Name: Przygotowanie i hodowla miogennych komórek prekursorowych/pierwotnych mioblastów z mięśni szkieletowych dorosłych i starszych ludzi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Naucz się izolować pierwotne mioblasty z mięśni szkieletowych dorosłych i starszych ludzi. Ta metoda umożliwia długoterminową hodowlę komórek z zachowaniem ich fenotypu do badań nad regeneracją mięśni.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez Radę ds. Badań nad Biotechnologią i Naukami Biologicznymi (BBSRC; BB/L021668/1), MRC i Arthritis Research UK w ramach MRC - Arthritis Research UK Centre for Integrated Research into Musculoskeletal Ageing (CIMA) oraz Wellcome Trust Institutional Strategic Support Fund (097826/Z/11/A). Autorzy pragną podziękować dr Dada Pisconti (Uniwersytet w Liverpoolu) za jej wiedzę i porady dotyczące izolacji komórek progenitorowych mięśni.

Wszystkie opisane tutaj eksperymenty z udziałem tkanek ludzkich zostały wcześniej zatwierdzone przez Uniwersytet w Liverpoolu, Szpital Uniwersytecki Aintree Hospital i Komitet Etyki Badań Południowo-Zachodniej Walii (nr zgody: 13/WA/0374), a eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi dobrej praktyki. Uniwersytet w Liverpoolu działał jako sponsor etyczny tego badania. Wszyscy dawcy wyrazili świadomą zgodę na włączenie do tego badania. Mięśnie wyizolowano od ludzi (BMI <25): dorośli: 30 ±2,8 lat i w wieku: 69 ±5 lat.
1. Przygotowanie do kultury
<ol>
	<li>Powlekanie powierzchni kultur lamininą
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór roboczy 10 μg/ml lamininy w 1x DPBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco).</li>
		<li>Odpipetować minimalną ilość roztworu lamininy, aby całkowicie pokryć powierzchnię, na której mają być posiewane komórki (Tabela 1). Inkubować naczynie hodowlane przez co najmniej 30 minut w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 przed posiewem komórek. Z lamininą należy obchodzić się ostrożnie, unikając użycia wiru. Roztwór roboczy 10 μg/ml lamininy rozcieńczony w DPBS może być przechowywany w temperaturze 4 °C i wielokrotnie używany.</li>
		<li>Użyj szalki Petriego o średnicy 60 mm (20 cm2) lub 2 dołków w płytce 6-dołkowej (2 x 10 cm2) na ~ 18 - 19 mg mięśni szkieletowych, aby pokryć komórki (5,50 x 104 komórki w sumie). Zliczanie komórek należy wykonywać przez cały czas podczas powlekania komórek do badań funkcjonalnych. 
		UWAGA: Próbki zostały pierwotnie pobrane z operacji stóp (prostownik palca brevis, piszczel przedni lub mięśnie odwodzicieli palucha) u pacjentek (dorośli: 30 ±2,8 lat, w wieku: 69 ±5 lat, BMI <25).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie roztworu enzymatycznego
	<ol>
		<li>Przygotować 250 mM roztworu roboczego CaCl2: 277 mg wywaru CaCl2 w 10 ml 1x DPBS. Przefiltrować roztwór za pomocą membrany filtracyjnej 0,2 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przygotować roztwór roboczy składający się z 1,5 U/ml kolagenazy D, 2,4 U/ml dypazy II i 2,5 mM CaCl2 w DMEM bez surowicy (zmodyfikowane podłoże Eagle's Medium) (Tabela 2).</li>
		<li>Dobrze wymieszaj i przefiltruj roztwór enzymatyczny przez membranę filtracyjną 0,2 μm w celu sterylizacji. Przygotować wcześniej roztwór enzymatyczny i zamrozić (-20 °C) w porcjach do wykorzystania w przyszłości.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Trawienie tkanek: dysocjacja mechaniczna i enzymatyczna
<ol>
	<li>Po pobraniu próbki utrzymuj mięśnie w temperaturze 4 °C w DPBS aż do strawienia. Przygotować minimalną objętość 2 ml roztworu kolagenazy-dypazy-CaCl2 na 18 - 19 mg tkanki mięśniowej i ogrzać ją do temperatury 37 °C przed dysocjacją tkanek.</li>
	<li>Zanurzyć na krótko biopsję mięśnia w 70% etanolu, przemyć świeżym DPBS i umieścić tkankę na nowej szalce Petriego z 1 ml roztworu enzymatycznego.</li>
	<li>Odrzuć jak najwięcej tkanki zwłóknistej i tłuszczowej i szybko, ale delikatnie rozerwij mięsień na małe, ale wyraźne kawałki (około >0,5 mm2) za pomocą sterylnych nożyczek lub skalpela chirurgicznego (ostrze nr 10).</li>
	<li>Przenieść próbkę do probówki o pojemności 50 ml z pozostałym 1 ml kolagenazy-dispazy-CaCl2.</li>
	<li>Inkubować tkankę w temperaturze 37 °C do 30 - 40 min. Poruszać tkanką mięśniową, delikatnie mieszając rurkę co 5 - 10 minut.</li>
	<li>Pokryj pipety pożywką, aby uniknąć przywierania uwolnionych komórek do plastikowych ścianek pipet. Dodaj 2 objętości sterylnego podłoża wzrostowego, np. 4 ml DMEM 20% FBS (płodowej surowicy bydlęcej), 1% L-glutaminy i 1% P/S (penicylina-streptomycyna), aby zatrzymać trawienie.</li>
	<li>Pipetę kilkakrotnie w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 5 ml, aby pomóc w uwolnieniu komórek z włókien mięśniowych. 
	UWAGA: Próbka jest zwykle całkowicie zdysocjowana ze względu na swój mały rozmiar. Jeśli jednak fragmenty mięśni nadal pozostają, należy przeprowadzić drugą inkubację z pozostałymi fragmentami mięśni i świeżym roztworem enzymatycznym.</li>
	<li>Przefiltrować roztwór mięśniowy przez sitko komórkowe o wielkości 70 μm na stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Umyj pozostałe komórki większą ilością pożywki i przefiltruj przez sitko.</li>
	<li>Wirować przy 443 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu osadzenia komórek. Ostrożnie wyrzucić supernatant.</li>
	<li>Rozpuść osad w pożywce F-12 (mieszanka odżywcza F-12 szynki), 20% FBS, 10% HS (surowica końska), 1% P/S, 1% α-glutaminy i 2,5 ng/ml FGF-b (Rekombinowany ludzki podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów). W tym przypadku należy użyć 4 ml pożywki na szalkę Petriego o średnicy 60 mm.</li>
</ol>
3. Zasiewanie komórek
<ol>
	<li>Pobrać z inkubatora naczynie hodowlane uprzednio pokryte 10 μg/ml lamininy (sekcja 1.1).</li>
	<li>Ostrożnie usuń nadmiar lamininy z naczynia hodowlanego i unikaj dotykania powierzchni (w przeciwnym razie zaburzy to strukturę białka). Umyj naczynie hodowlane za pomocą DPBS (opcjonalnie).</li>
	<li>Umieścić komórki bezpośrednio w naczyniu pokrytym lamininą i inkubować przez 24 godziny w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
	<li>Wizualizuj komórki pod mikroskopem jasnego pola (100-krotne powiększenie całkowite) następnego dnia. Okrągłe małe komórki przyczepione do powierzchni i pozostałe szczątki można zobaczyć w pożywce hodowlanej.</li>
	<li>Zmień pożywkę na świeżą pożywkę F-12 uzupełnioną 20% FBS, 10% HS, 1% P/S, 1% α-glutaminy i 2,5 ng/ml FGF-b.</li>
</ol>
4. Hodowla i pasażowanie komórek
<ol>
	<li>Zmieniaj pożywkę co 2 - 3 dni i dziel komórki, gdy tylko grupy komórek są widoczne pod mikroskopem (100-krotne powiększenie całkowite, przykład na rysunku 2, komórki od osób starszych, pasaż 0, po 7 dni), aby uniknąć spontanicznego różnicowania.</li>
	<li>Przy pierwszym pasażu (P1) zmień pożywkę na DMEM o wysokiej zawartości glukozy uzupełnioną o 20% FBS, 10% HS, 1% P/S, 1% α-glutaminy. Od tego momentu należy unikać stosowania FGF-b, ponieważ FGF jest silnym mitogenem i ważnym czynnikiem na początku hodowli, ale może sprzyjać przerostowi fibroblastów, jeśli jest stosowany dłużej w hodowli.</li>
	<li>Do pasażowania komórek:
	<ol>
		<li>Usuń pożywkę i umyj komórki dwukrotnie za pomocą DPBS.</li>
		<li>Dodaj minimalną objętość 0,25% EDTA-trypsyny, aby pokryć powierzchnię komórek. Delikatnie przetrząsać, aby upewnić się, że wszystkie komórki są pokryte roztworem oddzielającym, inkubować przez 10 sekund w temperaturze pokojowej i usunąć.</li>
		<li>Inkubować komórki w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 3 - 5 minut. Delikatnie postukać i sprawdzić pod mikroskopem jasnego światła (100-krotne powiększenie całkowite), czy komórki są zaokrąglone, ale nie całkowicie oderwane od powierzchni. Jeśli nie zaobserwuje się żadnych zmian w komórkach, inkubować jeszcze przez 5 minut.</li>
		<li>Dodać 5 ml pożywki wzrostowej (DMEM o wysokiej zawartości glukozy uzupełniony 20% FBS, 10% HS, 1% P/S, 1% α-glutaminy), aby zebrać komórki, dobrze wymieszać i przenieść komórki z nową pożywką do kolby T75. Przemyć pozostałe komórki, powtarzając ten krok, z kolejnymi 5 ml pożywki wzrostowej (łącznie 10 ml na jedną kolbę T75).</li>
		<li>W celu wstępnej płytkiki (najlepiej w pierwszym pasażu) inkubować komórki w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 40 minut. Zebrać supernatant z komórkami, które nie były przyłączone, i inkubować je w nowej kolbie T75. Powinno to wzbogacić kulturę w mioblastach, ponieważ większość fibroblastów powinna była przyczepić się w pierwszej kolbie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmieniaj pożywkę co 2 - 3 dni i dziel komórki od 1 do 4, gdy tylko osiągną 70% konfluencji, aby uzyskać maksymalną wydajność.</li>
	<li>W celu różnicowania, gdy komórki osiągną 70-80% konfluencji, zmień pożywkę hodowlaną na pożywkę różnicującą (DM): DMEM o wysokiej zawartości glukozy uzupełniony 2% HS, 1% P / S, 1% α-glutaminy. Komórki powinny być zróżnicowane w ciągu 5 - 7 dni w zależności od jakości i czystości kultury mioblastów.</li>
</ol>
5. Protokół transfekcji
<ol>
	<li>Wysiewaj 50 000 komórek/studzienkę na 12-dołkowej płytce do testów MF 20, starzenia i żywotności. Hodowla komórek na szkiełkach nakrywkowych lub w naczyniu pokrytym lamininą. W przypadku barwienia Ki67 wysiewaj 25 000 komórek / studzienkę na 12-dołkowej płytce.</li>
	<li>W przypadku transfekcji należy postępować zgodnie z procedurą producenta, stosując 5 μl odczynnika do transfekcji, 100 nM kontrolnego naśladowcy lub inhibitora mikroRNA, 100 nM naśladującego mikroRNA lub 100 nM inhibitora mikroRNA na studzienkę, o całkowitej objętości 1 ml.</li>
	<li>Zmiana na pożywkę różnicującą 6 godzin po transfekcji (DMEM o wysokiej zawartości glukozy uzupełniony 2% HS, 1% P/S, 1% α-glutaminy). W przypadku eksperymentów proliferacji wybarwić komórki 2 d po transfekcji; w przypadku starzenia się, 7 dni po transfekcji; a do barwienia MF20, siedem dni po transfekcji.</li>
</ol>
6. Barwienie immunologiczne komórek
<ol>
	<li>Barwienie immunologiczne Ki67, MyoD i MF 20
	<ol>
		<li>Przygotować roztwory bloku 1 (10% HS i 0,1% Triton-X w PBS) i bloku 2 (10% HS i 0,05% Triton-X w PBS). Użyj 500 μl odczynnika na dołek dla płytki 12-dołkowej. 
		UWAGA: Wykonaj następujące czynności za pomocą wytrząsarki do etapów inkubacji.</li>
		<li>Usuń nośnik z komórek.</li>
		<li>Przepłukać komórki PBS.</li>
		<li>Zamocuj ogniwa zimnym metanolem przez 10 minut na kołysce.</li>
		<li>Usuń metanol z komórek i przepłucz 3x PBS przez 5 minut za każdym razem.</li>
		<li>Dodać roztwór bloku 1 i inkubować komórki na kołysku w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
		<li>Dodaj pierwszorzędowy roztwór przeciwciała: do barwienia Ki67 użyj mAb królika do Ki67 (rozcieńczenie 1:1,000 w bloku 2); dla MyoD użyj MyoD1 (D8G3) XP Rabbit mAb (rozcieńczenie 1:100 w bloku 2); do barwienia MF 20 użyj przeciwciała pierwszorzędowego MYH1E (MF 20) (DSHB, rozcieńczenie 1:1,000 w bloku 2).</li>
		<li>Inkubować komórki z pierwszorzędowym przeciwciałem przez 1 godzinę (RT) do O/N (4 °C) na kołysce.</li>
		<li>Zebrać pierwotną AB (może być ponownie użyta, jeśli jest przechowywana w temperaturze 4 °C).</li>
		<li>Przepłukać komórki 3x PBS, za każdym razem 5 minut.</li>
		<li>Dodaj odpowiednie przeciwciało drugorzędowe: do barwienia Ki67 lub MyoD, kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H+L) drugorzędowe, koniugat Alexa Fluor 488 (rozcieńczenie 1:1,000 w PBS); do barwienia MF 20, kozie przeciwciało drugorzędowe anty-mysie IgG (H+L), koniugat Alexa Fluor 488 (rozcieńczenie 1:1,000 w PBS).</li>
		<li>Owinąć płytkę zawierającą komórki i inkubować przeciwciało drugorzędowe przez 2 godziny w ciemności na kołysce w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przepłucz komórki 3x PBS przez 5 minut za każdym razem.</li>
		<li>Dodać roztwór DAPI (rozcieńczenie 1:1 000 w PBS) na komórki i inkubować na kołysce w temperaturze RT przez 5 - 10 minut.</li>
		<li>Przepłucz komórki 3x PBS przez 5 minut za każdym razem.</li>
		<li>Dodaj 1 ml świeżego PBS.</li>
		<li>Zamontuj ogniwa na szkiełkach nakrywkowych w roztworze montażowym lub uszczelnij płytkę zawierającą komórki w PBS za pomocą Parafilmu, aby uniknąć parowania.</li>
		<li>Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Uwidocznij komórki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego tak szybko, jak to możliwe (nie później niż 2 tygodnie).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test żywotności
	<ol>
		<li>Usuń nośnik z komórek.</li>
		<li>Opłucz komórki w PBS.</li>
		<li>Dodać 1:1 000 bromku etydyny i 1:1 000 pomarańczy akrydynowej rozcieńczonych w PBS. 
		Uwaga: Zachowaj ostrożność i pracuj zgodnie z przepisami BHP — bromek etydyny jest czynnikiem rakotwórczym.</li>
		<li>Owinąć płytkę zawierającą komórki roztworem barwiącym i inkubować w temperaturze pokojowej na wahaczu przez 5 minut.</li>
		<li>Wykonaj zdjęcia komórek za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego: zielony kanał dla pomarańczy akrydyny; czerwony kanał dla bromku etydyny.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Hughes, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+muscle+strength+changes+in+older+adults%3A+influence+of+muscle+mass%2C+physical+activity%2C+and+health%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gerontol+A+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Longitudinal muscle strength changes in older adults: influence of muscle mass, physical activity, and health.</a> J Gerontol A Biol Sci. 56, B209-B217 (2001).</li>
<li>Ryall, J. G., Schertzer, J. D., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+underlying+age-related+skeletal+muscle+wasting+and+weakness%5BTitle%5D)+AND+%22Biogerontology%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms underlying age-related skeletal muscle wasting and weakness.</a> Biogerontology. 9, 213-228 (2008).</li>
<li>Uezumi, A., Fukada, S., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+progenitors+distinct+from+satellite+cells+contribute+to+ectopic+fat+cell+formation+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle.</a> Nat Cell Biol. 12, 143-152 (2010).</li>
<li>Lexell, J., Taylor, C. C., Sjostrom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+cause+of+the+ageing+atrophy%3F+Total+number%2C+size+and+proportion+of+different+fiber+types+studied+in+whole+vastus+lateralis+muscle+from+15-+to+83-year-old+men%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Sci%22%5BJournal%5D)">What is the cause of the ageing atrophy? Total number, size and proportion of different fiber types studied in whole vastus lateralis muscle from 15- to 83-year-old men.</a> J Neurol Sci. 84, 275-294 (1988).</li>
<li>Grounds, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reasons+for+the+degeneration+of+ageing+skeletal+muscle%3A+a+central+role+for+IGF-1+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Biogerontology%22%5BJournal%5D)">Reasons for the degeneration of ageing skeletal muscle: a central role for IGF-1 signalling.</a> Biogerontology. 3, 19-24 (2002).</li>
<li>Carlson, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+aging+and+rejuvenation+of+human+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Molecular aging and rejuvenation of human muscle stem cells.</a> EMBO Mol Med. 1, 381-391 (2009).</li>
<li>Brown, D. M., Goljanek-Whysall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((microRNAs%3A+Modulators+of+the+underlying+pathophysiology+of+sarcopenia%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">microRNAs: Modulators of the underlying pathophysiology of sarcopenia?</a> Ageing Res Rev. 24, 263-273 (2015).</li>
<li>Brooks, S. V., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contraction-induced+injury%3A+recovery+of+skeletal+muscles+in+young+and+old+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Contraction-induced injury: recovery of skeletal muscles in young and old mice.</a> Am J Physiol. 258, C436-C442 (1990).</li>
<li>Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+absolute+requirement+for+Pax7-positive+satellite+cells+in+acute+injury-induced+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration.</a> Development. 138, 3639-3646 (2011).</li>
<li>Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cell+of+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophys+Biochem+Cytol%22%5BJournal%5D)">Satellite cell of skeletal muscle fibers.</a> J Biophys Biochem Cytol. 9, 493-495 (1961).</li>
<li>Charge, S. B., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+regulation+of+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular regulation of muscle regeneration.</a> Physiol Rev. 84, 209-238 (2004).</li>
<li>Brack, A. S., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+changes+and+extrinsic+influences+of+myogenic+stem+cell+function+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Intrinsic changes and extrinsic influences of myogenic stem cell function during aging.</a> Stem cell Rev. 3, 226-237 (2007).</li>
<li>Kadi, F., Charifi, N., Henriksson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+number+of+satellite+cells+in+slow+and+fast+fibres+from+human+vastus+lateralis+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The number of satellite cells in slow and fast fibres from human vastus lateralis muscle.</a> Histochem Cell Biol. 126, 83-87 (2006).</li>
<li>Verdijk, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cell+content+is+specifically+reduced+in+type+II+skeletal+muscle+fibers+in+the+elderly%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Satellite cell content is specifically reduced in type II skeletal muscle fibers in the elderly.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 292, E151-E157 (2007).</li>
<li>Collins, C. A., Zammit, P. S., Ruiz, A. P., Morgan, J. E., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+population+of+myogenic+stem+cells+that+survives+skeletal+muscle+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells%22%5BJournal%5D)">A population of myogenic stem cells that survives skeletal muscle aging.</a> Stem cells. 25, 885-894 (2007).</li>
<li>Bortoli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+human+satellite+cells+during+muscular+aging+using+cDNA+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of human satellite cells during muscular aging using cDNA arrays.</a> Gene. 321, 145-154 (2003).</li>
<li>Thalacker-Mercer, A. E., Dell'Italia, L. J., Cui, X., Cross, J. M., Bamman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+genomic+responses+in+old+vs.+young+humans+despite+similar+levels+of+modest+muscle+damage+after+resistance+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Genomics%22%5BJournal%5D)">Differential genomic responses in old vs. young humans despite similar levels of modest muscle damage after resistance loading.</a> Physiol Genomics. 40, 141-149 (2010).</li>
<li>Jejurikar, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+increases+the+susceptibility+of+skeletal+muscle+derived+satellite+cells+to+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Aging increases the susceptibility of skeletal muscle derived satellite cells to apoptosis.</a> Exp Gerontol. 41, 828-836 (2006).</li>
<li>McArdle, A., Dillmann, W. H., Mestril, R., Faulkner, J. A., Jackson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+HSP70+in+mouse+skeletal+muscle+protects+against+muscle+damage+and+age-related+muscle+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Overexpression of HSP70 in mouse skeletal muscle protects against muscle damage and age-related muscle dysfunction.</a> FASEB J. 18, 355-357 (2004).</li>
<li>Sousa-Victor, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geriatric+muscle+stem+cells+switch+reversible+quiescence+into+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence.</a> Nature. 506, 316-321 (2014).</li>
<li>Cornelison, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Context+matters%3A+in+vivo+and+in+vitro+influences+on+muscle+satellite+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Context matters: in vivo and in vitro influences on muscle satellite cell activity.</a> J Cell Biochem. 105, 663-669 (2008).</li>
<li>Soriano-Arroquia, A., McCormick, R., Molloy, A. P., McArdle, A., Goljanek-Whysall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+changes+in+miR-143-3p%3AIgfbp5+interactions+affect+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22ageing+cell%22%5BJournal%5D)">Age-related changes in miR-143-3p:Igfbp5 interactions affect muscle regeneration.</a> ageing cell. 15, 361-369 (2016).</li>
<li>Goljanek-Whysall, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+multiple+target+genes+by+miR-1+and+miR-206+is+pivotal+for+C2C12+myoblast+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Regulation of multiple target genes by miR-1 and miR-206 is pivotal for C2C12 myoblast differentiation.</a> J Cell Sci. 125, 3590-3600 (2012).</li>
<li>Georgantas, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+myogenic+microRNAs+1%2C+133%2C+and+206+by+inflammatory+cytokines+links+inflammation+and+muscle+degeneration+in+adult+inflammatory+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of myogenic microRNAs 1, 133, and 206 by inflammatory cytokines links inflammation and muscle degeneration in adult inflammatory myopathies.</a> Arthritis Rheumatol. 66, 1022-1033 (2014).</li>
<li>Sharples, A. P., Al-Shanti, N., Stewart, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C2+and+C2C12+murine+skeletal+myoblast+models+of+atrophic+and+hypertrophic+potential%3A+relevance+to+disease+and+ageing%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cellular+physiology%22%5BJournal%5D)">C2 and C2C12 murine skeletal myoblast models of atrophic and hypertrophic potential: relevance to disease and ageing?</a> Journal of cellular physiology. 225, 240-250 (2010).</li>
<li>Hidestrand, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sca-1-expressing+nonmyogenic+cells+contribute+to+fibrosis+in+aged+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gerontol+A+Biol+Sci+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Sca-1-expressing nonmyogenic cells contribute to fibrosis in aged skeletal muscle.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 63, 566-579 (2008).</li>
<li>Alsharidah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+human+muscle+precursor+cells+obtained+from+young+and+old+donors+produce+similar+proliferative%2C+differentiation+and+senescent+profiles+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22ageing+cell%22%5BJournal%5D)">Primary human muscle precursor cells obtained from young and old donors produce similar proliferative, differentiation and senescent profiles in culture.</a> ageing cell. 12, 333-344 (2013).</li>
<li>Agley, C. C., Rowlerson, A. M., Velloso, C. P., Lazarus, N. L., Harridge, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+quantitative+immunocytochemical+characterization+of+primary+myogenic+cells+and+fibroblasts+from+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and quantitative immunocytochemical characterization of primary myogenic cells and fibroblasts from human skeletal muscle.</a> J Vis Exp. , (2015).</li>
<li>Pietrangelo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+the+myogenic+profile+of+aged+human+skeletal+muscle+satellite+cells+during+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of the myogenic profile of aged human skeletal muscle satellite cells during differentiation.</a> Exp Gerontol. 44, 523-531 (2009).</li>
<li>Webster, C., Pavlath, G. K., Parks, D. R., Walsh, F. S., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+myoblasts+with+the+fluorescence-activated+cell+sorter%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation of human myoblasts with the fluorescence-activated cell sorter.</a> Exp Cell Res. 174, 252-265 (1988).</li>
<li>Woods, K., Marrone, A., Smith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+cell+death+and+senescence+in+skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Programmed cell death and senescence in skeletal muscle stem cells.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. , 331-335 (2000).</li>
<li>Chakkalakal, J. V., Jones, K. M., Basson, M. A., Brack, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+aged+niche+disrupts+muscle+stem+cell+quiescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The aged niche disrupts muscle stem cell quiescence.</a> Nature. 490, 355-360 (2012).</li>
<li>Cornelison, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+and+separable+roles+for+Syndecan-3+and+Syndecan-4+in+skeletal+muscle+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Essential and separable roles for Syndecan-3 and Syndecan-4 in skeletal muscle development and regeneration.</a> Genes & development. 18, 2231-2236 (2004).</li>
<li>Pisconti, A., Cornelison, D. D., Olguin, H. C., Antwine, T. L., Olwin, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syndecan-3+and+Notch+cooperate+in+regulating+adult+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Syndecan-3 and Notch cooperate in regulating adult myogenesis.</a> J Cell Biol. 190, 427-441 (2010).</li>
<li>Schafer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age+dependence+of+the+human+skeletal+muscle+stem+cell+in+forming+muscle+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Artificial+organs%22%5BJournal%5D)">Age dependence of the human skeletal muscle stem cell in forming muscle tissue.</a> Artificial organs. 30, 130-140 (2006).</li>
<li>Castiglioni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+progenitors+that+exhibit+myogenic%2Fosteogenic+bipotency+in+vitro+by+fluorescence-activated+cell+sorting+from+human+fetal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cell+reports%22%5BJournal%5D)">Isolation of progenitors that exhibit myogenic/osteogenic bipotency in vitro by fluorescence-activated cell sorting from human fetal muscle.</a> Stem cell reports. 2, 92-106 (2014).</li>
<li>Stewart, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+proliferating+human+skeletal+muscle-derived+cells+in+vitro%3A+differential+modulation+of+myoblast+markers+by+TGF-beta2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of proliferating human skeletal muscle-derived cells in vitro: differential modulation of myoblast markers by TGF-beta2.</a> J Cell Physiol. 196, 70-78 (2003).</li>
<li>Wagner, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+and+replicative+senescence+have+related+effects+on+human+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Aging and replicative senescence have related effects on human stem and progenitor cells.</a> PloS one. 4, e5846(2009).</li>
<li>Gaster, M., Kristensen, S. R., Beck-Nielsen, H., Schroder, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cellular+model+system+of+differentiated+human+myotubes%5BTitle%5D)+AND+%22APMIS+%3A+acta+pathologica%2C+microbiologica%2C+et+immunologica+Scandinavica%22%5BJournal%5D)">A cellular model system of differentiated human myotubes.</a> APMIS : acta pathologica, microbiologica, et immunologica Scandinavica. 109, 735-744 (2001).</li>
<li>Gaster, M., Beck-Nielsen, H., Schroder, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+conditions+for+human+satellite+cells.+The+fractional+content+of+satellite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22APMIS+%3A+acta+pathologica%2C+microbiologica%2C+et+immunologica+Scandinavica%22%5BJournal%5D)">Proliferation conditions for human satellite cells. The fractional content of satellite cells.</a> APMIS : acta pathologica, microbiologica, et immunologica Scandinavica. 109, 726-734 (2001).</li>
<li>Danoviz, M. E., Yablonka-Reuveni, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+satellite+cells%3A+background+and+methods+for+isolation+and+analysis+in+a+primary+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle satellite cells: background and methods for isolation and analysis in a primary culture system.</a> Methods Mol Biol. 798, 21-52 (2012).</li>
<li>Chowdhury, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-Step+Purification+of+Human+Skeletal+Muscle+Myoblasts+and+Subsequent+Expansion+Using+Laminin-Coated+Surface%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering.+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">One-Step Purification of Human Skeletal Muscle Myoblasts and Subsequent Expansion Using Laminin-Coated Surface.</a> Tissue engineering. Part C, Methods. 21, 1135-1142 (2015).</li>
<li>Mamchaoui, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+pathological+human+myoblasts%3A+towards+a+universal+tool+for+the+study+of+neuromuscular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+muscle%22%5BJournal%5D)">Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders.</a> Skeletal muscle. 1, 34(2011).</li>
<li>Natarajan, A., Lemos, D. R., Rossi, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibro%2Fadipogenic+progenitors%3A+a+double-edged+sword+in+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle%22%5BJournal%5D)">Fibro/adipogenic progenitors: a double-edged sword in skeletal muscle regeneration.</a> Cell cycle. 9, 2045-2046 (2010).</li>
<li>Ciofani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypergravity+effects+on+myoblast+proliferation+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Hypergravity effects on myoblast proliferation and differentiation.</a> J Biosci Bioeng. 113, 258-261 (2012).</li>
</ol>

Nie ma nic do ujawnienia.

Tutaj przedstawiamy prostą, solidną, niedrogą, powtarzalną i wydajną metodę izolowania komórek progenitorowych mięśni / pierwotnych mioblastów od dorosłych i starszych ludzi z mięśni prostowników palców brevis, piszczelowych przednich lub odwodzicieli haluch. Protokół ten ma na celu umożliwienie badań z wykorzystaniem ludzkich pierwotnych mioblastów od dorosłych i starszych ludzi, zwłaszcza gdy bardziej wyrafinowane metody, takie jak sortowanie FACS lub MACS, nie są możliwe lub niepraktyczne.
Metoda izolacji przedstawiona w tym manuskrypcie trwa około 2 godzin. Podczas izolacji mięśni przemyto je w 70% etanolu, aby uniknąć zanieczyszczenia. Przed enzymatyczną dysocjacją mięśnia ważne jest, aby pokroić mięsień na małe, ale widoczne kawałki i uniknąć uszkodzenia komórek przez zbyt duże mielenie. Trawienie powoduje dysocjację włókien mięśniowych i uwolnienie komórek satelitarnych i miogennych komórek prekursorowych. W naszym przypadku dla ~20 mg mięśni szkieletowych, jedna szalka Petriego o średnicy 60 mm (20 cm2) była najbardziej odpowiednią powierzchnią do pobrania komórek. Komórki posiane na większej powierzchni wykazywały zmniejszoną proliferację, podczas gdy komórki posiane na mniejszej powierzchni wykazywały zwiększoną śmierć komórek i aglutynację.
Po wyizolowaniu komórki hodowano i namnażano na płytkach pokrytych lamininą. Stosowanie powierzchni niepowlekanych miało tendencję do zmniejszania skuteczności izolacji. Z tego powodu komórki mogą być korzystnie zbierane na wstępnie pokrytej powierzchni bezpośrednio po izolacji. Kultury wzbogacone w fibroblasty będą dominować, a nie komórki pochodzące z mioblastów, jeśli komórki zostaną zebrane na niepowlekanej powierzchni bezpośrednio po izolacji. Oprócz lamininy można zastosować inne rozwiązania do przyłączania komórek, takie jak Matrigel i odczynniki na bazie kolagenu. Roztwory powlekające mogą zawierać czynniki wzrostu i inne związki, które będą promować wzrost komórek, ale mogą one zmieniać zachowanie komórek, a tym samym wyniki eksperymentalne. Z naszego doświadczenia wynika, że 10 μg/ml lamininy jest optymalnym stężeniem i odpowiednim odczynnikiem powlekającym dla komórek satelitarnych oraz przyłączania i proliferacji mioblastów, ponieważ nie zawiera żadnego czynnika wzrostu ani innych uzupełnień. Co więcej, laminina jest naturalnie obecna w blaszce podstawnej, bezpośrednio związanej z sarkolemmą, która odgrywa kluczową rolę w przyłączaniu i migracji komórek satelitarnych przez włókno mięśni szkieletowych.
Suplementy pożywek hodowlanych mogą również mieć szkodliwy wpływ na zachowanie pierwotnego mioblastu. Na przykład grupy czynników wzrostu, takie jak FGF lub IGF, mają plejotropowy wpływ na pierwotne kultury mioblastów, przy czym FGF-2 kontroluje zarówno mitogenną, jak i programowaną odpowiedź na śmierć komórki31. Konieczne jest zatem rygorystyczne kontrolowanie warunków hodowli, zwłaszcza że różnice w zachowaniu pierwotnych mioblastów wyizolowanych z mięśni osób dorosłych i starszych z dużym prawdopodobieństwem wynikają z czystości kultur i prawdopodobieństwa przekroczenia mioblastów przez fibroblasty w kulturze podczas długotrwałych hodowli35. Zastosowaliśmy 1-godzinne wstępne posiewanie komórek podczas pierwszego rozłupywania na niepowlekanej powierzchni w celu zmniejszenia zanieczyszczenia kultur fibroblastami.
Opisana przez nas metoda jest odpowiednia do izolowania miogennych komórek progenitorowych z mięśni zarówno dorosłych, jak i starszych ludzi. Wyizolowana komórka składa się z reprezentatywnej miogennej populacji komórek, na co wskazuje wysoki odsetek komórek miogennych (ekspresja MyoD i właściwości miogenne uwidocznione za pomocą barwienia immunologicznego MF20 na rycinach 1 i 2) i może być wykorzystana jako model in vitro do badań funkcjonalnych procesów związanych z homeostazą mięśni.
Wcześniejsze badania charakteryzowały izolację i różnice we właściwościach lub ich braku ludzkich pierwotnych mioblastów od osób dorosłych i starszych 6,20,27,28,29,30,31,35,3 6,37,38. Wykazano istnienie geriatrycznych i/lub niefunkcjonalnych ludzkich MPC 6,20,22. Jednak nie wykazano również różnicy w zachowaniu świeżo wyizolowanych ludzkich MPC27. Nasz protokół pozwala na izolację pierwotnych mioblastów, które przynajmniej częściowo zachowują swój fenotyp, np. zmniejszony potencjał proliferacyjny lub starzenie się pierwotnych mioblastów wyizolowanych z mięśni osób w podeszłym wieku i pozwala na wykorzystanie tych komórek do badań funkcjonalnych molekularnych mechanizmów homeostazy mięśni podczas starzeniasię 22.
Pierwotne mioblasty wyizolowane opisaną metodą mogą być wykorzystywane nie tylko do badań różnicowania miogennego, ale także do badania zmian wewnątrzkomórkowych, takich jak zmiany w ekspresji genów zachodzące w ludzkich miogennych komórkach prekursorowych podczas starzenia. Jednak zmiany, które zachodzą w komórkach podczas długotrwałej hodowli ex vivo , muszą być brane pod uwagę przy analizie zmian fenotypowych i genotypowych zachodzących podczas starzenia się. Zalecamy użycie do tego celu świeżo wyizolowanych komórek.
Co więcej, opisana tutaj metoda pierwotnej hodowli mioblastów pozwala na ekspansję i stosunkowo długotrwałą hodowlę ludzkich pierwotnych mioblastów, co pozwala na solidne badania funkcjonalne in vitro. Wcześniej wykazaliśmy, że miogenne komórki progenitorowe wyizolowane naszą metodą mogą być wykorzystywane zarówno do profilowania ekspresji, jak i badań funkcjonalnych procesów związanych ze starzeniem się mięśni22. Metoda ta ma również zastosowanie do mięśni dorosłych i starych gryzoni i pozwala na wyizolowanie wzbogaconej kultury mioblastów, która może być wykorzystana do profilowania zmian genetycznych i epigenetycznych podczas starzenia się oraz badań funkcjonalnych22. Ograniczenia tej metody obejmują użycie, do pewnego stopnia, mieszanej populacji komórek, a nie czystej populacji komórek satelitarnych, którą można uzyskać przy użyciu bardziej wyrafinowanych opublikowanych metod 6,28,29,39,40,41,42,43.
Przedstawiamy uproszczony, niedrogi i powtarzalny protokół izolacji pierwotnych komórek mioblastów od dorosłych i starszych ludzi. Z naszego doświadczenia wynika, że dostępne, bardziej wyrafinowane metody izolacji i hodowli ludzkich mioblastów pierwotnych (takich jak komórki satelitarne sortowane przez MAC lub FACS) są idealne do niektórych rodzajów badań, takich jak profilowanie zmian transkryptomicznych lub proteomicznych w komórkach. Metody te są jednak drogie, wymagają przynajmniej pewnego poziomu wiedzy specjalistycznej i mogą okazać się trudne ze względu na niski wskaźnik proliferacji czystych pierwotnych kultur mioblastów i fibroblastów przerastających mioblasty.
Przedstawiamy powtarzalny protokół, który pozwala na prostą izolację i hodowlę ludzkich pierwotnych mioblastów do wykorzystania w badaniach funkcjonalnych. Ponadto proponujemy stosowanie lamininy42 i ograniczone stosowanie bFGF jako kluczowe czynniki udanej hodowli44. Proponujemy również unikanie naprężeń generowanych przez wirowanie podczas dzielenia komórek i jeden etap wstępnego powlekania przy pierwszym pasażu45. Podsumowując, zoptymalizowaliśmy skuteczny protokół izolacji i hodowli pierwotnych mioblastów/MPC z mięśni dorosłych i starszych ludzi, który ma również zastosowanie do mięśni gryzoni i umożliwia badania ekspresji i funkcjonalnej homeostazy mięśni.

Związana z chorobą i wiekiem postępująca utrata masy i funkcji mięśni szkieletowych powoduje osłabienie, spadek siły i obniżenie jakości życia osób starszych. Mięśnie szkieletowe stanowią około 40% masy ciała1. Podczas starzenia się i choroby dochodzi do postępującego zaniku poszczególnych włókien mięśniowych i obniżenia jakości mięśni w wyniku infiltracji tłuszczu i zwłóknienia1,2,3,4,5,6. Ostatnio zaproponowano, że specyficzne dla gatunku różnice w starzeniu się mięśni szkieletowych, a w szczególności, że utrata włókien mięśniowych występująca u gryzoni może nie wystąpić u ludzi7. Niemniej jednak pozostałe włókna mięśniowe starzejących się ssaków charakteryzują się zwiększoną podatnością na uszkodzenia i upośledzoną regeneracją8. W naprawie i utrzymaniu dorosłych mięśni pośredniczą komórki satelitarne9,10. Po uszkodzeniu mięśni i innych istotnych sygnałach komórki satelitarne aktywują się i namnażają. Podzbiór komórek powraca do stanu spoczynku, a pozostała część przekształca się w mioblasty (miogenne komórki progenitorowe - MPC). Przyczyniają się one do naprawy istniejącego myofiber11. Funkcjonalność komórek satelitarnych decyduje o powodzeniu regeneracji mięśni, a zmiany w dostępności komórek satelitarnych wraz ze starzeniem się zostały zademonstrowane12,13,14,15. Co więcej, komórki satelitarne z mięśni starych ludzi i gryzoni wykazują zmianę profilu transkrypcyjnego i zmniejszony potencjał regeneracyjny16,17,18,19. Wykazano również, że komórki satelitarne mięśni starych myszy i ludzi ulegają starzeniu, co skutkuje ich zmniejszoną funkcjonalnością20.
Najbardziej znaną linią komórkową umożliwiającą badanie homeostazy mięśni jest mysia linia komórkowa C2C1221. W znacznej liczbie badań wykorzystano również mysie pierwotne mioblasty22. Kultury te doprowadziły do znaczącego zrozumienia miogenezy myszy i kręgowców, a także regeneracji mięśni, atrofii mięśni/włókien mięśniowych i procesów hipertrofii zachodzących podczas chorób mięśni i starzenia się23,24,25,26. Ostatnio kilka grup opisało wykorzystanie ludzkich pierwotnych mioblastów do badania miogenezy i starzenia się mięśni. Nie ma jednak zgody co do różnic między pierwotnymi mioblastami wyizolowanymi z mięśni dorosłych i starszych ludzi27,28,29,30,31. Pomimo różnic charakteryzujących się w środowisku ogólnoustrojowym i lokalnym występującym podczas rozwoju, starzenia się i chorób 6,32,33,34, hodowle in vitro myoblast i myotube pozostają najbardziej dostępnymi narzędziami do badania mechanizmów molekularnych związanych z rozwojem, wzrostem i atrofią mięśni. Ponadto badania te zapewniają nie tylko solidne, ale także stosunkowo szybkie, niedrogie i wysokowydajne narzędzie do badań in vitro. Co więcej, implikacje etyczne związane z badaniami nad ludzkimi mięśniami oznaczają, że w przypadku eksperymentów funkcjonalnych obejmujących manipulacje ekspresją genów, hodowle in vitro ludzkich mioblastów i miotubek pozostają jedyną dostępną alternatywą dla organizmów modelowych kręgowców.
Tutaj pokazujemy prosty protokół eksperymentalny do solidnej, taniej i powtarzalnej izolacji pierwotnych mioblastów (MPC) z mięśni osób dorosłych i starszych oraz opisujemy standaryzowane warunki hodowli in vitro (Rysunek 1). Ponieważ pierwotne kultury z mięśni zwykle zawierają fibroblasty oprócz mioblastów, zalecamy etap wstępnego powlekania mający na celu poprawę czystości i jakości pierwotnych mioblastów. Podsumowując, opracowaliśmy protokół pozwalający na skuteczną i powtarzalną izolację, hodowlę i badania funkcjonalne wzbogaconych i funkcjonalnych MPC/pierwotnych mioblastów z mięśni szkieletowych osób dorosłych i starszych.

<table><tbody><tr><td>Szalki Petriego 60 mm</td><td>Greiner Bio One</td><td>628160</td><td>Cellstar Naczynie do hodowli komórkowych, PS, 60/15 MM, OTWORY WENTYLACYJNE.</td></tr><tr><td>Płytki do hodowli komórkowych (6-dołkowe)Płytki do hodowli komórkowych</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3516</td><td>Corning Costar. 6-dołkowe, płaskie dno (pakowane pojedynczo) .&nbsp;</td></tr><tr><td>Płytki do hodowli komórkowych (12-dołkowe)</td><td>Greiner bio-one</td><td>657 160</td><td>Cellstar Płytki wielodołkowe do hodowli komórkowych.&nbsp;</td></tr><tr><td>Kolby hodowlane</td><td>Greiner Bio One</td><td>&nbsp; 690175 (25 cm<s>2); 658175 (75 cm2).</td><td>Kolby do hodowli komórkowych z nasadką filtracyjną Cellstar.</td></tr><tr><td>Standardowy jednorazowy skalpel</td><td>Granton</td><td>91310</td><td>Sterylne ostrze ze stali nierdzewnej, wzór: 10.&nbsp;</td></tr><tr><td>Pipety</td><td>Greiner bio-one</td><td>606 180 (5 ml); 607 180 (10 mL); 760 180 (25 mL)</td><td>Pipety serologiczne Cellstar.&nbsp;</td></tr><tr><td>Pipety plastikowe Pasteura</td><td>Starlab</td><td>E1414-0311</td><td>3,0 ml pipeta Pasteura z podziałką (sterylna), ind. owinięta.</td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>BD</td><td>300613</td><td>20 ml BD strzykawka z mimośrodową końcówką.&nbsp;</td></tr><tr><td>0,2 &mikro; m filtry</td><td>Gilson</td><td>ALG422A</td><td>Sterylne filtry strzykawkowe CA 0,2 i mikro; m 33 mm Pk50.</td></tr><tr><td>Sitka komórkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>11597522</td><td>Sitko do hodowli komórkowych sterylne pakowane pojedynczo 70 &mikro; m polipropylenu.</td></tr><tr><td>Kolagenaza D</td><td>Roche</td><td>11088882001</td><td>Kolagenaza D; Aktywność: &ge; 0,15 U/mg&nbsp;</td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4693</td><td>Proteaza Dispase II z Bacillus polymyx. Aktywność: &ge; 0,5 U/mg ciała stałego.</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>449709</td><td>Chlorek wapnia, bezwodny, perełki i minus; 10 oczek, &ge; 99,9% na bazie metali śladowych&nbsp;</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114956-81-9&nbsp;</td><td>Laminina z błony podstawnej mięsaka mysiego Engelbreth-Holm-Swarm. 1 mg/ml.</td></tr><tr><td>DMEM-wysoki poziom glukozy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5671</td><td>Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Średni - wysoki poziom glukozy. Zawiera 4 500 mg/l glukozy i wodorowęglanu sodu, bez L-glutaminy i pirogronianu sodu.</td></tr><tr><td>Pożywka F-12</td><td>Gibco</td><td>21765029</td><td>Mieszanka składników odżywczych F-12 szynki. 1x + L-glutamina.</td></tr><tr><td>FGF-b</td><td>PetroTech</td><td>100-18B&nbsp;</td><td>Rekombinowany ludzki podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów.</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>Surowica bydlęca</td></tr> płodu.<tr><td>Surowica dla koni (HS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1270</td><td>Serum dla koni. Stado dawców, pochodzące z USA, sterylnie filtrowane.</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td>Penicylina-Streptomycyna z 10 000 jednostek penicyliny i 10 mg streptomycyny na ml w 0,9% NaCl, sterylnie przefiltrowana.</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td>L-glutamina, roztwór 200 mM, roztwór, sterylnie przefiltrowany.</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td>Roztwór trypsyny-EDTA. 0,25%, sterylnie przefiltrowany.</td></tr><tr><td>TrypLE Express&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>12604-013</td><td>TrypLE Express Enzyme (1x), bez czerwieni fenolowej.</td></tr><tr><td>DPBS (hodowla komórkowa)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami. Zmodyfikowany, bez chlorku wapnia i chlorku magnezu.</td></tr><tr><td>PBS (barwienie immunologiczne)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417-50TAB</td><td>Tabletka soli fizjologicznej buforowana fosforanami. Jedna tabletka na 200 ml wody dejonizowanej (0,01 M bufor fosforanowy, 0,0027 M chlorek potasu i 0,137 M chlorek sodu, pH 7,4).&nbsp;</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher</td><td>M/4000/PC17</td><td>Odczynnik analityczny do metanolu</td></tr><tr><td>klasy Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Triton X-100 do biologii molekularnej.</td></tr><tr><td>przeciwciało anty-MF 20</td><td>DSHB</td><td>MF20-c 2ea 211 i mikro; g/ml.</td><td>MYH1E (MF 20) Mab myszy.</td></tr><tr>przeciwciało <td>anty-MyoD</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>13812P</td><td>MyoD1 (D8G3) XP Rabbit mAb.</td></tr>przeciwciało <tr><td>anty-Ki67</td><td>Abcam</td><td>ab16667</td><td>MAb królika do Ki67 [SP6].</td></tr><tr><td>Przeciwciało wtórne anty-mysie 488&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-11029</td><td>Kozie przeciwciało drugorzędowe anty-mysie IgG (H+L), koniugat Alexa Fluor 488.</td></tr><tr><td>Przeciwciało drugorzędowe anty-królicze 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11034</td><td>Kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H+L) Przeciwciało drugorzędowe, koniugat Alexa Fluor 488.</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td></tr> <tr><td>Starzenie się i beta;-galaktozydaza Zestaw</td> do <td>barwienia Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>9860</td><td>Starzenie się i beta;-Galaktozydaza Zestaw do barwienia.</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>41639</td><td>Dimetylosulfotlenek. BioUltra, dla biologii molekularnej, &ge; 99,5% (GC).&nbsp;</td></tr><tr><td>Acridine Orange</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8097</td><td>Roztwór chlorowodorku pomarańczy akrydynowej 10 mg/ml w H2O.</td></tr><tr><td>Bromek etydyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td>Roztwór bromku etydyny. Bioodczynnik do biologii molekularnej 10 mg/ml w H2O.</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11668019</td><td>Lipofectamine 2000 Odczynnik do transfekcji</td></tr><tr><td>Kontrola mieszania dla transfekcji</td><td>Qiagen</td><td>1027271</td><td>miScript Inhibitor Neg. Control (5 nmol)</td></tr><tr><td>Hsa-miR-378a-3p miScript Primer Assay</td><td>Qiagen</td><td>218300</td><td>Hs_miR-422b_1 miScript Primer Assay (celuje w dojrzałe miRNA: has-miR-378a-3p). MIMAT0000732: 5'-ACUGGACUUGGAGUCAGAAGGC</td></tr><tr><td>Anti-has-miR-378a-3p miScript miRNA Inhibitor</td><td>Qiagen</td><td>219300</td><td>Anti-has-miR-378a-3p miScript miScript Inhibitor (celuje w dojrzałe miRNA: has-miR-378a-3p). MIMAT0000732: 5'-ACUGGACUUGGAGUCAGAAGGC</td></tr><tr><td>Wirówka Megafuge 2.0 R</td><td>Heraeus</td><td>75003085</td><td>n/a</td></tr><tr><td>Wirnik wirówki</td><td>Heraeus</td><td>3360</td><td>Wirnik wirówki Heraeus Sepatech Megafuge BS4402/A. Max. promień: 15,5 cm.</td></tr><tr><td>System mikroskopu odwróconego Eclipse Ti-E</td><td>Nikon</td><td>n/a</td><td>Okulary: CFI 10X/22; Powiększenie całkowite: 100X (MF20, Live/dead i Ki67).</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony Axiovert 200</td><td>Carl Zeiss</td><td>n/a</td><td>Okulary: Carl Zeiss 1016-758 W-PI 10X/25; Całkowite powiększenie: 100X (starzenie się &beta;-barwienie galaktozydazą).</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony Axiovert 25</td><td>Carl Zeiss</td><td>n/a</td><td>Okulary: E-PL 10X/20. Powiększenie całkowite: 100X (jasne pole).</td></tr><tr><td>Mikroskop do odwróconych kultur tkankowych</td><td>z membraną Nikon</td><td>n/a</td><td>Okular: CFWN 10X/20. Powiększenie całkowite: 100X (jasne pole).</td></tr><tr><td>Hydromount</td><td>Krajowa Diagnostyka</td><td>HS-106</td><td>Hydromount</td></tr></tbody></table>

przygotowanie i hodowla miogennych komórek prekursorowych/pierwotnych mioblastów z mięśni szkieletowych dorosłych i starszych ludzi

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Homeostaza mięśni szkieletowych zależy od wzrostu (hipertrofii), atrofii i regeneracji mięśni. Podczas starzenia się i w wielu chorobach dochodzi do zaniku mięśni. Utrata masy mięśniowej i funkcji wiąże się z zanikiem typu włókien mięśniowych, zmianą rodzaju włókien, wadliwą regeneracją mięśni związaną z dysfunkcją komórek satelitarnych, komórek macierzystych mięśni i innymi procesami patofizjologicznymi. Zmiany te są związane ze zmianami w niszach wewnątrzkomórkowych, a także miejscowych i ogólnoustrojowych. Oprócz najczęściej stosowanych modeli starzenia się mięśni u gryzoni, istnieje potrzeba zbadania homeostazy mięśni i zaniku przy użyciu modeli ludzkich, które ze względu na implikacje etyczne składają się głównie z kultur in vitro. Pomimo szerokiego zastosowania ludzkich miogennych komórek progenitorowych (MPC) i pierwotnych mioblastów w miogenezie, istnieją ograniczone dane na temat wykorzystania ludzkich pierwotnych kultur mioblastów i miotubek do badania mechanizmów molekularnych regulujących różne aspekty zaniku mięśni związanego z wiekiem, co pomaga w walidacji mechanizmów starzenia się proponowanych w mięśniach gryzoni. Wykorzystanie ludzkich MPC, pierwotnych mioblastów i miotub wyizolowanych od osób dorosłych i starszych, zapewnia fizjologicznie istotny model molekularnych mechanizmów procesów związanych ze wzrostem, atrofią i regeneracją mięśni. W tym miejscu szczegółowo opisujemy solidny, niedrogi, powtarzalny i wydajny protokół izolacji i utrzymania ludzkich MPC i ich potomstwa - mioblastów i miotub z próbek ludzkich mięśni przy użyciu trawienia enzymatycznego. Ponadto określiliśmy liczbę pasaży, przy której pierwotne mioblasty osób dorosłych i starszych ulegają starzeniu w hodowli in vitro. Wreszcie wykazujemy zdolność do transfekcji tych mioblastów oraz zdolność do charakteryzowania ich zdolności proliferacyjnej i różnicowania oraz proponujemy ich przydatność do wykonywania badań funkcjonalnych molekularnych mechanizmów miogenezy i zaniku mięśni in vitro.

MPCs/pierwotne mioblasty powinny być widoczne 24 h po wysianiu na powierzchnię pokrytą lamininą (Rycina 2). Komórki powinny przyjąć kształt wrzecionowaty i nadal wykazywać ekspresję MyoD w pasażu 4 (Rycina 1A, B). Fibroblasty można odróżnić po ich gwiaździstej morfologii oraz braku ekspresji MyoD (Rycina 1B, C). Po przytwierdzeniu się komórek następnego dnia, należy wymienić pożywkę na świeżą pożywkę z bFGF. Pożywkę hodowlaną należy wymieniać co 48 h.
Przedstawione tutaj reprezentatywne wyniki oraz opublikowane dane z naszego laboratorium22 mają na celu wsparcie naszego protokołu izolacji i hodowli oraz zademonstrowanie różnych technik, które mogą być wykorzystane do badań funkcjonalnych pierwotnych mioblastów ludzkich. Proliferację mioblastów można badać za pomocą immunobarwienia Ki67, a żywotność za pomocą testu barwienia żywotności komórek (Rycina 3). W celu indukcji różnicowania należy zmienić pożywkę hodowlaną na pożywkę do różnicowania. Miotuby powinny uformować się w ciągu 5 - 7 d i być pozytywne pod kątem ciężkiego łańcucha miozyny (Rycina 3). Należy zauważyć, że formowanie miotub może być mniej wydajne, gdy mioblasty są izolowane z mięśni osób starszych (Rycina 3). Można również przeprowadzić barwienie na starzenie (SA-β-galaktazydaza), aby ustalić odsetek komórek starzejących się w hodowli (Rycina 3). Zaobserwowaliśmy, że w dłuższych hodowlach (Rycina 3, pasaż 4), więcej mioblastów izolowanych z mięśni osób starszych wykazuje cechy starzenia.
W badaniach funkcjonalnych ekspresję genów i mikroRNA można manipulować poprzez dostarczanie wektorów ekspresyjnych, siRNA, mimetyków mikroRNA oraz antimiR za pomocą lipofilnych odczynników do transfekcji (Rysunek 4). Pozwala to na uzyskanie wydajności transfekcji na poziomie 40 - 70%, przy czym poziomy genów/mikroRNA są regulowane w górę lub w dół w zakresie fizjologicznym (Rysunek 4;22).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Naczynie hodowlane</td>
			<td>Przybliżona powierzchnia (na dołek)</td>
			<td>Objętość 10 µg/mL laminina</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>szalka 35 mm</td>
			<td>10 cm2</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>szalka 60 mm</td>
			<td>20 cm2</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>szalka 100 mm</td>
			<td>60 cm2</td>
			<td>4 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>płytka 24-dołkowa</td>
			<td>2 cm2</td>
			<td>200 µL/well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>płytka 12-dołkowa</td>
			<td>4 cm2</td>
			<td>500 µL/well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>płytka 6-dołkowa</td>
			<td>10 cm2</td>
			<td>1 ml/dołek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25</td>
			<td>25 cm2</td>
			<td>3 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75</td>
			<td>75 cm2</td>
			<td>5 ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Zalecane minimalne objętości roztworu lamininy w DPBS (10 µg/mL) do powlekania powierzchni hodowli.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td></td>
			<td >Aktywność właściwa/Masa molowa</td>
			<td >Stężenie końcowe</td>
			<td >Masa lub objętość potrzebna do 10 mL roztworu</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Collagenase D</td>
			<td >0.15 U/mg</td>
			<td >10 mg/mL (1.5 U/mL)</td>
			<td >100 mg</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Dispase II</td>
			<td >0.5 U/mg</td>
			<td >4.8 mg/mL (2.4 U/mL)</td>
			<td >48 mg</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >250 mM CaCl2</td>
			<td >110.98 g/mol</td>
			<td >2.5 mM</td>
			<td >100 µL</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 2. Przygotowanie enzymów do trawienia mięśni.
<img alt="Schemat izolacji komórek z biopsji mięśnia z wykorzystaniem dysocjacji mechanicznej, trawienia enzymatycznego i wirowania." src="/files/ftp_upload/55047/55047fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Graficzny abstrakt podsumowujący etapy protokołu. Dysocjacja ludzkiej biopsji mięśnia za pomocą nożyczek lub skalpela chirurgicznego (I). Inkubacja z roztworem enzymatycznym w temperaturze 37 °C przez 30 - 40 min (II). Zakończenie trawienia poprzez dodanie pożywki wzrostowej i przefiltrowanie roztworu przez filtr membranowy 70 µm do probówki do wirowania (III). Wirowanie przy 443 x g przez 5 min (IV). Odlanie supernatantu i resuspensja w pożywce wzrostowej zawierającej 2.5 ng/mL FGF (V). Wysianie komórek na szalkę pokrytą 10 µg/mL lamininy i wymiana pożywki po 24 h (VI). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55047/55047fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia starzenia komórkowego; komórki dorosłe i stare, kontrast fazowy, immunofluorescencja, analiza MyoD." src="/files/ftp_upload/55047/55047fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Mioblasty wyizolowane z mięśni osób dorosłych i osób starszych na różnych pasażach. A. Obrazy przedstawiają mioblasty wyizolowane z mięśnia prostownika krótkiego palców, mięśnia piszczelowego przedniego lub mięśnia odwodziciela palucha u pacjentek (dorosłe: 30 ± 2,8 lat, starsze: 69 ± 5 lat, BMI&lt;25). W pasażu 0 oraz po 5 dniach od wysiania komórki są nadal okrągłe i małe, ale widoczne pod mikroskopem świetlnym (A). Następnie mioblasty przybierają wydłużony kształt, jak pokazano w pasażu 2 (A). MyoD jest wyrażane w mioblastach, ale nie w fibroblastach (B). Przedstawiono ilościowe oznaczenie komórek MyoD-dodatnich; słupki błędu wskazują odchylenie standardowe; n = 3 (B). Reprezentatywny obraz wykazujący różnice w morfologii mioblastów i fibroblastów (C). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55047/55047fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obrazy mikroskopowe; żywotność, proliferacja, różnicowanie i starzenie się komórek w próbkach dorosłych i starszych." src="/files/ftp_upload/55047/55047fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Ludzkie pierwotne mioblasty można charakteryzować przy użyciu różnych technik barwienia. Żywotność komórek można wizualizować za pomocą testów żywotności komórek, proliferację można ocenić za pomocą immunobarwienia Ki67, różnicowanie można ocenić za pomocą immunobarwienia MF20 (ciężki łańcuch miozyny), a starzenie się można wizualizować za pomocą barwienia na beta-galaktozydazę związaną ze starzeniem (SA-β-galaktozydaza). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55047/55047fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna ekspresji miR-378, barwienie cytoszkieletu; wykres słupkowy ekspresji względnej." src="/files/ftp_upload/55047/55047fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Ludzkie pierwotne mioblasty mogą być wykorzystywane do badań funkcjonalnych homeostazy mięśni in vitro. A. Immunobarwienie MF20 (ciężki łańcuch miozyny) zróżnicowanych pierwotnych miotub z dorosłych ludzi, wykazujące wpływ nadekspresji lub inhibicji miR-378 na wielkość i liczbę miotub. B. qPCR wykazujący względną ekspresję miR-378 oraz Igf1r, zwalidowanego genu docelowego dla miR-378, po nadekspresji lub inhibicji miR-378 w ludzkich pierwotnych mioblastach. Przedstawiono ekspresję względną odpowiednio do Rnu-6 i β-2-mikroglobuliny. Słupki błędu przedstawiają SEM; n = 3, * - p&lt;0.05, test t Studenta. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55047/55047fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Ten protokół opisuje solidną, powtarzalną i prostą metodę izolacji i hodowli komórek progenitorowych mioblastów z mięśni szkieletowych osób dorosłych i starszych. Wykorzystywane tutaj mięśnie obejmują mięśnie stóp i nóg. Takie podejście umożliwia wyizolowanie wzbogaconej populacji pierwotnych mioblastów do badań funkcjonalnych.

Przygotowanie i hodowla miogennych komórek prekursorowych/pierwotnych mioblastów z mięśni szkieletowych dorosłych i starszych ludzi

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest zapewnienie solidnej, powtarzalnej i prostej procedury izolacji pierwotnych mioblastów od dorosłych i starszych ludzi. Protokół ten proponuje zoptymalizowany schemat postępowania w celu izolacji pierwotnych ludzkich mioblastów jako modelu in vitro do funkcjonalnych badań nad procesami związanymi z homeostazą mięśni podczas starzenia się. Protokół ten pozwala na zachowanie naturalnego zachowania komórek poprzez uniknięcie stresorów, takich jak wirowanie, oraz umożliwia izolację i długotrwałą hodowlę pierwotnych mioblastów w celu zachowania ich fenotypu.Procedurę należy rozpocząć od przygotowania szalki Petriego o pojemności 60 ml lub dwóch studni płytki sześciodołkowej. Następnie za pomocą pipety nanieść minimalną ilość roztworu lamininy, aby całkowicie pokryć powierzchnię szalki. Przed wysianiem komórek należy inkubować szalkę hodowlaną przez co najmniej 30 minut w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37 °C.Następnie należy przygotować roztwór enzymatyczny w DMEM bezzwrotnym. Dobrze wymieszać i przefiltrować roztwór enzymatyczny przez membranę filtracyjną 0,2 µm w celu sterylizacji. Po pobraniu próbki mięsień należy przechowywać w temperaturze 4 °C w DPBS do czasu trawienia.Przygotować co najmniej dwa mililitry roztworu enzymatycznego na 18 do 20 miligramów tkanki mięśniowej i ogrzać go do 37 °C przed dysocjacją tkanki. Następnie biopsjat mięśnia krótko zanurzyć w 70% etanolu. Przemyć go świeżym DPBS, a następnie 70% etanolem, po czym umieścić tkankę w nowej szalce Petriego w ilości roztworu enzymatycznego wystarczającej do pokrycia próbki.Usuń jak największą ilość tkanki włóknistej i tłuszczowej, a następnie delikatnie podrzyj mięsień na małe, ale wyraźnie rozróżnialne kawałki. Następnie przenieś próbkę do probówki o pojemności 50 ml zawierającej co najmniej 1 ml roztworu enzymatycznego. Inkubuj tkankę w temperaturze 37 °C przez maksymalnie 30 lub 40 minut, przemieszczając tkankę mięśniową poprzez delikatne potrząsanie probówką co 5 do 10 minut.Następnie pokryj pipety pożywką, aby zapobiec przyleganiu uwolnionych komórek do plastikowych ścianek pipet. Następnie dodaj cztery mililitry sterylnej pożywki wzrostowej, aby zatrzymać proces trawienia. Pipetuj roztwór kilkakrotnie w górę i w dół, aby pomóc komórkom odłączyć się od włókien mięśniowych.Następnie przefiltruj zawiesinę mięśniową przez sito komórkowe o oczkach 70 µm do probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Przemyj pozostałe komórki kolejną porcją pożywki, a następnie ponownie przefiltruj je przez sito.Następnie odwiruj próbkę przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aby uzyskać osad komórkowy. Po pięciu minutach ostrożnie odlej nadsącz. Następnie rozpuść osad w pożywce wzrostowej F12.W tym kroku należy wyjąć z inkubatora naczynie hodowlane uprzednio pokryte lamininą. Ostrożnie usuń nadmiar lamininy z naczynia hodowlanego, unikając dotykania powierzchni. Następnie delikatnie przemyj naczynie hodowlane DPBS.Następnie wysiej komórki bezpośrednio na naczynie pokryte lamininą. Inkubuj je przez 24 godziny w wilgotnej inkubatorze w temperaturze 37 °C. Następnego dnia zwizualizuj komórki pod mikroskopem w świetle przechodzącym.Małe, okrągłe komórki przywierają do powierzchni, a pozostałe zanieczyszczenia powinny być widoczne w pożywce hodowlanej. Następnie należy wymienić pożywkę na świeżą pożywkę F12. W tej procedurze pożywkę wymienia się co dwa do trzech dni, a komórki pasażuje się natychmiast po zauważeniu pod mikroskopem grup komórek, aby uniknąć spontanicznego różnicowania.W celu pasażowania komórek należy usunąć medium i dwukrotnie przemyć komórki DPBS. Dodać minimalną ilość trypsyny z 0,25% EDTA, niezbędną do pokrycia powierzchni komórek. Delikatnie potrząsnąć naczyniem, aby upewnić się, że wszystkie komórki są pokryte roztworem odrywającym, a następnie inkubować przez 10 sekund w temperaturze pokojowej przed jego usunięciem.Następnie inkubuj komórki w wilgotnej inkubatorze w temperaturze 37 °C przez trzy do pięciu minut. Delikatnie opukaj naczynie i sprawdź pod mikroskopem świetlnym, czy komórki są zaokrąglone, ale nie całkowicie oddzielone od powierzchni. Następnie dodaj pięć mililitrów pożywki wzrostowej, aby zebrać komórki, dokładnie wymieszaj i przenieś komórki wraz z nową pożywką do kolby T75.Następnie pozostałe komórki należy wypłukać kolejnymi 5 ml pożywki wzrostowej. Aby wykonać przesiew wstępny podczas pierwszego pasażu, komórki inkubuje się w temperaturze 37 °C przez od 40 minut do jednej godziny. Po tym czasie należy zebrać nadsącz zawierający nieprzytwierdzone komórki i inkubować je w nowym flasku T75.Powinno to wzbogacić hodowlę w mioblasty, ponieważ większość fibroblastów powinna przywrzeć do pierwszej kolby. Wymieniaj medium co dwa do trzech dni. Przesiej komórki, gdy tylko osiągną 70% konfluencji.W celu indukcji różnicowania, po osiągnięciu przez komórki 70 do 80 procent konfluencji, należy zmienić pożywkę hodowlaną na pożywkę do różnicowania. Różnicowanie komórek powinno nastąpić w ciągu pięciu do siedmiu dni, w zależności od jakości i czystości hodowli mioblastów. W pasażu zero, po pięciu dniach od wysiania, komórki są wciąż okrągłe i małe, lecz widoczne pod mikroskopem świetlnym.Mioblasty przyjmą następnie wydłużony kształt, charakterystyczny dla pasażowania. Jak tutaj pokazano, MyoD jest ekspresjonowany w mioblastach, ale nie w fibroblastach. Ludzkie pierwotne mioblasty można charakteryzować za pomocą barwienia na żywotność komórek, immunobarwienia Ki67 w celu oceny proliferacji, immunobarwienia MF20 w celu oceny różnicowania oraz barwienia na beta-galaktozydazę związaną z senescencją w testach starzenia komórkowego.Pierwotne mioblasty mogą być wykorzystywane do testów funkcjonalnych. Na tej ilustracji immunobarwienie MF20 zróżnicowanych pierwotnych miotub od dorosłych ludzi pokazuje wpływ nadekspresji lub inhibicji miR-378 na rozmiar i liczbę miotub. Analizy QPCR wykazują, że transfekcje mimikiem miR-378 oraz anty-miR przebiegły pomyślnie i doprowadziły do zmian w względnej ekspresji miR-378 oraz LGF 1R, zwalidowanego genu docelowego miR-378, po nadekspresji lub inhibicji miR-378 w ludzkich pierwotnych mioblastach.Po opanowaniu technika ta może zostać wykonana w czasie krótszym niż dwie godziny. Ten solidny i powtarzalny protokół jest szczególnie użyteczny w sytuacjach, gdy inne, bardziej zaawansowane i kosztowne metody, takie jak sortowanie komórek, nie są możliwe lub praktyczne. Ta uproszczona technika jest przydatna dla badaczy z zakresu mięśni do analizy zjawiska starzenia się w ludzkich modelach systemów in vitro.Podsumowując, proponowana metoda umożliwia izolację komórek progenitorowych mięśni szkieletowych z mięśni nie tylko dorosłych, ale także starszych ludzi, w celu przeprowadzenia funkcjonalnych badań in vitro, które mogą zostać zastosowane również w modelach zwierzęcych.

preparation-culture-myogenic-precursor-cellsprimary-myoblasts-from

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Technika mikrodysekcji eksplantów jest solidną i niezawodną metodą izolacji proliferujących komórek mięśni szkieletowych z mięśni młodocianych, dorosłych lub embrionalnych w celu pozyskania macierzystych komórek mięśni szkieletowych. Wyjątkowo komórki te zostały wyprowadzone klonalnie, co pozwoliło na stworzenie linii macierzystych komórek mięśni szkieletowych wykorzystywanych do transplantacji in vivo.

Kultura mikroeksplantów szkieletowych mięśni dorosłych i embrionalnych oraz izolacja komórek macierzystych mięśni szkieletowych

Sztucznie wytworzona tkanka mięśniowa ma ogromny potencjał w medycynie regeneracyjnej, jako model chorób, a także jako alternatywne źródło mięsa. W niniejszej pracy opisujemy proces tworzenia konstruktu mięśniowego, w tym przypadku z progenitorowych mioblastów mysich, oraz jego stymulację impulsami elektrycznymi.

Inżynieria tkanek mięśni szkieletowych z murynych komórek progenitorowych mioblastów i zastosowanie stymulacji elektrycznej

Systemy hodowli in vitro okazały się niezbędne dla naszego zrozumienia miogenezy kręgowców. Jednak wiele pozostaje do nauczenia się na temat rozwoju i wzrostu mięśni szkieletowych innych niż ssaki, szczególnie w taksonach podstawowych. Skuteczny i solidny protokół izolowania dorosłych komórek macierzystych tej tkanki, miogennych komórek prekursorowych (MPC) i utrzymywania ich samoodnawiania, proliferacji i różnicowania w warunkach hodowli pierwotnej, pozwala na identyfikację konserwatywnych i...

Przygotowanie pierwotnych miogennych kultur komórek prekursorowych/mioblastów z bazalnych linii kręgowców

Głównymi typami komórek przylegających pochodzących z ludzkich mięśni są komórki miogenne i fibroblasty. W tym przypadku populacje komórek są wzbogacane za pomocą sortowania komórek aktywowanego magnetycznie na podstawie antygenu CD56. Późniejsze znakowanie immunologiczne za pomocą specyficznych przeciwciał i zastosowanie technik analizy obrazu pozwala na ilościowe określenie cech cytoplazmatycznych i jądrowych w poszczególnych komórkach.

Izolacja i ilościowa charakterystyka immunocytochemiczna pierwotnych komórek miogennych i fibroblastów z ludzkich mięśni szkieletowych

Tutaj opisujemy ustawienia do równoległego monitorowania bioluminescencji okołodobowej i aktywności wydzielniczej ludzkich komórek wysp trzustkowych i pierwotnych miotub. W tym celu zastosowaliśmy dostarczanie genu lentiwirusowego za pomocą reportera zegara rdzeniowego lucyferazy, a następnie synchronizację in vitro i zbieranie pożywki odpływowej przez ciągłą peryfuzję komórek.

Równoległy pomiar ekspresji genów zegara okołodobowego i wydzielania hormonów w pierwotnych hodowlach komórkowych człowieka

Tutaj opisujemy metodologię uzyskiwania czystej populacji ludzkich mioblastów z dorosłej tkanki mięśniowej. Komórki te są wykorzystywane do badania różnicowania mięśni szkieletowych in vitro, a w szczególności do badania białek zaangażowanych w sygnalizację Ca2 +.

Izolacja ludzkich mioblastów, ocena różnicowania miogennego i pomiar wejścia wapnia w magazynie

Prezentujemy techniki izolacji, hodowli, charakterystyki i różnicowania ludzkich pierwotnych komórek progenitorowych mięśni (hMPC) uzyskanych z tkanki biopsji mięśni szkieletowych.  hMPC uzyskane i scharakteryzowane za pomocą tych metod mogą być wykorzystane do późniejszego rozwiązywania problemów badawczych związanych z ludzką miogenezą i regeneracją mięśni szkieletowych.

Izolacja, hodowla, charakterystyka i różnicowanie ludzkich komórek progenitorowych mięśni na podstawie procedury biopsji mięśni szkieletowych

Mioblasty to proliferujące komórki prekursorowe, które różnicują się, tworząc wielojądrowe miotuby, a w końcu mięśnie szkieletowe mięśni szkieletowych. W tym miejscu przedstawiamy protokół skutecznej izolacji i hodowli pierwotnych mioblastów z mięśni szkieletowych młodych dorosłych myszy. Metoda umożliwia badania molekularne, genetyczne i metaboliczne komórek mięśniowych w hodowli.

Izolacja i różnicowanie pierwotnych mioblastów z eksplantatów mięśni szkieletowych myszy

W tym protokole opisana jest metoda hodowli in vitro i analizy funkcjonalnej komórek macierzystych mięśni, która zachowuje większość ich interakcji z ich endogenną niszą.

Test pojedynczej hodowli włókien mięśniowych do oceny funkcjonalności dorosłych komórek macierzystych mięśni ex vivo

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół tworzenia matryc 3D mikrotkanek ludzkich mięśni szkieletowych oraz minimalnie inwazyjnych testów funkcji in situ, w tym analizy siły skurczu i obchodzenia się z wapniem.

Ocena funkcjonalnych wskaźników zdrowia mięśni szkieletowych w mikrotkankach mięśni szkieletowych człowieka

Protokół ten zapewnia ustandaryzowaną metodę izolowania i wzbogacania pierwotnych mioblastów z mięśni szkieletowych dorosłych i noworodków myszy poprzez dysocjację tkanek, filtrację sekwencyjną, wstępne nakładanie oraz określone warunki hodowlane, umożliwiając tworzenie i utrzymanie hodowli mioblastów pochodzących z komórek satelitarnych do dalszych zastosowań eksperymentalnych.

Izolacja komórek satelitarnych mięśni szkieletowych do badań in vitro miogenezy

Naucz się izolować pierwotne mioblasty z mięśni szkieletowych dorosłych i starszych ludzi. Ta metoda umożliwia długoterminową hodowlę komórek z zachowaniem ich fenotypu do badań nad regeneracją mięśni.

Przygotowanie i hodowla miogennych komórek prekursorowych/pierwotnych mioblastów z mięśni szkieletowych dorosłych i starszych ludzi (Wideo) | JoVE Journal

Przygotowanie i hodowla miogennych komórek prekursorowych/pierwotnych mioblastów z mięśni szkieletowych dorosłych i starszych ludzi

Przeglądaj więcej filmów