza wysokorozdzielcze odczyty przestrzenno-czasowe, które ułatwiają analizę porównawczą w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Łączy wczesne wnioski mechanistyczne z modelami przedklinicznymi za pośrednictwem konserwowanych procesów rozwojowych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę obrazowania, którą można dostosować do różnych gatunków roślin i zmiennych eksperymentalnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzowanemu montażowi na żelu i kontrolowanemu oświetleniu.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez bezpośrednią wizualizację odpowiedzi biologicznych na zaburzenia.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko dzięki ilościowym, podłużnym danym fenotypowym.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu biologii roślin, mikroskopii oraz mikrofluidalnego przygotowania próbek.
- Zależne od infrastruktury mikroskopii arkusza światła (light-sheet microscopy) z możliwością dostosowania oświetlenia LED i kontroli środowiskowej.
- Wymaga standaryzacji protokołów przygotowania żelu, transferu próbek i oświetlania pomiędzy zespołami.
- Wiąże się z koniecznością uwzględnienia adaptacji do różnych gatunków roślin, pożywek wzrostowych oraz profili rozpuszczalności związków.
- Ograniczone przez wymóg przejrzystości optycznej oraz kompatybilności materiałów żelowych z długościami fal obrazowania.
